專(zhuān)利名稱(chēng)：zonulin的肽拮抗劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及zonulin的肽拮抗劑，以及其使用方法。所說(shuō)的肽拮抗劑可與閉鎖小帶受體結(jié)合，但在生理上不調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。
背景技術(shù)：
Ⅰ．腸緊密連接的功能和調(diào)節(jié)緊密連接(“tj”)或閉鎖小帶(此后稱(chēng)為“ZO”)是吸收和分泌性上皮的標(biāo)志物之一(Madara,J.Clin.Invest.,83:1089-1094(1989)；和Madara,Textbook of Secretory Diarrhea Eds.Lebenthal等，第11章，125-138頁(yè)(1990))。作為頂部和基底側(cè)部分之間的屏障，它們選擇性地調(diào)節(jié)離子和水溶性溶質(zhì)通過(guò)細(xì)胞旁通路的被動(dòng)擴(kuò)散(Gumbiner,Am.J.Physiol.,253(Cell Physiol.22):C749-C758(1987))。這個(gè)屏障維持著由跨細(xì)胞途徑的通路活性產(chǎn)生的任何梯度(Diamond,Physiologist,20:10-18(1977))。
跨上皮傳導(dǎo)的變化通常引起細(xì)胞旁通路通透性的改變，因?yàn)槟c細(xì)胞漿膜的阻力相對(duì)較高(Madara，見(jiàn)前)。ZO代表著在這種細(xì)胞旁通路中的主要屏障，上皮組織的電阻似乎依賴(lài)于跨膜蛋白鏈的數(shù)量及其在ZO內(nèi)的復(fù)雜性，如用冷凍蝕刻電鏡所觀察到的那樣(Madara等，J.CellBiol.,101:2124-2133(1985))。
具有充足證據(jù)的是ZO，曾被認(rèn)為是穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，實(shí)際上是動(dòng)態(tài)的，很容易地適應(yīng)各種發(fā)育的(Magnuson等，Dev.Biol.,67:214-224(1978)；Revel等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Boil.,40:443-455(1976)；和Schneeberger等，J.Cell Sci.,32:307-324(1978))、生理的(Gilula等，Dev.Biol.,50:142-168(1976)；Madara等，J.Mebr.Biol.,100:149-164(1987)；Mazariegos等，J.Cell Biol.,98:1865-1877(1984)；和Sardet等，J.CellBiol.,80:96-117(1979))、和病理的(Milks等，J.Cell Biol.,103:2729-2738(1986)；Nash等，Lab.Invest.,59:531-537(1988)；和Shasby等，Am.J.Physiol.,255(Cell Physiol.,24):C781-C788(1988))環(huán)境。構(gòu)成這種適應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制仍不完全清楚。但是，可以明確的是，在Ca2+的存在下，ZO的集合是細(xì)胞相互作用的結(jié)果，這種相互作用觸發(fā)了一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致了一個(gè)有組織的ZO元件網(wǎng)絡(luò)的形成和調(diào)節(jié)，這些元件的組成僅部分地被闡明(Diamond,Physiologist,20:10-18(1977))。一個(gè)跨膜蛋白鏈的候選物，閉合素(occludin)，最近已經(jīng)被鑒定(Furuse等，J.Membr.Biol.,87:141-150(1985))。
在構(gòu)成膜接觸基礎(chǔ)的細(xì)胞漿膜下斑塊中已經(jīng)鑒定了6種蛋白，但它們的功能仍有待確定(Diamond,見(jiàn)前)。ZO-1和ZO-2作為一個(gè)雜二聚體(Gumbiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:3460-3464(1991))與一個(gè)未確定的130kD蛋白質(zhì)(ZO-3)一起存在于一個(gè)對(duì)去垢劑穩(wěn)定的復(fù)合體中。大多數(shù)免疫電鏡研究已經(jīng)將ZO-1精確定位于膜接觸點(diǎn)之下(Stevenson等，Molec.Cell Biochem.,83:129-145(1988))。兩個(gè)其他的蛋白質(zhì)，cingulin(Citi等，Nature(London),333:272-275(1988))和7H6抗原(Zhong等，J.Cell Biol.,120:477-483(1993))則位于距膜更遠(yuǎn)的位置，但尚未被克隆。Rab13，一個(gè)小的GTP結(jié)合蛋白最近也被定位在連接區(qū)(Zahraoui等，J.Cell Biol.,124:101-115(1994))。其他小的GTP結(jié)合蛋白已知可調(diào)節(jié)皮質(zhì)細(xì)胞骨架，也就是，rho可調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白-膜在局灶接觸點(diǎn)的附著(Ridley等，Cell,70:389-399(1992)),rac可調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的膜皺褶(Ridley等，Cell,70:401-410(1992))。根據(jù)對(duì)已經(jīng)較好定性的細(xì)胞連接、局灶接觸點(diǎn)(Guan等，Nature,358:690-692(1992))和粘附連接(Tsukita等，J.Cell Biol.,123:1049-1053(1993))中斑塊蛋白已知功能的推理，可以假設(shè)與tj相關(guān)的斑塊蛋白在跨越細(xì)胞膜的兩個(gè)方向和在調(diào)節(jié)與皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的連接中，參與信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
為適應(yīng)上皮所受到的許多不同的生理和病理刺激，ZO必須能發(fā)生迅速和協(xié)調(diào)的反應(yīng)，因此需要一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)的存在。涉及ZO集合和調(diào)節(jié)的機(jī)制的精確特性是目前一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。
現(xiàn)在有大量的證據(jù)表明，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和吸收性細(xì)胞的tj復(fù)合體之間存在tj結(jié)構(gòu)和功能的聯(lián)系(Gumbiner等，見(jiàn)前；Madara等，見(jiàn)前；和Drenchahn等，J.Cell boil.,107:1037-1048(1988))。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是由一個(gè)微絲的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)組成，微絲的精確幾何構(gòu)型是由大量的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白骨架調(diào)節(jié)的。一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的磷酸化狀態(tài)如何調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架與細(xì)胞漿膜結(jié)合的實(shí)例是肉豆蔻酸鹽的、富含丙氨酸的激酶C底物(此后稱(chēng)為“MARCKS”)。MARCKS是一個(gè)特殊的蛋白激酶C(此后稱(chēng)為“PKC”)底物，伴隨于漿膜的胞漿面(Aderem,Elsevier Sci.Pub.(UK),438-443頁(yè)(1992))。以其非磷酸化形式，MARCKS與膜肌動(dòng)蛋白相互交聯(lián)。因此，很可能肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)經(jīng)MARCKS與膜相聯(lián)系是相對(duì)剛硬的(Hartwig等，Nature,356:618-622(1992))?；罨腜KC使MARCKS磷酸化并從膜上釋放(Rosen等，J.Exp.Med.,172:1211-1215(1990)；和Thelen等，Nature,351:320-322(1991))。與MARCKS相連的肌動(dòng)蛋白很可能在空間上與膜分離并變得更有彈性。當(dāng)MARCKS去磷酸化時(shí)，它重新回到膜上并在此再與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)(Hartwig等，見(jiàn)前；和Thelen等，見(jiàn)前)。這些數(shù)據(jù)表明纖維肌動(dòng)蛋白(F-actin)網(wǎng)絡(luò)可能通過(guò)一個(gè)涉及肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(MARCKS是其中之一)的PKC依賴(lài)的磷酸化過(guò)程進(jìn)行重排。
多種的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子已顯示改變tj功能和/或結(jié)構(gòu)。兩棲動(dòng)物膽囊(Duffey等，Nature,204:451-452(1981))，和金魚(yú)(Bakker等，Am.J.Physiol.,246:G213-G217(1984))及比目魚(yú)(Krasney等，F(xiàn)ed.Proc.,42:1100(1983))腸的緊密連接，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)cAMP升高時(shí)，均顯示了對(duì)被動(dòng)離子流的阻力增強(qiáng)。而且，將兩棲動(dòng)物膽囊暴露于鈣離子載體似乎可增加tj的阻力，并導(dǎo)致tj結(jié)構(gòu)的改變(Palant等，Am.J.Physiol.,245:C203-C212(1983))。此外，用佛波醇酯激活PKC可增加腎(Ellis等，C.Am.J.Physiol.,263(Renal Fluid Electrolyte Physiol.32):F293-F300(1992))和腸(Stenson等，C.Am.J.Physiol.,265(Gastrointest.LiverPhysiol.,28):G955-G962(1993))上皮細(xì)胞系的細(xì)胞旁通透性。Ⅱ．血-腦屏障血-腦屏障(BBB)是一個(gè)極薄的膜屏障，對(duì)溶質(zhì)的自由擴(kuò)散有高度地阻力，并將血液和腦分隔開(kāi)。藥物或溶質(zhì)以分子大小通過(guò)此膜的移動(dòng)幾乎為零，除非該化合物具有包含在BBB膜中的幾個(gè)特異類(lèi)酶樣轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制之一的通路。BBB由多種細(xì)胞組成，而不是單一的上皮細(xì)胞層。在組成BBB的四種不同的細(xì)胞類(lèi)型(內(nèi)皮細(xì)胞、外膜細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)中，毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞成分代表了BBB通透性的限制因素。在脊椎動(dòng)物腦和脊髓中的毛細(xì)血管內(nèi)皮具有tj，關(guān)閉了內(nèi)皮細(xì)胞之間的孔，該孔正常存在于外周組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障中。最后，內(nèi)皮的tj在BBB有限的通透性中起作用。Ⅲ．閉鎖小帶毒素大多數(shù)通過(guò)刪除編碼霍亂毒素(CT)的ctxA基因而構(gòu)建的霍亂弧菌疫苗候選物，能夠引起高度的抗體反應(yīng)，但超過(guò)一半的疫苗接受者仍然發(fā)生輕度的腹瀉(Levine等，Infect.Immun.,56(1):161-167(1988))。根據(jù)在缺乏CT的條件下所引起的腹瀉程度，可以假設(shè)霍亂弧菌可以產(chǎn)生其他的產(chǎn)腸毒的因子，這些因子仍然存在于去除了ctxA序列的菌株中(Levine等，見(jiàn)前)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了由霍亂弧菌產(chǎn)生的第二個(gè)毒素，閉鎖小帶毒素(此后稱(chēng)為“ZOT”)，它可以解釋殘余的腹瀉現(xiàn)象(Fasano等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,8:5242-5246(1991))。zot基因直接位于ctx基因旁邊。在霍亂弧菌菌株中zot基因和ctx基因共同出現(xiàn)的高百分比(Johnson等，J.Clin.Microb.,31/3:732-733(1993)；和Karasawa等，F(xiàn)EBSMicrobiology Letters,106:143-146(1993))表明ZOT在導(dǎo)致霍亂典型的急性脫水性腹瀉中可能有協(xié)同作用。最近，zot基因也已在其他腸病原體中得到鑒定(Tschape,2nd傷寒熱和其他沙門(mén)氏菌病亞洲-太平洋研論會(huì)，47(摘要)(1994))。
以前曾發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在兔回腸粘膜上進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，ZOT通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間tj的結(jié)構(gòu)增加腸通透性(Fasano等，見(jiàn)前述)。發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞旁通路調(diào)節(jié)的結(jié)果，腸粘膜變得更易通透。還發(fā)現(xiàn)ZOT并不影響Na+-葡萄糖偶聯(lián)的活性轉(zhuǎn)運(yùn)，是非細(xì)胞毒性的，且不能完全消除跨上皮的阻力(Fasano等，見(jiàn)前述)。
最近，已發(fā)現(xiàn)ZOT能可逆性地開(kāi)放腸粘膜的tj，因此當(dāng)用作口服藥處方以腸道藥物輸送，與治療藥物共同使用時(shí)，ZOT能夠影響治療藥物的腸道輸送(WO 96/37196；1995年5月24日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)第08/443,864申請(qǐng)；和美國(guó)專(zhuān)利5,665,389；和Fasano等，J.Clin.Invest.,99:1158-1164(1997)；其中每一個(gè)均在此整體引用作為參考)。也已發(fā)現(xiàn)ZOT能夠可逆性地開(kāi)放鼻粘膜中的tj，因此當(dāng)ZOT與一個(gè)治療藥物共同使用時(shí)，能夠增強(qiáng)治療藥物的鼻粘膜吸收(1997年1月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)第08/781,057申請(qǐng)，；在此整體引用作為參考)。
在此整體引用作為參考的、1997年2月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/803,364中，一個(gè)ZOT受體從一個(gè)腸細(xì)胞系，即CaCo2細(xì)胞中被鑒定并純化。進(jìn)一步，在此整體引用作為參考的、1998年2月17日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/024,198中，ZOT受體從人腸、心和腦組織中已被得到鑒定和純化。ZOT受體代表了涉及腸和鼻通透性調(diào)節(jié)的細(xì)胞旁通路的第一個(gè)步驟。Ⅳ．Zonulin在未授權(quán)的于1997年5月21日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)098/859,931中，在此整體引用作為參考，免疫學(xué)和功能上與ZOT相關(guān)的哺乳動(dòng)物蛋白，作為哺乳動(dòng)物緊密連接的生理調(diào)節(jié)物，已被鑒定和純化。這些哺乳動(dòng)物蛋白，稱(chēng)為“zonulin”，可用于增強(qiáng)治療藥物通過(guò)腸和鼻粘膜tj、以及通過(guò)血腦屏障tj的吸收。
在本發(fā)明中，zonulin的肽拮抗劑首次被鑒定。所述的肽拮抗劑與ZOT受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。肽拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ZOT和zonulin與ZOT受體的結(jié)合，因此抑制ZOT和zonulin生理性調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接開(kāi)放的能力。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是鑒定zonulin的肽拮抗劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是合成和純化所述的肽拮抗劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用所述的肽拮抗劑作為在胃腸道炎癥治療中的抗炎劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用所述的肽拮抗劑抑制血腦屏障的破壞。
本發(fā)明的這些和那些目的，將很明顯地表現(xiàn)在下面提供的本發(fā)明詳細(xì)描述中，在一個(gè)實(shí)施方案中是通過(guò)zonulin的肽拮抗劑實(shí)現(xiàn)的，該zonulin的肽拮抗劑包括選自如下序列的氨基酸序列:SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:6,SEQID NO:7,SEQID NO:8,SEQID NO:9,SEQID NO:10,SEQID NO:11,SEQID NO:12,SEQID NO:13,SEQID NO:14,SEQID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQID NO:23,SEQ ID NO:24,和SEQ ID NO:35，其中所述的肽拮抗劑與一個(gè)ZOT受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。
圖表的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示了從兔腸中純化的zonulin(■)與各種陰性對(duì)照相比(從Q-瓊脂糖柱中得到的片斷2(◇)；片斷3(●)；片斷4(▲)；和片斷5(□))，對(duì)CaCo2單層細(xì)胞的組織阻力(Rt)的作用。
圖2顯示了從兔腸中純化的zonulin(■)與陰性對(duì)照(□)相比，對(duì)置于Ussing室中的兔回腸的組織阻力(Rt)的作用。
圖3顯示了從兔腸中純化的zonulin(■)與陰性對(duì)照(zonulin+抗ZOT抗體(□)；zonulin+抗tau抗體(△)；和tau(▲))相比，對(duì)置于Ussing室中的兔回腸的組織阻力(Rt)的作用。
圖4A和4B顯示了從人腦(▲)、人腸(●)、或人心臟(○)中純化的zonulin與陰性對(duì)照(□)相比，對(duì)置于Ussing室中的恒河猴空腸(圖4A)和恒河猴回腸(圖4B)的組織阻力(Rt)的作用。
圖5A和圖5B顯示了從人心臟(▲)或人腦(□)中純化的zonulin與陰性對(duì)照(■)相比，對(duì)置于Ussing室中的兔空腸(圖5A)和兔回腸(圖5B)的組織阻力(Rt)的作用。
圖6顯示了從兔和人不同組織中純化的zonulinN末端序列的比較。
圖7顯示了從人不同組織中純化的zonulin和IgM重鏈的N末端序列與ZOT生物活性片斷(氨基酸288-399)的N末端序列的比較。
圖8顯示了ZOT、zonulini、zonulinh，單獨(dú)(實(shí)心條)、或與肽拮抗劑FZI/0(空白條)或FZI/1(陰影條)合用，與陰性對(duì)照相比，對(duì)置于Ussing室中的兔回腸的組織阻力(Rt)的作用。N等于3-5；*為P＜0.01。
發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，在一個(gè)實(shí)施方案中，上述的本發(fā)明的目的是通過(guò)zonulin的肽拮抗劑實(shí)現(xiàn)的，該肽拮抗劑包括選自如下序列的氨基酸序列SEQID NO:1,SEQID NO:2,SEQID NO:3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24,和SEQ ID NO:35，其中所述的肽拮抗劑與ZOT受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。
肽拮抗劑的大小在本發(fā)明中不是關(guān)鍵的。一般來(lái)說(shuō)，肽拮抗劑的大小應(yīng)在8到110個(gè)氨基酸的范圍內(nèi)，優(yōu)選地從8到40個(gè)氨基酸，更優(yōu)選地為8個(gè)氨基酸。
肽拮抗劑可采用已知的技術(shù)化學(xué)合成和純化，如在≤肽和蛋白質(zhì)的高效液相色譜分離分析和構(gòu)象≥，Mant等編輯，C.R.C.印刷(1991)中所描述的，和一個(gè)肽合成儀，如Symphony(Protein Technologies,Inc.)；或通過(guò)重組DNA技術(shù)，即將編碼肽的核苷酸序列插入到合適的表達(dá)載體中，如一個(gè)大腸桿菌或酵母表達(dá)載體，在各自的宿主細(xì)胞中表達(dá)，并采用已知的技術(shù)從中純化。
肽拮抗劑可被用作抗炎劑以治療引起腸道通透性增加的胃腸道炎癥。因此，本發(fā)明的肽拮抗劑可用于治療，如導(dǎo)致蛋白丟失性腸病的腸道疾病。蛋白丟失性腸病可由以下原因引起感染，如C.頑固性感染、小腸結(jié)腸炎、志賀氏菌病、病毒性胃腸炎、寄生蟲(chóng)感染、細(xì)菌過(guò)度增生、Whipple’s?。痪哂姓衬っ訝€或潰瘍的疾病，如胃炎、胃癌、，膠原性結(jié)腸炎、炎性腸??；以淋巴管阻塞為特征的疾病，如，先天性腸淋巴管擴(kuò)張、伯克氏淋巴瘤、腸系膜結(jié)核，和用Fontan氏手術(shù)矯正先天性心臟病術(shù)后。
不發(fā)生潰瘍的粘膜疾病，如，Ménétrier’s病、乳糜瀉、嗜酸粒細(xì)胞性胃腸炎；和免疫疾病，如全身性紅斑狼瘡或食物過(guò)敏，主要是對(duì)牛奶過(guò)敏(也見(jiàn)≤小兒胃腸道疾病病理生理學(xué)診斷措施≥中的表40-2,Wyllie等編輯，Saunder Co.(1993),536-543頁(yè)；在此整體引用作為參考)。
因此，在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)治療胃腸道炎癥的方法，該法包括給予需要此種治療的患者有藥效劑量的zonulin的肽拮抗劑，其中所述的肽拮抗劑包括選自如下序列的氨基酸序列SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23，和SEQ ID NO:24，其中所述的肽拮抗劑與所述患者腸內(nèi)的ZOT受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)所述腸道中緊密連接的開(kāi)放。
為此，肽拮抗劑可以作為口服藥劑組合物為小腸輸送給藥。這種為小腸輸送的口服藥劑組合物在本領(lǐng)域中為人熟知，一般包括胃不吸收的片劑或膠囊(Remington’s藥物科學(xué)，16th版，Oso1編輯，MackPublishing Co.,89章(1980)；Digenis等，J.Pharm,.Sci.,83:915-921(1994)；Vantini等，Clinica Terapeutica,145:445-451(1993)；Yoshitomi等，Chem.Pharm.Bull.,40:1902-1905(1992)；Thoma等，Pharmazie,46:331-336(1991)；Morishita等，藥物設(shè)計(jì)和輸送，7:309-319(1991)；和Lin等，Pharmaceutical Res.,8:919-924(1991)；其中每一篇均在此整體引用作為參考)。
片劑通過(guò)添加，如醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯或醋酸纖維素對(duì)苯二甲酸酯，以制成胃不吸收的制劑。
膠囊是固體的藥劑形式，其中肽拮抗劑包被在一個(gè)硬的或軟的，可溶性容器或明膠外殼中。在制備膠囊中使用的明膠是通過(guò)水解成膠物質(zhì)獲得的。有兩種類(lèi)型的明膠。A型，來(lái)源于經(jīng)酸處理的豬皮，B型，從堿處理的骨和動(dòng)物皮膚中獲得。硬明膠膠囊的使用允許根據(jù)每個(gè)患者的最佳考慮選擇單一肽拮抗劑的處方或以準(zhǔn)確的劑量水平進(jìn)行合用。硬明膠膠囊由兩個(gè)部分組成，一部分套在另一部分上，因此完全地包繞肽拮抗劑。在這些膠囊的較長(zhǎng)端填入肽拮抗劑或含有肽拮抗劑的胃不吸收小珠，然后蓋上蓋。硬明膠膠囊主要由明膠、FD&C著色劑，有時(shí)需要遮光劑如二氧化鈦制成。USP允許用于此目的的明膠中含有0.15％(w/v)的二氧化硫以在生產(chǎn)過(guò)程中防止分解。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，為小腸輸送的口服藥劑也包括液體組合物，其中含有水性緩沖劑以防止肽拮抗劑被胃中的胃液明顯地滅活，從而使肽拮抗劑以活性的形式到達(dá)小腸?？稍诒景l(fā)明中使用的這種水性緩沖劑的實(shí)例包括碳酸氫鹽緩沖劑(pH5.5到8.7，最好是大約pH7.4)。
當(dāng)口服藥劑是一個(gè)液體組合物時(shí)，最好在服藥前配制這種藥劑以減少穩(wěn)定性問(wèn)題。在這種情況下，液體組分可通過(guò)在水性緩沖劑中溶解凍干的肽拮抗劑進(jìn)行制備。
肽拮抗劑可被用于抑制血腦屏障的破壞。因此，本發(fā)明的肽拮抗劑可用于治療，如伴有血腦屏障破壞的疾病狀態(tài)。這些疾病狀態(tài)的實(shí)例包括滲透性損傷，如腦缺血、中風(fēng)或腦水腫；高血壓；二氧化碳；痙攣發(fā)作；化學(xué)毒素；尿毒癥(腎功能不全)；腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎，如感染性(病毒(SRV、HIV等)、或細(xì)菌性(結(jié)核、溶血性流行性感冒、腦膜炎球菌等)、或過(guò)敏性；腫瘤；創(chuàng)傷性腦損傷；放射性腦損傷；未成熟和核黃疸；脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化癥或Guillian-Barre綜合征。
因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及伴有血腦屏障破壞的疾病狀態(tài)的治療方法，包括給予需要這種治療的患者藥效學(xué)上有效劑量的zonulin的肽拮抗劑，其中所述的肽拮抗劑是由氨基酸序列SEQ IDNO:35組合物，其中所述的肽拮抗劑與所述患者腦中的ZOT受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)所述腦中緊密連接的開(kāi)放。
為此，肽拮抗劑可以靜脈內(nèi)藥劑配方給藥以輸送至腦。這種配方在本領(lǐng)域中為人熟知，通常包括一種生理性稀釋劑，如蒸餾水、或0.9％(w/v)氯化鈉。
所應(yīng)用的肽拮抗劑的藥效學(xué)有效劑量在本發(fā)明中并不是嚴(yán)格的，并將根據(jù)要治療的疾病或狀態(tài)、以及要接受治療的患者的年齡、體重和性別而改變。一般來(lái)說(shuō)，為抑制胃腸道炎癥或抑制血腦屏障的破壞，如抑制zonulin的生物學(xué)活性，在本發(fā)明中使用的肽拮抗劑的劑量在大約7.5×10-6M到7.5×10-3M范圍內(nèi)，優(yōu)選地大約7.5×10-6到7.5×10-4M。為在如腸或血液中達(dá)到這樣的終濃度，在本發(fā)明的單一口服藥劑中肽拮抗劑的量一般為大約1.0μg到1000μg，最好是1.0μg到100μg。
肽拮抗劑也可采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)(Abrams,Methods Enzymol.,121:107-119(1986))，用作免疫原以產(chǎn)生可與zonulin特異結(jié)合的多克隆或單克隆抗體。這些抗體反過(guò)來(lái)可被用于在機(jī)體組織或液體中、或在zonulin的親和-純化中檢測(cè)zonulin，或選擇性的，用以與zonulin結(jié)合，因而抑制zonulin活性，如，抑制胃腸道炎癥或抑制血腦屏障的破壞。
下面提供的實(shí)例僅僅是為了舉例說(shuō)明的目的，并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)例1ZOT的純化采用分子量限制為10kDa的薄層流式濾器，將培養(yǎng)以質(zhì)粒pZ14轉(zhuǎn)化的V.霍亂菌株CVD110(Michalski等，Infect.Immu.,G1:4462-4468(1993))后獲得的5000ml上清部分，濃縮1000倍。含有霍亂弧菌zot基因的pZ14的構(gòu)建在inter alia,WO96/37196中詳細(xì)描述。得到的上清然后經(jīng)過(guò)8.0％(w/v)SDS-PAGE。通過(guò)對(duì)SDS-PAGE膠進(jìn)行考馬思亮蘭染色檢測(cè)蛋白帶。當(dāng)與采用相同方式處理的、轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒pTTQ181(Amersham,Arlington Heights,IL)的菌株CVD110中獲得的上清相比時(shí)，沒(méi)有檢測(cè)到與ZOT相對(duì)應(yīng)的蛋白帶。因此，盡管在pZ14中zot基因放在高度可誘導(dǎo)性和強(qiáng)的tac啟動(dòng)子之后，1000倍濃縮的pZ14上清中的蛋白的水平仍然在采用考馬思亮蘭染色SDS-PAGE膠上檢測(cè)不到。
A．MBP-ZOT為增加ZOT產(chǎn)生的量，zot基因與麥芽糖結(jié)合蛋白(此后稱(chēng)為“MBP”)基因在構(gòu)架中融合以產(chǎn)生一個(gè)MBP-ZOT融合蛋白。
MBP載體pMAL-c2(Biolab)通過(guò)將ZOT基因融合到大腸桿菌的malE基因而被用于表達(dá)和純化ZOT。這種結(jié)構(gòu)采用強(qiáng)的、誘導(dǎo)型tac啟動(dòng)子，和malE翻譯初始信號(hào)以得到克隆zot基因的高水平表達(dá)。載體pMAL-c2完全去掉了malE信號(hào)序列，此序列可導(dǎo)致融合蛋白在胞漿中的表達(dá)。MBP的親和色譜純化被用來(lái)促進(jìn)融合蛋白的分離(Biolab)。
更為特殊的是，載體pMAL-c2用EcoRⅠ(在malE基因的3’末端切割)線(xiàn)性化，插入kelnow片斷，并用XbaⅠ(在pMAL-c2多接頭上有單一位點(diǎn))消化。編碼ZOT的orf從質(zhì)粒pBB241亞克隆(Baudry等，Infect.Immun.,60:428-434(1992))。質(zhì)粒pBB241用BssHⅡ消化，插入Kelnow片斷，用XbaⅠ消化。然后平端XbaⅠ片斷亞克隆進(jìn)pMAL-c2以產(chǎn)生質(zhì)粒pLC10-c。由于插入體和載體均有平端和粘端，正確的方向是通過(guò)malE3’末端與插入體的5’末端相融合獲得的。然后pLC10-c電導(dǎo)入大腸桿菌DH5α菌株中。在pBB241中，BssHⅡ限制性位點(diǎn)位于zot orf中。因此，ZOT的1-8氨基酸在MBP-ZOT融合蛋白中是缺失的。
為了純化MBP-ZOT融合蛋白，將含pLC10-c的單一克隆接種于含有0.2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的10ml Luria Bertani肉湯中，并在37℃振蕩孵育過(guò)夜。培養(yǎng)物以1∶100稀釋于1.0ml同樣的新鮮培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩生長(zhǎng)，直至大約1.0×108細(xì)胞/ml。然后加入0.2mM IPTG以誘導(dǎo)MBP-ZOT表達(dá)，培養(yǎng)物在37℃下再孵育3小時(shí)。然后將細(xì)菌沉淀，并重新懸浮于20ml冰冷的“柱緩沖液”中，該緩沖液含20mM Tris-HCL、0.2M NaCl、1.0mM EDTA、10mM 2-ME、1.0mMNaN3。細(xì)菌懸液通過(guò)拍(french)壓處理和在4℃下以13,000×g離心30min進(jìn)行溶解。收集上清，用柱緩沖液1∶5稀釋?zhuān)⒀b入以柱緩沖液預(yù)平衡的1×10直鏈淀粉樹(shù)脂(Biolabs,MBP-融合純化系統(tǒng))柱中。用5倍體積的柱緩沖液沖洗柱后，通過(guò)在柱緩沖液中加入10ml的10mM麥芽糖洗脫MBP-ZOT融合蛋白。一般從1.0ml培養(yǎng)物中獲得的產(chǎn)量是2-3mg蛋白。
純化的MBP-ZOT融合蛋白的MBP融合部分然后通過(guò)每20μgMBP-ZOT應(yīng)用1.0μgXa因子蛋白酶(Biolabs)而切除。Xa因子蛋白酶正好在ZOT的氨基末端前進(jìn)行切除。這樣獲得的ZOT蛋白在8.0％(w/v)SDS-PAGE膠上電泳，再用電分離室(Schleicher&Schuell,Keene,NH)將其從膠上電洗脫。
當(dāng)在Ussing室中檢測(cè)時(shí)，所得到的純化ZOT劑量依賴(lài)性地引起Rt下降，其ED50為7.5×10-8M。
B．6xHis-ZOTzot基因采用pBB241質(zhì)粒(Baudry等，見(jiàn)前)DNA作為模板，用DeepVent聚合酶(New England Biolabs)通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。所用的順向和反向引物分別為5’-CGGGATCCCGTATGAGTATCTTT-3’(SEQ IDNO:39)；和5’-CCCAAGCTTGGGTCAAAATATACT-3’(SEQ IDNO:40)。這些寡核苷酸的5’尾端分別含一個(gè)BamHⅠ和一個(gè)HindⅢ限制性位點(diǎn)。得到的擴(kuò)增子(1.2kb)用8.0％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，并采用一個(gè)Xtreme旋轉(zhuǎn)柱(Pierce)從鹽和游離核苷酸中純化。上面提到的兩種限制性酶然后用來(lái)消化純化的擴(kuò)增子，得到的消化的擴(kuò)增子然后被插入到載體pQE30(Quiagen)中，該載體之前已經(jīng)用BamHⅠ和HindⅢ消化，這樣獲得質(zhì)粒pSU113。PQE30是一個(gè)表達(dá)載體，可使有6聚-組氨酸標(biāo)記(6xHis)的重組蛋白高水平的表達(dá)。因此質(zhì)粒pSU113的表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)6xHis-ZOT融合蛋白。然后pSU113轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α中。
為了純化6xHis-ZOT融合蛋白，得到的轉(zhuǎn)化大腸桿菌在150ml含有2.0％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨芐青霉素的Luria Bertani肉湯中37℃生長(zhǎng)過(guò)夜，直至A600為大約1.10。下一步，75ml過(guò)夜的培養(yǎng)物加入到1000ml含有2.0％(w/v)葡萄糖、25μg/ml卡那霉素和200μg/ml氨芐青霉素的Luria Bertani肉湯中，在37℃孵育大約3小時(shí)，同時(shí)劇烈震蕩，直至A600為大約0.7-0.9。然后，加入IPTG至終濃度為2.0mM，并繼續(xù)在37℃生長(zhǎng)5小時(shí)。接著，通過(guò)4000×g離心20分鐘收獲細(xì)胞，重新懸浮在5.0ml/g濕重的緩沖液A中，緩沖液A含6.0M GuHCl、0.1M磷酸鈉和0.01M Tris-HCl(PH8.0)，并在室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后，混合物在4℃以10,000×g離心30分鐘，在所得到的上清中加入4.0-5.0ml/g濕重的50％SUPERFLOW樹(shù)脂漿(QIAGEN)，并在室溫進(jìn)行攪拌1小時(shí)。得到的樹(shù)脂加入到1.6×8.0柱中，然后順序地以緩沖液A、緩沖液B和緩沖液C沖洗柱子，緩沖液B含8.0M尿素、0.1M磷酸鈉和0.01M Tris-HCl(pH8.0)，緩沖液C含8.0M尿素、0.1M磷酸鈉和0.01M Tris-HCl(pH6.3)。每次沖洗均至流經(jīng)液的A600小于0.01時(shí)止。用含有250mM咪唑的20ml緩沖液C將6xHis-ZOT融合蛋白從柱中洗脫。然后，含有6xHis-ZOT融合蛋白的餾分采用Davis,Ann.N.Y.Acad.Sci.,121:404(1964)所描述的方法用SDS-PAGE進(jìn)行檢查，并用考馬思亮蘭對(duì)膠進(jìn)行染色。含有6xHis-ZOT融合蛋白的餾分經(jīng)8.0M尿素透析，集合，再用PBS稀釋100倍。隨后，加入50％SUPERFLOW樹(shù)脂漿4.0ml，在室溫下進(jìn)行攪拌2小時(shí)，得到的樹(shù)脂裝入1.6×8.0柱中，然后用50mlPBS沖洗柱子。用含有250mM咪唑的10mlPBS從柱中洗脫出6xHis-ZOT融合蛋白。得到的洗脫物經(jīng)PBS透析，并以上述的方法用SDS-PAGE檢查6xHis-ZOT融合蛋白。
實(shí)例2親和性-純化抗ZOT抗體的生產(chǎn)為獲得特異的抗血清，表達(dá)和純化了一個(gè)奇特的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)-ZOT蛋白。
更為特殊的是，以質(zhì)粒pBB241(Baudry等，見(jiàn)前)作為模板DNA，寡核苷酸引物被用來(lái)通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增zot orf。順式引物(TCATCACGGC GCGCCAGG,SEQ ID NO:25)對(duì)應(yīng)著zot orf的15-32核苷酸，反向引物(GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT,SEQID NO:26)對(duì)應(yīng)著ctxA orf的5’末端。因此，ZOT的1-5氨基酸在得到的融合蛋白中是缺失的。擴(kuò)增產(chǎn)物被插入到位于pGEX-2T(Pharmacia,Milwaukee,WI)中GST基因末端的多接頭(SmaⅠ位點(diǎn))內(nèi)。PGEX-2T是一個(gè)融合蛋白表達(dá)載體，可將一個(gè)克隆基因表達(dá)為帶有日本血吸蟲(chóng)GST的融合蛋白。融合基因在tac啟動(dòng)子的控制之下。在IPTG的誘導(dǎo)下，發(fā)生去阻遏并表達(dá)GST融合蛋白。
得到的重組質(zhì)粒，稱(chēng)為pLC11，被電導(dǎo)入大腸桿菌DH5α中。為了純化GST-ZOT融合蛋白，在10ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LuriaBertani肉湯中接種一個(gè)含有pLC11的單一克隆，37℃振蕩孵育，過(guò)夜。培養(yǎng)物以1∶100稀釋于1.0ml同樣的新鮮培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩生長(zhǎng)，直至1.0×108細(xì)胞/ml。然后加入0.2mM IPTG以誘導(dǎo)GST-ZOT表達(dá)，培養(yǎng)物繼續(xù)在37℃孵育3小時(shí)。然后將細(xì)菌沉淀，重新懸浮于20ml冰冷的PBS(pH7.4)中，并用拍壓的方法溶解。在這些條件下GST-ZOT融合蛋白是不溶的，于是與細(xì)菌沉淀部分一起沉積。因此，沉淀重新懸浮在Laemli溶解緩沖液中，該緩沖液含0.00625MTris-HCl(pH6.8)、0.2M2-ME、2.0％(w/v)SDS、0.025％(w/v)溴酚蘭和10％(v/v)甘油，并在8.0％(w/v)PAGE-SDS膠上進(jìn)行電泳，用考馬思亮蘭染色。采用電分離室(Schleicher&Schuell,Keene,NH)將對(duì)應(yīng)融合蛋白的大約70kDa的帶(26kDa的GST+44kDa的ZOT)從膠中電洗脫出來(lái)。
所得到的洗脫蛋白10μg(10-20μg)與等量的福氏完全佐劑混合，注入兔體內(nèi)。4周和8周后與福氏不完全佐劑一起給予兩次激發(fā)劑量。1月后給兔放血。
為確定特異抗體的產(chǎn)生，10-10MZOT與兩個(gè)融合蛋白MBP-ZOT和GST-ZOT一起轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并與1∶5000稀釋的兔抗血清一起在4℃孵育過(guò)夜，同時(shí)中度振蕩。然后用含有0.05％(v/v)吐溫20的PBS(以后稱(chēng)為“PBS-T”)沖洗濾膜15分鐘4次，并與1∶30,000的結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔IgG稀釋液室溫孵育2小時(shí)。用含有0.1％(v/v)吐溫的PBS再次沖洗濾膜15分鐘4次，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(Amersham)檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。
在免疫印跡上，發(fā)現(xiàn)兔抗血清識(shí)別ZOT，還有MBP-ZOT和GST-ZOT融合蛋白，但不識(shí)別MBP陰性對(duì)照。
此外，為了證實(shí)合適抗ZOT抗體的產(chǎn)生，在Ussing室中進(jìn)行了中和實(shí)驗(yàn)。當(dāng)與pZ14上清在37℃預(yù)孵育60分鐘時(shí)，ZOT特異抗血清(1∶100稀釋)能夠完全抵銷(xiāo)放置在Ussing室中的兔回腸上ZOT誘導(dǎo)的Rt下降。
其次，采用MBP-ZOT親和柱親和純化了抗ZOT抗體。更特殊的是，MBP-ZOT親和柱是通過(guò)將如上述實(shí)例1描述的方法獲得的1.0mg純化MBP-ZOT固定到一個(gè)預(yù)先活化的膠(Aminolink,Pierce)上，室溫過(guò)夜而制備的。該柱用PBS沖洗，然后載入2.0ml抗ZOT兔抗血清。室溫孵育90分鐘后，柱用14mlPBS沖洗，用4.0ml含有50mM甘氨酸(pH2.5)、150mM NaCl和0.1％(v/v)曲拉通X-100的溶液將特異性抗ZOT抗體從柱中洗脫出來(lái)。1.0ml洗脫餾分的pH立即用1.0N NaOH進(jìn)行中和。
實(shí)例3Zonulin的純化基于1997年2月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/803,364的觀察，ZOT與特異的上皮表面受體相互作用，隨后激活一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以調(diào)節(jié)tj通透性，在本發(fā)明中可以假定ZOT可以模仿哺乳動(dòng)物tj的生理性調(diào)節(jié)劑的效應(yīng)。在1997年5月21日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/859,931中推測(cè)，ZOT和其生理性類(lèi)似物(zonulin)在功能上和免疫學(xué)上可能是相關(guān)的。因此，如這里所描述的，親和純化的抗ZOT抗體和Ussing室實(shí)驗(yàn)可聯(lián)合用來(lái)探索在不同的兔和人組織中的zonulin。
A．兔組織最初，zonulin是從兔腸純化的。組織在PBS中勻漿破碎。得到的細(xì)胞標(biāo)本然后以40,000rpm離心30分鐘，收集上清并凍干。得到的凍干產(chǎn)物然后在PBS(10∶1(v/v))中重新溶解，通過(guò)一個(gè)0.45mm的濾膜過(guò)濾，裝入一個(gè)Sephadex G-50色譜柱上，并用PBS洗脫。然后從柱中獲得的2.0ml餾分采用如上實(shí)例2中所述獲得的親和純化的抗ZOT抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western免疫印跡。
陽(yáng)性餾分，也就是那些與抗ZOT抗體結(jié)合的，合在一起，凍干，在(1∶1(v/v))PBS中重新溶解，并通過(guò)一個(gè)Q-Sepharose柱進(jìn)行鹽梯度色譜層析。鹽梯度為50mM Tris緩沖液(pH 8.0)中的0-100％(w/v)NaCl。收集5個(gè)20ml餾分，采用如上實(shí)例2中所述獲得的親和純化的抗ZOT抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western免疫印跡。餾分1(20％(w/v)NaCl)是Western免疫印跡試驗(yàn)中唯一的陽(yáng)性餾分。
從Q-Sepharose柱中獲得的餾分然后在CaCo2單層和在Ussing室中的兔小腸上被檢測(cè)其組織阻力效應(yīng)。
更特殊的是，CaCo2細(xì)胞生長(zhǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Falcon)內(nèi)，在95％O2/5％CO2的濕化氣體中、在37℃的DMEM培養(yǎng)基里生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基中含有10％(v/v)胎牛血清、40μg/l青霉素和90μg/l鏈霉素。每5天，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80％匯合時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶處理后，細(xì)胞以表面比例1∶5進(jìn)行傳代。在本研究中使用的細(xì)胞代數(shù)為15到30。
CaCo2單層在組織培養(yǎng)處理的聚碳酸酯濾膜上生長(zhǎng)至匯合(在以1∶2.5的表面比例接種后12-14天)，該濾膜與一個(gè)聚苯乙烯環(huán)(6.4mm直徑，Transwell Costar)緊密貼附。將膜緊密地恰當(dāng)插入，使改良Ussing室的漿膜室和粘膜室得以分開(kāi)，實(shí)驗(yàn)按照Fasano等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,8:5242-5246(1991)描述的方法在Ussing室中的兔腸上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在圖1中顯示。
如圖1中顯示，含有Zonulin的餾分與Zonulin陰性餾分相比，引起CaCo2單層阻力的顯著下降。
下一步，Ussing室實(shí)驗(yàn)采用來(lái)自2-3kg的成年雄性新西蘭大白兔的回腸進(jìn)行，該兔采用頸部脫臼處死。取出一段20cm的回腸片斷，洗凈腸內(nèi)容物，沿腸系膜邊緣剖開(kāi)，剝除肌肉和漿膜層。8個(gè)這樣制備的粘膜片然后放置在有機(jī)玻璃的Ussing室中(1.12cm2開(kāi)放)，與一個(gè)電壓鉗裝置(EVC4000WPI,Saratosa,FL)相連，浸于新鮮配制的林格氏溶液中，該液含53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM甘露醇、1.69mMNa2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mMNaHCO3。浸液用一個(gè)與恒溫循環(huán)泵相連的水套蓄水池維持溫度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。
100μl從兔腸中純化的zonulin加入到粘膜側(cè)。每10分鐘測(cè)量電壓差(PD)，采用Fasano等前面的描述的方法計(jì)算短路電流(Isc)和組織阻力(Rt)。因?yàn)榻M織不同，數(shù)據(jù)以ΔRt(在時(shí)間X的Rt)-(在時(shí)間0的Rt)計(jì)算。結(jié)果在圖2中顯示。
如圖2所示，含有zonulin的餾分與zonulin陰性餾分相比，導(dǎo)致兔小腸阻力顯著降低。一旦將zonulin從蓄水池中去除，這種效應(yīng)完全逆轉(zhuǎn)。
Zonulin陽(yáng)性的餾分也進(jìn)行了8.0％(w/v)SDS-PAGE電泳，隨后采用抗ZOT抗體進(jìn)行Western免疫印跡。然后，經(jīng)SDS-PAGE分離的蛋白帶用CAPS緩沖液轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜(Millipore)上，該緩沖液含100ml(3-[環(huán)己胺]-1-丙烷磺酸)10x、100ml甲醇和800ml蒸餾水。通過(guò)Westem免疫印跡檢測(cè)到的排列于單一條帶的蛋白具有明顯的大約為47kDa的分子量。此條帶從PVDF濾膜上切下，根據(jù)Hunkapiller在蛋白質(zhì)微量定性方法，Shibley編輯，11-12章，Humana Press，第315-334頁(yè)(1985)中所述的方法，采用Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng)儀，型號(hào)494(Perkin-Elmer Applied Biosystems Apparatus Model 494)，進(jìn)行N-末端序列分析。從兔腸中純化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO:27中顯示。
兔zonulinN-末端序列通過(guò)BLAST搜索分析與其他蛋白序列相比較。這種分析的結(jié)果顯示兔zonulin的N-末端序列與人類(lèi)tau蛋白的N-末端序列85％等同，100％相似。
其結(jié)果，為了確定是否兔zonulin和tau是同樣物質(zhì)，在Ussing室中進(jìn)行了交叉中和實(shí)驗(yàn)。更特殊的是，10μl/ml兔zonulin加入到未處理或與抗tau抗體(1∶10稀釋)(Sigma)在37℃預(yù)孵育60分鐘的兔回腸的粘膜面。與抗ZOT抗體(1∶10稀釋)(實(shí)例2)預(yù)孵育的10μl/ml兔zonulin；和0.4μg/ml純化的tau(Sigma)均被用作對(duì)照。結(jié)果在圖3顯示。
如圖3中顯示，兔zonulin引起典型的組織阻力下降，而在將蛋白從Ussing室中去除時(shí)輕易地逆轉(zhuǎn)。這種活性被與抗ZOT抗體預(yù)處理完全中和，但不被與抗tau抗體預(yù)處理而中和。另一方面，組織暴露于tau蛋白的組織阻力無(wú)明顯效應(yīng)出現(xiàn)。
兔zonulin也在兔的其他不同組織中檢測(cè)到，即，兔心臟、腦、肌肉、胃、脾、肺、腎，和兔腸的不同部分，即，遠(yuǎn)端空腸、近端空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸。也就是說(shuō)，當(dāng)這些兔組織以與上述兔腸同樣的方式進(jìn)行處理，并在進(jìn)行8.0％(w/v)SDS-PAGE電泳后，采用如上面實(shí)例2所述獲得的親和純化的抗ZOT抗體進(jìn)行Western免疫印跡時(shí)，在所有被試驗(yàn)的組織中檢測(cè)到大小在近似47kDa的一個(gè)單一條帶。
B．人組織zonulin也從幾種人的組織中純化，包括腸、心臟和腦。胎兒和成人組織均被使用。組織通過(guò)在PBS中勻漿破壞。然后得到的細(xì)胞標(biāo)本在40,000rpm下離心30分鐘，收集上清并凍干。得到的凍干產(chǎn)物然后在PBS(10∶1(v/v))中重新溶解，通過(guò)一個(gè)0.45mm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾，裝入一個(gè)SephadexG-50色譜柱上，并用PBS洗脫。然后從柱中獲得的2.0ml餾分采用如上實(shí)例2中所述獲得的親和純化的抗ZOT抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western免疫印跡。
陽(yáng)性餾分，也就是那些與抗ZOT抗體結(jié)合的，合在一起，凍干，在(1∶1(v/v))PBS中重新溶解，并通過(guò)一個(gè)Q-Sepharose柱進(jìn)行鹽梯度色譜層析。鹽梯度為50mM Tris緩沖液(pH 7.4)中的0-100％(w/v)NaCl。收集5個(gè)20ml餾分，采用如上實(shí)例2中所述獲得的親和純化的抗ZOT抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Western免疫印跡。餾分1(20％(w/v)NaCl)在Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)中顯示為47kDa大小的單一條帶。餾分2(40％(w/v)NaCl)在Western免疫印跡實(shí)驗(yàn)中顯示有兩個(gè)35kDa和15kDa大小的附加條帶。餾分3(60％(w/v)NaCl)和餾分4(80％(w/v)NaCl)僅顯示為35kDa和15kDa條帶。這些結(jié)果表明zonulin可被可能存在于所用的人組織中的蛋白酶降解，降解的產(chǎn)物同完整蛋白相比，以較高的鹽濃度從柱中洗脫。
然后，從Q-Sepharose柱中獲得的餾分1(來(lái)自人心臟、腸和腦組織)和餾分4(來(lái)自心臟組織)，在Ussing室中的兔腸和恒河猴腸上檢測(cè)了它們的組織阻力效應(yīng)。
Ussing室實(shí)驗(yàn)采用不同的腸道進(jìn)行，包括來(lái)自2-3kg成年雄性新西蘭大白兔或5-6kg成年雄性恒河猴的空腸、回腸或結(jié)腸。在動(dòng)物處死后，取出腸的不同部分，包括空腸、回腸和結(jié)腸，洗凈腸內(nèi)容物，沿腸系膜邊緣剖開(kāi)，剝除肌肉和漿膜層。8個(gè)這樣制備的粘膜片(3個(gè)空腸、3個(gè)回腸和2個(gè)結(jié)腸)然后放置在有機(jī)玻璃的Ussing室中(1.12cm2開(kāi)放)，與一個(gè)電壓鉗裝置(EVC4000WPI,Saratosa,FL)相連，浸于新鮮配制的林格氏溶液中，該液含53mMNaCl、5.0mMKCl、30.5mM甘露醇、1.69mM Na2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mM NaHCO3。浸液用一個(gè)與恒溫循環(huán)泵相連的水套蓄水池維持溫度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。
100μl從人心臟純化的zonulin餾分1、或從人腦中純化的zonulin餾分1、或從人腸中純化的zonulin餾分1、或從人心臟純化的餾分4，加入到粘膜側(cè)。每10分鐘測(cè)量電壓差(PD)，采用Fasano等前面的描述的方法計(jì)算短路電流(Isc)和組織阻力(Rt)。以Rt計(jì)算的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4A和圖4B，但因?yàn)榻M織不同，數(shù)據(jù)如圖5A和圖5B所示以ΔRt(在時(shí)間X的Rt)-(在時(shí)間0的Rt)計(jì)算。結(jié)果在圖4A和4B(猴腸)及圖5A和圖5B(兔腸)中顯示。
如圖4A和圖4B顯示，從人心臟和腸純化的zonulin(餾分1)與PBS陰性對(duì)照相比，引起猴腸阻力(空腸(圖4A)和回腸(圖4B))的顯著降低。當(dāng)從人心臟或人腸中純化的zonulin在結(jié)腸中檢測(cè)時(shí)未觀察到顯著的變化。圖4A和圖4B也顯示了當(dāng)檢測(cè)從人腦中純化的zonulin(餾分1)時(shí)，未觀察到對(duì)猴空腸(圖4A)和猴回腸(圖4B)的顯著效應(yīng)。從人心臟純化的zonulin的餾分4也導(dǎo)致猴小腸組織阻力的顯著下降。
如圖5A和圖5B中顯示，當(dāng)使用兔腸時(shí)，獲得了相似的結(jié)果。即，從人心臟純化的zonulin(餾分1)顯示了對(duì)兔空腸(圖5A)和兔回腸(圖5B)組織阻力的顯著作用，而對(duì)結(jié)腸則沒(méi)有。圖5A和圖5B也顯示了當(dāng)對(duì)人腦中純化的zonulin(餾分1)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)兔空腸(圖5A)和兔回腸(圖5B)未觀察到明顯的效應(yīng)。
為確定zonulin是否可增加胰島素的口服輸送，采用兔腸進(jìn)行了的體外模型實(shí)驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，成年雄性新西蘭大白兔(2-3kg)頸部脫臼處死。取出兔小腸(空腸或回腸)的片斷，清洗腸內(nèi)容物，沿腸系膜邊緣剖開(kāi)，剝除肌肉和漿膜層。8個(gè)這樣制備的粘膜片然后放置在有機(jī)玻璃的Ussing室中(1.12cm2開(kāi)放)，與一個(gè)電壓鉗裝置(EVC 4000 WPI,Saratosa,FL)相連，浸于新鮮配制的林格氏溶液中，該液含53mM NaCl、5.0mM KCl、30.5mM甘露醇、1.69mM Na2HPO4、0.3mM NaH2PO4、1.25mM CaCl2、1.1mM MgCl2和25mM NaHCO3。浸液用一個(gè)與恒溫循環(huán)泵相連的水套蓄水池維持溫度在37℃，并充以95％O2/5％CO2。測(cè)量電壓差(PD)，計(jì)算短路電流(Isc)和組織阻力(Rt)。一旦組織達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的條件，按其阻力基數(shù)將組織配對(duì)，單獨(dú)或在100μl來(lái)自餾分1的心臟zonulin存在下，腔內(nèi)暴露于10-11M125I-胰島素(Amersham,Arlington Heights,IL；2.0μCi=10-12M)。立即從漿膜側(cè)獲取1.0ml試樣和從粘膜側(cè)獲取50μl試樣，以確定基線(xiàn)值。然后在隨后的100分鐘內(nèi)，以20分鐘的間隔收集漿膜側(cè)的樣品。
發(fā)現(xiàn)心臟zonulin以時(shí)間依賴(lài)的方式增加胰島素在空腸(未處理的對(duì)zonulin處理的組織分別是0.058±0.003fmol/cm2·min對(duì)0.12±0.005fmol/cm2·min,p=0.001)、和在回腸(未處理的對(duì)zonulin處理的組織分別是0.006±0.0002fmol/cm2·min對(duì)0.018±0.005fmol/cm2·min,p=0.05)的腸吸收。
從人心臟純化zonulin餾分1、從人腸中純化的zonulin餾分1和從人腦中純化的zonulin餾分1，也在進(jìn)行8.0％(w/v)SDS-PAGE電泳后，采用上述實(shí)例2所述獲得的抗ZOT抗體進(jìn)行Western免疫印跡。然后，經(jīng)SDS-PAGE分離的蛋白帶用CAPS緩沖液轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜(Millipore)上，該緩沖液含100ml(3-[環(huán)己胺]-1-丙烷磺酸)10x、100ml甲醇和800ml蒸餾水。通過(guò)Western免疫印跡檢測(cè)到的排列于單一條帶的蛋白具有明顯的大約為47kDa的分子量。此條帶從PVDF濾膜上切下，根據(jù)Hunkapiller在蛋白質(zhì)微量定性方法，Shibley編輯，11-12章，Humana Press,第315-334頁(yè)(1985)中所述的方法，采用Perkin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng)儀，型號(hào)494，進(jìn)行N-末端序列分析。從成人心臟中純化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO:28中顯示，從成人腦中純化的zonulin N-末端序列在SEQ ID NO:29中顯示，從胎兒腦中純化的zonulinN-末端序列在SEQ ID NO:36中顯示。
從成人腸(SEQ ID NO:31)中純化的zonulin的N-末端前9個(gè)氨基酸也被測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO:28顯示的、從人心臟中純化的zonulin的N-末端前9個(gè)氨基酸是等同的(見(jiàn)圖6)。從胎兒腸中純化的zonulin的N-末端序列的前20個(gè)氨基酸也被測(cè)序Met Leu Gln Lys Ala Glu SerGly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu(SEQ ID NO:30)，并發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO:28顯示的人心臟中純化的zonulin的氨基酸序列幾乎是等同的(見(jiàn)圖6)。
從成人腦和胎兒腦中純化的zonulin的N-末端序列(SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:36)與從每個(gè)心臟、胎兒腸和成人腸中純化的zonulin的N-末端序列(SEQID NO:28、SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31)完全不同(見(jiàn)圖6-7)。這種不同相信可以解釋zonulin在決定組織通透性中的組織特異性，如上面所舉例的腸。
從心臟、腸和腦中純化的人zonulin的N-末端序列都與從兔腸中純化的zonulin的N-末端序列不同(圖6)。為確定是否這些蛋白代表著tau相關(guān)的蛋白家族的不同亞型，從兔和人來(lái)源的組織在進(jìn)行8.0％(w/v)SDS-PAGE電泳后，采用抗ZOT抗體或抗tau抗體進(jìn)行Western免疫印跡。從兔和人組織(包括腦、腸、和心臟)純化的、被發(fā)現(xiàn)可被抗ZOT抗體識(shí)別的47kDa zonulin帶，也發(fā)現(xiàn)與抗tau抗體有交叉反應(yīng)。通過(guò)鹽層析獲得的從人腦純化的zonulin的不同餾分也采用抗ZOT抗體或抗tau抗體進(jìn)行了Western免疫印跡?？筞OT抗體可以識(shí)別完整的47kDa蛋白及35kDa和15kDa分解片斷，抗tau抗體則僅能識(shí)別完整的47kDa蛋白和35kDa片斷，而抗tau抗體不能識(shí)別15kDa片斷。為確定是否35kDa片斷包括zonulin的N-末端或C-末端，獲取了35kDa帶的N-末端，發(fā)現(xiàn)是Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly AspLeu(SEQ ID NO:32)。這個(gè)序列與完整的人腦zonulin(SEQ ID NO:29)的N-末端序列不同。這些結(jié)果表明15kDa片斷代表著zonulin的N-末端部分，而35kDa片斷代表著zonulin的C-末端部分。
綜合起來(lái)，這些結(jié)果表明被抗tau抗體識(shí)別的zonulin區(qū)朝向zonulin的C-末端，對(duì)于從人或兔組織來(lái)源的zonulin不同亞型是共同的(而N-末端部分可能不同)，可能參與蛋白的通透效應(yīng)(基于以下的觀察，tau與β-微管蛋白結(jié)合，隨后發(fā)生細(xì)胞骨架的重排；和餾分4對(duì)猴小腸組織阻力的效應(yīng))。
從心臟和腸中純化的人zonulin的N-末端序列通過(guò)B1AST搜索分析與其他蛋白序列進(jìn)行了比較。分析結(jié)果顯示，人zonulin的N-末端序列與人類(lèi)IgM重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO:37)的N-末端序列95％等同。
其結(jié)果，為了確定是否從心臟中純化的人zonulin和人IgM是同一物質(zhì)，對(duì)人zonulin進(jìn)行部分消化以獲得一個(gè)內(nèi)部片斷，然后將其測(cè)序。
更特殊的是，含有從人心臟中純化的zonulin的1.0mm PVDF濾膜放置于預(yù)先用0.1％(w/v)三氟乙酸(TFA)沖洗過(guò)的塑料管中，并用甲醇沖洗。加入含100mMTris(pH 8.2)、10％(v/v)CH3CN和1.0％(v/v)脫氫曲拉通X-100的緩沖溶液75μl，與膜在37℃孵育60分鐘。然后加入150ng胰蛋白酶，再在37℃孵育24小時(shí)。得到的溶液超聲處理10分鐘，輕輕移除上清。然后加入0.1％(w/v)TFA75μl，溶液再超聲處理10分鐘，并傾去上清。兩份試樣均裝載在5.0μm微粒大小、300孔徑的0.5mm×250mmC18柱上。在2小時(shí)15分鐘時(shí)間內(nèi)形成從0.1％(w/v)TFA到45％CH3CN水+0.1％(w/v)TFA的梯度。最后收集各峰并測(cè)序。
從成人心臟純化的人zonulin的內(nèi)部序列發(fā)現(xiàn)是Leu Ser Glu ValThr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly(SEQ ID NO:33)。
人zonulin的內(nèi)部序列通過(guò)BLAST搜索分析與其他蛋白序列進(jìn)行了比較。此分析的結(jié)果顯示人zonulin的內(nèi)部序列與人類(lèi)IgM重鏈可變區(qū)的任何內(nèi)部序列的等同性為0％。
上面實(shí)例3的結(jié)果表明(1)zonulin代表了細(xì)胞旁通路的生理性調(diào)節(jié)劑；(2)兔zonulin的N-末端序列與tau蛋白的N-末端序列高度同源；(3)zonulin和tau是兩個(gè)在免疫學(xué)上相關(guān)但功能上不同的截然不同物質(zhì)；(4)從人心臟和腸中獲得的人zonulin的N-末端序列與IgM重鏈可變區(qū)的N-末端序列高度同源；(5)人zonulin和IgM是兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上相關(guān)但功能上不同的截然不同的物質(zhì)；和(6)zonulin代表著一個(gè)具有共同的、活性C-末端序列和可變的N-末端序列的tau相關(guān)蛋白家族。
實(shí)例4zonulin的肽拮抗劑已知ZOT、人腸zonulin(zonulini)和人心臟zonulin(zonulinh)均作用于腸(Fasano等，Gastroenterology,112:839(1997)；Fasano等，J.Clin.Invest.,96:710(1995)；和圖1-5)和內(nèi)皮細(xì)胞tj，且三者均具有相似的、與ZOT受體在腸內(nèi)分布一致(Fasano等(1997)，見(jiàn)前；和Fasano等(1995)，見(jiàn)前)的區(qū)域效應(yīng)(Fasano等(1997)，見(jiàn)前；和圖1-5)，在本發(fā)明中推測(cè)，這三個(gè)分子與同樣的受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用。因此，對(duì)ZOT和人zonulin的基本氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，以了解參與腸tj調(diào)節(jié)的受體-配體相互作用所需要的絕對(duì)結(jié)構(gòu)。對(duì)這些分子N-末端序列的分析發(fā)現(xiàn)了下列共同的序列(框在圖7中的氨基酸殘基8-15)非極性(腸為Gly，腦為Val)、可變的、非極性、可變的、非極性、極性、可變的、極性(Gly)。Gly在位置8、Val在位置12和Gln在位置13，所有均在ZOT、zonulini和zonulinh中高度保守(見(jiàn)圖7)，相信對(duì)于在腸內(nèi)的受體結(jié)合功能是關(guān)鍵性的。為了證實(shí)這些，化學(xué)合成了合成的八肽Gly GlyVal Leu Val Gln Pro Gly(SEQ ID NO:15)(稱(chēng)為FZI/0，并對(duì)應(yīng)于人胎兒zonulini的氨基酸殘基8-15)。
下一步，兔回腸如上所述置于Ussing室中，單獨(dú)暴露于100μgFZI/0(SEQ ID NO:15)、100μg FZI/1(SEQ ID NO:34)、1.0μg6xHis-ZOT(如實(shí)例1所述獲得)、1.0μg zonulini(如實(shí)例3所述獲得)、或1.0μg zonulinh(如實(shí)例3所述獲得)；或預(yù)先暴露于100μgFZI/0或FZI/120分鐘，此時(shí)加入1.0μg 6xHis-ZOT、1.0μg zonulini、或1.0μg zonulinh。然后如上所述計(jì)算ΔRt。結(jié)果見(jiàn)圖8。
如圖8中顯示，F(xiàn)ZI/0不能誘導(dǎo)Rt的任何顯著性改變(與陰性對(duì)照相比0.5％)(見(jiàn)實(shí)心條)。相反，用FZI/0預(yù)先處理20分鐘分別減少了ZOT、zonulini、zonulinh對(duì)Rt效應(yīng)的75％、97％和100％(見(jiàn)空心條)。在圖8中也顯示，當(dāng)采用第二個(gè)合成肽(FZI/1)時(shí)，這種抑制效應(yīng)可被完全去除(見(jiàn)陰影條)，F(xiàn)ZI/1是通過(guò)改變?cè)谖恢?的Gly、位置12的Val和在位置13的Gln(指zonulini)并對(duì)應(yīng)于zonulinb的氨基酸殘基(分別是Val,Gly,和Arg)而化學(xué)合成的。
上述的結(jié)果證實(shí)在ZOT和zonulin家族的N-末端的殘基8和15之間有一個(gè)區(qū)域跨度，對(duì)與靶受體的結(jié)合是十分重要的，且在位置8、12和13的氨基酸殘基決定著這種結(jié)合的組織特異性。
盡管已詳細(xì)描述了本發(fā)明，并引用了它們特定實(shí)施例作為參考，但很明顯對(duì)于本領(lǐng)域的一個(gè)普通的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不背離其精神和范圍的情況下，各種改變和調(diào)整均是可行的。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)者FASANO,Alessio(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng)zonulin的肽拮抗劑及其使用方法(ⅲ)序列數(shù)目40(ⅳ)通訊地址(A)收信人SUGHRUE,MION,ZINN,MACPEAK&SEAS,PLLC(B)街道2100 Pennsylvania Avenue,N.W.,Suite 800(C)城市華盛頓州(D)州D.C.
(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編20037(Ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)目前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日1998年8月3日
(C)分類(lèi)(ⅷ)律師/代理人信息(A)名稱(chēng)KIT,Gordon(B)登記號(hào)30,764(C)參考/摘要號(hào)A-7242(ⅸ)電信信息(A)電話(huà)(202)293-7060(B)傳真(202)293-7869(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:
Gly Arg Val Cys Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
Gly Arg Val Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性
(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
Gly Arg Val Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
Gly Arg Val Leu Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:
Gly Arg Leu Cys Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:
Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
Gly Arg Leu Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:
Gly Arg Leu Leu Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:
Gly Arg Gly Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:
Gly Arg Gly Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:
Gly Arg Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:
Gly Arg Gly Leu Val Gln Asp Gly15(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:
Gly Gly Val Cys Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:
Gly Gly Val Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:
Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:
Gly Gly Val Leu Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:
Gly Gly Leu Cys Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:
Gly Gly Leu Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:
Gly Gly Leu Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:
Gly Gly Leu Leu Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:
Gly Gly Gly Cys Val Gln Pro Gly15(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:
Gly Gly Gly Cys Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly1 5(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:
Gly Gly Gly Leu Val Gln Asp Gly1 5(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)成股性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:
TCATCACGGC GCGCCAGG(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)成股性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:
GGAGGTCTAG AATCTGCCCG AT(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性
(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:
Asn Gln Arg Pro Pro Pro Ala Gly Val Thr Ala Tyr Asp Tyr Leu Val Ile Gln1 5 1015(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu15 10 15 20(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:Val Thr Phe Tyr Thr Asp Ala Val Ser1 5(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽
(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:
Met Leu Gln Lys Ala Glu Ser Gly Gly Val Leu Val Gln Pro Gly Xaa Ser Asn Arg Leu1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Xaa Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:
Xaa Xaa Asp Gly Thr Gly Lys Val Gly Asp Leu1510(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:
Leu Ser Glu Val Thr Ala Val Pro Ser Leu Asn Gly Gly15 10(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:
Val Gly Val Leu Gly Arg Pro Gly15(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度8個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:
Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly15(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:
Xaa Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Ile Gly Arg Leu Val Ile1 5 10 15 20(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu1 5 10 1520(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型肽(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:
Phe Cys Ile Gly Arg Leu Cys Val Gln Asp Gly Phe Val Thr15 10(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)成股性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)
(ⅳ)反義無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:
CGGGATCCCG TATGAGTATC TTT(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)成股性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線(xiàn)性(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅲ)假設(shè)無(wú)(ⅳ)反義無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:
CCCAAGCTTG GGTCAAAATA TACT
權(quán)利要求
1．zonulin的肽拮抗劑，包括選自下列序列組的氨基酸序列SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:24，和SEQ ID NO:35，其中所述的肽拮抗劑與一個(gè)閉鎖小帶毒素受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。
2．一種治療胃腸道炎癥的方法，該方法包括給予需要此種治療的患者藥學(xué)上有效劑量的zonulin的肽拮抗劑，其中所述的肽拮抗劑包括選自下列序列組的氨基酸序列SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20,SEQID NO:21,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23，和SEQ ID NO:24，其中所述的肽拮抗劑與所述患者腸中的閉鎖小帶毒素受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)該腸道中緊密連接的開(kāi)放。
3．一種治療伴有血腦屏障破壞的疾病狀態(tài)的方法，包括給予需要這種治療的患者藥學(xué)上有效劑量的zonulin的肽拮抗劑，其中所述的肽拮抗劑包括氨基酸序列SEQ ID NO:35，其中所述的肽拮抗劑與所述患者腦中的閉鎖小帶毒素受體結(jié)合，但并不在生理上調(diào)節(jié)該腦中緊密連接的開(kāi)放。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了zonulin的肽拮抗劑及其使用方法。肽拮抗劑與閉鎖小帶受體結(jié)合,但在生理上不調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物緊密連接的開(kāi)放。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1313772SQ99810031
公開(kāi)日2001年9月19日 申請(qǐng)日期1999年7月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月3日
發(fā)明者A·法薩諾 申請(qǐng)人:巴爾的摩馬里蘭大學(xué)