專利名稱：新的neuropilin/生長因子結(jié)合及其應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及Neuropilin(NP-1)受體和選自以下一組的生長因子的復(fù)合物，及用這種復(fù)合物誘導(dǎo)或拮抗由一或多種所述生長因子介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的方法，及分離的結(jié)合配偶體，如與一或多種生長因子和NP-1的復(fù)合物結(jié)合的抗體，所述生長因子的組為血管內(nèi)皮生長因子-B167(VEGF-B167)血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)，血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)和加工形式的血管內(nèi)皮生長因子-B186(加工的VEGF-B186)。
在胚胎發(fā)育中，初級血管網(wǎng)是在稱為血管生成的過程中，通過中胚層細(xì)胞原位分化而建立的。據(jù)信包含胚胎新血管生成及成體新血管化的所有后繼過程都受稱為血管生成過程中預(yù)先存在的血管結(jié)構(gòu)中新毛細(xì)管的萌生及分裂的影響。(Popper等，酶及蛋白質(zhì)，199649138-162；Breier等，Dev.Dyn.1995204228-239；Risau，自然，1997386 671-674)。血管生成不僅參于胚胎發(fā)育和新組織生長，修復(fù)及再生中，也參于女性月經(jīng)周期，妊娠期及參于傷口及創(chuàng)傷的修復(fù)中。血管生成除發(fā)生在正常機(jī)體之外，還包含于許多病理過程，特別是腫瘤生長及轉(zhuǎn)移，及其它疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變，銀屑病及關(guān)節(jié)病，其中血管增殖尤其微血管系統(tǒng)增殖是增加的。抑制血管生成可用于預(yù)防或減輕這些病理狀況。
另一方面，啟動血管生成在血管待建立或延伸之處是所需的，例如在組織或器官移植之后，或刺激梗塞組織或狹窄動脈中建立側(cè)支循環(huán)如在冠心病及閉塞性脈管炎中。
血管生成是高度復(fù)雜的，包含保持細(xì)胞周期中的內(nèi)皮細(xì)胞，胞外基質(zhì)的降解，遷移并侵染周圍組織，最后血管形成。復(fù)雜血管生成過程的分子機(jī)制基礎(chǔ)遠(yuǎn)未明了。
由于血管生成在如此多的生理及病理進(jìn)程中起關(guān)鍵作用，因此對參于調(diào)節(jié)血管生成中的因子已深入研究。許多生長因子已示出參于血管生成的調(diào)節(jié)當(dāng)中，包括成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)，及肝細(xì)胞生長因子(HGF)。例如參見Folkman等，生物化學(xué)雜志1992,267,10931-10934。
已提示內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子的一特定家族，血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)及其相應(yīng)受體主要負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞生長和分化的刺激，及分化的細(xì)胞的某些功能。這些因子是PDGF家族成員，并呈現(xiàn)主要通過內(nèi)皮受體酪氨酸激酶(RTKs)起作用。
在PDGF家族中已鑒別9種不同的蛋白質(zhì)，二種是PDGFs(A和B)，一種是VEGF，其它六種是與VEGF密切相關(guān)的成員。此六種與VEGF密切相關(guān)的成員是VEGF-B，見于路德維格癌癥研究所及赫爾辛基大學(xué)的國際專利申請PCT/US96/02957(WO96/26736)及美國專利5,840,693和5,607,918中所述；VEGF-C見于Joukov等，EMBO雜志，199615290-298及Lee等，美國科學(xué)院院報199693 1988-1992所述；VEGF-D，見于國際專利申請No.PCT/US97/14696(WO98/07832)及Achen等，美國科學(xué)院院報199895548-553所述；胎盤生長因子(PlGF)，見于Maglione等，美國科學(xué)院院報1991,889267-9271所述；VEGF2，見于人體基因組科學(xué)有限公司的國際專利申請No.PCT/US94/05291(WO95/24473)所述；和VEGF3，見于人體基因組科學(xué)有限公司的國際專利申請No.PCT/US95/07283(WO96/39421)所述。每個VEGF家族成員與VEGF氨基酸序列具有30％-45％的相同性。VEGF家族成員共享的VEGF同源結(jié)構(gòu)域含有形成半胱氨酸結(jié)基序的6個半胱氨酸殘基。VEGF家族的功能特點包括改變內(nèi)皮細(xì)胞遷移程度，誘導(dǎo)血管通透性和血管生成及淋巴管生成性。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是已從幾種來源中分離出的同源二聚體糖蛋白。VEGF呈現(xiàn)對內(nèi)皮細(xì)胞高特異性促有絲分裂活性。VEGF在胚胎血管生成期間新血管形成及成體生命期間血管生成中有重要調(diào)節(jié)功能(Carmeliet等，自然1996380435-439；Ferrara等，自然，1996380439-442；Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.,1997 184-25)。VEGF所起的明顯作用已研究證實，示出單一VEGF等位基因的失活會產(chǎn)生由于血管結(jié)構(gòu)不能發(fā)育而導(dǎo)致的胚胎死亡(Carmeliet等，自然，1996 380 435-439；Ferrara等，自然，1996 380 439-442)。VEGF除具有強(qiáng)的朝向單核細(xì)胞的趨化活性之外，還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活物抑制劑，并還能誘導(dǎo)血管通透性。由于其誘導(dǎo)微血管通透性，有時將其稱為血管通透性因子(VPF)。VEGF的分離及性質(zhì)參見Ferrara等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，1991 47 211-218，及Connolly，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，1991 47 219-223。單一VEGF基因的可變mRNA剪切產(chǎn)生5個同種型VEGF。
VEGF-B與VEGF具有相似血管生成及其它性質(zhì)，但在組織中分布與表達(dá)不同于VEGF。特別地，VEGF-B在心臟中強(qiáng)烈表達(dá)，在肺中只微弱表達(dá)，而VEGF正相反。由此推測VEGF與VEGF-B盡管在一些組織中共表達(dá)，但也存在功能差異。VEGF-B在體內(nèi)和體外均能促進(jìn)低濃度VEGF的促有絲分裂活性。
VEGF-B是用酵母共雜交相互作用阱篩選技術(shù)，通過篩選可與細(xì)胞類樹脂酸結(jié)合蛋白I(CRABP-I)相互作用的細(xì)胞蛋白而分離的。VEGF-B的分離及特點見于PCT/JS96/02957及Olofsson等，美國科學(xué)院院報1996932576-2581所述。
VEGF-C分離自PC-3前列腺癌細(xì)胞系(CRL1435)的條件培養(yǎng)基，通過用轉(zhuǎn)染而表達(dá)VEGFR-3的細(xì)胞篩選培養(yǎng)基產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)的酪氨酸磷酸化的能力。VEGF-C是用重組VEGFR-3經(jīng)親和層析純化的，并克隆自PV-3DNA文庫。VEGF-C的分離及特點見于Joukov等，EMBO雜志，199615290-298所述。
VEGF-D分離自購于Clontech的人乳腺cDNA文庫，通過用得自稱為“Soares Breast 3NbHBst”的人cDNA文庫的表達(dá)的序列標(biāo)記作雜交探針篩選而獲得(Acher等，美國科學(xué)院院報，1998 95 548-553)。VEGF-D的分離及特點見于國際專利申請No.PCT/US97/146966(WO98/07832)所述。
VEGF-D基因在成年人中廣泛表達(dá)，但不是遍在地表達(dá)。VEGF-D在心臟，肺及骨骼肌中強(qiáng)表達(dá)。VEGF-D在脾，卵巢，小腸及結(jié)腸中中度表達(dá)，在腎，胰腺，胸腺，前列腺和睪丸中低度表達(dá)。在來自腦，胎盤，肝或周圍血白細(xì)胞的RNA中未檢測到VEGF-DmRNA。
PlGF分離自胎盤cDNA文庫。其分離與特點見于Maglione等，美國科學(xué)院院報，1991 88 9267-9271所述。目前其生物學(xué)功能還不十分清楚。
VEGF2分離自高度致瘤性不依賴于雌激素的人乳腺癌細(xì)胞系。盡管此分子據(jù)稱與PDGF有22％同源性，與VEGF有30％同源性，但是編碼VEGF2的基因的分離方法不清楚且還未公開對其生物學(xué)活性的鑒定。
VEGF3分離自衍生自結(jié)腸組織的cDNA文庫。VEGF3與VEGF有大約36％相同性和66％相似性。分離編碼VEGF3的基因的方法還不清楚，其生物活性特點也未揭示。
兩個蛋白質(zhì)間相似性通過對比氨基酸序列及一個蛋白質(zhì)對另一個蛋白質(zhì)序列的保守氨基酸取代而確定，而相同性的確定不包括保守氨基酸取代。
VEGF-B與VEGF呈大約40～50％的序列相同性，并與PlGF呈大約30％序列相同性。PlGF和VEGF-B mRNA的可變剪切分別產(chǎn)生二個同種型蛋白質(zhì)PlGF-1和PlGF-2,VEGF-B167和VEGF-B168(Hauser等，生長因子9:259(1993))，所有這些蛋白質(zhì)均與Flt-1結(jié)合。在這兩種情況中，這些同種型蛋白之一PlGF-2和VEGF-B167具有與細(xì)胞表面肝素硫酸蛋白聚糖(HSPGs)結(jié)合的堿性C-末端，并可由肝素釋放。此肝素結(jié)合區(qū)類似于由VEGF基因外顯子7編碼的氨基酸序列。
VEGF-C和VEGF-D不同于VEGF家族的其它成員，它們在VEGF-同源結(jié)構(gòu)域兩側(cè)有N-和C-末端延伸，并且是蛋白酶解加工的(Joukov等，EMBO雜志16:3898(1997)；Acher等，美國科學(xué)院院報，95:548(1988))。另外，VEGF-C已知不與肝素結(jié)合，而VEGF-B167和一些VEGF(VEGF165,VEGF189和VEGF206)與肝素結(jié)合。成熟形式的VEGF-D缺失VEGF/PlGF特征性肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多堿性區(qū)。
PDGF/VEGF家族成員通過與受體酪氨酸激酶結(jié)合而發(fā)揮作用。已鑒別5種內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶，稱為VEGFR-1(Fit-1),VEGFR-2(KDR/Flk-1),VEGFR-3(Flt4),Tie和Tek/Tie-2。所有這些均有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的固有酪氨酸激酶活性。VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3,Tie和Tek/Tie-2在脈管生成及血管生成中的必需性及特異性，已通過定向突變滅活鼠胚胎中的這些受體而證實。
已知與VEGFs結(jié)合的一受體酪氨酸激酶是Flt-1/VEGF-1(Shibuya等，Oncogene,5:519-524(1990)；Vries等，科學(xué)255:989-991(1992))；Flk-1/KDR/VEGFR-2(Matthews等，美國科學(xué)院院報88:9026-30(1991)；Terman等，生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊187:1579-86(1992)；Millauer等，細(xì)胞72:835-46(1993))；和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2與VEGF高親和性結(jié)合，且VEGFR-1還結(jié)合VEGF-B和PlGF。VEGF-C也示出是VEGFR-3的配體，且其還激活VEGFR-2(Joukov等，EMBO雜志，1996 15 290-298)。VEGF-D與VEGFR-2和VEGFR-3均結(jié)合。Tek/Tie-2的配體見于Regeneron Pharmaceuticals公司的國際專利申請No.PCT/JS95/12935(WO96/11269)所述。Tie的配體還未鑒別。
VEGFR-1,VEGFR-2和VEGFR-3通過不同內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。VEGFR-1和VEGFR-2均在血管內(nèi)皮中表達(dá)(Oelrichs等，Oncogene,1992 8 11-18；Kaipainen等，J.Exp.Med.,1993 178 2077-2088；Dumont等.，Dev.Dyn.,1995 203 80-92；Fong等，Dev.Dyn.,1996 207 1-10),VEGFR-3大部分在成體組織的淋巴內(nèi)皮中表達(dá)(Kaipainen等，美國科學(xué)院院報1995 9 3566-3570)。VEGFR-3還在腫瘤周圍的血管中表達(dá)。
VEGFR基因的破壞導(dǎo)致脈管結(jié)構(gòu)發(fā)育異常而在妊娠中期引起胚胎死亡。對攜帶完全失活的VEGFR-1基因的胚胎進(jìn)行分析提示此受體是內(nèi)皮的功能結(jié)構(gòu)所需的(Fong等，自然，1995 376 66-70)。然而，VEGFR-1的胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)的缺失產(chǎn)生具有正常血管結(jié)構(gòu)的存活小鼠(Hiratsuka等，美國科學(xué)院院報1998 95 9349-9354)。這些差異存在的原因尚待解釋，但提示由酪氨酸激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的受體不是VEGFR-1的合適功能所需的。對具有VEGFR-2的失活的等位基因的純合小鼠進(jìn)行分析提示此受體是內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血細(xì)胞生成及脈管生成所必需的(Shalaby等，自然，1995 376 62-66；Shalaby等，細(xì)胞，1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活導(dǎo)致由于大血管的異常結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致的心血管疾病(Dumont等，科學(xué)，1998 282 946-949)。
盡管VEGFR-1主要在發(fā)育期間的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其在胚胎發(fā)育的早期階段也可見于造血前體細(xì)胞中(Fong等，自然，1995 37666-70)。在成體中，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表達(dá)此受體(Barleon等，血液，1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1由大多數(shù)(如果不是全部)血管表達(dá)(Breier等，Dev.Dyn.1995 204-228-239；Fong等，Dev.Dyn,1996 207 1-10)。
受體VEGFR-3在胚胎發(fā)育早期在內(nèi)皮細(xì)胞上廣泛表達(dá)，但隨著胚胎發(fā)育逐漸限于靜脈內(nèi)皮，然后淋巴內(nèi)皮(Kaipainen等，癌癥研究，1994 92 3566-3570)。VEGFR-3在成體組織中的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。此受體是胎胚發(fā)育期間脈管發(fā)育所必需的。定向失活鼠VEGFR-3基因的二個拷貝導(dǎo)致特征在于具有缺陷管腔的異常結(jié)構(gòu)的大血管的缺陷血管形成，在性交后9.5天引起心包腔內(nèi)液體積聚和冠心病?；谶@些發(fā)現(xiàn)已提出VEGFR-3是初級血管長成較大血管所必需的。然而，在這些鼠淋巴管的發(fā)育中VEGFR-3的作用未能研究，因為在淋巴系統(tǒng)形成之前胚胎死去。不過可設(shè)想VEGFR-3在胚胎發(fā)育和成體生存期間在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，從而在淋巴管發(fā)育及淋巴管生成中起作用。這可由發(fā)現(xiàn)VEGFR-3的配體VEGF-C在轉(zhuǎn)基因鼠的皮膚中的異位表達(dá)，導(dǎo)致真皮中淋巴內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管擴(kuò)大而證實。進(jìn)一步可推測VEGF-C可在淋巴內(nèi)皮中具有主要功能，在血管生成及通透性調(diào)節(jié)方面呈現(xiàn)與VEGF共享的次要功能(Joukov等，EMBO雜志，1996 15 290-298)。
VEGF/VEGF受體系統(tǒng)的一些抑制劑已顯示出通過抗血管生成機(jī)制而阻止腫瘤生長，見于Kim等，自然，1993 62 841-844和Saleh等，癌癥研究，1996 56 393-401所述。
近年來，已經(jīng)純化并克隆一種新的130-135kDa VEGF同種型特異受體(Soker等，細(xì)胞，1998 735-735)。發(fā)現(xiàn)此VEGF受體與VEGF165同種型通過對肝素呈微弱親和性的外顯子7編碼的序列而特異結(jié)合(Soker等，細(xì)胞，1998 92 735-745)。令人驚奇地，此受體呈現(xiàn)與人Neuropilin-1(NP-1)相同，NP-1是一種參與早期神經(jīng)形態(tài)發(fā)生的受體。PlGF-2似乎也與NP-1相互作用(Migdal等，生物化學(xué)雜志，1998 273 22272-22278)。NP-1表達(dá)增強(qiáng)VEGF165與KDR的結(jié)合，并增強(qiáng)VEGF165的生物活性(Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998))。
NP-1已鑒別為是一受體，其介導(dǎo)腦衰蛋白/semaphorins(腦衰蛋白-1/SemaⅢ/Sema D)的化學(xué)排斥活性，腦衰蛋白/semaphorins是具有排斥錐體和軸突指導(dǎo)功能的跨膜及分泌糖蛋白的一個大家族(Kolodkin等，細(xì)胞，75:1389-1399(1993)；Zhigang等，細(xì)胞，90:739-751(1997)；Kolodkin等，細(xì)胞，90:753-762(1997))。SemaⅢ與NP-1結(jié)合的Kd為2-3×10-10M,VEGF165與NP-1結(jié)合的Kd為2-3×10-10M，二者相似(Zhigang等，細(xì)胞，90:739-751(1997)；Kolodkin等，細(xì)胞90:753-761；Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998))。由于兩種具有明顯不同生物活性(即VEGF刺激血管生成及SemaⅢ化學(xué)排斥神經(jīng)細(xì)胞)的不同結(jié)構(gòu)的配體與相同受體結(jié)合并具有相似親和性，此發(fā)現(xiàn)是非常令人驚奇的。
發(fā)現(xiàn)NP-1在一些腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)，并在VEGF-B是高表達(dá)的一些器官中較突出，如心臟，胰腺及骨骼肌。
發(fā)明概述本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186均能與NP-1的胞外域結(jié)合，形成介導(dǎo)有效的細(xì)胞應(yīng)答和/或拮抗非所需生物活性的生物活性復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)VEGF-B167通過負(fù)責(zé)肝素結(jié)合的區(qū)域中外顯子6B編碼的序列與NP-1受體結(jié)合。結(jié)合也可發(fā)生在NP-1與PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186之間。
由于可變剪接的結(jié)果，VEGF-B有各種同種型。VEGF-B167由外顯子1～5加上外顯子6B和外顯子7組成，外顯子7中有終止密碼子。VEGF-B186由外顯子1～5加上外顯子6A組成，且其終止于外顯子6B，但不同于VEGF-B167的外顯子6B所用讀框。外顯子7在VEGF-B186中不翻譯。如上所述，VEGF-B167與NP-1結(jié)合。僅表達(dá)外顯子1-5的構(gòu)建體的產(chǎn)物(鼠VEGF-BkEx1-5，如PCT/US97/23533所述，該文獻(xiàn)引入本文作參考)不與NP-1結(jié)合這一事實表明結(jié)合位點不在外顯子1-5中。相似地，加工的VEGF-B186不含有外顯子7的表達(dá)產(chǎn)物，但仍結(jié)合NP-1的事實表明VEGF-B167的VEGF-B外顯子6B編碼的區(qū)域結(jié)合NP-1。
加工形式的VEGF-B186也能結(jié)合NP-1，且也不含有外顯子6B。盡管還未知產(chǎn)生不同于全長形式的加工形式的VEGF-B186的切割位點的位置，但此加工形式的VEGF-B186包含外顯子1～5和至少部分外顯子6A。因此，在部分外顯子6A中也許有第二個結(jié)合位點，其在加工的VEGF-B186中表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D和其它配體是模塊結(jié)構(gòu)，因為各結(jié)構(gòu)域在可以分別表達(dá)且互相分離。在細(xì)胞表面，VEGF-B167的一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合Flt-1，另一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合Neuropilin和肝素硫酸鹽。此獨(dú)立的模塊性及可分離性可例如通過連接共受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域而利用。
還發(fā)現(xiàn)VEGF-C與VEGFR-2和VEGFR-3及Neuropilin受體結(jié)合。VEGF-C△N△C不與NP-1結(jié)合而全長VEGF-C與之結(jié)合。
人VEGF-B的氨基酸序列參見Eriksson等的PCT申請公開No.WO96/26736(Gen Bank數(shù)據(jù)庫登記號No.U52819)所述。NP-1的氨基酸或核苷酸序列參見Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998)(EMBL數(shù)據(jù)庫登記號No.AF016050)所述。分析內(nèi)皮細(xì)胞增殖的一有效方法如Olofsson等，美國科學(xué)院院報93:2576-81(1996)所述。
含有受體蛋白的樣品例如可以是在正常表達(dá)受體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中自然產(chǎn)生的可溶的NP-1受體。通過蛋白酶解從細(xì)胞中天然脫落的組織樣品或組織液也可以用作受體樣品。
類似物或功能類似物指相應(yīng)多肽的修飾的形式，其中至少有一個氨基酸取代，這樣的類似物在體內(nèi)和/或體外基本保留與未修飾的多肽相同的生物活性。另外，本發(fā)明鑒別的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的類似物可以是小分子，例如蛋白質(zhì)或肽或非蛋白質(zhì)化合物。類似物也可包括用毒素或藥物或放射性同位素標(biāo)記的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D，加工的VEGF-B186或其衍生物(包括但非限于單體或二聚體的片段)，這些標(biāo)記可靶向在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)及正調(diào)節(jié)的NP-1。這種分子可用于拮抗或抑制由生長因子的VEGF-家族成員誘導(dǎo)的不需要的細(xì)胞應(yīng)答，如腫瘤誘導(dǎo)的血管生成或牛皮癬或視網(wǎng)膜病變，可通過類似于Kim等所述方法(自然，362:1480-87(1994))進(jìn)行。
廢除NP-1與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186之間的相互作用可減輕在癌癥中的生物學(xué)活性。也可能的是VEGF-B167不經(jīng)Flt-1而經(jīng)NP-1通過仍未知機(jī)制在細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可存在于表達(dá)NP-1的正?；虬┘?xì)胞中。抑制此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的處理可用于治療和/或調(diào)節(jié)正常或病理血管形成。
分離NP-1與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的復(fù)合物的步驟包括使用NP-1受體，優(yōu)選NP-1的胞外域與免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠A結(jié)合而進(jìn)行。或者不使用瓊脂糖凝膠A而使用離子交換層析，凝膠過濾或親和層析。含有受體/IgG融合蛋白的條件培養(yǎng)基與用編碼各個生長因子配體或其類似物的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或天然表達(dá)配體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基相互作用，或與含有候選配體類似物的溶液相互作用。表達(dá)NP-1-IgG融合蛋白的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可經(jīng)過瓊脂糖凝膠A層析柱或基質(zhì)以固定受體，或者融合蛋白在ELISA測定中可固定在纖維素圓盤中或吸附在塑料圓盤上。含有表達(dá)配體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的第二種溶液然后經(jīng)過固定的受體。如果需要。此配體可放射標(biāo)記以易于通過放射分析測定結(jié)合的配體數(shù)量。
這種分析可用于篩選包含NP-1受體過表達(dá)的情況，即通過檢測與對照組相比較結(jié)合放射性的提高而篩選。此方法也可用于篩選與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和/或加工的VEGF-B186相競爭的類似物的存在與否，即通過檢測與對照組相比較結(jié)合放射性的降低，而指示用于測試中的放射標(biāo)記的配體與非放射性的推定類似物之間的競爭。
對VEGF家族成員的可檢測細(xì)胞應(yīng)答例如包括內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管生成，受體的酪氨酸磷酸化，及細(xì)胞遷移。同種型特異誘導(dǎo)可實現(xiàn)。特例包括尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)誘導(dǎo)，內(nèi)皮細(xì)胞遷移和一些內(nèi)皮細(xì)胞類型的生長刺激。管形成也是可能的。
表達(dá)受體蛋白或其一部分的細(xì)胞可以是天然表達(dá)此受體的細(xì)胞，或者可以是其中導(dǎo)入編碼此受體或其一部分的核酸的細(xì)胞，這樣此受體蛋白或其一部分被表達(dá)。可轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼Neuropilin的核酸，以提高在體外和在體內(nèi)細(xì)胞中的表達(dá)。在不表達(dá)Neuropilin的細(xì)胞中的表達(dá)(如造血細(xì)胞，見Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998))應(yīng)使它們對誘導(dǎo)更易應(yīng)答。應(yīng)通過VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186誘導(dǎo)，但不應(yīng)通過未加工的(即全長的)VEGF-B186誘導(dǎo)。同樣，通過與那些表達(dá)特定RTK的細(xì)胞毗鄰的細(xì)胞對NP-1或其一部分的表達(dá)也可調(diào)節(jié)RTK的有效濃度和/或由RTK進(jìn)行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
當(dāng)本文涉及導(dǎo)入編碼NP-1，其胞外域，結(jié)合配體的片段或其類似物，或與VEGF-B167或VEGF-C有結(jié)合親和性并由在嚴(yán)格條件下與編碼結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈的核苷酸序列時，其可以經(jīng)用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，或用病毒載體(如腺病毒，痘病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染，或用細(xì)菌載體(如BCG)體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)染，或注射裸DNA進(jìn)行。
肝素通過那些結(jié)合肝素的生長因子可調(diào)節(jié)NP-1結(jié)合，且一堿性肝素結(jié)合肽可不依賴于直接NP-1相互作用而調(diào)節(jié)NP-1結(jié)合。VEGF-C不結(jié)合肝素，因此VEGF-C不能進(jìn)行肝素調(diào)節(jié)。
或者，前述分析通過固定VEGF-B167配體或候選類似物，并將固定的配體與表達(dá)受體或其一部分的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基接觸而進(jìn)行，受體的一部分如是胞外域或結(jié)合配體的片段。
檢測蛋白質(zhì)/受體結(jié)合的方法可包括檢測VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或它們的類似物與NP-1受體蛋白或其一部分的特異結(jié)合的方法，或檢測由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答，如uPA和PAI-1誘導(dǎo)，及受體磷酸化。
本發(fā)明的另一方面涉及一種含有兩種分子的分離的配體一受體復(fù)合物，所述分子之一為所述配體，并含有VEGF-B167，加工的VEGF-B186,VEGF-C和VEGF-D的NP-1結(jié)合序列(例如，VEGF-B167的外顯子6B編碼的序列)，第二種所述分子為所述受體，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合VEGF-C、結(jié)合VEGF-D或結(jié)合加工的VEGF-B186的NP-1的受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、VEGF-C、VEGF-D或加工的VEGF-B186有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。優(yōu)選的受體是NP-1受體，且配體包括VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1結(jié)合序列(例如，VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合序列)。
配體或復(fù)合物的分離與純化可通過常規(guī)方法進(jìn)行，如根據(jù)Harlow等，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室出版(1988)和/或Marshak等，蛋白質(zhì)純化及定性方案，冷泉港實驗室出版(1996)所述方法，用單克隆抗體進(jìn)行免疫親和性純化。各個配體或復(fù)合物的適當(dāng)抗體可通過常規(guī)方法產(chǎn)生。
一種無細(xì)胞復(fù)合物可體內(nèi)或體外使用以競爭VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與受體的結(jié)合，或防止在配體結(jié)合后細(xì)胞結(jié)合的受體二聚體化。這種無細(xì)胞復(fù)合物包含至少一個受體分子例如可溶的NP-1(sNP-1)，和一個二聚體分子。sNP-1是一種非膜結(jié)合蛋白及受體的一部分，如NP-1的胞外域或結(jié)合配體的片段。二聚體分子可以是VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或它們的類似物的同源二聚體或混合的二聚體。二聚體的一個分子可與復(fù)合物中的受體分子結(jié)合，另一個分子具有能與細(xì)胞表面受體結(jié)合的游離結(jié)合位點。
本發(fā)明另一方面提供了一種與配體一受體復(fù)合物上的表位有特異結(jié)合親和性的分離的結(jié)合配偶體，所述復(fù)合物包含VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186蛋白或其類似物，所述蛋白與選自如下一組的一種受體的結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域有特異結(jié)合相互作用，所述的組為包含NP-1的氨基酸序列，NP-1的胞外域或結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，與NP-1的結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、VEGF-C、VEGF-D或加工的VEGF-B186的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，或與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼NP-1結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈；其中該結(jié)合配偶體基本上與未復(fù)合的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其類似物無結(jié)合親和性。嚴(yán)格雜交條件例如如下所述在42℃在5×SSC,20mM NaPO4,pH 6.8,50％甲酰胺中雜交；并在42℃在0.2×SSC中沖洗。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白基于被雜交序列的長度及GC核苷酸基本含量可改變這些條件，還了解存在確定這種變化的公式。例如參見Sambrook等“分子克隆實驗手冊”，第二版，P9.47-9.51，冷泉港，紐約冷泉港實驗室(1989)。優(yōu)選地此結(jié)合配偶體也基本上與任何未復(fù)合的受體蛋白或其受體類似物無結(jié)合親和性。此結(jié)合配偶體可以是與這種生長因子/受體復(fù)合物反應(yīng)或識別其的抗體?？墒褂枚嗫寺』騿慰寺】贵w，但優(yōu)選單克隆抗體。這種抗體可通過標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)，篩選出那些分別結(jié)合受體或配體的抗體。
如本申請所用，序列相同性百分率是通過用Lasergene程序包的“MEGALIGN”序列對比工具(DNASTAR,Ltd.Abacus House,ManorRoad,West Ealing,London W130AS United Kingdom)并利用其預(yù)設(shè)條件進(jìn)行測定的。此序列對比然后手工校正，并在適于對比的區(qū)域內(nèi)估算相同性數(shù)目。
本發(fā)明另一方面涉及VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的根據(jù)上述方法獲得的拮抗劑的如下應(yīng)用，(ⅰ)拮抗VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(ⅱ)拮抗由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
一優(yōu)選的拮抗劑包括一種抗體，該抗體與以下結(jié)構(gòu)有結(jié)合特異性(ⅰ)一蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該蛋白質(zhì)具有包含NP-1的氨基酸序列，結(jié)合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186并與NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少90％氨基酸相同性的其類似物的氨基酸序列的多肽鏈，或者具有與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有結(jié)合親和性并由在嚴(yán)格條件下與編碼NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈；或(ⅱ)與NP-1受體有結(jié)合親和性并包含VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1結(jié)合序列的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合序列)。
與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有結(jié)合親和性的蛋白質(zhì)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)至少90％，優(yōu)選至少95％的氨基酸相同性并且特別優(yōu)選與其相應(yīng)。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186類似物的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1結(jié)合序列(例如VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合序列)呈現(xiàn)至少90％，優(yōu)選至少95％的序列相同性且特別優(yōu)選與其相應(yīng)。
本發(fā)明另一方面涉及一種受體蛋白的應(yīng)用，該受體蛋白選自包含NP-1的氨基酸序列，NP-1的胞外域的氨基酸序列，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或其結(jié)合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186并與NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有至少90％氨基酸相同性的類似物的氨基酸序列的多肽鏈，或者與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有結(jié)合親和性并由在嚴(yán)格條件下與編碼NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈；所述應(yīng)用為用在一種方法中以拮抗(a)VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與蛋白質(zhì)如細(xì)胞表面受體的結(jié)合，或(b)誘導(dǎo)由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。
多肽鏈與各個生長因子的細(xì)胞表面受體相競爭，并占據(jù)可用的生長因子，從而防止生長因子與細(xì)胞表面受體的有效相互作用，并防止誘導(dǎo)由該生長因子正常介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答。一適當(dāng)?shù)碾逆溈梢允强扇苄问降氖荏w(sNP-1)，如Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998)所述。
本發(fā)明另一方面提供了一種識別VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方法，該方法包括提供與NP-1的氨基酸序列或其結(jié)合VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的受體的序列變體有結(jié)合特異性的蛋白質(zhì)，其中此蛋白質(zhì)與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1結(jié)合序列有至少90％，優(yōu)選至少95％的氨基酸序列相同性，這樣此蛋白質(zhì)當(dāng)提供給表達(dá)細(xì)胞表面受體的細(xì)胞時，能與受體特異作用，從而基本上抑制VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與受體的結(jié)合。該蛋白質(zhì)可以是根據(jù)上述一種方法的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的類似物，優(yōu)選是不誘導(dǎo)由VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186介導(dǎo)的細(xì)胞活性的類似物。
Neuropilin中的相互作用結(jié)構(gòu)域，或VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D的分離的可溶的NP結(jié)合結(jié)構(gòu)域或肽，可用作任何VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D的全效可溶抑制劑。VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C或VEGF-D衍生的結(jié)構(gòu)域或肽也可通過各種方法貼附于細(xì)胞表面，如表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，或與其它細(xì)胞表面分子有親和性的連接的結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明另一方面提供了包含這種生長因子/受體復(fù)合物的藥物制備物。
本發(fā)明另一方面提供了治療特征在于NP-1細(xì)胞表面受體過表達(dá)的疾病的方法，所述方法包括對患有所述疾病的患者施用有效結(jié)合或拮抗NP-1受體的量的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或根據(jù)上述方法之一獲得的類似物。
對NP-1的剔除及過表達(dá)研究已顯示在脈管系統(tǒng)尤其心臟中的令人感興趣的效應(yīng)，其中VEGF-B167很可能是重要因素。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其衍生物也能調(diào)節(jié)NP-1的其它配體即腦衰蛋白-1/semaphorin Ⅲ/D,semaphorin E及semaphorin Ⅳ的結(jié)合，且以此方式，VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186和/或其衍生物可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
當(dāng)受體蛋白包含非NP-1殘基的多肽鏈，但仍顯示與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186有結(jié)合親和性時，其應(yīng)與NP-1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域呈至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，尤其優(yōu)選至少95％的氨基酸相同性。相似地，VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的有用類似物應(yīng)分別與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的NP-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)至少80％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，尤為優(yōu)選至少95％的序列相同性。
附圖簡述本發(fā)明參考舉例論證的試驗將得以進(jìn)一步闡述，結(jié)果如圖示

圖1示出轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的pIg和NP-1-Ig的SDS-PAGE圖。
圖2示出用特異抗體對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中代謝標(biāo)記的生長因子的親和沉淀。
圖3示出用受體/免疫球蛋白融合蛋白對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中代謝標(biāo)記的生長因子的親和沉淀。
圖4示出用Flt-1-Ig或Flt-4-Ig融合蛋白作為陰性對照，對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中代謝標(biāo)記的生長因子的親和沉淀。
圖5示出VEGF-B167和VEGF-B186與抗體(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的結(jié)合。
圖6示出mVEGF-BkEx1-5和VEGF165與抗體(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的結(jié)合。
圖7示出VEGF-C和VEGF-C△N△C與抗體(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的結(jié)合。
圖8示出VEGF-D和VEGF-D△N△C與抗體(IP),NP-1-Ig,Flt1-Ig和Flt4-Ig的結(jié)合。
圖9示出GST-VEGF-B167的親和層析。
圖10示出用圖9中洗脫的物質(zhì)進(jìn)行的銀染SDS-PAGE圖。
圖11是示出GST-mVEGF-B167(外顯子6B)對VEGF與PAE-NP-1細(xì)胞結(jié)合的競爭結(jié)合測試結(jié)果的條形圖。
圖12示出NP-1-Ig和NP-1-myc抗體與VEGF的結(jié)合試驗結(jié)果。
圖13(a),(b)和(c)分別示出VEGF,VEGF-B167和VEGF-B186與NP-1-Ig和NP-1-myc抗體的結(jié)合試驗結(jié)果。
圖14示出VEGF-B167和NP-1-Ig直接結(jié)合測試結(jié)果。
實施例詳述本發(fā)明參考以下舉例示出的實施例將得以進(jìn)一步闡述。
實施例1克隆可溶的Neuropilin-1-Ig融合構(gòu)建體將鼠NP-1的胞外域(鼠NeuropilincDNA的248-2914bp，登記號D50086)克隆入pIgplus(Ingenius)中。此胞外域的3’部分(2738-2914bp)首先作為EcoRV-BamHⅠ片段連接于pIgplus中，5’部分(248-2738bp)然后作為EcoRV片段(5’EcoRV位點衍生自pBluescript KSⅡ載體)連接進(jìn)該載體。胞外域的序列因此克隆入具有編碼人IgG Fc部分的pIgplus載體序列的框架中，以產(chǎn)生融合蛋白，該融合蛋白可通過蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠從轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的培養(yǎng)基中沉淀出，隨后進(jìn)行SDS-PAGE及銀染。結(jié)果示于圖1。將NP-pIgplus或pIgplus轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后24-32小時之間收集無血清的條件培養(yǎng)基。通過銀染檢測蛋白質(zhì)。如圖1所示，檢測到一個大約135kDa的條帶，而在只用pIgplus載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)基中未見到這種條帶。在53-76kD之間遷移的多肽代表血清白蛋白。大約為30kD的低分子量條帶據(jù)信代表部分蛋白酶解的Fc尾部。
實施例2轉(zhuǎn)染，免疫沉淀及可溶受體結(jié)合通過磷酸鈣沉淀法用編碼可溶受體Ig-融合蛋白VEGFR-1-Ig(Olofsson等，美國科學(xué)院院報95:11716(1998)),VEGFR-3-Ig或得自實施例1的NP-1-Ig的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞。VEGFR-3通過擴(kuò)增R3的7個Ig環(huán)，加上將人Ig的Fc部分置于載體pREP7中而構(gòu)建。
293-T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時，用含有0.2％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基(DMEM)沖洗，并饑餓24-32小時。收集培養(yǎng)基并經(jīng)離心澄清，用蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠沉淀融合蛋白。
用編碼hVEGF165,mVEGF-B167,mVEGF-B186,hVEGF-C,hVEGF-D,PlGF-1或PlGF-2的質(zhì)粒相似地轉(zhuǎn)染293-T或293EBNA細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后24小時用100μCi/ml Pro-mix TML-35S(Amersham)將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞代謝標(biāo)記6～7小時。向標(biāo)記培養(yǎng)基中加入10μg/ml肝素以促進(jìn)結(jié)合硫酸肝素的生長因子從細(xì)胞表面及細(xì)胞周圍基質(zhì)中釋出，除用于VEGF轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基之外，代謝標(biāo)記的培養(yǎng)基用VEGF抗體免疫沉淀2小時以免疫耗竭內(nèi)源性VEGF。然后將相似量的含有代謝標(biāo)記的生長因子的培養(yǎng)基用于免疫沉淀或用于受體結(jié)合分析。生長因子在室溫用含有受體-Igs的結(jié)合緩沖液(磷酸緩沖鹽水(PBS),0.5％BSA,0.2％Tween20)保溫3小時。然后將瓊脂糖凝膠珠用冰冷的結(jié)合緩沖液洗一次，用PBS洗3次，進(jìn)行15％SDS-PAGE分析。
用抗VEGF165,VEGF-B167,VEGF-B186,VEGF-C,VEGF-D的特異抗體和蛋白質(zhì)A瓊脂糖膠進(jìn)行免疫沉淀。結(jié)果示于圖2。還用與蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠偶聯(lián)的可溶的NP-1-Ig蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠沉淀，以從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中沉淀代謝標(biāo)記的VEGF165,VEGF-B167,VEGF186,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-1和PlGF-2。結(jié)果示于圖3。如圖2，圖3對比所示，通過可溶的NP-1-Ig和通過特異抗體沉淀的hVEGF165,mVEGF-B167,mVEGF-B186(加工形式)，hVEGF-C和PlGF-2的量幾乎相同。相反，在NP-1-Ig與hVEGF-D或PlGF-1之間檢測到無明顯結(jié)合。然而，下述圖8的結(jié)果表明盡管相互作用較弱，但hVEGF-D仍能結(jié)合NP-1-Ig。
作為陰性對照，用Flt-1-Ig或Flt-4-Ig從表達(dá)VEGF165,VEGF-B167,VEGF-B186,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-1和PlGF-2的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中親和沉淀代謝標(biāo)記的生長因子。結(jié)果如圖4所示，所示配體與所示受體的結(jié)合的喪失是期望的。
實施例3:VEGF家族成員與特異抗體，NP-1,Flt-1和Flt-4的結(jié)合用分別表達(dá)VEGF-B167,VEGF-B186,mVEGF-BkEx1-5(通過表達(dá)含有鼠VEGF-B的外顯子1-5的構(gòu)建體而產(chǎn)生)，VEGF165,VEGF-C,VEGF-C△N△C(由如Joukov等，EMBO雜志，16:3898-911(1997)所述構(gòu)建的VEGF-C的102-225位氨基酸組成的構(gòu)建體)，VEGF-D，和VEGF-D△N△C(由如Achen等，美國科學(xué)院院報95:548-53(1998)所述構(gòu)建的VEGF-D的93-201位氨基酸組成的構(gòu)建體)的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基重復(fù)進(jìn)行實施例2的一般步驟。結(jié)果示于圖5～8。
圖5示出配體VEGF-B167和VEGF-B186與NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的結(jié)合分析，圖6示出配體mVEGF-BkEx1-5和VEGF165與NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的結(jié)合分析。在圖中，IP是指用抗體沉淀配體的免疫沉淀，并作為陽性對照。VEGF-B186的抗體是WO96/26736中所述VEGF-B的N末端肽的多克隆抗體。此抗體還識別VEGF-B167和mVEGF-BkEx1-5?？筕EGF165抗體購自R&D系統(tǒng)公司。在圖6中，可以觀察到mVEGF-BkEx1-5與NP-1不結(jié)合。圖5示出加工的VEGF-B186(下部條帶)與可溶的NP-1結(jié)合，但全長VEGF-B186(上部條帶)未與之結(jié)合。由于mVEGF-BkEx1-5未與NP-1結(jié)合，因此相互作用位點很可能在加工的VEGF-B186的C末端區(qū)域，其最可能位于VEGF-B186的外顯子6A內(nèi)，并在全長形式中被封閉而在加工的形式中暴露。
圖7和圖8分別示出VEGF-C和VEGF-C△N△C，及VEGF-D和VEGF-D△N△C與NP-1-Ig,Flt-1-Ig和Flt-4-Ig的結(jié)合。兩種全長VEGF-C和VEGF-D與Neuropilin-1(NP-1)的結(jié)合被檢測到。然而，相當(dāng)于這些生長因子成熟形式的截短的△N△C形式的VEGF-C和VEGF-D未示出任何與NP-1的結(jié)合。
在每張附圖中，各個生長因子通過特異抗體免疫沉淀的陽性對照稱為IP。
實施例4生產(chǎn)及純化VEGF-B167GST融合蛋白及VEGF-B186GST融合蛋白將覆蓋mVEGF-B167的117-161位氨基酸的外顯子6B，用5’-ACGTAGATCTAGCCCCAGGATCCTC-3’(SEQ ID NO:1)和5’-ACGTGAATTCTCACCTACAGGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO:2)作引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。擴(kuò)增的片段用適當(dāng)?shù)拿赶⑦B于質(zhì)粒pGEX-2T(Pharmacia Biotech)的BamHⅠ和EcoRⅠ位點。經(jīng)測序檢定此構(gòu)建體。用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL-21并根據(jù)廠商指導(dǎo)純化。將蛋白質(zhì)在PBS中透析過夜。
相似地生產(chǎn)摻入VEGF-B186的外顯子6A和部分外顯子6B(116～163位氨基酸)的多肽表達(dá)產(chǎn)物的GST融合蛋白用于稍后的試驗中。
實施例5生產(chǎn)和純化VEGF GST融合蛋白VEGF的外顯子7用5’-ATCGGGATCCCCCTGTGGGCCTTGC-3’(SEQ ID NO:3)和5’ACGTGAATTCTTAACATCTGCAAGTACGTT-3’(SEQ IDNO:4)作引物，通過PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的片段用適當(dāng)?shù)拿赶⑦B于pGEX-2T(Pharmacia Biotech)的BamHⅠ和EcoRⅠ位點。經(jīng)測序檢定此構(gòu)建體。用此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化E.coli BL-21并根據(jù)廠商指導(dǎo)純化。將蛋白質(zhì)在PBS中透析過夜。
實施例6用GST-VEGF-B167外顯子6B親和層析將谷胱甘肽瓊脂糖純化的GST-VEGF-B167外顯子6B應(yīng)用于Hi-阱肝素瓊脂糖凝膠素和層析柱(5ml)，并充分洗滌，然后以在20mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中的0.15-1.5M NaCl的線性鹽梯度從層析柱中洗脫。結(jié)果示于圖9。此親和層析示出VEGF-B167的外顯子6B編碼的序列(GST-VEGF-B167)與肝素相互作用，且多數(shù)蛋白質(zhì)用0.8M NaCl可被洗脫。圖10示出洗脫物的銀染SDS-PAGE。
實施例7結(jié)合可溶受體并與GST融合蛋白競爭用編碼可溶的Ig-融合受體VEGFR-1和NP-1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞。然后從轉(zhuǎn)染后在含有0.2％BSA的DMEM中饑餓24小時的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中收集培養(yǎng)基。用蛋白質(zhì)A瓊脂糖凝膠沉淀融合蛋白。通過用hVEGF165pSG5,mVEGF-B167pSG5,mVEGF-B186pSG5和mVEGF-BkEx1-5pSG5(Olofsson等，美國科學(xué)院院報95:11716(1998))轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞生產(chǎn)配體，且此細(xì)胞在10mg/ml肝素存在下用100μCi/ml Pro-mix TML-35S(Amersham)代謝標(biāo)記6-7小時。除用于hVEGF165轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基之外，代謝標(biāo)記的培養(yǎng)基用VEGF抗體免疫耗竭內(nèi)源性VEGF以及可能的VEGF異源二聚體，免疫耗竭進(jìn)行2小時。將生長因子與等量模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)基與可溶的受體-Ig融合蛋白在4℃結(jié)合3小時，并用含有1％Triton-X100的PBS洗3次，用PBS洗一次，并在還原條件下經(jīng)15％SDS-PAGE分析。為了競爭，實施例4和5中制備的25mg每種GST融合蛋白，以及GST單獨(dú)在受體取出之前，與代謝培養(yǎng)基保溫30分鐘，如上述進(jìn)行分析。
實施例8在細(xì)胞結(jié)合的受體上，GST-VEGF-B167和GST-VEGF-B186對125-hVEGF165與NP-1結(jié)合的競爭將人重組VEGF165用125I試劑放射標(biāo)記至比活性為2.5×105cpm/ng。將種植于24孔平板中的鋪滿的豬動脈內(nèi)皮(PAE)細(xì)胞，PAE-NP-1細(xì)胞和PAE-NP-1-VEGFR-1細(xì)胞用冰冷的結(jié)合緩沖液(F12,0.5mg/ml BSA,20mM Hepes pH7.4)洗一次，并將具有或不具有增加量的rhVEGF165,rhVEGF121(R&D系統(tǒng))，GST,GST-VEGF(見實施例5),GST-VEGF-B167(見實施例4)和GST-VEGF-B186(類似產(chǎn)生的)的1ng/ml標(biāo)記的VEGF加入結(jié)合緩沖液中。表達(dá)NP-1的PAE-NP-1細(xì)胞得自Soker等，細(xì)胞92:735-45(1998)。然后將此PAE-NP-1細(xì)胞用在pcDNA3.1載體中含有全長人VEGF受體1的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并用zeocin選擇所得轉(zhuǎn)染物以獲得PAE-NP-1-VEGFR-1細(xì)胞。在4℃結(jié)合2小時之后，用含有5μg/ml肝素的冰冷的結(jié)合緩沖液(F12,0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)；20mM Hepes pH7.4)將此細(xì)胞洗4次，用冰冷的PBS洗1次。然后在0.5M NaOH中裂解。用γ計數(shù)儀計數(shù)細(xì)胞裂解物的放射活性。
GST-VEGF-B167(外顯子6B)對125I-hVEGF165與NP-1結(jié)合的競爭結(jié)果示于圖11。使用1ng/ml125I-hVEGF165和20μg/ml GST融合蛋白。如圖11所示，GST-VEGF-B167親和性較低，完成大約50％競爭。陰性對照組使用的是GST和VEGF121，兩者均無競爭。陽性對照組使用的是mVEGF164，其確實競爭。
實施例9:GST-VEGF167和GST-VEGF-B186與表達(dá)NP-1的細(xì)胞的交聯(lián)如上述放射標(biāo)記GST融合蛋白和VEGF-B167和VEGF-B186，并如Cao等，生物化學(xué)雜志，271:3154(1996)所述，用10ng標(biāo)記的蛋白質(zhì)和二琥珀酰亞氨基辛二酸酯(DSS)交聯(lián)劑(Pierce)交聯(lián)于種植于6孔平板中的表達(dá)NP-1及共表達(dá)NP-1和VEGFR-1(實施例8)的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。交聯(lián)的蛋白質(zhì)在還原條件下通過6％SDS-PAGE解析。加入過量(1μg)的rhVEGF165作競爭劑。
實施例10:VEGFR-1和NP-1之間的直接作用可溶的myc標(biāo)記的NP-1和PAE-Flt1細(xì)胞或NIH-VEGFR-1細(xì)胞(Sawano等，細(xì)胞生長與分化，7:213-21(1996))用于測試VEGFR-1和NP-1之間的相互作用。myc標(biāo)記的NP-1通過將myc標(biāo)記附著于NP-1胞外域上而產(chǎn)生?？扇艿腘P-1(sNP-1)在有或無配體的情況下與細(xì)胞交聯(lián)，并將交聯(lián)物用單克隆抗myc抗體免疫沉淀。此抗myc抗體得自Berkeley抗體公司(Babco)。將此復(fù)合物通過6％SDS-PAGE解析，移至硝基纖維素上并用Flt1抗體(SantaCruz)探查。
結(jié)果示于圖12和13。圖12示出等量的NP-1-Ig和NP-1-myc用于結(jié)合試驗。圖13(a),(b)，和(c)示出VEGF,VEGF-B167和VEGF-B186的結(jié)合結(jié)果。二聚體的NP-1-Ig和單體的NP-1-myc以相似強(qiáng)度至少結(jié)合VEGF和VEGF-B167。VEGF-B186的結(jié)合較弱。
實施例11測試NP-1和/或NP-1模擬分子過量的可溶NP-1(sNP-1)以類似于sFlt1的方式(Goldman等，1998)，通過阻止與內(nèi)皮細(xì)胞上及表達(dá)受體的細(xì)胞上的RTK相互作用，而阻斷VEGF,VEGF-B,VEGF-C和VEGF-D信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過在存在過量NP-1的情況下用測試配體刺激受體進(jìn)行體外測試。通過測定體外激酶分析或抗磷酸酪氨酸Western印跡分析中的自磷酸化對結(jié)果進(jìn)行定量。
實施例12配體對不同細(xì)胞類型的定向結(jié)合NP-1受體的VEGF家族的配體，通過用含有NP-1 DNA的病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此該細(xì)胞表達(dá)NP-1受體，從而定向于不同類型的細(xì)胞。
實施例13與NP-1和NP-2在低嚴(yán)格條件下雜交尋找組織特異性同源物NP-1受體的同源物通過在如上述低嚴(yán)格條件下篩選結(jié)合測試而被測試與VEGF家族和成纖維細(xì)胞生長因子家族成員的配體的結(jié)合。
實施例14可溶NP-1與VEGF-B167的直接結(jié)合為進(jìn)一步確定NP-1與VEGF-B167間的相互作用。測試VEGF-B167直接結(jié)合可溶NP-1-Ig融合蛋白的能力。純化的GST或GST-VEGF-B167在室溫在ELISA平板上包被90分鐘。除去蛋白質(zhì)溶液并用含有5％BSA的PBS將包被的孔封閉30分鐘。用含有0.5mg/ml BSA的PBS將平板洗3次，并與可溶NP-1-Ig在1μg/ml濃度保溫，在室溫下結(jié)合2小時。在加入與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗人Ig之前，如上述洗平板3次，將抗人Ig抗體置于孔中40分鐘，之后如上所述洗滌平板，另加一次用PBS洗滌，然后根據(jù)供應(yīng)商指示(DAKO)加入100μl底物1,2-鄰苯二胺二氫氯化物(ODP)。加入100μl0.5MH2SO4終止反應(yīng)。在450nm讀取吸光度。結(jié)果示于圖14。Flt4-Ig用作陰性對照，其不與GST或GST-VEGF-B167結(jié)合(結(jié)果未示出)。
用途生長因子的VEGF家族成員如VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186與Neuropilin-1受體之間的相互作用，可用于通過用例如攜帶NP-1DNA的病毒載體轉(zhuǎn)化需增強(qiáng)生長因子活性的細(xì)胞由此該細(xì)胞表達(dá)過量的NP-1受體而增強(qiáng)配體的作用。
NP-1受體與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其類似物之間復(fù)合物的形成，可用于治療患有特征在于NP-1受體過表達(dá)的疾病的患者，這可通過給予這種患者有效結(jié)合或拮抗NP-1受體的量的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其類似物。NP-1和VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其類似物之間復(fù)合物的形成還可用于治療特征在于NP-1受體低表達(dá)的狀態(tài)。這種狀態(tài)可包括正常成人內(nèi)皮或需要提高血管形成的狀態(tài)。在給定情況下所施用的數(shù)量取決于患者的特點及疾病的性質(zhì)且能被本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗測定而定。
VEGF-B的某些同種型可參于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長遷移及刺激及管形成中。通過轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)提高體外或體內(nèi)細(xì)胞中Neuropilin的表達(dá)，可使此細(xì)胞對同種型更易應(yīng)答。通過毗鄰表達(dá)特定RTK的細(xì)胞的細(xì)胞表達(dá)Neuropilin也可以調(diào)節(jié)由RTK有效濃度和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
可轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼Neuropilin的核酸以提高其在體外或體內(nèi)細(xì)胞中的表達(dá)。在不表達(dá)Neuropilin的細(xì)胞(如造血細(xì)胞，見Soker等，細(xì)胞，92:735-745(1998))中的表達(dá)應(yīng)使它們更加應(yīng)答VEGF-B167而非未加工的(即全長的)VEGF-B186。
肝素也應(yīng)調(diào)節(jié)Neuropilin結(jié)合，且VEGF-B167的一堿性肝素結(jié)合肽可不依賴于直接NP-1相互作用而調(diào)節(jié)。VEGF-C不結(jié)合肝素，因此VEGF-C不能被調(diào)節(jié)。
Neuropilin中的相互作用結(jié)構(gòu)域，或VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的分離的可溶NP結(jié)合結(jié)構(gòu)域或肽，可用作VEGF-B167,VEGF165,PlGF-2,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的全效可溶抑制劑。VEGF-B167,VEGF165,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-2或加工的VEGF-B186衍生的結(jié)構(gòu)域或肽也可通過各種方法錨著于細(xì)胞表面，如表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，或與其它細(xì)胞表面分子具有親和性的連接的結(jié)構(gòu)域。
NP-1可與腫瘤細(xì)胞相關(guān)。廢除VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D,PlGF-2和/或加工的VEGF-B186與NP-1之間的相互作用可減輕癌癥中的生物學(xué)活性。也可能的是通過仍未知的機(jī)制，一或多個這些生長因子不經(jīng)Flt-1而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，且此機(jī)制在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生。廢除相互作用將調(diào)節(jié)此信號機(jī)制。
對NP-1的剔除及過表達(dá)研究已顯示對心血管系統(tǒng)，尤其在VEGF-B167可能很重要的心臟的令人感興趣的效力。VEGF-B167還能調(diào)節(jié)NP-1的其它配體的結(jié)合，這些配體稱為腦衰蛋白-1/semaphorin Ⅲ/D,semaphorin E和semaphorin Ⅳ，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186或其類似物可適當(dāng)?shù)仂o脈內(nèi)施用，或通過類似于目前用于定向輸送VEGF或FGF的系統(tǒng)的定向輸送系統(tǒng)而施用。這種系統(tǒng)例如包括使用質(zhì)粒形式的DNA(Isner等，Lancet,348:370(1996))，或使用重組腺病毒(Giordano等，自然醫(yī)學(xué)，2:534-39(1996))。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186還可通過類似于所述提供VEGF的方法(Bauters等，美國生理學(xué)會，ppH 1263-271(1994)；Asahara等，循環(huán)，91:2793(1995))以蛋白質(zhì)形式提供，或通過使用缺陷皰疹病毒(Mesri等，循環(huán)研究，76:161(1995))而提供。VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186的小分子類似物可口服。也可使用其它標(biāo)準(zhǔn)輸送模式如皮下，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，或靜脈內(nèi)注射。
NP-1受體或其部分與VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D或加工的VEGF-B186蛋白的復(fù)合物也可用于產(chǎn)生抗體。此抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。通常地，可用常規(guī)生產(chǎn)抗體的技術(shù)生產(chǎn)抗NP-1/生長因子復(fù)合物的抗體。例如，特異的單克隆抗體可通過免疫接種由重組DNA表達(dá)而獲得的融合蛋白而產(chǎn)生?？筕EGF-B167/受體復(fù)合物的嵌合的及人化的抗體和抗體片段均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。標(biāo)記的單克隆抗體，尤其用于篩選特征在于NP-1受體過表達(dá)或低表達(dá)的疾病。這種疾病例如包括血管及淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤。
在診斷/預(yù)防裝置中，上述抗體，生長因子或受體是標(biāo)記的，且所剩未標(biāo)記的二者之一是結(jié)合底物的，由此在抗體與生長因子/受體復(fù)合物之間結(jié)合后，通過測定附著于底物的標(biāo)記數(shù)量，可確定抗體一生長因子/受體復(fù)合物。常規(guī)的ELISA試劑盒例如是這種診斷/預(yù)防裝置。
標(biāo)記可以是直接或間接的，共價或非共價的?？贵w，生長因子或受體可以共價或非共價地偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)某判?，順磁性，電子致密的，生態(tài)的(ecogenic)或放射性試劑以顯像。在診斷分析中，可使用放射性或非放射性標(biāo)記。放射性標(biāo)記例如是放射性原子或基團(tuán)，如125I或32P。非放射性標(biāo)記例如是酶，如辣根過氧化物酶，或熒光標(biāo)記如異硫氰酸熒光素(FITC)。
論斷/預(yù)防試劑盒還可包括使用PCR以確定NP-1和/或各個生長因子的表達(dá)。
前面的闡述及實施例只是舉例說明本發(fā)明，而非有限制目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明精神及原理的范圍內(nèi)，可對本發(fā)明的實施方案加以改動。所有改變均包括在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表<110>路德維格癌癥研究所赫爾辛基大學(xué)許可貿(mào)易公司<120>新的NEUROPILIN/生長因子結(jié)合及其應(yīng)用<130>路德維格研究所-卡里·阿利塔洛等<140><141><150>60/104,723<151>1998-10-19<150>60/112,991<151>1998-12-18<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1acgtagatct agccccagga tcctc<210>2<211>28<212>DNA<213>Hongia koreensis<400>2acgtgaattc tcacctacag gttgctgg<210>3<211>25<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3atcgggatcc ccctgtgggc cttgc<210>4<211>30<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4acgtgaattc ttaacatctg caagtacgtt
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1、一種含有兩種分子的分離的配體一受體復(fù)合物，所述分子之一為所述配體，其包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列或其與VEGF-B167具有90％氨基酸序列相同性的結(jié)合受體的類似物，第二種所述分子為所述受體，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
2、一種含有兩種分子的分離的配體一受體復(fù)合物，所述分子之一為所述配體，其選自由VEGF-B167，加工的VEGF-B186,VEGF-C和VEGF-D組成的一組，第二種所述分子為所述受體，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
3、如權(quán)利要求2所述的復(fù)合物，其中所述配體選自VEGF-B167，加工的VEGF186和VEGF-C。
4、一種可溶的融合蛋白質(zhì)，包含一種免疫球蛋白和一種受體，所述受體選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
5、一種模塊組合，其包含至少第一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和第二個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述第一個結(jié)構(gòu)域包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列，所述第二個結(jié)構(gòu)域選自VEGF165,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186。
6、一種調(diào)節(jié)與表達(dá)或過表達(dá)VEGF-B、VEGF-C和/或VEGF-D的活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的結(jié)合和生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述細(xì)胞中導(dǎo)入一載體，該載體包括編碼一種受體序列的核苷酸序列，該受體序列選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
7、一種抑制與活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一種包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列的多肽或包含由VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列的多肽處理所述細(xì)胞。
8、一種抑制與活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一種包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列的多肽處理所述細(xì)胞。
9、一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對腦衰蛋白/semaphorin糖蛋白的應(yīng)答性的方法，所述方法包括用選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186的物質(zhì)處理該細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種含有兩種分子的分離的配體一受體復(fù)合物，所述分子之一為所述配體，其包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列或其結(jié)合受體的類似物，第二種所述分子為所述受體，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
2.一種含有兩種分子的分離的配體一受體復(fù)合物，所述分子之一為所述配體，其選自由VEGF-B167，加工的VEGF-B186，VEGF-C和VEGF-D組成的一組，第二種所述分子為所述受體，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
3.如權(quán)利要求2所述的復(fù)合物，其中所述配體選自VEGF-B167，加工的VEGF186和VEGF-C。
4.一種可溶的融合蛋白質(zhì)，包含一種免疫球蛋白和一種受體，所述受體選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
5.一種模塊組合，其包含至少第一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和第二個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，所述第一個結(jié)構(gòu)域包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列，所述第二個結(jié)構(gòu)域選自VEGF165,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186。
6.一種調(diào)節(jié)與活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的結(jié)合和生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述細(xì)胞中導(dǎo)入一載體，該載體包括編碼一種受體序列的核苷酸序列，該受體序列選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
7.一種抑制與活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一種包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列的多肽或包含由VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列的多肽處理所述細(xì)胞。
8.一種抑制與活細(xì)胞相關(guān)的生長因子的生物活性的方法，所述生長因子選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括用一種包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列的多肽處理所述細(xì)胞。
9.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對腦衰蛋白/semaphorin糖蛋白的應(yīng)答性的方法，所述方法包括用選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186的物質(zhì)處理該細(xì)胞。
10.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞對腦衰蛋白/semaphorin糖蛋白的應(yīng)答性的方法，所述方法包括用一種包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合表位的多肽或包含由VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列的多肽處理所述細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10的方法，其中所述多肽包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列。
12.如權(quán)利要求10的方法，其中所述多肽包含由加工的VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列。
13.一種調(diào)節(jié)與活細(xì)胞相關(guān)的一種蛋白質(zhì)的結(jié)合和生物活性的方法，所述蛋白質(zhì)選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186，所述方法包括向所述細(xì)胞中導(dǎo)入一載體，該載體包括編碼一種受體序列的核苷酸序列，由此所述細(xì)胞能表達(dá)所述受體序列，該受體序列選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈。
14.一種抑制腫瘤細(xì)胞生長或增殖的方法，包括用以下物質(zhì)處理所述細(xì)胞的步驟，所述物質(zhì)為(a)一種可溶的蛋白質(zhì)，其選自包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物的氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈；或(b)一種多肽，其包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的NP-1結(jié)合表位或由加工的VEGF-B186的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合表位。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞用可溶的NP-1處理。
16.如權(quán)利要求14的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞用包含由VEGF-B167的外顯子6B編碼的氨基酸序列的多肽處理。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中所述多肽包含由加工的VEGF-B167的外顯子6A編碼的NP-1結(jié)合序列。
18.與一種配體一受體復(fù)合物上的一表位有特異結(jié)合親和性的一種分離的結(jié)合配偶體，所述復(fù)合物包含一種選自VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D和加工的VEGF-B186及其類似物的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與選自如下一組的一種蛋白質(zhì)的結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)域有特異結(jié)合相互作用，所述的組為包含NP-1的氨基酸序列，其胞外域或其結(jié)合配體的片段的氨基酸序列，與所述結(jié)合配體的片段有至少90％氨基酸相同性的結(jié)合VEGF-B167、結(jié)合加工的VEGF-B186或結(jié)合VEGF-C的其受體類似物氨基酸序列的多肽鏈，以及與VEGF-B167、加工的VEGF-B186或VEGF-C有結(jié)合親和性的并由在嚴(yán)格條件下與編碼所述結(jié)合配體的片段的核酸雜交的核酸編碼的多肽鏈；所述結(jié)合配偶體與未復(fù)合的VEGF-B167,VEGF-C,VEGF-D，加工的VEGF-B186或其類似物基本上無結(jié)合親和性。
19.如權(quán)利要求18的分離的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體與未復(fù)合形式的所述蛋白質(zhì)或其類似物基本上無結(jié)合親和性。
20.如權(quán)利要求18的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體是抗體。
21.如權(quán)利要求20的結(jié)合配偶體，其中所述結(jié)合配偶體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了選自VEGF－B
文檔編號C07K19/00GK1324242SQ99812335
公開日2001年11月28日 申請日期1999年10月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月19日
發(fā)明者卡里·阿利塔洛, 烏爾夫·埃里克松, 布里吉塔·奧洛夫松, 泰賈·馬基嫩 申請人:路德維格癌癥研究所, 萊森希亞有限公司