專利名稱：修飾的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽以及表達該肽與異源蛋白質(zhì)的融合蛋白的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽，編碼該肽的基因，包含融合在一起的該基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的載體，轉(zhuǎn)化了所述載體的微生物，以及利用該微生物制備所述異源蛋白質(zhì)的方法。
在胞內(nèi)方法中，編碼異源蛋白質(zhì)的基因在微生物的細胞質(zhì)內(nèi)表達和積累。雖然公知該方法能得到較高的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)量，但表達出來的異源蛋白質(zhì)不是天然活性形式而是氨基端甲硫氨酸化了的。此外，通過這種方法制備的沒有生物活性的異源蛋白質(zhì)經(jīng)常形成不溶的包涵體，必須將其溶解并經(jīng)過重折疊步驟轉(zhuǎn)化為天然的活性形式。
對于分泌法來說，編碼信號肽和異源蛋白質(zhì)的融合蛋白的基因在微生物的細胞質(zhì)內(nèi)表達，然后融合蛋白質(zhì)在跨過胞質(zhì)膜時被微生物的信號肽酶加工去掉信號肽。加工過的蛋白質(zhì)被分泌到微生物的細胞質(zhì)(內(nèi))膜和外膜之間的周質(zhì)空間。但是，已知該方法與胞內(nèi)方法相比，異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量低得多。因此，分泌法的產(chǎn)率需要提高。就此方法而言，已有報道說信號肽酶準(zhǔn)確和有效地切割被表達融合蛋白的信號肽基元在提高分泌異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量上非常重要(Akita,M.等，生物化學(xué)雜志265:8164(1990))。
一般來說，信號肽分為兩種，親水信號肽和疏水信號肽。親水信號肽通常由12到70個氨基酸組成。典型的疏水信號肽，例如大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽含有13到30個氨基酸，它包含3個區(qū)域含有1或2個堿性氨基酸的氨基端親水區(qū)；含有大約10個堿性氨基酸的中央疏水區(qū)；以及含有帶小側(cè)鏈的氨基酸的羧基端親水區(qū)。
由于以和信號肽形成融合蛋白的形式表達的異源蛋白質(zhì)經(jīng)常被胞質(zhì)蛋白酶迅速降解，當(dāng)信號肽的分泌效率低時，分泌出來的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量下降。因此，通過修飾宿主微生物中表達的融合蛋白質(zhì)的信號肽基元能增加分泌出來的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
人生長激素(hGH)包含191個氨基酸，分子量為21500Da。自從1956年首次從人垂體中分離到純化形式的hGH(Li和Papkoff，科學(xué)124:1293(1956))以來，對hGH已做了大量研究來闡述，例如hGH對人代謝的影響(Beck,J.C.等，科學(xué)125:884(1957))以及hGH對垂體小軀干的抑制活性(Raben,M.S.，臨床內(nèi)分泌學(xué)雜志18:901(1958))。最近，有報道說hGH對治療唐氏綜合癥、骨質(zhì)疏松癥、創(chuàng)傷和燒傷也有效。
由于從人垂體獲得的hGH量有限，有人試圖通過胞內(nèi)方法在基因工程化的大腸桿菌中產(chǎn)生大量hGH(Goeddel,D.V.等，自然281:544(1979))。但是，該方法也受到前面提到的產(chǎn)生不適合人用的甲硫氨酸化hGH問題的牽制。進一步嘗試利用二肽氨肽酶除去甲硫氨酸化hGH的甲硫氨酸導(dǎo)致hGH產(chǎn)量低得令人難以接受。
相應(yīng)地，也試過分泌生產(chǎn)天然hGH。例如，EP55942、20147和114695公開了表達天然形式的hGH并通過分泌回收它的方法。然而，由這些方法產(chǎn)生的可回收量的hGH仍然很低。
EP177343公開了一種制備hGH的方法，包括在有表達誘導(dǎo)物異丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的情況下，表達編碼hGH和堿性磷酸酶或者內(nèi)毒素信號肽的融合蛋白的基因，并將hGH分泌到周質(zhì)中。但是，該方法hGH產(chǎn)量低，并且需要使用昂貴的表達誘導(dǎo)物IPTG。
因此，需要建立一種高產(chǎn)hGH的有效方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該肽的基因。
本發(fā)明的再一目的是提供包含融合在一起的該基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的載體，本發(fā)明的再一目的是提供轉(zhuǎn)化了所述載體的微生物，本發(fā)明的再一目的是提供利用該微生物制備所述異源蛋白質(zhì)的方法。
與本發(fā)明的一個方面相對應(yīng)，此處提供了一種修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽(命名為MST)，其特征在于氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22個氨基酸中的至少一個被其他氨基酸取代，條件是MST第2和第4個氨基酸至少一個是賴氨酸Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser IleAla Thr Asn Ala Tyr Ala
發(fā)明詳述在本發(fā)明所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽(MST)中，優(yōu)選的是那些，其中第2個氨基酸Lys未被取代；第4個氨基酸Asn被Ser、Thr、Lys或Gln取代；第5個氨基酸Ile未被取代，或者被Thr或Ser取代；第12個氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；第20個氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及第22個氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
同樣優(yōu)選的是那些，其中第2個氨基酸Lys被任何其他氨基酸取代；第4個氨基酸Asn被Lys取代；第5個氨基酸Ile被Ser、Thr、Asn、Gln或Arg取代；第12個氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；第20個氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及第22個氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
更優(yōu)選的MST是那些有以下氨基酸取代情況的(a)第4個Thr取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(b)第4個Thr取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(c)第4個Lys取代Asn，第5個Thr取代Ile，第22個Gln取代Tyr；(d)第4個Ser取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(e)第4個Ser取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(f)第4個Thr取代Asn，第12個Gly取代Met，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(g)第4個Thr取代Asn，第12個Leu取代Met，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(h)第4個Lys取代Asn，第5個Ser取代Ile，第22個Gln取代Tyr；(i)第2個Val取代Lys，第4個Lys取代Asn，第5個Ser取代Ile，第22個Gln取代Tyr；以及(j)第4個Lys取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr。
本發(fā)明的MST可以由含有從MST氨基酸序列根據(jù)遺傳密碼子推導(dǎo)的核苷酸序列的基因編碼。由于密碼子簡并性，可能存在編碼相同氨基酸的不同密碼子，因此本發(fā)明的MST包括所有推導(dǎo)自MST氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選，所述MST基因可以包括1或多個大腸桿菌的偏愛密碼子。
可以利用定點突變(Papworth,C.等，策略9:3(1996))通過將天然大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽基因(命名為STⅡ基因)的1或多個核苷酸突變來制備MST基因?？梢岳贸Ｒ?guī)方法(Sambrook等，分子克隆實驗指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,USA(1989))來獲得大腸桿菌的STⅡ基因。此外，也可以化學(xué)合成MST基因。
本發(fā)明的MST當(dāng)與異源蛋白質(zhì)融合時能帶來該異源蛋白質(zhì)通過微生物(例如大腸桿菌)細胞膜的高效分泌。這樣，利用含有融合在一起的MST基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的表達載體，就能夠便利地在大腸桿菌的細胞質(zhì)中表達MST和異源蛋白質(zhì)的融合蛋白(稱為MST/異源蛋白)，并且融合蛋白能被有效地加工除去MST基元從而將異源蛋白質(zhì)迅速地釋放到大腸桿菌的周質(zhì)中。因此，利用本發(fā)明的MST將導(dǎo)致異源蛋白質(zhì)產(chǎn)率大幅提高。
MST基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的融合可以依照常規(guī)連接方法操作(Sambrook等，同前)。
代表性的異源蛋白質(zhì)包括人生長激素(hGH)、集落刺激因子(G-CSF)、干擾素、白介素、尿激酶原、胰島素、Ⅷ因子、水蛭素、超氧化物歧化酶和降鈣素，但它們并不限制可以用于本發(fā)明的異源蛋白質(zhì)。編碼異源蛋白質(zhì)的基因可以通過常規(guī)方法獲得，例如cDNA文庫篩選和PCR。
本發(fā)明的表達載體可以進一步包含如下核苷酸序列(SEQ ID NO:2)之修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素ⅡShine-Dalgano序列(修飾過的STⅡ SD序列)，該序列剛好插在MST基因的起始密碼子之前5’-GAGGTGTTTT-3’修飾過的STⅡ SD序列含有一個4核苷酸長的STⅡ SD序列(GAGG)和一個6核苷酸長的富T序列。修飾過的STⅡ SD序列中的STⅡ SD序列提供了一個非常強的核糖體結(jié)合位點，在沒有表達誘導(dǎo)物(例如異丙基硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))時它能增強表達水平。修飾過的STⅡSD序列中的富T序列起到防止由此轉(zhuǎn)錄出來的mRNA形成二級結(jié)構(gòu)的作用，從而增強表達效率。修飾過的STⅡ SD序列可以通過常規(guī)方法制備(Sambrook等，同前)，例如化學(xué)合成法。此外，可以對具有如下核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的SDⅡ SD基因進行定點突變來獲得修飾過的STⅡ SD序列5’-GCTCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGAAAAAGAATA-3’可以將修飾過的STⅡ SD序列插在MST基因的ATG起始密碼子前面，或者可以將MST基因的ATG起始密碼子前面的STⅡ SD序列進行修飾。
本發(fā)明的表達載體的例子包括在實施例1到10中制備的pT14S1SH-4T22Q、pT14S1SH-4T20V22Q、pT14S1SH-4KST22Q、pT14S1SH-4S22Q、pT14S1SH-4S20V22Q、pT14S1SH-4T12G20V22Q、pT14S1SH-4T12L20V22Q、pT14SSH-4K5S22Q、pT14SSH-2V4K5T22Q和pT14SSH-4K20V22Q，優(yōu)選的載體是pT14S1SH-4T22Q和pT14S1SH-4T20V22Q。
可以按照常規(guī)轉(zhuǎn)化方法(Sambrook等，同前)將本發(fā)明的表達載體導(dǎo)入微生物，例如大腸桿菌中。在轉(zhuǎn)化微生物中，優(yōu)選轉(zhuǎn)化子大腸桿菌HM10011和HM10012，它們已根據(jù)用于專利程序的國際承認的微生物保藏布達佩斯條約的規(guī)定，于1998年8月12日保藏在韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心(KCCM)(地址食品工程系，工學(xué)院，Yonsei University,Sodaemungu,Seoul120-749,Republic of Korea)，保藏號分別為KCCM-10137和KCCM-10138。
通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化微生物使它表達編碼MST/異源蛋白質(zhì)融合蛋白的基因并將異源蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)，以及從周質(zhì)中回收異源蛋白質(zhì)可以制備到異源蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)化微生物的培養(yǎng)可以按照常規(guī)方法(Sambrook等，同前)進行。可以將微生物培養(yǎng)物離心或過濾來收集分泌異源蛋白質(zhì)的微生物?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法(Ausubel,F.M.等，現(xiàn)代分子生物學(xué)指南，1989)將所述轉(zhuǎn)化微生物破碎來獲得周質(zhì)溶液。例如可以在低滲溶液(例如蒸餾水)中通過滲透壓沖擊來破碎微生物。周質(zhì)液中的異源蛋白質(zhì)的回收可以按照常規(guī)方法(Sambrook等，同前)操作，例如離子交換層析、凝膠過濾柱層析或者免疫柱層析。例如，可以通過DEAE-Separose柱層析、Phenyl Separose柱層析和Sephadex G-100柱層析等連續(xù)操作來純化hGH。
根據(jù)本發(fā)明制備的異源蛋白質(zhì)是天然形態(tài)的，氨基端沒有甲硫氨酸化，因此，可以直接用于各種用途。
以下實施例意在進一步闡述本發(fā)明，而非限制其范圍。預(yù)備實施例1篩選人生長激素cDNA基因(步驟1)構(gòu)建人垂體cDNA文庫向1g人垂體加入10ml胍溶液(4M異硫氰酸胍，50mM Tris-HCl,pH7.5,10mM EDTA，和5％2-巰基乙醇)并勻漿。勻漿物于6℃、10000rpm離心10分鐘。向上清液中加入1/10體積的2％乙醚肌氨酰(Sigma,USA),混合物于65℃保持2分鐘。所得溶液中加入氯化銫至終濃度0.1g/ml,將混合物在9ml墊層溶液(5.7M CsCl和0.1mM EDTA)上于25000rpm離心16小時以便得到RNA沉淀。沉淀物溶于3ml懸浮液(5mM EDTA,0.5％肌氨酰和5％巰基乙醇)中，然后相繼用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,v/v/v)體系和氯仿/異戊醇(24∶1,v/v/)抽提。向合并在一起的抽提液中加入1/10體積的3M醋酸鈉和2.5體積的乙醇，利用常規(guī)方法(Sambrook等，同前)離心混合物以便獲得RNA沉淀。將RNA沉淀溶于蒸餾水(D.W.)中，于70℃保持10分鐘。然后加入氯化鋰至濃度為0.5M，用寡dT-纖維素層析(Type3,Collaboratory Research,USA)按照Aviv和Leder的方法(Aviv,H和Leder P，分子生物學(xué)雜志134:743(1972))分離poly(A)+RNA。這樣獲得的poly(A)+RNA于65℃處理5分鐘，冷卻至0℃，立即加入20μl5mM dNTP、40μl5X緩沖液(0.25MTris-HCl,pH8.3,0.5M KCl和50mM MgCl2)、10μl 200mM DTT、20μl0.5mg/ml oligo(T12-18)(Pharmacia Inc.,Sweden)、80μl D.W.、10μl(10單位)RNAsin(Promega,USA)和20μl(20單位)AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Life ScienceInc.,USA)?；旌衔镉?2℃反應(yīng)90分鐘后，向反應(yīng)體系中加入5ul 0.5MEDTA(pH8.0)和200μl Tris緩沖的酚，混勻，并于室溫、10000rpm離心10分鐘。用二乙醚將上清液提取兩次，向合并在一起的提取液中混入20μl3M醋酸鈉和1ml 95％乙醇來沉淀單鏈cDNA(ss cDNA)。
為了由ss cDNA合成雙鏈cDNA(ds cDNA)，將ss cDNA沉淀溶于284μl D.W.中，加入40μl 5mM NTP、80μl 5X第二鏈(SS)緩沖液(250mM Tris-HCl(pH7.2)、450mM KCl、15mM二硫蘇糖醇、15mM MgCl2和0.25mg/ml牛血清清蛋白)、12μl 5mM β-NAD+、2μl 3000Ci/mmol[α-32P]dCTP、4μl(4單位)大腸桿菌DNA連接酶以及10μl(100單位)大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ?；旌衔镉?4℃反應(yīng)16小時后，反應(yīng)體系如上進行酚提取和乙醇沉淀來獲得ds cDNA沉淀。
為了產(chǎn)生ds cDNA的平末端，將ds cDNA沉淀溶于42μl D.W.中，隨后加入5μl NTP、16μl 5XSS緩沖液、1μl 5mM β-NAD+、4μlRNAase(2μg/ml,Biolabs,USA)、4μl(4單位)RNAase H、2μl(20單位)大腸桿菌DNA連接酶和4μl(8單位)T4 DNA連接酶，隨后使混合物于37℃反應(yīng)45分鐘。反應(yīng)完成后，反應(yīng)體系如上進行酚提取和乙醇沉淀以便獲得平末端的ds cDNA沉淀。
為了通過甲基化保護ds cDNA的EcoRⅠ限制位點，將平末端ds cDNA沉淀溶于25μl D.W.中，然后加入27μl 2X甲基化酶緩沖液(100mM NaCl、100mM Tris-HCl,pH8.0和1mM EDTA)、1μl 50X SAM溶液(1mg S-腺苷甲硫氨酸)和10μl(10單位)EcoRⅠ甲基化酶(Biolabs,USA)。混合物于37℃反應(yīng)2小時，反應(yīng)體系如上進行酚提取和乙醇沉淀。將沉淀的cDNA與EcoRⅠ接頭(Biolabs,USA)和T4 DNA連接酶混合，混合物于4℃反應(yīng)16小時以便獲得EcoRⅠ接頭連接的cDNA。
用EcoRⅠ處理所述EcoRⅠ接頭連接的cDNA，經(jīng)過Sepharose CL-4B柱層析來除去殘留的接頭。將EcoRⅠ接頭連接的cDNA插入λgt11(Amersham,USA)的EcoRⅠ位點。利用入體外包裹試劑盒(AmershamCo.,USA)將這樣得到的λgt11進行體外包裹，然后轉(zhuǎn)染大腸桿菌Y1088(ATCC37195)從而獲得人垂體cDNA文庫。
(步驟2)篩選人生長激素cDNA基因為了從步驟1制備的cDNA文庫中篩選出人生長激素克隆，如下進行噬斑雜交。
根據(jù)報道的人生長激素的氨基端氨基酸序列(Liu W.K.，等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報93:428(1964)；Li,C.H.等，美國化學(xué)學(xué)會雜志88:2050(1966))，設(shè)計并合成以下核苷酸序列代表的30核苷酸片段混合序列寡核苷酸探針Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg(SEQ ID NO:4)5’-TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGG-3’(SEQ ID NO:5)利用混合序列寡核苷酸探針，按照Benton等的方法(Benton,W.E.等，科學(xué)196:180(1977))進行初級噬斑雜交以便得到陽性克隆。對這些克隆進行次級和三級噬斑雜交從而獲得含有人生長激素cDNA基因的克隆。
為了證實該克隆含有人生長激素基因，用EcoRⅠ切割所克隆的噬菌體DNA，然后利用混合序列寡核苷酸探針對DNA片段做Southern印跡(Southern,E.，分子生物學(xué)雜志98:503(1975))。此外，將含有人生長激素基因的0.65kb EcoRⅠ片段插入M13mp18載體(Pharmacia,USA)的EcoRⅠ位點從而獲得載體M13-hGH。利用雙脫氧介導(dǎo)的鏈終止法(Sanger,F.等，美國科學(xué)院學(xué)報74:5463-5467(1977))確定載體M13-hGH中的人生長激素基因的核苷酸序列。預(yù)備實施例2制備編碼成熟人生長激素的基因為了制備編碼成熟人生長激素的cDNA基因，利用以下引物S1和AS1對在預(yù)備實施例1的步驟2中獲得的載體M13-hGH做PCR。設(shè)計有義引物S1來提供位于成熟人生長激素第1個氨基酸的密碼子上游的NdeⅠ限制位點(5’-CATATG-3’)，反義引物AS1提供終止密碼子下游的BamHⅠ限制位點(5’-GGATCC-3’)。
有義引物S1(SEQ ID NO:6)5’-CCGCATATGTTCCCAACCATTCCC-3’反義AS1(SEQ ID NO:7)5’-GCTGGATCCTAGAAGCCACAGCTGC-3’用NdeⅠ和BamHⅠ切割擴增好的人生長激素基因從而獲得編碼成熟人生長激素的基因(命名為hGH基因)。將hGH基因插入載體pET14b(Movagen,USA)來獲得載體pT-hGH。


圖1顯示了以上構(gòu)建載體pT-hGH的過程。預(yù)備實施例3構(gòu)建含有編碼大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽/hGH融合蛋白的基因的載體(步驟1)克隆大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽基因為了制備大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽基因，在大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽的核苷酸序列的基礎(chǔ)上設(shè)計下面一對互補寡核苷酸，并用DNA合成儀(380B型，Applied Biosystem,USA)合成。
有義鏈寡核苷酸STⅡ S1(SEQ ID NO:8)5’-TCATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTACGCGT-3’反義鏈寡核苷酸STⅡ AS1(SEQ ID NO:9)5’-ACGCGTAGGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAACATAGATGCAAGAAGAAATGCGATATTCTTTTTCATGA-3’將寡核苷酸設(shè)計成大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ的起始密碼子上游有NcoⅠ和BspHⅠ限制位點，另一端通過一個沉默突變引入MluⅠ限制位點。
將兩個寡核苷酸于95℃退火得到含有編碼大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽的核苷酸序列(STⅡ基因)的平末端ds DNA片段。
將所述STⅡ基因插入載體pUC19(Biolabs,USA)中的SmaⅠ位點以獲得載體pUC19ST。
(步驟2)制備編碼STⅡ/hGH融合蛋白的基因為了制備編碼STⅡ/hGH融合蛋白的基因，利用在預(yù)備實施例2中使用過的引物S2和AS1，將預(yù)備實施例2中得到的載體pT-hGH做PCR。將有義引物S2設(shè)計成成熟人生長激素第1個氨基酸(苯丙氨酸)的密碼子上游有MluⅠ限制位點(5’-CATATG-3’)。
有義引物S2(SEQ ID NO:10)5’-GCGACGCGTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3’用MluⅠ和BamHⅠ切割擴增好的DNA片段，然后插入步驟2中獲得的pUC19ST的MluⅠ/BamHⅠ部分。這樣獲得的載體pUC19SH含有編碼STⅡ/hGH融合蛋白的基因(命名為STⅡ/hGH基因)。
圖2描述了以上構(gòu)建載體pUC19ST和pUC19SH的過程。
(步驟3)向STⅡ/hGH基因添加大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ Shine-Dalgarno序列用BspHⅠ和BamHⅠ切割步驟2中獲得的載體pUC19SH從而得到一個640bp的STⅡ-hGH片段，將它插入載體pET14b(Novagen,USA)的NcoⅠ/BamHⅠ部分得到載體pT14SH。
利用引物S3和AS3將載體pT14SH做PCR。將有義引物S3設(shè)計成提供大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ Shine-Dalgarno序列(稱為STⅡ SD序列)和XbaⅠ限制位點，反義引物AS3提供位于成熟hGH終止密碼子下游的BamHⅠ從而得到含有STⅡ SD和STⅡ-hGH融合基因的DNA片段(STⅡ SD-STⅡ-hGH)。
有義引物S3(SEQ ID NO:11)5’-GCTCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATA-3’反義引物AS3(SEQ ID NO:12)5’-GGATGCCACGCTGGATCCTAGAAAGCCACAGCTGC-3’用XbaⅠ和BamHⅠ切割所述STⅡ SD-STⅡ-hGH片段，然后插入載體pET14b(Movagen,USA)的XbaⅠ/BamHⅠ部分得到載體pET14SSH。用載體pET14SSH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene,USA)得到轉(zhuǎn)化子命名為大腸桿菌HM10010。
圖3表示以上構(gòu)建載體pT14SSH的過程。預(yù)備實施例4用STⅡ-hGH基因生產(chǎn)hGH為了檢驗大腸桿菌內(nèi)毒素ⅡSD序列對產(chǎn)生hGH的影響，分別在有和沒有表達誘導(dǎo)物(IPTG)的情況下，將轉(zhuǎn)化了載體pET14SSH的大腸桿菌BL21(DE3)和同樣得自預(yù)備實施例3步驟3的大腸桿菌HM10010在LB培養(yǎng)基(1％bacto-蛋白胨，0.5％bacto-酵母提取物和1％NaCl)中于37℃培養(yǎng)24小時。每份培養(yǎng)物在10000rpm離心10分鐘以便沉淀細菌細胞，將沉淀懸浮在1/10體積等滲溶液(20％蔗糖，含有1mM EDTA的10mM Tris-Cl緩沖液，pH7.0)中。懸浮液在室溫下保持30分鐘，然后在10000rpm離心15分鐘以收集細菌細胞。將細胞于4℃重懸在D.W.中，在12000rpm離心20分鐘從而得到上清液，作為周質(zhì)液。利用抗hGH的抗體(Boehringer Mannheim)按照ELISA方法(Kato,K.等，免疫學(xué)雜志116:1554(1976))檢測周質(zhì)液中的hGH水平，計算每升培養(yǎng)物產(chǎn)生的hGH量。結(jié)果如表1所示。
表1
從表1可以看出，含有STⅡ SD序列的載體pT14SSH即使在沒有表達誘導(dǎo)物IPTG時也高產(chǎn)hGH。
實施例1到10實施例1到10描述了根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建含有編碼MST/hGH融合蛋白的基因的載體，其中MST代表修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽。按照定點突變(Papworth C.等，策略9:3(1996))將得自預(yù)備實施例3之步驟3的質(zhì)粒pT14SSH中的STⅡ基因或STⅡ SD序列進行修飾，這是通過利用一個帶有修飾過的核苷酸序列的有義引物和帶有與有義引物互補的核苷酸序列的反義引物做PCR進行的。
在實施例1到10中獲得的修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽MST(MST1到MST10)和STⅡ的特征見表2，以下描述實施例1到10的制備過程。
表Ⅱ
實施例1構(gòu)建含有編碼MST1/hGH融合蛋白的基因的載體(步驟1)利用以下互補引物S4和AS4將得自預(yù)備實施例3的載體pT14SSH做PCR，上述引物設(shè)計來以Thr密碼子(ACA)取代STⅡ的第4個密碼子(ATT)。
有義引物S4(SEQ ID NO:23)5’-GGTGTTTTATGAAAAAGACAATCGCATTTCTTC-3’反義引物AS4(SEQ ID NO:24)5’-GAAGAAATGCGATTGTCTTTTTCATAAAACACC-3’用XbaⅠ和MluⅠ切割這樣得到的載體從而獲得一個0.1kb的XbaⅠ/MluⅠ片段，將其插入載體pT14SSH的XbaⅠ/MluⅠ部分獲得載體pT14SSH-4T。載體pT14SSH-4T含有編碼修飾過的STⅡ/hGH融合蛋白的基因，所述蛋白STⅡ的第4個氨基酸被Thr代替。
(步驟2)
利用以下互補引物S5和AS5將載體pT14SSH-4T做PCR，上述引物設(shè)計來以Gln密碼子(CAA)取代STⅡ的第22個密碼子(AAT)從而獲得載體pT14SSH-4T22Q。
有義引物S5(SEQ ID NO:25)5’-CAAATGCCCAAGCGTTCCCA-3’反義引物AS5(SEQ ID NO:26)5’-TGGGAACGCTTGGGCATTTG-3’載體pT14SSH-4T22Q含有編碼MST1/hGH融合蛋白的基因，該蛋白中STⅡ的第4和22個氨基酸分別被Thr和Gln取代。
(步驟3)利用以下互補引物S6和AS6將載體pT14SSH-4T22Q做PCR，所述引物在STⅡ SD序列5’-GAGG-3’和STⅡ起始密碼子之間有如下所示的6核苷酸序列以便防止其mRNA轉(zhuǎn)錄物形成二級結(jié)構(gòu)。
有義引物S6(SEQ ID NO:27)5’-TCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGA-3’反義引物AS6(SEQ ID NO:28)5’-TCATAAAACACCTCAACCTCTAGA-3’這樣得到的載體pT14S1SH-4T22Q含有一個修飾過的STⅡ SD序列和編碼MST1/hGH融合蛋白的基因，該蛋白的STⅡ的第4和第22個氨基酸分別被Thr和Gln取代。
圖4顯示了以上構(gòu)建載體pT14S1SH的過程。
用載體pT14S1SH-4T22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得到一個轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10011，已于1998年8月12日保藏在韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心(KCCM)，保藏號KCCM-10137。實施例2構(gòu)建含有編碼MST2/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟2的過程，只是使用以下互補引物S7和AS7，所述引物設(shè)計來以Val和Gln密碼子(GTT和CAA)分別取代STⅡ的第20和22個密碼子(AAT和TAT)從而得到載體pT14SSH-4T20V22Q。
有義引物S7(SEQ ID NO:29)5，-GTTTTTTCTATTTGCTACAGTTGCCCAAGCGTTCCCAACCATTCCC-3’反義引物AS7(SEQ ID NO:30)5’-GGGAATGGTTGGGAACGCTTGGGCAACTGTAGCAATAGAAAAAAC-3’然后，重復(fù)實施例中步驟3的過程，只是利用載體pT14SSH-4T20V22Q得到載體pT14S1SH-4T20V22Q。載體pT14S1SH-4T20V22Q含有修飾過的STⅡ SD序列和一個編碼MST1/hGH融合蛋白的基因，該蛋白的STⅡ的第4、第20和第22個氨基酸分別被Thr、Val和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4T20V22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)得到一個轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10012，已于1998年8月12日保藏在韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心(KCCM)，保藏號KCCM-10138。實施例3構(gòu)建含有編碼MST3/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟1的過程，只是使用以下互補引物S8和AS8，所述引物設(shè)計來以Lys和Thr密碼子(AAG和ACA)分別取代STⅡ的第4和5個密碼子(AAT和ATC)從而得到載體pT14SSH-4K5T。
有義引物S8(SEQ ID NO:31)5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGACAGCATTTCTTC-3’反義引物AS8(SEQ ID NO:32)5’-GAAGAAATGCTGTCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’使用載體pT14SSH-4K5T，重復(fù)實施例1中步驟2的過程以便得到載體pT14SSH-4K5T22Q。
然后，用載體pT14SSH-4K5T22Q重復(fù)實施例1中步驟3的過程以便得到載體pT14S1SH-4K5T22Q。載體pT14S1SH-4K5T22Q含有修飾過的STⅡ SD序列和一個編碼MST3/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、5和22個氨基酸分別被Lys、Thr和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4K5T22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10013。實施例4構(gòu)建含有編碼MST4/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟1的過程，只是使用以下互補引物S9和AS9，所述引物設(shè)計來以Ser密碼子(TCT)取代STⅡ的第4個密碼子(AAT)從而得到載體pT14SSH-4S。
有義引物S9(SEQ ID NO:33)5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGTCTATCGCATTTCTTC-3’反義引物AS9(SEQ ID NO:34)5’-GAAGAAATGCGATAGACTTTTTCATAAAACACCTC-3’使用載體pT14SSH-4S，重復(fù)實施例1中步驟2的過程以便得到載體pT14SSH-4S22Q。
然后，用載體pT14SSH-4S22Q重復(fù)實施例1中步驟3的過程以便得到載體pT14S1SH-4S22Q。載體pT14S1SH-4S22Q含有修飾過的STⅡSD序列和一個編碼MST4/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4和22個氨基酸分別被Ser和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4S22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10014。實施例5構(gòu)建含有編碼MST5/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟2的過程，只是使用實施例4中得到的載體pT14SSH-4S和實施例2中使用的引物S7和AS7，從而得到載體pT14SSH-4S20V22Q。
然后使用載體pT14SSH-4S20V22Q，重復(fù)實施例1中步驟3的過程以便得到載體pT14S1SH-4S20V22Q。載體pT14S1SH-4S20V22Q含有修飾過的STⅡ SD序列和一個編碼MST5/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、20和22個氨基酸分別被Ser、Val和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4S20V22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10015。實施例6構(gòu)建含有編碼MST6/hGH融合蛋白的基因的載體用以下互補引物S10和AS10將實施例2中獲得的載體pT14SSH-4T20V22Q做PCR，所述引物設(shè)計來以Gly密碼子(GGT)取代STⅡ的第12個密碼子(ATG)從而獲得載體pT14SSH-4T12G20V22Q。
有義引物S10(SEQ ID NO:35)5’-GCATTTCTTCTTGCATCTGGTTTCGTTTTTTCTATTGC-3’反義引物AS10(SEQ ID NO:36)5’-GCAATAGAAAAAACGAAACCAGATGCAAGAAGAAATGC-3’然后使用載體pT14SSH-4T12G20V22Q重復(fù)實施例1中步驟3的過程以便得到載體pT14S1SH-4T12G20V22Q。載體pT14S1SH-4T12G20V22Q含有修飾過的STⅡ SD序列和一個編碼MST6/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、12、20和22個氨基酸分別被Thr、Gly、Val和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4T12G20V22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10016。實施例7構(gòu)建含有編碼MST7/hGH融合蛋白的基因的載體用以下互補引物S11和AS11將實施例6中獲得的載體pT14SSH-4T12G20V22Q做PCR，所述引物設(shè)計以Leu密碼子(CTT)取代STⅡ的第12個密碼子(GGT)從而獲得載體pT14SSH-4T12L20V22Q。
有義引物S11(SEQ ID NO:37)5’-GCATTTCTTCTTGCATCTCTTTTCGTTTTTTCTATTGC-3’反義引物AS11(SEQ ID NO:38)5’-GCAATAGAAAAAACGAAAAGAGATGCAAGAAGAAATGC-3’然后使用載體pT14SSH-4T12L20V22Q重復(fù)實施例1中步驟3的過程以便得到載體pT14S1SH-4T12L20V22Q。載體pT14S1SH-4T12L20V22Q含有修飾過的STⅡ SD序列和一個編碼MST7/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、12、20和22個氨基酸分別被Thr、Leu、Val和Gln取代。
用載體pT14S1SH-4T12L20V22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10017。實施例8構(gòu)建含有編碼MST8/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟1的過程，但使用以下互補引物S12和AS12，所述引物設(shè)計以Lys和Ser密碼子(AAG和TCT)取代STⅡ的第4和第5個密碼子(AAT和ATC)從而獲得載體pT14SSH-4K5S。
有義引物S12(SEQ ID NO:39)5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGTCTGCATTTCTTC-3’反義引物AS12(SEQ ID NO:40)5’-GAAGAAATGCAGACTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’使用載體pT14SSH-4K5S重復(fù)實施例1中步驟2的過程以便得到載體pT14SSH-4K5S22Q。載體pT14SSH-4K5S22Q含有編碼MST8/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、5和22個氨基酸分別被Lys、Ser和Gln取代。
用載體pT14SSH-4K5S22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10018。實施例9構(gòu)建含有編碼MST9/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟1的過程，但使用以下互補引物S13和AS13，所述引物設(shè)計以Val、Lys和Thr密碼子(GTT、AAG和ACA)取代STⅡ的第2、4和5個密碼子(AAA、AAT和ATC)從而獲得載體pT14SSH-2V4K5T。
有義引物S13(SEQ ID NO:41)5’-GAGGTGTTTTATGGTTAAGAAGACAGCATTTCTTC-3’反義引物AS13(SEQ ID NO:42)5’-GAAGAAATGCTGTCTTCTTAACCATAAAACACCTC-3’使用載體pT14SSH-2V4K5T重復(fù)實施例1中步驟2的過程以便得到載體pT14SSH-2V4K5T22Q。載體pT14SSH-2V4K5T22Q含有編碼MST9/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第2、4、5和22個氨基酸分別被Val、Lys、Thr和Gln取代。
用載體pT14SSH-2V4K5T22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10019。實施例10構(gòu)建含有編碼MST10/hGH融合蛋白的基因的載體重復(fù)實施例1中步驟1的過程，但使用以下互補引物S14和AS14，所述引物設(shè)計以Lys密碼子(AAG)取代STⅡ的第4個密碼子(AAT)從而獲得載體pT14SSH-4K。
有義引物S14(SEQ ID NO:43)5’-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGATCGCATTTCTTC-3’反義引物AS14(SEQ ID NO:44)5’-GAAGAAATGCGATCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3’使用載體pT14SSH-4K重復(fù)實施例1中步驟2的過程以便得到載體pT14SSH-4K22Q。用實施例2中使用的引物S7和AS7將載體pT14SSH-4K22Q做PCR從而獲得載體pT14SSH-4K20V22Q。載體pT14SSH-4K20V22Q含有編碼MST10/hGH融合蛋白的基因，其中STⅡ的第4、20和22個氨基酸分別被Lys、Val和Gln取代。
用載體pT14SSH-4K20V22Q轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)從而獲得轉(zhuǎn)化子，命名為大腸桿菌HM10020。實施例11利用MST/hGH基因制備hGH為了檢驗MST對hGH產(chǎn)量的影響，利用實施例1到10制備的轉(zhuǎn)化子(大腸桿菌HM10011到HM10020)，在不加IPTG的情況下重復(fù)預(yù)備實施例4的過程。在預(yù)備實施例3之步驟3中制備的轉(zhuǎn)化子HM10010作為對照。hGH水平計算為每升培養(yǎng)基中hGH的產(chǎn)量。結(jié)果如表Ⅲ所示。
表Ⅲ
從表Ⅲ可以看出，本發(fā)明的每個含有MST基因的載體hGH產(chǎn)量高于含有天然STⅡ的對照載體p14SSH。另外，在本發(fā)明的載體中，含有修飾過的STⅡ SD序列的載體與含有天然STⅡ SD序列的那些相比，hGH產(chǎn)量高。
將周質(zhì)液調(diào)節(jié)至pH5.3到6.0，吸附到預(yù)平衡至pH5.8的DEAE-Separose(Pharmacia Inc.,Sweden)柱子上，然后用10mM NaCl溶液洗柱子。利用分別含有20mM、40mM和80mM的NaCl緩沖液洗脫hGH,收集含有hGH的流分并合并。
合并的流分經(jīng)Phenyl Separose(Pharmacia Inc.,Sweden)柱層析獲得純度99％的hGH，經(jīng)Sephadex G-100(Pharmacia Inc.,Sweden)柱層析進一步純化。
純化的hGH流分經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)來確定純度和hGH的大致濃度，然后經(jīng)ELISA確定流分中的確切濃度。
圖5再現(xiàn)了SDS-PAGE的結(jié)果，其中1道顯示蛋白大小標(biāo)記蛋白質(zhì)；2道顯示純化的hGH。從圖5可以看出，通過培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子可以獲得高純度的hGH。
此外，確定了hGH的氨基端氨基酸序列，結(jié)果顯示按照本發(fā)明制備的hGH氨基端未被甲硫氨酸化。
參考以上具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，但應(yīng)當(dāng)認識到本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做出各種改進和變化，它們也落在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽，其特征在于氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22個氨基酸中的至少一個被其他氨基酸取代，條件是修飾后的肽第2和第4個氨基酸至少一個是賴氨酸Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser IleAla Thr Asn Ala Tyr Ala
2．權(quán)利要求l所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽，其中第2個氨基酸Lys未被取代；第4個氨基酸Asn被Ser、Thr、Lys或Gln取代；第5個氨基酸Ile未被取代，或者被Thr或Ser取代；第12個氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；第20個氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及第22個氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
3．權(quán)利要求1所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽，其中第2個氨基酸Lys被任何其他氨基酸取代；第4個氨基酸Asn被Lys取代；第5個氨基酸Ile被Ser、Thr、Asn、Gln或Arg取代；第12個氨基酸Met未被取代，或者被Ala、Gly、Val、Leu或Ile取代；第20個氨基酸Asn未被取代，或者被Ile、Phe、Ala或Val取代；以及第22個氨基酸Tyr未被取代，或者被Gln、Asn、Ala或Lys取代。
4．權(quán)利要求1所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽，其具有以下氨基酸取代情況(a)第4個Thr取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(b)第4個Thr取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(c)第4個Lys取代Asn，第5個Thr取代Ile，第22個Gln取代Tyr；(d)第4個Ser取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(e)第4個Ser取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(f)第4個Thr取代Asn，第12個Gly取代Met，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(g)第4個Thr取代Asn，第12個Leu取代Met，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr；(h)第4個Lys取代Asn，第5個Ser取代Ile，第22個Gln取代Tyr；(i)第2個Val取代Lys，第4個Lys取代Asn，第5個Thr取代Ile，第22個Gln取代Tyr；以及(k)第4個Lys取代Asn，第20個Val取代Asn，第22個Gln取代Tyr。
5．編碼權(quán)利要求1到4任何一項所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽的基因。
6．包含融合在一起的權(quán)利要求5所述基因和編碼異源蛋白質(zhì)的基因的表達載體。
7．權(quán)利要求6的表達載體，其中所述異源蛋白質(zhì)是人生長激素。
8．權(quán)利要求6的表達載體，它還包含具有如下核苷酸序列的一個修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ Shine-Dalgano序列，該序列緊接在權(quán)利要求5所述基因的起始密碼子前面5’-GAGGTGTTTT-3’
9．權(quán)利要求8的表達載體，它是pT14S1SH-4T22Q或者pT14S1SH-4T20V22Q。
10．轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6到9任何一項所述表達載體的微生物。
11．權(quán)利要求10的微生物，它是被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
12．權(quán)利要求11的微生物，其中所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌是大腸桿菌HM10011(KCCM-10137)或大腸桿菌MH10012(KCCM-10138)。
13．一種在微生物中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求10所述轉(zhuǎn)化微生物以便產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)并將其分泌至周質(zhì)；以及從周質(zhì)中純化該異源蛋白質(zhì)。
14．權(quán)利要求13的方法，其中所述轉(zhuǎn)化微生物是大腸桿菌HM10011(KCCM-10137)或大腸桿菌MH10012(KCCM-10138)。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所述異源蛋白質(zhì)是人生長激素。
全文摘要
一種如下制備的異源蛋白質(zhì)(ⅰ)培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化了表達載體的微生物以便產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)并分泌到周質(zhì)中，其中的表達載體包含編碼融合在一起的修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽和異源蛋白質(zhì)的基因，所述修飾過的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽是通過將氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)的大腸桿菌內(nèi)毒素Ⅱ信號肽中第2、第4、第5、第12、第20和第22個氨基酸中的至少一個用其他氨基酸取代獲得的，條件是修飾后的肽第2和第4個氨基酸至少一個是賴氨酸；(ⅱ)從周質(zhì)中純化所述異源蛋白質(zhì)。
文檔編號C07K14/245GK1318070SQ99810924
公開日2001年10月17日 申請日期1999年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月15日
發(fā)明者權(quán)世昌, 鄭圣燁, 申勛, 崔宰道, 崔基斗, 李寬淳 申請人:韓美藥品工業(yè)株式會社