專利名稱：抗癌抗生素力達(dá)霉素與單鏈抗體的組裝融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組裝融合蛋白LDM-Fv，抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型導(dǎo)向藥物。
抗癌抗生素力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM；亦稱C1027)是本所從我國湖北省土壤分離得到的一株鏈霉菌產(chǎn)生的大分子肽類抗腫瘤活性物質(zhì)，對(duì)癌細(xì)胞有極強(qiáng)的殺傷作用，其半數(shù)抑制克隆形成濃度(IC50)比阿霉素、絲裂霉素等強(qiáng)10000倍以上。是迄今國內(nèi)外報(bào)道的對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性最強(qiáng)的大分子肽類抗腫瘤抗生素。其分子由力達(dá)蛋白(Lida-protein，LDP)和力達(dá)發(fā)色團(tuán)(Lida-chromophore，LDC)兩部分組成，具有烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)是活性成份，蛋白對(duì)發(fā)色團(tuán)起保護(hù)作用，兩者以非共價(jià)鍵結(jié)合，可拆分與組裝重建。重建后的力達(dá)霉素分子同樣具有天然力達(dá)霉素的高度活性。單克隆抗體(單抗)具有高度特異性，單抗導(dǎo)向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示選擇性殺傷，動(dòng)物體內(nèi)有顯著的療效。但一般單抗導(dǎo)向藥物臨床應(yīng)用效果欠佳，主要問題之一是由于藥物包括免疫毒素是蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，使用IgG單抗與蓖麻毒素A鏈制備的免疫毒素，分子量為180 kDa，與綠膿桿菌毒素制備的免疫毒素分子量190 kDa，在體內(nèi)運(yùn)送過程中受到多種因素制約難以進(jìn)入腫瘤深部。因此，研制小型的單抗導(dǎo)向藥物受到廣泛重視。在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中，IV型膠原酶降解IV型膠原，破壞基底膜的完整性。已證實(shí)腫瘤細(xì)胞的侵襲力與其IV型膠原酶活性呈正相關(guān)。腫瘤的生長依賴于新的血管生成以提供必須的營養(yǎng)。腫瘤誘導(dǎo)的血管生成不僅有助于原發(fā)瘤的生長，而且為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了通道。血管生成過程十分復(fù)雜，其核心環(huán)節(jié)是內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，而增殖內(nèi)皮細(xì)胞的特征之一是IV型膠原酶活性增高，抑制IV型膠原酶(基質(zhì)金屬蛋白酶)可抑制血管生成。因此，IV型膠原酶是抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子靶點(diǎn)。本發(fā)明所涉及的單鏈抗體scFv-M97能抑制IV型膠原酶活性。
本項(xiàng)發(fā)明的目的是采用DNA重組和分子組裝重建的技術(shù)路線，制備抗癌抗生素力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)與單鏈抗體的組裝融合蛋白(LDM-Fv)，以獲得小型、高效的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的新型導(dǎo)向藥物。經(jīng)檢索，目前國內(nèi)外尚未見有類似發(fā)明的有關(guān)報(bào)道。
本項(xiàng)發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)包括以下步驟1.力達(dá)蛋白-特異性單鏈抗體融合基因的構(gòu)建重組質(zhì)粒pAB和pC，分別含單鏈抗體scFv-M97和力達(dá)蛋白基因(本研究室保存)。表達(dá)質(zhì)粒pKK223-3購自Pharmacia公司，含Tac啟動(dòng)子，宿主菌為E.coli JM109。用Promega公司盒提取質(zhì)粒DNA用作PCR模板。PCR引物由賽百盛公司合成，PAGE純化。
單鏈抗體基因引物上游引物5’CGGAATTCCATATGGCCCAGGTGAAGCTG 3’EcoRI下游引物5’CATGCCATGG TGA ACC GCC TCC ACC ATGTTTGATTTCCAGCTTG 3’NcoI Ser Gly Gly Gly Gly力達(dá)蛋白基因引物上游引物5’CATGCCATGGGGGCCCGCCTTCTCCGTCAGTC 3’NcoI下游引物5’CCCAAGCTTCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTGGCGGTC 3’Hind IIIPCR反應(yīng)體系預(yù)變性96℃ 10分鐘擴(kuò)增 94℃ 1分鐘60℃ 1分鐘30個(gè)循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。將PCR擴(kuò)增后(圖2)的力達(dá)蛋白和scFv-M97基因片段及質(zhì)粒pUC18用限制性內(nèi)切酶消化，酶切產(chǎn)物純化后以2∶2∶1的分子比進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli JM109，鑒定重組子(圖3a，b)，對(duì)陽性克隆進(jìn)行DNA序列分析，融合基因長1083bP，編碼361個(gè)氨基酸ATG GCC CAG GTG AAG CTG CAG GAG TCT GGA CCT GAA CTG GTG AAG CCT GGGGCT TTA GTG AAA ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTC ACA GAC TACGAT ATA AAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAG GGA CTT GAG TGG ATT GGACDR 1TGG ATT TAT CCT GGA GAT GGT AGT GCT AAG TAC AAT GAG AAG TTC AAG GGCCDR 2AAG GCC ACA CTG ACT GCA GAC AAA TCC TCC AGC ACA GCC TAC ATG CAG CTCAGC AGC CTG ACT TCT GAG AAC TCT GCA GTC TAT TTC TGT GCA AGA GGG CATCDR3AAC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGAGGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTCLinker 1ACT CAG TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATATCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT GTT GAT ACT TAT GGC GAT ACT TTT ATG TACCDR1TGG TAC CAG CAG AAA CCA GGA CAG CCA CCC AAC CTC CTC ATC TAT CTT GCACDR 2ACC AAC TTA GGA TCT GGG GTC CCT GCC AGG TTC ATT GGC AGT GGG TTT AGGACA AAC TTC ACC CTC ACC ATC GAT CCT GTG GGG GCT GAT GAT GCT GCA ACCTAT TAC TGT CAG CAA AAT AAT GAG GAT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGC ACCCDR 3AAG CTG GAA ATC AAA CAT GGT GGA GGC GGT TCA CCA TGG GCG CCC GCC TTCLinker 2 (Gly4 Ser) Nco ITCC GTC AGT CCC GCC TCG GGT CTG AGT GAC GGA CAG AGC GTG TCG GTG TCGGTC AGC GGT GCC GCC GCC GGC CAG ACC TAC TAC ATC GCC CAG TGC GCT CCGGTC GGT GGC CAG GAC GCG TGC AAC CCG GCG ACC GCG ACG TCC TTC ACC ACGGAC GTG TCC GGA GCG GCG TCG TTC AGC TTC GTC GTG CGC AAG TCG TAC ACGGTC TCC ACG CCC GAA GGC ACG CCG GTC GGC AGC GTC GAC TGC GCC ACG GCCGCC TGT AAC CTC GGC GCC GGC AAC TCC GGG CTC GAC CTC GGC CAC GTG GCTCTG ACC TTC GGC TGA AAG CTT GC。基因序列及讀框均正確地再進(jìn)一步亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒pKK223-3中(圖4)。
2.力達(dá)蛋白-單鏈抗體融合蛋白LDP-Fv在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)在大腸桿菌JM109(本研究室保存)中進(jìn)行。挑選單一陽性克隆，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，次日按1∶50轉(zhuǎn)種，當(dāng)A600值約0.6時(shí)，加入IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，終濃度為1.5mmol/L，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)約3小時(shí)。菌體總蛋白處理誘導(dǎo)前后的樣品離心，按每0.1A值10 ul PBS(磷酸緩沖夜)重懸菌體，加等體積2×上樣緩沖液，沸水浴5分鐘。菌體周間質(zhì)提取液的制備取與上述體積相等的菌液，離心收集菌體，加5倍體積的外周質(zhì)提取液(含溶菌酶1mg/ml，20％蔗糖，30mM Tris·Hcl，PH8.0，1mM乙二胺四乙酸)，冰浴30分鐘，10000g離心，收集上清，即為菌體外周質(zhì)提取液。沉淀系包涵體，用6mol/L鹽酸胍，20mmol/L Tris·Hcl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，5mmol/L二硫蘇糖醇的溶液溶解，即為包涵體抽提物。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12％SDS-PAGE電泳后(圖5)，Bio-Rad電轉(zhuǎn)移槽中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(200mA，6h)，轉(zhuǎn)移后的醋酸纖維素膜用小鼠抗力達(dá)蛋白單克隆抗體及HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行顯色鑒定(圖6)。
3.組裝融合蛋白LDM-Fv制備取溴化氰活化的Sepharose 4B 4g干膠，用1mol/L的鹽酸充分膨脹，以每克干膠30mg抗力達(dá)蛋白單抗(本研究室保存)包被2小時(shí)。菌體外周質(zhì)提取液經(jīng)PBS透析，用F9(抗力達(dá)蛋白)-Sepharose 4B親和層析柱純化。依次用PBS，PBS+2.5mol/L NaCl和0.1mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，將第II蛋白峰用0.3mol/L Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中和再用PBS透析、濃縮、冷凍干燥。取高活性力達(dá)霉素凍干品，加冷甲醇振搖5分鐘，-20℃放置1小時(shí)，中間振搖1次；在0℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，上清液含發(fā)色團(tuán)，沉降物為力達(dá)蛋白，重復(fù)提取2次。發(fā)色團(tuán)甲醇液蒸發(fā)濃縮，-70℃儲(chǔ)存。發(fā)色團(tuán)不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)需低溫、避光進(jìn)行。取力達(dá)蛋白-單鏈抗體融合蛋白溶于0.01mol/L PBS(pH7.0)中，加入5倍分子量的發(fā)色團(tuán)，振搖混合5分鐘，-20℃ 放置過夜，Sephadex G-50柱層析，收集蛋白部分。
4.組裝融合蛋白LDM-Fv的免疫學(xué)活性以104/孔的密度將高轉(zhuǎn)移性人肺巨細(xì)胞癌PG細(xì)胞和人肝癌BEL7402細(xì)胞接種于96孔板中，37℃培養(yǎng)過夜。棄上清后，以0.125％戊二醛固定細(xì)胞，1％BSA封閉，將待測抗體加入細(xì)胞板中，孵育洗滌后加入FC98，再次孵育洗滌后加入HRP-羊抗鼠IgG，以O(shè)PD為底物染色。ELISA檢測結(jié)果表明，融合蛋白LDM-Fv仍保留單抗的免疫反應(yīng)性(圖7)。
5.組裝融合蛋白LDM-Fv對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用克隆形成測定，取對(duì)數(shù)生長期的PG細(xì)胞(購自北京醫(yī)科大學(xué)病理系)加入96孔培養(yǎng)板，每孔50個(gè)細(xì)胞/0.2ml，培養(yǎng)24小時(shí)。10倍稀釋各藥物和偶聯(lián)物，每濃度4孔，每孔加50ul，37℃溫育1h，無血清PRMI 1640培養(yǎng)液洗2次，加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)7天，鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落，大于50個(gè)細(xì)胞的集落列入計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示組裝融合蛋白對(duì)IV型膠原酶高表達(dá)的人肺細(xì)胞癌系PG細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用，明顯高于阿霉素和絲裂霉素。抑制50％克隆形成的濃度(IC50)為9.5×10-15mol/L(圖8)。
6.融合蛋白LDP-Fv阻斷腫瘤細(xì)胞的侵襲重組人工基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)，取200ul NIH3T3細(xì)胞(北京市腫瘤研究所)培養(yǎng)液上清作為趨化因子加入BoydenChamber(Costar公司)中的下室，上、下室之間用孔徑為8um的無PVP聚碳酸脂膜分開，在膜上鋪50ul 1∶6稀釋的人工基底膜膠(Matrigel)，37℃聚合30分鐘后，每孔各加入100ul濃度為2×106/ml細(xì)胞懸液和不同濃度的藥物，總體積200ul/孔。常規(guī)培養(yǎng)10小時(shí)，甲醇固定，HE染色，顯微鏡下計(jì)穿膜的細(xì)胞數(shù)，每組設(shè)3個(gè)平行樣本，為避免細(xì)胞毒作用對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，所用藥物為組裝前的融合蛋白，并以除去發(fā)色團(tuán)的力達(dá)蛋白作對(duì)照。結(jié)果表明，融合蛋白能抑制IV型膠原酶的活性，有較強(qiáng)的抗侵襲能力(圖9)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果是采用DNA重組和分子組裝重建的技術(shù)路線制備的組裝融合蛋白(LDM-Fv)屬于新型導(dǎo)向藥物，對(duì)IV型膠原酶高表達(dá)的人肺細(xì)胞癌系PG細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用，融合蛋白能抑制IV型膠原酶的活性，具有較強(qiáng)的抗侵襲能力


圖1力達(dá)霉素與單鏈抗體的組裝融合蛋白構(gòu)建技術(shù)路線其中 1-力達(dá)蛋白2-力達(dá)發(fā)色團(tuán)3-力達(dá)霉素4-單鏈抗體scFv-M975-重組融合蛋白6-組裝融合蛋白圖2瓊脂糖凝膠電泳分析PCR修飾性擴(kuò)增結(jié)果其中 1.分子量λDNA/EcoRI+HindIII. 2.scFv-M97基因.
3.力達(dá)蛋白基因.4.分子量標(biāo)準(zhǔn)pBR322/BstI圖3重組融合蛋白LDP-Fv的DNA序列測定其中a-正鏈b-負(fù)鏈圖4表達(dá)質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶鑒定其中 1.分子量λDNA/EcoRI+HindIII. 2.重組質(zhì)粒/EcoRI+HindIII.
3.重組質(zhì)粒/EcoRI. 4.重組質(zhì)粒
5.空載pKK223-3/EcoRI. 6.空載pKK223-3圖5重組融合蛋白LDP-Fv表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定其中1.分子量標(biāo)準(zhǔn) 2.pKK223-3轉(zhuǎn)化菌3.融合基因轉(zhuǎn)化菌(IPTG誘導(dǎo)前).4.融合基因轉(zhuǎn)化菌(IPTG誘后)5.經(jīng)親和層析純化的重組融合蛋白LDP-Fv圖6Western blot鑒定重組融合蛋白LDP-Fv圖7ELISA檢測單抗3D6和組裝融合蛋白LDM-Fv對(duì)肺癌PG細(xì)胞和肝癌BEL7402細(xì)胞的免疫反應(yīng)性其中△3D6(PG細(xì)胞)□組裝融合蛋白LDM-Fv(PG細(xì)胞)*3D6(BEL7402細(xì)胞，本研究室保存)○組裝融合蛋白LDM-Fv(BEL7402細(xì)胞)圖8組裝融合蛋白LDM-Fv及天然力達(dá)霉素對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用其中●天然力達(dá)霉素IC50為2.5×10-16mol/L□組裝融合蛋白LDM-FvIC50為9.5×10-15mol/L阿霉素IC50為1.5×10-12mol/L■絲裂霉素IC50為2.1×10-11mol/L圖9體外抗侵襲實(shí)驗(yàn)分析其中
力達(dá)蛋白處理組
融合蛋白LDP-Fv處理組●P＜0.0權(quán)利要求
1.抗癌抗生素力達(dá)霉素(LDM.)與單鏈抗體scFv的組裝融合蛋白(LDM-Fv)，其特征是所說的方案的實(shí)施包括以下步驟A.力達(dá)蛋白/單鏈抗體scFv融合基因的構(gòu)建；B.融合蛋白LDP-Fv在大腸桿中的誘導(dǎo)表達(dá)；C.組裝融合蛋白LDM-Fv的制備；D.組裝融合蛋白LDM-Fv抗腫瘤作用的檢測。
2.按照權(quán)利要求1所述的組裝融合蛋白，其特征是所說的力達(dá)蛋白/單鏈抗體scFv融合基因是運(yùn)用基因工程技術(shù)，將力達(dá)蛋白基因和單鏈抗體scFv基因連接，融合基因長1083bp，編碼361個(gè)氨基酸。
3.按照權(quán)利要求1所述的組裝融合蛋白，其特征是力達(dá)蛋白/單鏈抗體scFv融合基因克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白LDP-Fv。
4.按照權(quán)利要求1所述的組裝融合蛋白，其特征是提取純化融合蛋白并與力達(dá)發(fā)色團(tuán)組裝，獲得最終產(chǎn)物力達(dá)霉素與單鏈抗體scFv的組裝融合蛋白LDM-Fv。
5.按照權(quán)利要求1所述的組裝融合蛋白，其特征是體外培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PG細(xì)胞和人肝癌BEL-7402細(xì)胞，用克隆形成法測定組裝融合蛋白LDM-Fv對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；用重組人工基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)分析融合蛋白LDP-Fv抗侵襲能力。
全文摘要
抗癌抗生素力達(dá)霉素分子由力達(dá)蛋白(Lida－protein,LDP)和活性成份力達(dá)發(fā)色團(tuán)(Lida－chromophore LDC)兩部分組成,并以非共價(jià)鍵結(jié)合,可拆分與組裝重建,由于單鏈抗體scFv能特異性與Ⅳ型膠原酶結(jié)合并抑制其活性,為提高藥物對(duì)毛細(xì)管的通透性以及在實(shí)體瘤內(nèi)的穿透性,本發(fā)明運(yùn)用DNA重組和分子重建技術(shù),制備得到新型小型抗腫瘤導(dǎo)向藥物力達(dá)霉素與單鏈抗體的組裝融合蛋白LDM－Fv,分子量約37kDa,它有抑制Ⅳ型膠原酶的活性、抗侵襲和極強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞作用,其半數(shù)抑制克隆形成的濃度(IC
文檔編號(hào)C07K16/00GK1251840SQ99121668
公開日2000年5月3日 申請(qǐng)日期1999年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月13日
發(fā)明者甄永蘇, 李順強(qiáng), 江敏 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所