專利名稱：表達以及分泌制管張素和endostatin的免疫融合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及制備和使用含有血管生成抑制劑的融合蛋白的方法和組合物。更具體地講，本發(fā)明涉及制備和使用含有免疫球蛋白Fc區(qū)和血管生成抑制劑的稱為免疫融合物(immunofusin)的融合蛋白的方法和組合物。
背景技術(shù)：
人們發(fā)現(xiàn)兩種有效血管生成抑制劑制管張素(O’Reilly等(1994)Cell 79315)和endostatin(O’Reilly等(1997)Cell 88277)由原發(fā)性腫瘤天然產(chǎn)生。這兩種蛋白是內(nèi)皮細胞增生的特異性抑制劑并通過阻斷血管生成(阻斷供給腫瘤營養(yǎng)的新血管的形成)而抑制腫瘤生長。研究表明，這些血管生成抑制劑甚至在非常高劑量下都是無毒的，它們可以抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長并可以使原發(fā)性腫瘤退化到顯微休眠狀態(tài)。已鑒定出這兩種抑制劑是非常大的完整分子的蛋白酶解片段。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)制管張素是纖溶酶原的一個片段，而endostatin是膠原蛋白XVIII的一個片段。
在癌癥領(lǐng)域人們已非常關(guān)注這兩種蛋白，因為已經(jīng)證實它們抑制小鼠中的許多不同類型腫瘤的生長，而沒有明顯的副作用或抗藥性。傳統(tǒng)的化學(xué)治療通常導(dǎo)致主要由癌細胞遺傳不穩(wěn)定性引起的獲得性抗藥性。使用血管生成抑制劑的治療不是把癌細胞作為目標(biāo)而是針對支持腫瘤生長的正常內(nèi)皮細胞。因為內(nèi)皮細胞在遺傳上是穩(wěn)定的，所以血管生成抑制劑治療可減少抗藥性。這些研究表明，采用endostatin的延長的抗血管生成治療的小鼠不發(fā)生抗藥性。因此，對小鼠周期性重復(fù)的endostatin治療延長腫瘤休眠期以及停止治療后腫瘤不復(fù)發(fā)(Boehm等(1997)Nature 390404)。
盡管用小鼠獲得有希望的結(jié)果，但是仍然不能用大腸桿菌、桿狀病毒、酵母和哺乳動物表達系統(tǒng)大批量生產(chǎn)臨床級可溶的、有活性的制管張素和endostatin。用大腸桿菌表達獲得不確定組合物的不溶性蛋白聚集物，不能將這種蛋白注射到人體內(nèi)。其它生產(chǎn)方法諸如桿狀病毒和哺乳動物表達系統(tǒng)得到非常低水平的重組蛋白(O’Reilly等(1997)Cell 88277)。
迄今可以將該低得率表達系統(tǒng)解釋為制管張素和endostatin這兩種是非常大的蛋白內(nèi)部片段。在缺乏從前體分子中切割的殘基時，該截短蛋白可能沒有進行合適的折疊。例如，制管張素有26個形成大量二硫鍵的半胱氨酸殘基。在分泌途徑中，制管張素自身的表達不能提供最適環(huán)境以正確地形成這些大量的二硫鍵。此外，以大腸桿菌生產(chǎn)的重組endostatin蛋白在透析期間沉淀，可能是由于endostatin的疏水性引起(O’Reilly等(1997)Cell 88277)。
以其現(xiàn)存形式使用制管張素和endostatin主要障礙是不得不將相對大量的蛋白每天注射，持續(xù)數(shù)星期至數(shù)月以達到所需的臨床效果。例如，目前在小鼠模型中，需要劑量20mg/kg/天的endostatin以證實最佳藥效(Boehm等(1997)Nature 390404)。已知急需在臨床上試驗endostatin和制管張素，重要是的得到可以產(chǎn)生大量臨床級物質(zhì)的生產(chǎn)方法。
在哺乳動物細胞中，已經(jīng)用來生產(chǎn)高水平表達融合蛋白的一種表達系統(tǒng)是編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白的DNA構(gòu)成物。這種構(gòu)成物的融合產(chǎn)物統(tǒng)稱為“免疫融合物”。已經(jīng)將幾種靶蛋白成功地表達為免疫融合物，它們包括IL2、CD26、Tat、Rev、OSF-2、βIG-H3、IgE受體、PSMA和gp120。這些表達構(gòu)成物公開于美國專利第5,541,087號和美國專利第5,726,044號，其公開內(nèi)容均通過引用結(jié)合到本文中。
在哺乳動物細胞中，表達重組融合蛋白的主要目的一直是試圖對所述雜種分子賦予新的或有用的特性，例如合適的折疊、增加溶解度、體內(nèi)引導(dǎo)細胞因子或毒素、Fc受體結(jié)合、補體活化、A蛋白結(jié)合、延長循環(huán)半壽期和增加穿過血-腦屏障的能力。在哺乳動物細胞中所產(chǎn)生的重組融合蛋白的實例包括細胞因子免疫綴合物(Gillies等(1992)Proc.Natl Acad Sci USA 891428；Gillies等(1993)Bioconjugate Chemistry 4230)、免疫粘附素(Capon等(1989)Nature337525)、免疫毒素(Chaudhary等(1989)Nature 339394)和神經(jīng)生長因子綴合物(Friden等(1993)Science 259373)。上述每個出版物都通引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的一個目的是提供有利于在各種哺乳動物宿主細胞中有效地生產(chǎn)和分泌血管生成抑制劑的新的DNA。本發(fā)明的另一個目的是提供治療哺乳動物的方法，該治療方法采用編碼血管生成抑制劑蛋白的核酸或氨基酸序列明確的血管生成抑制劑蛋白，包括非天然的、生物合成或其它人工蛋白諸如合理設(shè)計產(chǎn)生的蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明的特征是用于制備和使用含有血管生成抑制劑蛋白的融合蛋白的方法和組合物。所述融合蛋白可以促進高水平表達有生物活性的血管生成抑制劑蛋白。然后在給予哺乳動物(例如人)之前，可以將血管生成抑制劑蛋白從所述融合蛋白中切下并將其與藥學(xué)上可接受的載體組合。或者，可以將編碼含有血管生成抑制劑的融合蛋白的核酸序列或氨基酸序列明確的含有血管生成抑制劑的融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體組合，然后給予所述哺乳動物。
在一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明融合蛋白的核酸分子，例如DNA或RNA分子。所述核酸分子編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和至少一種靶蛋白，本文也稱為血管生成抑制劑蛋白，所述蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子從5’到3’方向依次編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子從5’到3’方向順序地編碼信號序列、靶序列和免疫球蛋白Fc區(qū)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)包括免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，而最好是包括至少一個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，例如免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第2(CH2)結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第3(CH3)結(jié)構(gòu)域并且根據(jù)用來產(chǎn)生Fc區(qū)的免疫球蛋白的類型，任選包括免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)第4(CH4)結(jié)構(gòu)域。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述免疫球蛋白Fc區(qū)包括絞鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。在某些情況下，所述免疫球蛋白Fc區(qū)最好是缺乏至少CH1結(jié)構(gòu)域。盡管所述免疫球蛋白Fc區(qū)可以基于任何免疫球蛋白種類，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，但是優(yōu)選為基于IgG的免疫球蛋白Fc區(qū)。
在另一個實施方案中，可以有效地結(jié)合將本發(fā)明的核酸摻入到復(fù)制型表達載體中，然后可以將其轉(zhuǎn)染到哺乳動物宿主細胞中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的這種核酸序列的宿主細胞。
在另一方面，本發(fā)明提供包含或者直接通過多肽鍵或者用多肽接頭的方式，與靶蛋白連接的免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白，所述靶蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物?？梢詫⑺霭械鞍淄ㄟ^其C-末端融合到免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端。然而，在一個更優(yōu)選的實施方案中，將所述靶蛋白通過其N-末端融合到免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端，在另一個實施方案中，所述融合蛋白可以包含選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段的第二靶蛋白。在這種類型的構(gòu)成物中，第一和第二靶蛋白可以是相同或不相同的蛋白。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述融合蛋白包含第一靶蛋白制管張素、免疫球蛋白Fc區(qū)和第二靶蛋白endostatin?？梢詫⒌谝缓偷诙械鞍谆蛘咧苯拥鼗蛘哂枚嚯慕宇^的方連接在一起。另一方面，可以將這兩種靶蛋白或者直接地或者通過多肽接頭連接到所述免疫球蛋白Fc區(qū)。在后一種情況下，將第一靶蛋白連接到免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端，而將第二靶蛋白連接到免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端。
在另一個實施方案中，兩種融合蛋白可以或者通過共價鍵(例如二硫鍵或肽鍵)或者通過非共價鍵結(jié)合產(chǎn)生多聚體蛋白。在一個優(yōu)選的實施方案中，將兩種融合蛋白通過半胱氨酸殘基(最好是位于排列在這兩條鏈的免疫球蛋白Fc區(qū)內(nèi)的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)內(nèi))的一個或多個二硫鍵共價結(jié)合。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白包含分子量約40kD的纖溶酶原片段，并任選地包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶蛋白包含具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的膠原蛋白XVIII片段。此外，所述靶蛋白可以是全長制管張素或endostatin或它們的生物活性片段。在制備某些融合蛋白中所述靶蛋白的來源將取決于所述靶蛋白預(yù)期的用途。例如，如果是將所述靶蛋白給予人，則所述靶蛋白最好是人源靶蛋白。
在另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)包含免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白的融合蛋白的方法，所述靶蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。所述方法包括步驟(a)提供含有編碼這種融合蛋白的DNA分子(或者有或者沒有信號序列)的哺乳動物細胞和(b)培養(yǎng)所述哺乳動物細胞以生產(chǎn)所述融合蛋白。然后可以將所生產(chǎn)的融合蛋白收集、重折疊，必要時，采用眾所周知的常規(guī)純化技術(shù)純化，然后在本領(lǐng)域中使用。假設(shè)所述融合蛋白包含在免疫球蛋白Fc區(qū)和所述靶蛋白之間排列的蛋白水解酶切割位點，則可以采用常規(guī)蛋白水解酶將所述靶蛋白從所述融合蛋白中切除，并且必要時，在使用之前純化。
在另一方面，本發(fā)明提供治療需要血管生成抑制劑基本治療的哺乳動物(例如人)的方法。例如，設(shè)想可以將本發(fā)明的血管生成抑制劑給予腫瘤患者。用血管生成抑制劑治療可以使腫瘤生長減慢或停止，并在某些情況下，可以引起腫瘤消退。治療可以包括給予所述哺乳動物足量的血管生成抑制劑以使腫瘤生長減慢或停止?？梢砸匀诤系鞍椎男问交蚝怂帷⒆詈檬桥c表達載體有效結(jié)合核酸與藥學(xué)上可接受的載體組合，提供所述血管生成抑制劑。
從以下詳細描述、附圖和權(quán)利要求書中，本發(fā)明的前面所述和其它目的、特點和優(yōu)點將更加顯而易見。
附圖簡述

圖1A-1F是按照本發(fā)明構(gòu)建的典型血管生成抑制劑融合蛋白的示意圖(參見實施例10-15)。所述圖分別描述了，圖1A，制管張素的Fc-Kringle 1；圖1B，制管張素的Fc-內(nèi)部Kringle 1；圖1C，制管張素的Fc-Endostatin-GlySer接頭-內(nèi)部Kringle 1；圖1D，制管張素的Fc-Endostatin-GlySer接頭-Kringle 1；圖1 E，F(xiàn)c-Endostatin-GlySer接頭-制管張素；圖1F，制管張素-Fc-Endostatin。垂直線代表連接排列在所述Fc分子絞鏈區(qū)內(nèi)的連接半胱氨酸殘基(C)任選的二硫鍵。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供融合蛋白，本文是指免疫融合物，所述融合蛋白可用于大批量生產(chǎn)臨床級血管生成抑制劑。在使用之前，可以將所述血管生成抑制劑從免疫融合物蛋白構(gòu)成物中切下。然而，設(shè)想可以將所述免疫融合物或編碼所述免疫融合物的核酸直接給予需要用血管生成抑制劑治療的哺乳動物。
因此，本發(fā)明提供包含免疫球蛋白Fc區(qū)和至少一種靶蛋白的融合蛋白，靶蛋白在本文是指血管生成抑制劑。血管生成抑制劑最好是選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。然而，設(shè)想可以將具有血管生成抑制劑活性的其它多肽(目前已知的或以后發(fā)現(xiàn)的)表達成為本文所述類型的融合蛋白。
在如圖1A-1F的附圖中，說明了體現(xiàn)本發(fā)明蛋白構(gòu)成物的6個典型的實施方案。因為優(yōu)選為二聚體構(gòu)成物，所以用通過半胱氨酸在相鄰的亞基之間的一對二硫鍵交聯(lián)的二聚體進行所有說明。在所述附圖中，圖示二硫鍵通過免疫球蛋白鉸鏈區(qū)將兩個免疫球蛋白Fc部分連接在一起，因此具有這些分子的天然形式的特征。當(dāng)優(yōu)選包括Fc鉸鏈區(qū)的構(gòu)成物并且該構(gòu)成物已經(jīng)顯示有希望作為治療劑的同時，本發(fā)明設(shè)想可以根據(jù)需要選擇在其它位置上進行交聯(lián)。此外，在某些情況下，用于實施本發(fā)明的二聚體和多聚體可以由非共價結(jié)合而產(chǎn)生，例如，疏水性相互作用。
因為同源二聚體構(gòu)成物是本發(fā)明重要的實施方案，所以圖1說明了這樣的構(gòu)成物。應(yīng)當(dāng)認為異源二聚體結(jié)構(gòu)也是有用的，但正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，通常難以將它們純化。然而，可以構(gòu)建用于在包括人類在內(nèi)的各種哺乳動物物種中對抑制血管生成有活性的構(gòu)成物，包括同源二聚體和異源二聚體的混合物。例如，所述異源二聚體結(jié)構(gòu)的一條鏈可以包含endostatin，而另一條鏈則可以包含制管張素。
圖1A說明按照實施例10中所述方法生產(chǎn)的二聚體構(gòu)成物。所述二聚體的每個單體包含包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc區(qū)1。直接與Fc區(qū)I的C端連接的是制管張素2的第一Kringle區(qū)，內(nèi)環(huán)和外環(huán)兩種。圖1B顯示包含如圖1A中的相同F(xiàn)c區(qū)的本發(fā)明的第二個實施方案(參見實施例11)，這時僅具有與Fc區(qū)1的C末端連接的制管張素3的Kringle 1的內(nèi)環(huán)。從圖1C到1E描述了本發(fā)明所述蛋白構(gòu)成物的各種實施方案，所述蛋白構(gòu)成物包括作為靶蛋白的串聯(lián)排列和接頭連接的多種血管生成抑制劑。圖1C中，所述靶蛋白包含全長endostatin 4、多肽接頭5和制管張素3的Kringle1的內(nèi)環(huán)。圖1D圖示蛋白包含如圖1A相同的Fc區(qū)以及包含全長endostatin 4、多肽接頭5和全部Kringle 1區(qū)的制管張素(內(nèi)環(huán)和外環(huán)兩種)2的靶蛋白。因為最大C端蛋白結(jié)構(gòu)域包含全長拷貝制管張素7中，所以圖1E與圖1D的構(gòu)成物不同。
盡管圖1A-1E表示Fc-X型構(gòu)成物，其中X為所述靶蛋白，但是設(shè)想X-Fc型構(gòu)成物也可用于實施本發(fā)明。此外，設(shè)想本發(fā)明有用的蛋白也可用公式X-Fc-X表示，其中X代表相同或不相同的靶蛋白。圖1F描述了這樣的一種構(gòu)成物，所述構(gòu)成物包含N-至C-端方向的全長人制管張素7、包括鉸鏈區(qū)的人免疫球蛋白Fc區(qū)6和全長人endostatin結(jié)構(gòu)域4。
本文所用的術(shù)語“血管生成抑制劑”是指減少或抑制哺乳動物中的新血管形成的任何多肽鏈。關(guān)于癌癥治療，所述血管生成抑制劑減少或抑制腫瘤內(nèi)或表面、最好是在實體瘤的里面或表面的新血管形成。設(shè)想采用眾所周知的多種常用方法可以鑒定有用的血管生成抑制劑。這樣的方法包括，例如牛毛細血管內(nèi)皮細胞增生測定、雞尿囊絨膜(CAM)測定或小鼠角膜測定。然而，優(yōu)選為CAM測定(參見，例如O’Reilly等(1994)Cell 79315-328和O’Reilly等(1997)Cell 88277-285，其公開內(nèi)容均通過引用結(jié)合到本文中)。概括地講，從受精三天卵白中取出具有完整卵黃的胚胎，然后置于培養(yǎng)皿中。于37℃、3％CO2溫育三天后，將各個胚胎尿囊絨膜置于含有推定的血管生成抑制劑的甲基纖維素板中。在溫育約48小時之后，于顯微鏡下觀察所述尿囊絨膜以提供抑制區(qū)的證據(jù)。
用于實施本發(fā)明優(yōu)選的血管生成抑制劑包括，例如制管張素(O’Reilly等(1994)Cell 79315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5，885,795號)和endostatin(O’Reilly等(1997)Cell 88277-285和美國專利第5,854,205號)。如前所述，制管張素和endostatin是內(nèi)皮細胞增生的特異性抑制劑并能夠通過阻斷血管生成而抑制腫瘤生長，即阻斷供給腫瘤營養(yǎng)的新血管的形成。
已經(jīng)鑒定制管張素為纖溶酶原的蛋白酶解片段(O’Reilly等(1994)Cell 79315-328和美國專利第5,733,876、5,837,682和5,885,795號，這些公開內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中)。具體地講，制管張素是含有至少三個纖溶酶原Kringle區(qū)的纖溶酶原的38 kDa內(nèi)部片段。已經(jīng)鑒定endostatin為膠原蛋白XVIII的蛋白酶解片段(O’Reilly等(1997)Cell 88277-285，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。具體地講，endostatin是膠原蛋白XVIII的20 kDa C-末端片段。本文所用的術(shù)語“制管張素”和“endostatin”不僅是指全長蛋白，而且還分別指其變異體和生物活性片段，以及纖溶酶原和膠原蛋白XVIII的生物活性片段。術(shù)語生物活性片段，就制管張素而論是指纖溶酶原或制管張素的任何蛋白片段，根據(jù)CAM測定所述片段至少具有全長制管張素活性的30％，更優(yōu)選至少70％和最優(yōu)選至少90％。術(shù)語生物活性片段，就endostatin而論是指膠原蛋白XVIII或endostatin的任何蛋白片段，根據(jù)CAM測定所述片段至少具有全長endostatin活性的30％，更優(yōu)選至少70％和最優(yōu)選至少90％。
術(shù)語變異體包括特定變異體和等位變異體，以及其它天然產(chǎn)生或非天然產(chǎn)生的變異體，例如由常規(guī)基因工程方法產(chǎn)生的變異體，它們或者與本文公開的endostatin天然產(chǎn)生的序列或者與本文公開的制管張素天然產(chǎn)生序列至少70％相似或60％相同，更優(yōu)選至少75％相似或65％相同和最優(yōu)選的80％相似和70％相同。
為了確定候選多肽是否與參比多肽具有必不可少的相似性或同一性的百分率，首先將候選氨基酸序列和參比氨基酸序列對比，所述序列對比采用Smith和Waterman(1981)，J.Mol.Biol.147195-197中所描述的的動態(tài)編程算法(dynamic programming algorithm)和Henikoff和Henikoff(l992)“蛋白質(zhì)組件的氨基酸取代矩陣”，Proc.NatlAcad Sci.USA 8910915-10919的圖2中所描述的BLOSUM62取代矩陣。對于本發(fā)明，缺口插入補償參數(shù)(gap insertion penalty)的合適值為-12，而缺口延伸補償參數(shù)(gap extension penalty)的合適值為-4。采用Smith-Waterman算法和BLOSUM62矩陣諸如GCG程序組(Oxford Molecular Group，Oxford，英國)進行序列對比的計算機程序是市場上可得到的并被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛使用。
一旦在候選序列和參比序列之間進行了序列對比，就可以計算出相似性的百分數(shù)。將每條序列的各個氨基酸按照它們與其它氨基酸的相似性依次比較。如果相對于兩個對比的氨基酸的BLOSUM62矩陣值為零或負數(shù)，則相似性的配對數(shù)為0；否則相似性的配對數(shù)為1.0。相似性的原始數(shù)是序列對比的氨基酸相似性的配對數(shù)的總和。然后用較小候選序列或參比序列的氨基酸數(shù)除原始數(shù)，將原始數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。所述標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)為相似性的百分率。或者，為了計算同一性的百分率，將每條序列的對比氨基酸依次進行比較。如果所述氨基酸為不相同，同一性配對數(shù)為0；否則同一性配對數(shù)為1.0。原始同一性的配對數(shù)為序列對比的相同氨基酸的總和。然后用較小候選序列或參比序列中的氨基酸數(shù)除原始數(shù)，將原始數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。所述標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)為同一性的百分率。為了計算相似性和同一性的百分率，將插入和缺失忽略不計。因此，盡管在原始序列對比中使用缺口補償參數(shù)，但它們不用于本計算。
將本文所公開的靶蛋白表達作為具有免疫球蛋白Fc區(qū)的融合蛋白。已知每個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)由4或5個結(jié)構(gòu)域組成。所述結(jié)構(gòu)域依次命名如下CH1-鉸合部-CH2-CH3(-CH4)。所述重鏈結(jié)構(gòu)域的DNA序列在免疫球蛋白種類之間存在殘余同源，例如IgG的CH2結(jié)構(gòu)域與IgA和IgD的CH2結(jié)構(gòu)域以及與IgM和IgE的CH2結(jié)構(gòu)域同源。
本文所用的術(shù)語“免疫球蛋白Fc區(qū)”不用說是指免疫球蛋白鏈恒定區(qū)的羧基端部分，最好是免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或它們的一部分。例如，免疫球蛋白Fc區(qū)可以包含1)CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，2)CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域，3)CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，4)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域或5)兩個或多個結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，在所述DNA構(gòu)成物中所用的Fc區(qū)包括至少免疫球蛋白鉸鏈區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，而最好是缺乏至少CH1結(jié)構(gòu)域。
目前衍生重鏈恒定區(qū)的優(yōu)選的免疫球蛋白種類為IgG(Igγ)(γ亞類1、2、3或4)。可以使用其它種類的免疫球蛋白IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)和IgM(Igμ)。在美國專利第5,541,087和5,726,044號中詳細地討論了選擇合適免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。從某些免疫球蛋白種類和亞類中選擇特定免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列以獲得特定的結(jié)果被認為是在本領(lǐng)域中的技術(shù)水平內(nèi)。編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA構(gòu)成物部分最好是包括至少一部分鉸合部結(jié)構(gòu)域和最好至少一部分Fcγ的CH3結(jié)構(gòu)域或在任何IgA、IgD、IgE和IgM中的同源結(jié)構(gòu)域。
根據(jù)應(yīng)用情況，人們可以使用人類以外的物種例如小鼠或大鼠的恒定區(qū)基因。用作免疫融合物DNA構(gòu)成物中的融合配偶體的Fc區(qū)一般可以來自任何物種的哺乳動物。當(dāng)人們不希望在宿主細胞或動物中激發(fā)抗Fc區(qū)的免疫應(yīng)答時，所述Fc區(qū)可以得自與宿主細胞或動物的相同物種。例如，當(dāng)宿主動物或細胞是人時，可以使用人Fc；同樣，當(dāng)宿主動物或細胞是小鼠時，可以使用鼠Fc。此外，這些恒定區(qū)構(gòu)成物的置換或缺失也將是有作用的，其中置換或缺失所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的一個或多個氨基酸殘基。一個實例是引入在CH2區(qū)上段中的氨基酸置換以產(chǎn)生與Fc受體的親和力降低的Fc變異體(Cole等(1997)J.Immunol.1593613)。其中本領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員可以采用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)制備這樣的構(gòu)成物。
使用人Fcγ1作為Fc區(qū)序列有幾個優(yōu)點。例如，如果血管生成抑制劑Fc融合蛋白被用作生物藥物，則Fcγ1結(jié)構(gòu)域可以對所述融合蛋白賦予效應(yīng)子功能活性。所述效應(yīng)子功能活性包括生物活性諸如補體活化、涉及抗體的細胞的細胞毒性、胎盤轉(zhuǎn)運和增加血清半壽期。Fc結(jié)構(gòu)域還提供通過抗-Fc ELISA來檢測和通過結(jié)合到金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白(“A蛋白”)來純化。然而，在某些應(yīng)用情況下，最好是從Fc區(qū)消除特異性的效應(yīng)子功能，諸如Fc受體結(jié)合或補體活化。
就血管生成抑制劑免疫融合物而論，免疫球蛋白Fc融合配偶體的一種功能是有利于血管生成抑制劑蛋白的合適折疊以產(chǎn)生活性血管生成抑制劑蛋白并影響所述活性部分至少在細胞外培養(yǎng)基中的溶解度。由于該Fc融合配偶體是親水性的，所以血管生成抑制劑免疫融合物溶解性好，與例如大腸桿菌中產(chǎn)生的重組endostatm不同(O’Reilly(1997)Cell 88277)。在本文所公開的所有實施例中，都獲得高產(chǎn)率的免疫融合物。血管生抑制劑免疫融合物通常以濃度約30-100μg/ml分泌到培養(yǎng)基中，并可通過A蛋白層析容易地純化成同質(zhì)性。另外，可以將血管生成抑制劑免疫融合物切割，然后采用常規(guī)純化方法進一步純化，采用例如肝素瓊脂糖凝膠法、賴氨酸瓊脂糖凝膠法或親和純化法。
除高水平表達外，本發(fā)明融合蛋白還顯示較長的血清半壽期，推測可能是由于它們的分子大小較大。例如，在小鼠中，人Fc-人制管張素的血清半壽期為33小時，與之相比人制管張素為4-6小時(O’Reilly等(1996)Nature Medicine 2689)。相信分子量40kD的制管張素和分子量20kD的endostatin都太小以至通過腎過濾有效地清除。相比之下，F(xiàn)c-制管張素的二聚體形式和二聚體Fc-endostatin分別是145kD和100kD，因為有兩個連接于或者兩個制管張素分子或者兩個endostatin分子的兩個免疫球蛋白Fc區(qū)。這樣的二價體結(jié)構(gòu)與制管張素受體和endostatin受體的結(jié)合親和力較高。如果血管生成抑制活性是受體介導(dǎo)的，則Fc融合蛋白比單價體制管張素或單價體endostatin自身潛在性更有效地抑制腫瘤。此外，如果制管張素和/或endostatin屬于二聚體蛋白配體類，則Fc對制管張素或endostatin產(chǎn)生的物理性限制使二聚作用成為一種分子內(nèi)過程，因此，動態(tài)平衡有利于二聚體并增強其與受體的結(jié)合。也可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將半胱氨酸殘基導(dǎo)入到合適位置的單體上以通過共價二硫鍵形成而穩(wěn)定該二聚體。
本文所用的術(shù)語“多價體”是指摻入兩個或多個生物學(xué)活性片段的重組分子。形成該多價體分子的蛋白片段可以通過多肽肽接頭連接，所述接頭連接組分部分而不會引起移碼并使每個分子獨立起作用。
本文所用的術(shù)語“二價體”是指在本發(fā)明融合構(gòu)成物中含有兩個靶蛋白的多價體重組分子，例如Fc-X分子，其中X獨立地選自制管張素、endostatin或它們的變異體。由于有兩個X部分與免疫球蛋白Fc區(qū)(通常其自身是包括至少一部分鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域，以及任選的CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈片段的二聚體)融合，因此所述分子為二價體(參見，例如圖1A)。如果本發(fā)明的融合構(gòu)成物的形式為Fc-X-X，則所產(chǎn)生的Fc二聚體分子為四價體?？梢酝ㄟ^肽接頭將形成Fc-X-X分子的這兩種蛋白連接。二價體分子可以增加所述分子和其受體之間的表觀結(jié)合親和力。例如，F(xiàn)c-endostatin的一個endostatin部分可以以一定親和力結(jié)合到細胞上的受體上，同一Fc-endostatin的第二個endostatin部分可以以非常高的親和力(表觀親和力)結(jié)合到相同細胞上的第二個受體上。這是因為第一個endostatin部分結(jié)合后，第二個endostatin部分與所述受體的物理鄰近效應(yīng)所致。在抗體結(jié)合到抗原的情況下，表觀親和力增加至少104。
本文所用的術(shù)語“多聚體”和“多聚體的”是指或者例如通過共價性相互作用(例如通過二硫鍵)共價地或者例如通過疏水性相互作用非共價地使兩條或多條多肽鏈的穩(wěn)定結(jié)合。術(shù)語多聚體包括同源多聚體(其中所述多肽是相同的)以及異源多聚體(其中所述多肽是不相同的)。
本文所用的術(shù)語“二聚體的”是指特異性多聚體分子，其中兩條蛋白多肽鏈通過共價或非共價性相互作用的穩(wěn)定連接。應(yīng)當(dāng)理解，免疫球蛋白Fc區(qū)Fc片段自身通常為包括至少一部分鉸鏈區(qū)和CH3結(jié)構(gòu)域和任選的CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈片段的二聚體。已知許多蛋白配體是以二聚體結(jié)合到它們的受體上。如果蛋白配體X天然地二聚體化，則在Fc-X分子中的X部分將在更大程度上二聚體化，因為二聚體形成過程是濃度依賴性的。通過相聯(lián)的免疫球蛋白Fc區(qū)連接的兩個X部分的物理鄰近效應(yīng)將使二聚體形成成為分子內(nèi)過程，使動態(tài)平衡有利于二聚體形成并增強其結(jié)合到受體上。
不用說，本發(fā)明采用常規(guī)重組DNA方法來產(chǎn)生用于實施本發(fā)明的Fc融合蛋白。所述Fc融合構(gòu)成物最好是在DNA水平上產(chǎn)生，并且將所產(chǎn)生的DNA整合到表達載體中，然后表達產(chǎn)生所述免疫融合物。本文所用的術(shù)語“載體”不用說是指包含核苷酸序列的任何核酸，所述核苷酸序列可以摻入到宿主細胞中并重組及整合到所述宿主細胞基因組中或作為附加體自主復(fù)制。這樣的載體包括線型核酸、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、RNA載體、病毒載體等。病毒載體非限制性實例包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。本文所用的術(shù)語靶蛋白的“基因表達”或“表達”，不用說是指轉(zhuǎn)錄DNA序列、翻譯mRNA轉(zhuǎn)錄物和分泌Fc融合蛋白產(chǎn)物。
有用的表達載體為pdCs(Lo等(1988)Protein Engineering11495，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，其中Fc-X基因的轉(zhuǎn)錄采用人巨細胞病毒的增強子/啟動子和猿猴病毒40多腺苷酸化信號。所用的人巨細胞病毒的增強子序列和啟動子序列得自Boshart等，1985，Cell 41521中提供的核苷酸-601至+7序列，該文獻公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。所述載體也含有突變二氫葉酸還原酶基因作為選擇標(biāo)記(Simonsen和Levinson(1983)Proc.Nat Acad Sci USA802495，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)。
可以用本發(fā)明的DNA序列將合適的宿主細胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，并且用來表達和分泌靶蛋白。目前用于本發(fā)明的優(yōu)選宿主細胞包括無限增殖雜交瘤細胞、NS/O骨髓瘤細胞、293細胞、中國倉鼠卵巢細胞、海拉(Hela)細胞和COS細胞。
本發(fā)明的融合蛋白最好是用常規(guī)重組DNA方法產(chǎn)生。所述融合蛋白最好是由編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白(本文也稱為血管生成抑制劑)的DNA分子在宿主細胞中表達產(chǎn)生。優(yōu)選的構(gòu)成物可以從5’至3’方向編碼信號序列、免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白。或者，所述構(gòu)成物可以從5’至3’方向編碼信號序列、靶蛋白和免疫球蛋白Fc區(qū)。
本文所用的術(shù)語“信號序列”不用說是指肽區(qū)段，所述肽區(qū)段在所述宿主細胞中引導(dǎo)分泌血管生成抑制劑免疫融合物蛋白并在翻譯后再切除。本發(fā)明的信號序列是一種多核苷酸，它編碼引發(fā)轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的氨基酸序列。用于本發(fā)明的信號序列包括抗體輕鏈信號序列例如抗體14.18 (Gillies等，1989，Jour.of ImmunolMeth.，125191-202)、抗體重鏈信號序列例如MOPC141抗體重鏈信號序列(Sakano等，1980，Nature 2865774)和本領(lǐng)域中已知的任何其它信號序列(參見例如，Watson，1984，Nucleic Acids Research125145)。這些參考文獻都通過引用結(jié)合到本文中。
本領(lǐng)域中，信號序列的特征已經(jīng)很清楚，并且已知通常含有16-30個氨基酸殘基，以及可以含有更多或更少的氨基酸殘基。通常信號肽由三個區(qū)組成堿性N-端區(qū)、中央疏水區(qū)和更強極性的C-端區(qū)。中央疏水區(qū)含有4-12個疏水性殘基，在轉(zhuǎn)運新生多肽期間，所述疏水性殘基錨定信號肽穿過膜脂層雙分子層。引發(fā)后，通常稱為信號肽酶的細胞酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)酶切信號肽。潛在的信號肽切割位點一般在“(-3，-1)規(guī)則(rule)”后，因此，典型信號肽在位置-1至-3具有少量中性氨基酸殘基，并在該區(qū)域內(nèi)缺乏脯氨酸殘基。信號肽酶在-1和+1氨基酸之間酶切這樣的一種信號肽。因此，可以將編碼信號序列的DNA部分在分泌期間從所述免疫融合蛋白的氨基端切除。這導(dǎo)致分泌由Fc區(qū)和所述靶蛋白組成的免疫融合蛋白。von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.，144683對信號肽序列進行了詳細討論，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，對用于本發(fā)明的特定信號序列的適應(yīng)性可能需要進行某些常規(guī)實驗。這種實驗將包括確定信號序列引導(dǎo)分泌免疫融合物的能力，還要確定所用的序列的最佳構(gòu)型、基因組或cDNA以達到有效分泌免疫融合物。另外，根據(jù)von Heijne所述規(guī)則(上述參考文獻)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠產(chǎn)生合成信號肽，并用常規(guī)實驗測試這樣的合成信號序列的效能。信號序列也稱為“信號肽”、“前導(dǎo)序列”或“前導(dǎo)肽”。
所述信號序列和免疫球蛋白Fc區(qū)的融合物本文有時稱為分泌盒。用于實施本發(fā)明的典型分泌盒是從5’至3’方向編碼免疫球蛋輕鏈基因的信號序列和人免疫球蛋白γ1基因的Fcγ1區(qū)的多核苷酸。免疫球蛋白Fcγ1基因的Fcγ1區(qū)最好是包括至少一部分鉸合結(jié)構(gòu)域和至少一部分CH3結(jié)構(gòu)域，或者至少部分鉸合結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。編碼所述分泌盒的DNA可以是其基因組構(gòu)型或其cDNA構(gòu)型。
在另一個實施方案中，所述DNA序列編碼所述分泌盒和血管生成抑制劑蛋白之間插入的蛋白酶切割位點。切割位點用于所編碼融合蛋白的蛋白酶剪切，因此從血管生成抑制劑蛋白中分離Fc結(jié)構(gòu)域。本文所用的“蛋白酶切割位點”不用說是指通過蛋白酶或其它蛋白剪切劑優(yōu)先剪切的氨基酸序列。有用的蛋白酶切割位點包括蛋白酶諸如胰蛋白酶、纖溶酶或腸激酶K識別的氨基酸序列。現(xiàn)在已知許多切割位點/剪切劑對。參見例如美國專利第5,726,044號，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。其中所述靶蛋白序列是制管張素、endostatin或其活性變異體的前體分子，通過用內(nèi)源蛋白酶諸如彈性蛋白酶或纖溶酶或尿激酶剪切產(chǎn)生所需蛋白產(chǎn)物。
本發(fā)明也包括含重組制管張素和endostatin或其片段的不同組合的融合蛋白，所述融合蛋白可以大量制備。盡管在抑制腫瘤生長方面已證實有效，但制管張素和endostatin怎樣阻斷血管生成的機制沒有完全弄清楚。制管張素具有幾種Kringle結(jié)構(gòu)，而endostatin具有不同結(jié)構(gòu)的基序，其中每種都可以單獨引起或促使所述蛋白結(jié)合到內(nèi)皮細胞，然后發(fā)揮抗血管生成作用。因此，本發(fā)明包括制管張素的生物活性片段(諸如Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3及其組合物)和endostatin的生物活性片段的靶蛋白，所述生物活性片段與天然產(chǎn)生的全長制管張素和endostatin生理作用相似。
本發(fā)明的另一個實施方案提供血管生成抑制劑的雙功能雜種構(gòu)成物。本文所用的雙功能雜種分子或構(gòu)成物是指通過組合兩種蛋白亞基產(chǎn)生的蛋白，其中所述兩種亞基可以得自不同的蛋白。每種蛋白亞基具有其自身獨立的功能，所以在所述雜種分子中，該兩種亞基的功能可以是相加或協(xié)同的功能。這樣功能的雜種蛋白使得可以在動物模型中測試制管張素和endostatin的協(xié)同作用。優(yōu)選的雙功能雜種蛋白包含或者直接串聯(lián)或者通過多肽接頭串聯(lián)至少兩種不同的血管生成抑制劑。例如，在一個優(yōu)選的實施方案中，所述靶序列編碼按讀框與至少一部分endostatin連接的至少一部分制管張素，而制管張素結(jié)構(gòu)域和endostatin結(jié)構(gòu)域均具有抗血管生成活性或血管生成抑制作用。這兩個單位均可以通過多肽接頭連接。
本文所用的術(shù)語“多肽接頭”不用說是指可以將兩個蛋白質(zhì)或一個蛋白質(zhì)和一個Fc區(qū)連接在一起的肽序列。所述多肽接頭最好是包含多種氨基酸諸如甘氨酸和/或絲氨酸。最好是，所述多肽接頭包括一系列長度約為10-15個殘基的甘氨酸和絲氨酸的肽。參見例如美國專利第5,258,698號，其公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。然而，設(shè)想可以通過常規(guī)實驗法確定所述最佳接頭的長度和氨基酸組分。
發(fā)現(xiàn)如果將制管張素的不同部分表達作為Fc融合分子，則獲得高水平表達，推測可能是因為Fc部分作為一種載體，幫助所述多肽在C-端正確地折疊。此外，F(xiàn)c區(qū)可以糖基化和在生理pH時高度帶電，因此Fc區(qū)可以幫助溶解疏水性蛋白。
本發(fā)明也提供生產(chǎn)非人類物種的制管張素和endostatin的Fc融合蛋白的方法。非人類血管生成抑制劑融合蛋白對血管生成抑制劑臨床前期的研究是有作用的，因為一種蛋白質(zhì)藥物效能和毒性研究在對試驗之前必須在動物模型系統(tǒng)中進行。人蛋白可能在小鼠模型中不產(chǎn)生作用，因為所述蛋白可能誘發(fā)免疫應(yīng)答，和/或具有不同的藥物動力學(xué)特征，而扭曲試驗結(jié)果。因此，等效鼠蛋白是在小鼠模型中試驗的人蛋白最好的替代物。
標(biāo)準(zhǔn)Lewis肺癌小鼠模型(O’Reilly等(1997)Cell 88277)用來比較可溶性人Fc-人制管張素、人Fc-人Endostatin、鼠Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠Endostatin與大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)生的所述不可溶的蛋白。在Lewis肺癌模型中在抑制腫瘤生長方面，可溶的Fc融合蛋白比用大腸桿菌產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白更有效。此外，將實驗小鼠近親交配，其腫瘤是誘發(fā)而不是自發(fā)產(chǎn)生。因此，在小鼠模型中的效能可能與抗人腫瘤的效能無關(guān)。采用狗的臨床前期研究將提供關(guān)于這些血管生成抑制劑對自發(fā)性腫瘤的效能更準(zhǔn)確的信息，因為有大量天然發(fā)生的自發(fā)性狗腫瘤。生產(chǎn)本發(fā)明的鼠(mu)Fc-鼠制管張素、鼠Fc-鼠endostatm和狗(ca)Fc-狗制管張素、狗Fc-狗endostatin的方法將有利于血管生成抑制劑在鼠和狗兩個系統(tǒng)中的臨床前研究。
本發(fā)明提供通過給予本發(fā)明的DNA、RNA或蛋白治療血管生成性疾病(condition mediated by angiogenesis)的方法。血管生成性疾病包括，例如實體瘤；血源性腫瘤(blood born tumors)、轉(zhuǎn)移瘤、良性瘤包括血管瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)纖維瘤、粒性結(jié)膜炎和膿性肉芽腫；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；牛皮癬；眼部血管生成性疾病(糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、黃斑變性、角膜移植排斥、新生血管性青光眼)；晶狀體后纖維組織形成、發(fā)紅(rubeosis)、遺傳性出血性毛細血管擴張綜合征；心肌血管生成；斑性新血管形成；毛細管擴張；血友病患者關(guān)節(jié)血管纖維瘤和創(chuàng)傷性肉芽；以及內(nèi)皮細胞過度或異常刺激、腸粘連、動脈硬化、硬皮病性疤痕和肥大性疤痕即疤痕疙瘩。
本文公開的DNA構(gòu)成物可用于基因治療，其中將endostatin基因或制管張素基因通過各種方式之一傳遞到細胞中，例如與啟動子連接的天然DNA或病毒載體內(nèi)的DNA。進入細胞后，則表達制管張素基因和/或endostatin基因或基因片段，而所述蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生以發(fā)揮其正常生物功能。本發(fā)明的DNA構(gòu)成物可高水平表達所述融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白也可用于治療血管生成性疾病，而且比天然血管生成抑制劑和其它重組血管生成抑制劑具有更好的臨床效果，因為本發(fā)明的血管生成抑制劑免疫融合物比所述其它重組血管生成抑制劑或單獨的天然血管生成抑制劑具有更長的血清半壽期。由于所述二價體和二聚體結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的二價體形式和二聚體形式應(yīng)具有更強的結(jié)合親和力。由于通過所融合的Fc區(qū)或柔性多肽接頭連接的兩種不同血管生成抑制劑可能的協(xié)同作用，本發(fā)明的雙功能雜種分子可具有更好的臨床效果。
可以將本發(fā)明的組合物通過任何合適的方式給予動物，所述給藥為直接(例如，局部注射、植入或局部給予組織部位)或全身性(例如胃腸外或口服)給予。如果所述組合物以胃腸外提供，諸如靜脈內(nèi)、皮下、眼、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、頰、直腸、陰道、眼框內(nèi)、腦內(nèi)、顱內(nèi)、椎管內(nèi)、心室內(nèi)、鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)或通過氣霧劑給予，所述組合物最好是包含部分水或生理上可匹配的液體懸浮液或溶液。因此，所述載體(carrier)或媒介物(vehicle)為生理上可接受的以便除了傳遞所需組合物給患者之外，沒有另外負面影響患者的電解質(zhì)和/或容積平衡。用于所述制劑的液體介質(zhì)因此可以包括正常生理鹽水(例如，9.85％NaCl水溶液，0.15M，pH7-7.4)。
每次給予所述免疫融合物的劑量范圍優(yōu)選為50ng/m2-lg/m2，更優(yōu)選為5μg/m2-200 mg/m2，而最優(yōu)選為0.1mg/m2-50 mg/m2。每次給予編碼所述免疫融合物的核酸的劑量范圍優(yōu)選為1μg/m2-100mg/m2，更優(yōu)選為20μg/m2-10mg/m2，而最優(yōu)選為400μg/m2-4mg/m2。然而設(shè)想在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)，通過常規(guī)實驗法可以很好確定給予的最佳方式和劑量。
通過以下非限制的實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例實施例1.人Fc-人Endostatin的表達按照Lo等的學(xué)說((1998)Protein Engineering 11495)，將人endostatin表達作為人Fc-人endostatin(huFc-huEndo)融合蛋白。Fc是指人免疫球蛋白γ的Fc片段(SEQ ID NO1所示為其DNA序列；SEQ IDNO2所示為其氨基酸序列)。(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR)用來連接endostatin cDNA (SEQ ID NO3；其氨基酸序列公開于SEQ ID NO4中)，用于表達Fc-Endo融合蛋白。正向引物或者是5’-CC CCG GGTAAA CAC AGC CAC CGC GAC TTC C(SEQ ID NO5；所編碼的氨基酸公開于SEQ ID NO6中)或者是5’-C AAG CTT CAC AGC CACCGC GAC TTC C(SEQ ID NO7；所編碼的氨基酸公開于SEQ IDNO8中)，其中XmaI位點或HindIII位點后是編碼endostatin N-端的序列。具有XmaI位點的引物使endostatin cDNA連接到IgGFc區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域末端的XmaI位點。具有HindIII位點的引物使endostatin cDNA連接到pdCs-Fc(D4K)載體的HindIII位點，所述載體在所述融合蛋白連接點含有腸激酶識別位點Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.26823311-23317)。所述反向引物是5’-C CTC GAG CTA CTT GGAGGC AGT CAT G(SEQ ID NO9)，將所述引物設(shè)計置于翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在endostatin C-端之后，而這之后是XhoI位點。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測序，并將XmaI-XhoI片段連接到XmaI和XhoI消化產(chǎn)生的pdCs-Fc載體上。同樣，將編碼endostatin的HindIII-XhoI片段連接到經(jīng)適當(dāng)消化的pdCs-huFc(D4K)載體中。通過電穿孔NS/O細胞，隨后在含有100nM氨甲蝶呤的生長培養(yǎng)基中選擇，獲得穩(wěn)定表達Fc-endo或Fc(D4K)-endostatin的克隆。通過抗-人Fc ELISA (實施例3)測定并通過SDS-PAGE證實蛋白表達水平，其顯示約52kD蛋白產(chǎn)物。通過有限稀釋將最佳生產(chǎn)克隆亞克隆。實施例2.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染關(guān)于瞬時轉(zhuǎn)染，通過質(zhì)粒DNA與磷酸鈣共沉淀(Sambrook等(1989)Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)或按照供應(yīng)商的方法通過采用脂轉(zhuǎn)染胺+(LipofectAMINE Plus)(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)的脂轉(zhuǎn)染，將所述質(zhì)粒引入人腎293細胞中。
為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，通過電穿孔將質(zhì)粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/O細胞中。將NS/O細胞生長于用10％胎牛血清補充的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基中。將約5×106細胞用PBS洗滌一次，并再次懸浮于0.5mlPBS中。然后將10μg線狀化質(zhì)粒DNA與所述細胞一起在冰上的基因脈沖發(fā)生器容器(Gene Pulser Cuvette)(0.4cm電極缺口(electrode gap)BioRad，Hercules，CA)中溫育10分鐘。采用設(shè)定0.25V和500μF的基因脈沖發(fā)生器(Gene Pulser)(BioRad，Hercules，CA)進行電穿孔。將它們重新懸浮于生長培養(yǎng)基中之后，使細胞在冰上恢復(fù)10分鐘，然后平板接種到兩個96孔板上。通過生長在100nM氨甲蝶呤(MTX)中選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，MTX在轉(zhuǎn)染后2天加入。給所述細胞每3天更換培養(yǎng)基1次，連續(xù)3次以上，然后在2-3周出現(xiàn)MTX-抗性克隆。通過抗-Fc ELISA測定克隆上清液，以鑒定出高生產(chǎn)克隆。分離高生產(chǎn)克隆，然后在含100nM MTX生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
用于抗-muFc ELISA的方法相似，只是將ELISA板用PBS中0.5μg/ml AffiniPure山羊抗-鼠IgG(H＋L)(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)以100μl孔進行包被；而第二抗體為結(jié)合辣根過氧化物酶的山羊抗-muIgG(Fcγ)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以15000稀釋倍數(shù)使用。對于抗-caFc ELISA，ELISA板同樣用PBS中的5μg/ml AffiniPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)以100μl孔進行包被；而第二抗體為結(jié)合辣根過氧化物酶的AffinPure兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，以15000稀釋倍數(shù)使用。實施例4.人Fc-人制管張素的表達基本上按實施1所述將人制管張素(DNA序列見SEQ ID NO10；氨基酸序列見SEQ ID NO11)表達為人Fc-人制管張素(huFc-huAngio)融合蛋白。PCR用來連接制管張素cDNA(SEQ ID NO3)，以用pdCs-huFc或pdCs-huFc(D4K)載體表達。相應(yīng)的正向引物為5’-CC CCGGGT AAG AAA GTG TAT CTC TCA GAG(SEQ ID NO12；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO13)和5’-C CCC AAG CTT AAA GTG TATCTC TCA GAG (SEQ ID NO14；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO15)，其中XmaI位點或HindIII位點之后為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5’-CCC CTC GAG CTA CGC TTC TGT TCC TGA GCA(SEQ ID NO16)，設(shè)計所述引物使翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之后，而再后是XhoI位點。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測序，然后將所產(chǎn)生的編碼制管張素的XmaI-XhoI片段和HindIII-XhoI片段分別連接到pdCs-huFc和pdCs-huFc(D4K)載體上。按實施例2和3所述，選擇并測定穩(wěn)定表達huFc-huAngio和huFc(D4K)-huAngio的NS/0克隆。實施例5.鼠Fc-鼠-Endostatin的表達基本上按實施1所述將鼠endostatm(DNA序列見SEQ IDNO17；氨基酸序列見SEQ ID NO18)和鼠Fc(DNA序列見SEQ IDNO19；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO20)表達為鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白。PCR用來連接endostatin cDNA(SEQ IDNO4)，以用pdCs-muFc(D4K)載體表達。正向引物為5’-C CCC AAGCTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C(SEQ ID NO21；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO22)，其中HindIII位點之后為編碼endostatin N-端的序列。反向引物為5’-CCC CTC GAG CTA TTT GGA GAA AGAGGT C(SEQ ID NO23)，設(shè)計所述引物使翻譯終止密碼子(STOPcodon)(反密碼子，CTA)緊接在endostatin C-端之后，而這之后是XhoI位點。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測序，然后將所產(chǎn)生的編碼endostatin的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實施例2和3中所述，選擇并測定(抗-muFc ELISA)穩(wěn)定表達muFc(D4K)-muEndo的NS/O克隆。實施例6.鼠Fc-鼠制管張素的表達基本上按實施例所述將鼠制管張素(DNA序列見SEQ ID NO24；氨基酸序列見SEQ ID NO25)表達為鼠Fc-鼠制管張素(muFc-muAngio)融合蛋白。PCR用來連接所述制管張素cDNA(SEQ ID NO6)，以便以pdCs-Fc(D4K)載體表達。正向引物為5’-C CCC AAG CTT GTG TATCTG TCA GAA TGT AAG CCC TCC TGT CTC TGA GCA(SEQ IDNO26；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO27)，其中HindIII位點之后為編碼制管張素N-端的序列。反向引物是5’-CCC CTC GAG CTACCC TCC TGT CTC TGA GCA(SEQ ID NO28)，設(shè)計所述引物使翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，CTA)緊接在制管張素C-端之后，而這之后是XhoI位點(CTCGAG)。將所述PCR產(chǎn)物克隆并測序，然后將編碼制管張素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體上。如實施例2和3所述，選擇并測定(抗-muFc ELISA)穩(wěn)定表達muFc(D4K)-muAngio的NS/O克隆。實施例7.狗Fc(caFc)的表達將從狗血中分離的狗外周血單核細胞(PBMC)用來制備mRNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶和寡聚物(dT)合成第一條cDNA鏈后，采用正向引物5’-CC TTA AGC GAA AAT GGA AGA GTT CCT CGC(SEQ ID NO29；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO30)，其中緊靠編碼狗Fc鉸鏈區(qū)序列的上游導(dǎo)入AfIII位點；以及反向引物5’-C CTC GAG TCA TTT ACCCGG GGA ATG GGA GAG GGA TTT CTG(SEQ ID NO31)，其中在狗Fc翻譯終止密碼子(STOP codon)(反密碼子，TCA)之后導(dǎo)入XhoI位點，進行PCR以擴增狗Fc(Kazuhiko等，(1992)JP 1992040894-A1)。所述反向引物還導(dǎo)入沉默突變以產(chǎn)生XmaI限制酶切位點，該位點有利于通過接頭-連接物構(gòu)建pdCs-caFc(D4K)載體，然后連接到編碼狗endostatm或制管張素的DNA構(gòu)成物上。用同樣的方法構(gòu)建pdCs-huFc，Lo等(Lo等，Protem Engineering(1998)11495)對其進行了詳細地論述，如下構(gòu)建pdCs-huFc的表達載體。將編碼狗Fc的AflII-XhoI片段連接到編碼所述輕鏈信號肽的XbaI-AflII片段以及XbaI-XhoI消化的pdCs載體。所產(chǎn)生的pdCs-caFc表達載體然后用來轉(zhuǎn)染293細胞。轉(zhuǎn)染后約3天，通過A蛋白層析純化所述上清液。采用結(jié)合過氧化物酶的兔抗-狗IgG(Fc片段特異性)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)，在SDS-PAGE后再通過蛋白質(zhì)印跡分析，確定狗Fc (DNA序列見SEQ ID NO32；氨基酸序列見SEQ ID NO33)的表達。實施例8.狗Fc-狗Endostatin的表達基本按實施例5所述將狗endostatin的編碼序列(DNA序列見SEQID NO34；氨基酸序列見SEQ ID NO35)連接到HindIII-XhoI片段上以表達Fc融合蛋白。在3’端，引入終止密碼子(STOP codon)，例如通過PCR緊接在編碼C-末端賴氨酸殘基的密碼子之后引入終止密碼子，而這之后是NotI限制酶切位點。然而在5’端，有一個DraIII限制酶切位點便于重組?；瘜W(xué)合成一個HindIII粘端和一個DraIII粘端組成的寡核苷酸雙鏈體，然后用來連接編碼其余的狗endostatin cDNA的DraIII-XhoI限制性片段。所用的雙鏈體如下所示HindIII5'-AGCTT CAC ACC CAC CAG GAC TT C CAG CCG GTG CTG CAC CTG(SEQID NO36)A GTG TGG GTG GTC CTG AAG GTC GGC CAC GAC GTG-5’(SEQID NO38)DraIII在所述雙鏈體中第一個CAC編碼狗endostatin N-端組氨酸殘基。因此編碼狗全長endostatin的HindIII-XhoI片段可連接到HindIII-XhoI消化的pdCs-caFc載體(參見實施例7)用于表達。如實施例2和3中所述，選擇并通過抗-caFc ELISA測定穩(wěn)定表達caFc-caEndo的NS/O克隆。在SDS-PAGE上分析并通過蛋白質(zhì)印跡分析確定所述蛋白產(chǎn)物。實施例9.狗Fc-狗制管張素的表達基本上按以上實施例所述，連接編碼狗全長制管張素的cDNA(DNA序列見SEQ ID NO39；氨基酸序列見SEQ ID NO40)以表達caFc融合蛋白。簡單地說，在3’端引入終止密碼子(STOP codon)，例如通過PCR緊接在編碼C-端賴氨酸殘基的密碼子之后引入終止密碼子，而這之后是NotI限制酶切位點而不是XhoI位點。因為在狗制管張素的cDNA中有一個內(nèi)部XhoI限制酶切位點。在5’端，緊接在制管張素N-端的上游按讀框引入HindIII位點。然后將編碼狗全長制管張素的HindIII-NotI片段連接到HindIII-NotI消化的pdCs-caFc載體(其中通過接頭連接將NotI位點引入XhoI位點處)用于表達。如實施例2和3中所述，選擇并通過抗-caFc ELISA測定穩(wěn)定表達caFc-caAngio的NS/O克隆。在SDS-PAGE上分析并通過蛋白質(zhì)印跡分析確定所述蛋白產(chǎn)物。實施例10.鼠制管張素的鼠Fc-K1的表達制管張素包含纖溶酶原的5個Kringle結(jié)構(gòu)域中的前4個。為了測定是否任何一個或幾個Kringle結(jié)構(gòu)域決定所觀察到的制管張素的抗-血管生成活性，則可產(chǎn)生單個Kringle結(jié)構(gòu)域或其組合物用于測試。為了證實Fc作為融合蛋白配偶體的作用，鼠制管張素的第一個Kringle結(jié)構(gòu)域(K1)的表達用以下方式實現(xiàn)。第一個Kringle結(jié)構(gòu)域終止于鼠制管張素的Glu-87處(SEQ ID NO25)。在該位置的cDNA中有一個合適的NsiI限制酶切位點，以便NsiI消化后，將第4個堿基3’-突出端通過T4聚合酶去除以產(chǎn)生一個平端。將翻譯終止密碼子通過連接到回文接頭TGA CTC GAG TCA(SEQ ID NO41)引入緊接在編碼Glu-87的GAA下游，其中所述終止密碼子TGA之后是XhoI位點。然后將編碼該截短制管張素的HindIII-XhoI片段即只是第一個Kringle，連接到pdCs-muFc(D4K)載體中用于表達。按抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達。實施例11.鼠制管張素的鼠Fc-innerK1的表達Kringle結(jié)構(gòu)域由多個環(huán)組成，包括外環(huán)和內(nèi)環(huán)。在鼠制管張素的第一個Kringle中，所述內(nèi)環(huán)明確為Cys 55和Cys 79，它們在所述環(huán)的堿基處一起形成一個二硫鍵。內(nèi)環(huán)Cys-67與外環(huán)的一個Cys殘基形成另一個二硫鍵以產(chǎn)生所述Kringle結(jié)構(gòu)。為了測試內(nèi)環(huán)是否具有抗-血管生成活性，將它如下表達為muFc-innerK1(Kringle 1)。用編碼第一個Kringle的DNA片段作模板，具有序列5’GGG CCT TGGAGC TAC ACT ACA(SEQ ID NO42；所編碼的氨基酸見SEQ IDNO43)的誘變引物用來通過PCR使TGC(Cys-67)誘變?yōu)锳GC(Ser)。如果將Kringle 1的內(nèi)環(huán)表達但不表達其外環(huán)，則這保證Cys-67不形成二硫鍵。具有序列5’GCGGATCCAAGCTT AGT ACA CAT CCCAAT GAG GG (SEQ ID NO44；所編碼的氨基酸見SEQ ID NO45)的上游引物用來緊接5’Ser-43(AGT)的密碼子按讀框引入HindIII位點。將一個BamHI位點也引入緊接在HindIII位點的上游。所述BamHI位點用于連接以下實施例12所示柔性Gly-Ser接頭末端處的BamHI位點。因此，通過鼠制管張素Glu-87將編碼Ser-43的HindIII-XhoI DNA片段連接于pdCs-muFc(D4K)載體用于表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達muFc-innerK1。實施例12.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-innerK1的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-innerK1包含通過含甘氨酸和絲氨酸殘基的一個多肽接頭連接到鼠制管張素第一個Kringle內(nèi)環(huán)的鼠Fc-鼠Endo。如下裝配所述DNA構(gòu)成物。
在鼠endostatin cDNA的3’末端有一個BspHI位點。為了在鼠endostain的C-端引入一個甘氨酸和絲氨酸殘的柔性接頭，將編碼endostatin的540-bp HindIII-BspHI片段連接到SEQ ID NO46和SEQID NO48中公開的寡核苷酸形成的重疊寡核苷酸雙鏈體。SEQ IDNO46編碼的氨基酸接頭見SEQ ID NO47。
將編碼鼠endostatin和Gly-Ser接頭HindIII-BamHI的片段亞克隆到標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中。然后將BamHI位點用來引入編碼實施例11中的innerK1的BamHI-XhoI片段。將所產(chǎn)生的編碼muEndo-GlySer接頭-innerK1的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達。以抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達muFc-muEndo-GlySer接頭-innerK1。實施例13.鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-K1的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-K1包含通過含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的第一個Krmgle的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構(gòu)成物如下裝配。
將編碼鼠Endo-GlySer接頭的HindIII-BamHI片段的BamHI末端(實施例12)通過以下連接物連接到編碼鼠制管張素Kringle 1的HindIII-XhoI片段(實施例10)。BamHI5’GA TCC TCA GGC C (SEQ ID NO49)G AGT CCG GTCGA (SEQ ID NO50)HindIII所述連接物具有一個HindIII的粘端，連接時不需要再產(chǎn)生HindIII位點。因此，將所產(chǎn)生的編碼muEndo-GlySer接頭-Kringle 1的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達。用抗-muFcELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達muFc-muEndo-GlySer接頭-K1。實施例14.鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的表達雜種分子鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素包含通過含甘氨酸和絲酸殘基的多肽接頭連接到鼠制管張素的鼠Fc-鼠Endo。將所述DNA構(gòu)成物基本上如下裝配。將編碼鼠Endo-GlySer接頭的HindIII-BamHI片段BamHI末端(實施例12)通過實施例13中所述連接物連接到編碼鼠制管張素的HindIII-XhoI片段。將所產(chǎn)生的編碼鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素的HindIII-XhoI片段連接到pdCs-muFc(D4K)載體用于表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達鼠Fc-鼠Endo-GlySer接頭-鼠制管張素。實施例15.人制管張素-人Fc-人Endo的表達雜種分子人制管張素-人Fc-人Endo包含通過肽鍵連接到人Fc＝人Endo的人制管張素。將所述DNA構(gòu)成物如下裝配。首先通過PCR產(chǎn)生編碼人制管張素但無終止密碼子的HindIII-XhoI片段，以使制管張素的最后氨基酸殘基的密碼子緊接著是XhoI位點的CTCGAG。通過以下AflII-HindIII連接物，將5’末端的HindIII連接到輕鏈信號肽的XbaI-AfIII片段(Lo等，Protein Engineering(1998)11495)AfIII5’TTAAGCGGCC(SEQ ID NO51)CG CGG GTCGA (SEQ ID NO52)HindIII’在連接時，上述連接物的HindIII粘端不再產(chǎn)生HindIII位點。在3’末端，通過以下XhoI’-AfIII連接物，將XhoI位點連接到編碼人Fc-人-Endo的AfIII-XhoI片段的AfIII位點XhoI’5’TCGACTCCGGC (SEQ ID NO53)GAGGCCGAATT (SEQ ID NO54)AfIII在連接時，上述連接物的XhoI粘端不再產(chǎn)生XhoI位點。所產(chǎn)生的編碼信號肽-人制管張素-人Fc-人endostatin的XbaI-XhoI片段克隆到pdCs載體上用于表達。用抗-muFc ELISA和SDS-PAGE分析，在瞬時表達和穩(wěn)定表達中均獲得高水平表達。實施例16.藥物代謝動力學(xué)在一組藥物代謝動力學(xué)研究中，將移植100-200mm3Lewis肺腫瘤的C57/BL6小鼠，每只鼠注射720μg人Fc-人制管張素到其尾靜脈中。根據(jù)O’Reilly所描述的實際治療方案(O’Reilly(1996)NatureMedicine 2689)，選擇在該研究中使用的腫瘤大小和人Fc-人制管張素的劑量。在注射后1/2、1、2、4、8、24和48小時從眼眶后采取血樣。在抗-人Fc ELISA后再用蛋白質(zhì)印跡分析分析所述血樣。發(fā)現(xiàn)人Fc-人制管張素的循環(huán)半壽期在小鼠中約為32小時，而蛋白質(zhì)印跡分析顯示高于90％的人-Fc-人制管張素以完整的分子保持循環(huán)。
還以200μg/小鼠的劑量在無腫瘤的Swiss小鼠中重復(fù)所述藥物代謝動力學(xué)研究。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)人Fc-人制管張素的循環(huán)半壽期約為33小時。
等同實施方案本發(fā)明可以體現(xiàn)為其它具體的但不偏離其精神或基本特征的形式。因此認為前述實施方案是在所有方面說明而不是限制本文所描述的發(fā)明。因此本發(fā)明的范圍由附屬的權(quán)利要求書限定而不是由以上所述限定，因此本發(fā)明包括在權(quán)利要求書等同目的和范圍內(nèi)的所有修改。
序列表<110>Lo，Kin-MingLi，YueGillies，StePhen D<120>表達以及分泌制管張素和ENDOSTATIN的免疫融合物<130>LEX-006PC<140><141><150>US 60/097,883<151>1998-08-25<160>S4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>696<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(1)..(696)<223>人免疫球蛋白γ的Fc片段<400> 1gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca 48Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc 96Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30aag gac acc ctc atg arc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg 144Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg 192Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 240Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 288Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 336Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110ctc cca gcc ccc arc gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 384Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125cga gaa cca cag gtg tac acc etg ccc cca tca cgg gag gag atg acc 432Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr130 135 140aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc480Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac528Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat576Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc624Ser Lys Leu 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Ser Pro Ser Thr His Pro Asn Glu35 40 45gga cta gaa gag aac tac tgt agg aac cca gac aat gat gaa caa ggg 192Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln Gly50 55 60cct tgg tgc tac act aca gat ccg gac aag aga tat gac tac tgc aac 240Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asn65 70 75 80att cct gaa tgt gaa gag gaa tgc atg tac tgc agt gga gaa aag tat 288Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys Tyr85 90 95gag ggc aaa atc tcc aag acc atg tct gga ctt gac tgc cag gcc tgg 336Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala Trp100 105 110gat tct cag agc cca cat gct cat gga tac atc cct gcc aaa ttt cca 384Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe Pro115 120 125agc aag aac ctg aag atg aat tat tgc cac aac cct gac ggg gag cca 432Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140agg ccc tgg tgc ttc aca aca gac ccc acc aaa cgc tgg gaa tac tgt 480Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr Cys145 150 155 160gac atc ccc cgc tgc aca aca ccc ccg ccc cca ccc agc cca acc tac 528Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr Tyr165 170 175caa tgt ctg aaa gga aga ggt gaa aat tac cga ggg acc gtg tct gtc 576Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val180 185 190acc gtg tct ggg aaa acc tgt cag cgc tgg agt gag caa acc cct cat 624Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205agg cac aac agg aca cca gaa aat ttc ccc tgc aaa aat ctg gaa gag 672Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu210 215 220aac tac tgc cgg aac cca gat gga gaa act gct ccc tgg tgc tat acc 720Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240act gac agc cag ctg agg tgg gag tac tgt gag att cca tcc tgc gag 768Thr Asp Ser Gln Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255tcc tca gca tca cca gac cag tca gat tcc tca gtt cca cca gag gag 816Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu Glu260 265 270caa aca cct gtg Gtc Gag gaa tgc tac cag agc gat ggg cag agc tat 864Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser Tyr275 280 285cgg ggt aca tcg tcc act acc atc aca ggg aag aag tgc cag tcC tgg 912Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300gca gct atg ttt cca cac agg cat tcg aag acc cca gag aac ttc cca 960Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro305 310 315 320gat gct ggc ttg gag atg aac tac tgc agg aac ccg gat ggt gac aag 1008Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Lys325 330 335ggc cct tgg tgc tac acc act gac ccg agc gtc agg tgg gaa tac tgc 1056Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys340 345 350aac ctg aag cgg tgc tca gag aca gga ggg 1086Asn Leu Lys Arg Cys Ser Glu Thr Gly Gly355 360<210>25<211>362<212>PRT<213>小家鼠<400>25Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Ile Gly Asn Gly Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Met Ser Arg Thr Lys Ser Gly Val Ala Cys Gln Lys Trp Gly Ala20 25 30Thr Phe Pro His Val Pro Asn Tyr Ser Pro Ser Thr His Pro Asn Glu35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Gln Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Asp Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asn65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met Tyr Cys Ser Gly Glu Lys Tyr85 90 95Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Asp Cys Gln Ala Trp100 105 110Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ala Lys Phe Pro115 120 125Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys His Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Thr Lys Arg Trp Glu Tyr Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Thr Val Ser Val180 185 190Thr Val Ser Gly Lys Thr Cys Gln Arg Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205Arg His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Glu Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr Asp Ser Gin Leu Arg Trp Glu Tyr Cys Glu Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255Ser Ser Ala Ser Pro Asp Gln Ser Asp Ser Ser Val Pro Pro Glu Glu260 265 270Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr Gln Ser Asp Gly Gln Ser Tyr275 280 285Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp290 295 300Ala Ala Met Phe Pro His Arg His Ser Lys Thr Pro Glu Asn Phe Pro305 310 315 320Asp Ala Gly Leu Glu Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Lys325 330 335Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys340 345 350Asn Leu Lys Arg Cys Ser Glu Thr Gly Gly355 360<210>26<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠Fc-Angio的正向引物<220><221>CDS<222>(2)..(49)<400>26c ccc aag ctt gtg tat ctg tca gaa tgt aag 31Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys1 5 10<210>27<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>27Pro Lys Leu Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys1 5 10<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述小鼠Fc-Angio的反向引物<400>28cccctcgagctaccctcctg tctctgagca 30<210>29<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述狗Fc的正向引物<220><221>CDS<222>(3)..(29)<400>29cc tta agc gaa aat gga aga gtt cct cgc 29Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg1 5<210>30<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>30Leu Ser Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg1 5<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述狗Fc的反向引物<400>31cctcgagtca tttacccggg gaatgggaga gggatttctg 40<210>32<211>702<212>DNA<213>家犬<220><221>CDS<222>(1)..(702)<223>Fc<400>32gaa aat gga aga gtt cct cgc cca cct gat tgt ccc aaa tgc cca gcc 48Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala1 5 10 15cct gaa atg ctg gga ggg cct tcg gtc ttc atc ttt ccc ccg aaa ccc 96Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30aag gac acc ctc ttg att gcc cga aca cct gag gtc aca tgt gtg gtg 144Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45gtg gat ctg gga cca gaa gac cct gag gtg cag atc agc tgg ttc gtg 192Val Asp Leu Gly Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val50 55 60gac ggt aag cag atg caa aca gcc aag act cag cct cgt gag gag cag 240Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80ttc aat ggc acc tac cgt gtg gtc agt gtc ctc ccc att ggg cac cag 288Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln85 90 95gac tgg ctc aag ggg aag cag ttc acg tgc aaa gtc aac aac aaa gcc 336Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala100 105 110ctc cca tcc ccg atc gag agg acc atc tcc aag gcc aga ggg cag gcc 384Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala115 120 125cat cag ccc agt gtg tat gtc ctg ccg cca tcc cgg gag gag ttg agc 432His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser130 135 140aag aac aca gtc agc ttg aca tgc ctg atc aaa gac ttc ttc cca cct 480Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro145 150 155 160gac att gat gtg gag tgg cag agc ast gga cag cag gag cct gag agc 528Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser165 170 175aag tac cgc acg acc ccg ccc cag ctg gac gag gac ggg tcc tacttc 576Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe180 185 190ctg tac agc aag ctc tct gtg gac aag agc cgc tgg cag cgg gga gac 624Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp195 200 205acc ttc ata tgt gcg gtg atg cat gaa gct cta cac aac cac tac aca 672Thr Phe Ile Cys Ala Val Met Mis Glu Ala Leu His Ash His Tyr Thr210 215 220cag aaa tcc ctc tcc cat tct ccg ggt aaa 702Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys225 230<210>33<211>234<212>PRT<213>家犬<400>33Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Leu Gly Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val50 55 60Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln85 90 95Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala115 120 125His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser130 135 140Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro145 150 155 160Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser165 170 175Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe180 185 190Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp195 200 205Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr210 215 220Gln Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys225 230<210>34<211>552<212>DNA<213>家犬<220><221>CDS<222>(1)..(552)<223>Endostatin<400>34cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg gtg gcc ctg aac 48His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15agc ccg cag ccg ggc ggc atg cga ggc atc cgg gga gcg gac ttc cag 96Ser Pro Gln Pro Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30tgc ttc cag cag gcg cgc gcc gcg ggg ctg gcc ggc acc ttc cgg gcc 144Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Ala Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala35 40 45ttc ctg tcg tcg cgg ctg cag gac ctc tac agc atc gtg cgc cgc gcc 192Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60gac cgc acc ggg gtg ccc gtc gtc aac crc agg gac gag gtg crc ttc 240Asp Arg Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe65 70 75 80ccc agc tgg gag gcc tta ttc tcg ggc tcc gag ggc cag ctg aag ccc 288Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gln Leu Lys Pro85 90 95ggg gcc cgc atc ttc tct ttc gac ggc aga gat gtc ctg cag cac ccc 336Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gln His Pro100 105 110gcc tgg ccc cgg aag agc gtg tgg cac ggc tcc gac ccc agc ggg cgc 384Ala Trp Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg115 120 125cgc ctg acc gac agc tac tgc gag acg tgg cgg acg gag gcc ccg gcg 432Arg Leu Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala130 135 140gcc acc ggg cag gcg tcg tcg ctg ctg gcg ggc agg ctg ctg gag cag 480Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gln145 150 155 160gag gcc gcg agc tgc cgc cac gcc ttc gtg gtg ctc tgc atc gag aac 528Glu Ala Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175agc gtc atg acc tcc ttc tcc aag 552Ser Val Met Thr Ser Phe Ser Lys180<210>35<211>184<212>PRT<213>家犬<400>35His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn1 5 10 15Ser Pro Gln Pro Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln20 25 30Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Ala Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala
35 40 45Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala50 55 60Asp Arg Thr Gly Val Pro Val Val Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu Phe65 70 75 80Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Gln Leu Lys Pro85 90 95Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Gln His Pro100 105 11Ala Trp Pro Arg Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly Arg115 120 125Arg Leu Thr Asp Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ala130 135 140Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Glu Gln145 150 155 160Glu Ala Ala Ser Cys Arg His Ala Phe Val Val Leu Cys Ile Glu Asn165 170 175Ser Val Met Thr Ser Phe Ser Lys180<210>36<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述HindIII/DraIII接頭上鏈<220><221>CDS<222>(3)..(41)<400>36ag ctt cac acc cac cag gac ttc cag ccg gtg ctg cac ctg 41Leu His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu1 5 10<210>37<211>13<212>PRT<213>人工序列<400>37Leu His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu1 5 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Asn Tyr85 90 95gag ggc aaa att tcc aag aca aag tct gga ctc gag tgc caa gcc tgg336Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Lys Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp100 105 110aac tct caa acc cca cat gct cat gga tat att cct tcc aaa ttt cca384Asn Ser Gln Thr Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125agc aag aac ttg aag atg aat tac tgc cgt aac cct gat ggg gag ccc432Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140cgc cca tgg tgt ttc acc atg gat ccc aac aaa cgc tgg gaa ttc tgt 480Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys145 150 155 160gac att ccc cgc tgt aca aca cca cca ccc cct tcg ggc cca acg tac 528Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr165 170 175cag tgt ctg aag ggc aga ggg gag agc tac cga ggg aag gtg tcc gtc 576Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lys Val Ser Val180 185 190act gtc tct gga cat aca tgt cag cactgg agt gaa cag acc cct cac624Thr Val Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205aag cac aac agg acc cca gaa aac ttc cct tgc aaa aat ttg gat gaa 672Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu210 215 220aac tac tgt cgc aac cct gat gga gaa aca gct cca tgg tgc tac aca 720Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240acc aac agt gag gtg agg tgg gaa cac tgc cag att ccg tcc tgt gag 768Thr Asn Ser Glu Val Arg Trp Glu His Cys Gln Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255tcc tct cca ata acc aca gaa tat ttg gat gcc cca gct tca gtg cca 816Ser Ser Pro Ile Thr Thr Glu Tyr Leu Asp Ala Pro Ala Ser Val Pro260 265 270cct gaa caa act cct gtg gtc cag gag tgc tac cac ggc aat ggg cag 864Pro Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln275 280 285agt tat cga ggc aca tca tcc act act atc aca gga aga aaa tgt cag 912Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln290 295 300tct tgg tca tct atg aca cca cac cga cat gag aag acc cca gaa cac 960Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Glu His305 310 315 320ttc ccg gag gct ggc etg aca atg aac tac tgc agg aat ccc gac gcc 1008Phe Pro Glu Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala325 330 335gac aaa agc cct tgg tgt tac acc acc gac ccc tct gtg cgc tgg gag 1056Asp Lys Ser Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu340 345 350ttc tgt aac ttg aga aaa tgc 1077Phe Cys Asn Leu Arg Lys Cys355<210>40<211>359<212>PRT<213>家犬<400>40Ile Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Thr Tyr Arg Gly1 5 10 15Thr Met Ala Lys Thr Lys Asn Asp Val Ala Cys Gln Lys Trp Ser Asp20 25 30Asn Ser Pro His Lys Pro Asn Tyr Thr Pro Glu Lys His Pro Leu Glu35 40 45Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Glu Asn Gly50 55 60Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Asp Val Arg Phe Asp Tyr Cys Asn65 70 75 80Ile Pro Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr85 90 95Glu Gly Lys Ile Ser Lys Thr Lys Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp100 105 110Asn Ser Gin Thr Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro115 120 125Ser Lys Asn Leu Lys Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Pro130 135 140Arg Pro Trp Cys Phe Thr Met Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Phe Cys145 150 155 160Asp Ile Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr165 170 175Gln Cys Leu Lys Gly Arg Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Lys Val Ser Val180 185 190Thr Val Ser Gly Mis Thr Cys Gln His Trp Ser Glu Gln Thr Pro His195 200 205Lys His Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu210 215 220Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Glu Thr Ala Pro Trp Cys Tyr Thr225 230 235 240Thr ASn Ser Glu Val Arg Trp Glu His Cys Gln Ile Pro Ser Cys Glu245 250 255Ser Ser Pro Ile Thr Thr Glu Tyr Leu Asp Ala Pro Ala Ser Val Pro260 265 270Pro Glu Gln Thr Pro Val Val Gln Glu Cys Tyr His Gly Asn Gly Gln275 280 285Ser Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Ile Thr Gly Arg Lys Cys Gln290 295 300Ser Trp Ser Ser Met Thr Pro His Arg His Glu Lys Thr Pro Glu His305 310 315 320Phe Pro Glu Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala325 330 335Asp Lys Ser Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu340 345 350Phe Cys Asn Leu Arg Lys Cys355<210>41<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述其中終止密碼子TGA后為XhoI終點的回文接頭<400>41tgactcgagt ca12<210>42<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于鼠制管張素的誘變引物<220><221>CDS<222>(1)..(21)<400>42ggg cct tgg agc tac act aca 21Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr1 5<210>43<211>7<212>PRT<213>人工序列<400>43Gly Pro Trp Ser Tyr Thr Thr1 5<210>44<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于在鼠制管張素中導(dǎo)入HindIII的引物<220><221>CDS<222>(9)..(32)<400>44gcggatcc aag ctt agt aca cat ccc aat gag gg 34Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu1 5<210>45<211>8<212>PRT<213>人工序列<400>45Lys Leu Ser Thr His Pro Asn Glu1 5<210>46<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述BspHI/BamHI接頭上鏈<220><221>CDS<222>(2)..(58)<400>46c atg acc tct ttc tcc aaa tcg agc ggg ggc agc ggg ggc gga ggc agc 49Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15ggc ggg ggc g 59Gly Gly Gly<210>47<211>19<212>PRT<213>人工序列<400>47Met Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15Gly Gly 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1.編碼一種融合蛋白的DNA分子，它包括(a)信號序列；(b)免疫球蛋白Fc區(qū)；和(c)靶蛋白序列，該靶蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。
2.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述信號序列、所述免疫球蛋白Fc區(qū)和所述靶蛋白序列從5’到3’方向按順序編碼。
3.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述信號序列、所述靶蛋白序列和所述免疫球蛋白Fc區(qū)從5’到3’方向依次編碼。
4.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)包含一個免疫球蛋白鉸鏈區(qū)。
5.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)包含一個免疫球蛋白鉸鏈區(qū)和一個免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)包含一個鉸鏈區(qū)和一個CH3結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)缺乏至少所述CH1結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1的所述DNA，其中所述免疫球蛋白Fc區(qū)編碼至少一部分免疫球蛋白γ。
9.用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞的復(fù)制型表達載體，所述載體包含權(quán)利要求1的所述DNA。
10.包含權(quán)利要求1的所述DNA的哺乳動物細胞。
11.包含免疫球蛋白Fc區(qū)和靶蛋白的融合蛋白，其中所述靶蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段、具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段和它們的組合物。
12.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述纖溶酶原片段的分子量約為40kD并包含SEQ ID NO3所示氨基酸序列。
13.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白包含SEQ IDNO3所示氨基酸序列。
14.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述膠原蛋白XVIII片段包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列。
15.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白包含至少兩種選自制管張素、endostatin、纖溶酶原片段和膠原蛋白XVIII片段的分子，其中將所述兩種分子通過一個多肽接頭連接。
16.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端。
17.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，其中所述靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端。
18.一種多聚體蛋白，它包含至少兩種權(quán)利要求11的通過二硫鍵連接的融合蛋白。
19.權(quán)利要求18的所述多聚體蛋白，其中至少一種所述融合蛋白的靶蛋白為制管張素，而至少一種所述融合蛋白的靶蛋白為endostatin。
20.權(quán)利要求18的所述多聚體蛋白，其中兩種所述融合蛋白的靶蛋白均為制管張素。
21.權(quán)利要求18的所述多聚體蛋白，其中兩種所述融合蛋白的靶蛋白均為endostatin。
22.權(quán)利要求11的所述融合蛋白，它還包含一個第二靶蛋白，所述第二靶蛋白選自制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段和具有endostatin活性的膠原蛋白XVIII片段。
23.權(quán)利要求22的所述融合蛋白，其中所述第二靶蛋白通過多肽接頭連接到所述第一靶蛋白。
24.權(quán)利要求22的所述融合蛋白，其中所述第一靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區(qū)的N-末端，而所述第二靶蛋白連接到所述免疫球蛋白Fc區(qū)的C-末端。
25.一種多聚體融合蛋白，它包含至少兩種權(quán)利要求11的融合蛋白，其中所述融合蛋白通過多肽鍵連接。
26.產(chǎn)生融合蛋白的方法，所述方法包括以下步驟a)提供權(quán)利要求10的所述哺乳動物細胞；和b)培養(yǎng)所述哺乳動物細胞以生產(chǎn)所述融合蛋白。
27.權(quán)利要求26的所述方法，它包括收集所述靶蛋白的附加步驟。
28.權(quán)利要求26的所述方法，它包括從所述靶蛋白切除所述免疫球蛋白Fc區(qū)的附加步驟。
29.治療血管生成性疾病的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的所述DNA給予需要血管生成抑制劑的哺乳動物的步驟。
30.治療血管生成性疾病的方法，該方法包括將權(quán)利要求9的所述載體給予需要血管生成抑制劑的哺乳動物的步驟。
31.通過給予制管張素或endostatin緩解病情的治療方法，該方法包括將有效量權(quán)利要求11的所述融合蛋白給予患所述疾病的哺乳動物的步驟。
全文摘要
所公開的內(nèi)容為編碼一種免疫球蛋白Fc－血管生成抑制劑融合蛋白的核苷酸序列,例如DNA序列或RNA序列。所述血管生成抑制劑可以是制管張素、endostatin、具有制管張素活性的纖溶酶原片段或具有endostatin活性的膠原蛋白ⅩⅧ片段。可以將所述核苷酸序列插入到合適的表達載體中并在哺乳動物細胞中表達。此外所公開的內(nèi)容還有通過表達這種核苷酸序列生產(chǎn)一系列免疫球蛋白Fc－血管生成抑制劑融合蛋白。所公開的內(nèi)容還有使用這種核苷酸序列和融合蛋白治療血管生成性疾病的方法。
文檔編號C07K19/00GK1326467SQ99812456
公開日2001年12月12日 申請日期1999年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月25日
發(fā)明者K·M·羅, Y·李, S·D·吉利斯 申請人:利思進藥品公司