專利名稱：疏水性蛋白質(zhì)的增溶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析樣品中大分子的方法和儀器。
背景技術(shù)：
在分析大分子領(lǐng)域中，單向和雙向凝膠電泳已經(jīng)成為分離和顯現(xiàn)大分子的標(biāo)準(zhǔn)工具。
單向凝膠電泳，可使例如蛋白質(zhì)的大分子混合物在變性條件下通過聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，按照質(zhì)量差異分離成單一組分。大分子混合物首先在例如1％十二烷基硫酸鈉(SDS)(一種陰離子兩親去污劑)的溶液中溶解。對于蛋白質(zhì)，這種去污劑破壞幾乎天然蛋白質(zhì)中所有非共價相互作用，即大部分的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂類相互作用。SDS的陰離子以每兩個氨基酸殘基與大約一個SDS的比例結(jié)合至蛋白質(zhì)主鏈，它賦予SDS和變性蛋白的復(fù)合物大量的與蛋白質(zhì)質(zhì)量粗略成比例的凈負(fù)電荷。蛋白質(zhì)的混合物接著在含SDS的凝膠中電泳。
分離、分析和顯示大分子混合物的更靈敏的方法是雙向電泳。這樣的雙向電泳通常包括在第一向的等電聚焦電泳和在第二向的SDS凝膠電泳的順序分離。
等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)以其酸性和堿性殘基的相對含量為基礎(chǔ)。在外加電場的影響下，更高荷電的蛋白質(zhì)比相似大小和形狀的較低荷電的蛋白質(zhì)移動快。如果蛋白質(zhì)從樣品區(qū)經(jīng)過一個非對流介質(zhì)(常規(guī)的例如聚丙烯酰胺的凝膠)移動，將會產(chǎn)生電泳分離。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入某一區(qū)域，在該區(qū)域的pH值使蛋白質(zhì)凈電荷為零(等電點，p1)，它會停止相對于介質(zhì)的移動。進(jìn)一步地，如果蛋白質(zhì)的移動經(jīng)過自陽極單調(diào)升高的pH梯度，則蛋白質(zhì)會“聚焦”在其等電點。兩種具有不同的荷電比例、或不同的滴定度、不同的氨基酸的蛋白質(zhì)將憑借它們不同的等電點被分離。事實上，這種分離方法能分辨在其各自序列內(nèi)幾百個氨基酸中僅相差不到一個帶電荷的氨基酸的兩種蛋白質(zhì)。
等電聚焦通常在含共價固定pH梯度的聚丙烯酰胺凝膠的薄平膠條(例如，IPG凝膠條)上進(jìn)行。脫水狀態(tài)的IPG凝膠條有商品提供，使用之前在適當(dāng)?shù)娜芤褐性偎?。重要的是，再水合溶液必須與含有要分離蛋白質(zhì)的溶液相容。
實踐中，按照雙向凝膠電泳，含有感興趣的大分子的細(xì)胞和組織樣品以提取液溶解和增溶。感興趣的大分子應(yīng)當(dāng)溶解，同時仍保留它們的自然電荷。在非變性條件下，某些膜蛋白可通過相對溫和的方式溶解，例如用例如TritonX-10的非離子表面活性劑溶液提取。在變性條件下，許多膜蛋白是相對不溶的并且僅能用強表面活性劑和離液序列高的試劑或者有機溶劑溶解。
變性條件下用于溶解膜蛋白的溶液包括含有離液序列高的試劑尿素或硫脲的溶液，其中尿素是弱堿性的并且是弱疏水性的。含有尿素的溶液也用于IPG凝膠的再水合。含有尿素的溶液已知對溶解弱疏水性蛋白有效，并且適于和市售的凝膠(例如Pharmacia，固定化電解質(zhì)干膠條(ImmobilineDryStrips))一起使用。一種特別常規(guī)的溶液是7M尿素、2M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP。
然而，含有強疏水性蛋白的細(xì)胞膜顯示需要強疏水性提取液以溶解細(xì)胞膜蛋白。這種高有機質(zhì)溶液先前未和雙向電泳結(jié)合使用，由于市售的IPG條(雙向電泳的第一向)在疏水和親水相互作用下，沒有恰當(dāng)?shù)脑诟哂袡C質(zhì)溶液中再水合的化學(xué)成分。例如，環(huán)丁砜提取液不能再水合常規(guī)100％丙烯酰胺IPG條。這意味著弱疏水性溶液已持續(xù)用于等電點聚焦蛋白質(zhì)的增溶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)出包括親水和疏水單體混合物的IPG凝膠，以生產(chǎn)改進(jìn)的IPG凝膠。
優(yōu)選地，本發(fā)明的IPG凝膠比市售的凝膠更疏水，并且優(yōu)選地，IPG凝膠是兩親的且具有改善的穩(wěn)定性。進(jìn)一步地，這些IPG凝膠優(yōu)選和例如環(huán)丁砜的強疏水性提取液一起使用，它提供提取樣品中更大范圍的蛋白質(zhì)和其它大分子的能力。
本發(fā)明提供具有不同特性的多種凝膠，適于分離更大范圍的蛋白質(zhì)和其它大分子。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及適用于電泳的固定pH梯度(IPG)的凝膠，它包括親水和疏水單體的混合物，其中至少一種單體包括一種或多種低級烷基基團。優(yōu)選地，這種凝膠包括聚合單體單元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同并且是氫或C1-C4烷基，其限制條件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一種為C1-C4烷基。
在第一方面的第一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及適用于電泳的IPG凝膠，其中該凝膠包括丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺(DMA)，或者N-丙烯酰基氨基丙醇(AAP)和二甲基丙烯酰胺(DMA)的混合物。
在第二方面，本發(fā)明涉及分離和/或分析樣品內(nèi)至少一種大分子的方法，它包括采用如本文所述的本發(fā)明的IPG凝膠對樣品進(jìn)行等電聚焦電泳。
優(yōu)選地，這種方法進(jìn)一步包括增溶樣品內(nèi)的至少一種大分子。
如第二方面所述，本方法優(yōu)選繼之以進(jìn)一步的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離或分析。在特別優(yōu)選的實施方案中，該分離在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行。
第二方面的方法優(yōu)選結(jié)合常規(guī)的分離方法以獲得改進(jìn)的分離和分析。
在第三方面，本發(fā)明提供如本文所述的本發(fā)明的IPG凝膠的用途，以分離和分析樣品內(nèi)的至少一種大分子。大分子優(yōu)選是蛋白質(zhì)混合物中的一種蛋白質(zhì)。
在第四方面，本發(fā)明涉及分離和/或分析樣品內(nèi)大分子用的試劑盒，該試劑盒包括增溶劑、本發(fā)明的固定pH梯度(IPG)的凝膠和使用說明書(可選配)。


圖1是AAP+DMA IPG條的照片復(fù)印件，它包括在常規(guī)溶液中提取和分離的大腸桿菌(E.coli)的全細(xì)胞蛋白提取物。
圖2是AAP+DMA IPG條的照片復(fù)印件，它包括在環(huán)丁砜溶液中提取和分離的大腸桿菌(E.coli)全細(xì)胞提取物。
圖3是AAP+DMA IPG條的照片復(fù)印件，它包括在水基提取液中提取和分離的天然人血漿。
圖4是采用常規(guī)的和環(huán)丁砜的溶液提取和分離的大腸桿菌(E.coli)全細(xì)胞制備物的照片復(fù)印件。在圖4(a)中，常規(guī)溶液在7cm 4-7 Pharmacia IPG條上聚焦。在圖4(b)中，環(huán)丁砜提取液在含丙烯酰胺和DMA的實驗室制備的7cm 4-7 IPG上聚焦。
圖5是采用常規(guī)的和環(huán)丁砜的溶液提取和分離的大腸桿菌(E.coli)全細(xì)胞制備物的照片復(fù)印件。在圖5(a)中，常規(guī)提取液在18cm 4-7 PharmaciaIPG條上聚焦。在圖5(b)中，環(huán)丁砜溶液在含丙烯酰胺和DMA的實驗室制備的18cm 4-7 IPG上聚焦。
圖6是采用常規(guī)的和環(huán)丁砜的溶液提取和分離的大鼠肝全細(xì)胞制備物的照片復(fù)印件。
圖7是采用常規(guī)的和環(huán)丁砜的溶液提取和分離的大腸桿菌(E.coli)膜制備物的照片復(fù)印件。在圖7(a)中，常規(guī)提取液用于提取蛋白質(zhì)。在圖7(b)中，環(huán)丁砜提取液用于提取蛋白質(zhì)。在圖7(c)中，變化的環(huán)丁砜提取液(6M環(huán)丁砜4M硫脲，1％ASB-14，2mM TBP)用于提取蛋白質(zhì)。
圖8是顯示通過活性炭和AG501×8樹脂清潔環(huán)丁砜提取液，以還原朝向凝膠酸性末端的離子的照片復(fù)印件。使用以下溶液(a)未經(jīng)樹脂處理過的包括環(huán)丁砜、硫脲、C7的環(huán)丁砜溶液，(b)未經(jīng)樹脂處理過的包括環(huán)丁砜、硫脲和ASB14的環(huán)丁砜溶液，(c)經(jīng)炭和Biorad AG501×8樹脂處理的包括環(huán)丁砜、硫脲、C7的環(huán)丁砜溶液，(d)經(jīng)炭和Biorad AG501×8樹脂處理的包括環(huán)丁砜、硫脲、ASB14的環(huán)丁砜溶液。
圖9是比較環(huán)丁砜溶液和常規(guī)樣品提取液的的照片復(fù)印件。凝膠代表(a)常規(guī)或(b)環(huán)丁砜提取液內(nèi)1mg/mL大腸桿菌(E.coli)全細(xì)胞蛋白提取物。方框區(qū)是在兩種凝膠中均發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，圓圈區(qū)表示使用常規(guī)提取液時未見的一些蛋白質(zhì)。
縮寫AAP N-丙烯?；被糄MA 二甲基丙烯酰胺SDS PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳TEMED N，N，N′，N′-四甲基乙二胺APS 過硫酸銨T 總丙烯酰胺C 交聯(lián)劑ASB 酰氨磺基甜菜堿(Amidosulfobetaine)；Tetradeconoyl酰氨基丙基二甲基胺基丙烷磺酸鹽(Tetradeconolyamido propyldimethyl ammonio propane sulfonate)TBP 三丁基膦PDA 派嗪二-丙烯酰胺Tris Tris緩沖液MQ水 Milli-Q水(純凈水)具體實施方式
按照本發(fā)明，IPG凝膠包括親水和疏水單體亞基混合物，其中至少一種亞基包括一個或多個低級烷基。優(yōu)選地，本發(fā)明的IPG凝膠比用丙烯酰胺單獨生產(chǎn)的那些凝膠更疏水。
聚合凝膠基質(zhì)按照第一方面該凝膠是固定pH梯度的凝膠，優(yōu)選包括聚合單元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6。
單元(I)的R2和R3優(yōu)選是C1-C4烷基，更優(yōu)選是CH3。在特別優(yōu)選的實施方案中，單元(I)中R1是H，R2和R3是CH3。
在備選的實施方案中，單元(II)中R5和R6相同或不同，并且是氫或丙醇。一項實施方案中，R4、R5和R6是H。在最優(yōu)選的實施方案中，單元(II)中R4和R5是H，R6是丙醇。
在實施方案中，單元(I)和單元(II)的摩爾比為約1∶10到10∶1。優(yōu)選單元(I)和單元(II)的摩爾比為約1∶5到5∶1，更優(yōu)選為約1∶2到2∶1，最優(yōu)選為1∶1。
優(yōu)選的實施方案中，凝膠可以干燥并在其干燥狀態(tài)貯藏。
在一項優(yōu)選的實施方案中，凝膠包括DMA和丙烯酰胺的混合物。DMA是疏水分子，與丙烯酰胺相差兩個額外的甲基。這種IPG凝膠優(yōu)選在常規(guī)提取樣品溶液和疏水的環(huán)丁砜溶液中充分再水合。
優(yōu)選地，通過吸收到IPG條中的溶液測量再水合。優(yōu)選通過計算干燥的和再水合的凝膠之間的重量差異。該膠條優(yōu)選至少再水合至“傾注體積”，即傾注時的長×寬×厚。
另一優(yōu)選的實施方案中，凝膠包括AAP和DMA的混合物。優(yōu)選地，這種凝膠能夠和環(huán)丁砜提取液、常規(guī)提取液和水基提取液再水合。
在特別優(yōu)選的實施方案中，IPG凝膠含有約1∶1摩爾比的丙烯酰胺和DMA或者AAP和DMA。
優(yōu)選地，IPG凝膠是穩(wěn)定的并具有兩親性。
按照本發(fā)明，穩(wěn)定的凝膠板能夠洗滌干燥并在使用之前貯藏適當(dāng)時間。優(yōu)選地，穩(wěn)定凝膠板能夠在室溫或涼爽條件下貯藏約1年，而不會損失其官能度。優(yōu)選地，貯藏之后，凝膠板能夠再水合，提供確定的pH表面性質(zhì)，并且顯示較少的易碎或欠柔順的趨勢。優(yōu)選地，在適當(dāng)條件(暗室或涼爽的溫度)下貯藏時，凝膠板耐聚合水凝膠隨時間的化學(xué)分解。
優(yōu)選地，按照下述的標(biāo)準(zhǔn)方法，試驗按照本發(fā)明的凝膠板的穩(wěn)定性1)Kirkwood，T.B.L對生物標(biāo)準(zhǔn)物和產(chǎn)品穩(wěn)定性的判定(Predicting thestability of biological standards and products)，Biometrics 33736-742(1977)；2)Porterfield，R.I和Capone，J.J.產(chǎn)品穩(wěn)定性評估中動力學(xué)模型和阿累尼烏斯方法的應(yīng)用(Applications of Kinetic models and Arrhenius methodsto product stability evaluations)，Med.Devices Diagn.Industry April 1984，pg45-50；3)Kennon，L用模型來確定化學(xué)制藥的穩(wěn)定性(Use of models indetermining chemical pharmaceutical stability)，J.Pharm.Sci.53815-818(1964)。這些參考文獻(xiàn)通過引用文獻(xiàn)并入本文。
優(yōu)選地，對按照本發(fā)明的凝膠板測試其在酸性或堿性條件下的化學(xué)穩(wěn)定性。優(yōu)選地，二甲基丙烯酰胺和AAP具有比丙烯酰胺更好的水解穩(wěn)定性。參見，例如，Electrophoresis 1996 Apr17(4)723-31，作為參考引入本文。
一項實施方案中，IPG凝膠是IPG凝膠條或IPG凝膠板。
優(yōu)選地，凝膠板是聚合的一整片凝膠。優(yōu)選地，典型的膠條通常是從膠板上切下的，用于2-D凝膠的窄條(3至10mm寬)。優(yōu)選地，膠板比通常用于2-D凝膠的膠寬。通常，市售的IPG是3.3mm寬。
IPG膠條優(yōu)選附著在襯板上。
優(yōu)選地，襯板是塑料襯板。塑料優(yōu)選是處理過的塑料。優(yōu)選地，這種處理使聚合丙烯酰胺與塑料交聯(lián)從而固定凝膠。
在第二方面，本發(fā)明涉及分離和/或分析樣品內(nèi)至少一種大分子的方法，包括采用如本文所述的IPG凝膠對樣品進(jìn)行等電聚焦。
在優(yōu)選的實施方案中，該方法包括增溶樣品內(nèi)的大分子。
優(yōu)選地，增溶通過將樣品和疏水性溶劑一起混合的方法進(jìn)行。
優(yōu)選地，增溶的大分子是增溶的蛋白質(zhì)大分子(例如，肽、多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物)。
一項實施方案中，該方法進(jìn)一步包括混合烷基化劑，優(yōu)選半胱氨酸烷基化劑，例如和溶解的樣品一起的丙烯酰胺或碘乙酰胺。
優(yōu)選地，樣品選自由細(xì)胞外液、組織樣品、細(xì)胞樣品、微生物樣品和培養(yǎng)樣品所組成的組。優(yōu)選的樣品的例子包括但不限于，大腸桿菌(E.coli)樣品和大鼠肝臟樣品。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的IPG凝膠與強疏水性提取液相容，例如含環(huán)丁砜和其它疏水性溶劑(例如不能使常規(guī)IPG凝膠或膠條再水合的那些溶液)的溶劑。當(dāng)細(xì)胞樣品在疏水性例如環(huán)丁砜溶液中溶解時，疏水蛋白質(zhì)通常溶解。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)細(xì)胞樣品順利地溶于環(huán)丁砜溶液，并接著顯示在雙向凝膠上。顯示在凝膠上的蛋白質(zhì)溶液優(yōu)于目前市售的最強的樣品增溶溶液。
因此，優(yōu)選地，疏水性溶劑包括活性組分，它選自以下物質(zhì)組成的組環(huán)丁砜、環(huán)丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亞砜、二甲基甲酰胺。
在一項實施方案中，疏水性溶劑還包括其它組分，例如表面活性劑，如CHAPS、Triton X100、ASB 14、C7BZ0、SB 3-10或者任何非離子或兩性離子表面活性劑或它們的混合物；或者替代前者，或者另外，該溶劑可包括還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、TBP、三氰乙基膦(TCEP)、三羧乙基膦(TCEP)或巰基乙醇，或者它們的混合物。
在一項實施方案中，疏水性溶劑包括環(huán)丁砜、環(huán)丁烯砜或它們的混合物。
疏水性溶劑優(yōu)選是環(huán)丁砜溶液。一項實施方案中，環(huán)丁砜溶液用于從組織樣品中提取總蛋白。優(yōu)選地，從樣品中提取強疏水性蛋白質(zhì)。一項實施方案中，強疏水性蛋白質(zhì)包括，例如，大腸桿菌(E.coli)的膜蛋白。
一項實施方案中，疏水性溶劑包括約0.1M至約10.58M環(huán)丁砜，(飽和或100％環(huán)丁砜)。優(yōu)選地，環(huán)丁砜溶液包括1M至8M環(huán)丁砜；更優(yōu)選2M至6M環(huán)丁砜；更優(yōu)選地，3M至5M環(huán)丁砜；最優(yōu)選4M環(huán)丁砜。
優(yōu)選地，疏水性溶劑進(jìn)一步包括硫脲、ASB14和TBP。一項特別優(yōu)選的實施方案中，疏水性溶劑包括4M環(huán)丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP。
在一可替代的實施方案中，疏水溶劑可包括市售的溶劑如含有尿素的溶劑，特別是含有7M的尿素。優(yōu)選地，該疏水溶劑還包括硫脲、ASB14和TBP。在一特別優(yōu)選的實施方案中，尿素溶液包括7M尿素、2M硫脲、1％ASB14、2mM TBP。
第三方面，本發(fā)明涉及如文所述的本發(fā)明的IPG凝膠分離或分析樣品內(nèi)大分子的用途，例如，分離或分析蛋白質(zhì)復(fù)雜混合物中蛋白質(zhì)的分子(例如，肽、多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物)。
第四方面，本發(fā)明涉及用于分離和/或分析樣品內(nèi)至少一種大分子的試劑盒，這種試劑盒包括增溶劑、本發(fā)明的固定pH梯度(IPG)的凝膠和使用說明書(可選配)。
優(yōu)選地，增溶劑是疏水性溶劑。
優(yōu)選地，疏水性溶劑包括活性組分、表面活性劑和還原劑，其中活性組分選自由環(huán)丁砜、環(huán)丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺組成的組。
在優(yōu)選的實施方案中，疏水性溶劑包括4M環(huán)丁砜、4M硫脲、1％ASB-14和2mM TBP。
優(yōu)選地，試劑盒進(jìn)一步包括烷基化試劑，優(yōu)選半胱氨酸烷基化試劑，例如丙烯酰胺或碘乙酰胺。
整個說明書中，所使用的詞“包括(comprise)”，或者其變化，例如“comprises”、“comprising”，應(yīng)理解成意味包含規(guī)定的成分、整數(shù)或步驟、或者多種成分、多個整數(shù)或步驟，但不是排除任何其它成分、整數(shù)或步驟，或者多種成分、多個整數(shù)或步驟。
已經(jīng)包含于本說明書中的文獻(xiàn)、做法、材料、裝置、論文等的任何討論僅僅是為了說明本發(fā)明。不能因為其在本申請每個權(quán)利要求優(yōu)選權(quán)日之前已存在于澳大利亞，就認(rèn)為任何或所有這些素材成為一部分現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)或者是與本發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域的普通常識。
通過以下非限制性實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實施例1丙烯酰胺和DMA IPG條的IPG傾注。
傾注這些IPG所需的丙烯酰胺溶液由50％丙烯酰胺和50％DMA(以摩爾為基礎(chǔ))組成。用于傾注IPG的丙烯酰胺的百分比是40％T、4％C。因此丙烯酰胺配方如下所示40％T，4％C

表1為傾注7cm，4-7 DMA IPG(0.5mm)，采用Dr pH確定以下配方

表2
為傾注7cm，3-10 DMA IPG(0.5mm)，采用Dr pH確定以下配方

表3在采用小型傾注機傾注IPG梯度之前，向以上兩種溶液中，加入2μl的TEMED和5μl的40％APS。IPG在50度聚合1小時。它們接著以10％甲醇洗滌3次，以5％甘油、10％甲醇洗滌1次，并干燥過夜。然后可將IPG切成條，在-20℃或-80℃貯藏直至需要用于再水合。
實施例2AAP和DMA IPG條的IPG傾注。
制備具有3-10pH梯度和7cm的平板凝膠的IPG條。概述丙烯酰胺溶液和3-10溶液的配方。采用50∶50摩爾定量的DMA和AAP制備40％T、4％C丙烯酰胺溶液。

表4IPG傾注pH室。

表5繼之以IPG傾注步驟(如丙烯酰胺和DMA IPG條)。
實施例3環(huán)丁砜處理，以改進(jìn)環(huán)丁砜的性能。
1.加熱環(huán)丁砜至約50°并通過活性炭柱。這還可以成批操作。
2.在加入一種或多種表面活性劑和一種或多種還原劑之前，使環(huán)丁砜/硫脲溶液去離子(借助于混合床離子交換樹脂)。
實施例4大腸桿菌(E.coli)總蛋白的提取凍干的大腸桿菌(E.coli)購自Sigma(EC1)并從頭到尾用于這些實驗。大腸桿菌(E.coli)再懸浮于5mL的常規(guī)提取液或環(huán)丁砜提取液中。它們接著超聲處理1.5分鐘15秒為一次沖擊，并置于冰上保持低溫。每個樣品在21000×g旋轉(zhuǎn)離心10分鐘，移走上清液并用于再水合DMA IPG(用環(huán)丁砜提取液)或Pharmacia IPG(用常規(guī)提取液)。
實施例5大鼠肝臟總蛋白的提取將一個冰凍的大鼠肝臟(7.65g濕重)解凍，先切成小塊，再在液氮中碾碎。肝臟分成三份并分別以20mL的常規(guī)提取液、環(huán)丁砜提取液或變化的環(huán)丁砜提取液(6M環(huán)丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM TBP)提取。樣品采用探測器在70％強度下超聲處理4×15秒，在冰上保持低溫。樣品接著在14000×g旋轉(zhuǎn)離心45分鐘，收集上清液并用于IPG再水合。
實施例6大腸桿菌(E.coli)膜蛋白的提取將兩個1ml等分的冰凍大腸桿菌(E.coli)解凍并匯合。向匯合的樣品中加入10mL冰冷的100mM碳酸鈉。然后超聲處理(30％強度1×15秒，40％強度3×15秒，50％強度2×15秒)樣品，并且置于冰上保持低溫。室溫下樣品以2500rpm旋轉(zhuǎn)離心10分鐘。向上清液中加入90mL 100mM碳酸鈉，樣品在冰上攪拌1小時。樣品接著在4度于115000×g旋轉(zhuǎn)離心1小時，以使膜蛋白成為小球。然后采用1.5mL 50mM Tris-HCl，pH7.3將小球洗滌兩次，并分成4份裝入微量離心管中。每次洗滌之后蛋白質(zhì)在室溫下于21000×g旋轉(zhuǎn)10分鐘。小球分別在500μl的常規(guī)提取液、環(huán)丁砜提取液或變化的環(huán)丁砜提取液(6M環(huán)丁砜、4M硫脲、1％ASB-14、2mM三丁基膦)中再懸浮。樣品置于超聲浴5分鐘，再在室溫下于21000×g旋轉(zhuǎn)離心10分鐘。收集上清液并用于IPG再水合。
實施例7天然人血漿的制備收集人血(50mL)并肝素化。在4度將樣品在2000×g旋轉(zhuǎn)離心20分鐘。仔細(xì)移走血漿留下紅細(xì)胞，并在-80度貯藏。
實施例8IPG條再水合大腸桿菌(E.coli)樣品不經(jīng)稀釋施加至混合IPG條。大鼠肝臟樣品用提取液(不含蛋白質(zhì))稀釋五倍，加樣至IPG條上。人血漿(天然)用水稀釋60倍以上，并加至AAP+DMA IPG條上。每個樣品以125μl以及作為示蹤染料的痕量橘黃G一起加至IPG條。IPG條通常需再水合5-6小時。
實施例9IPG聚焦IPG條的聚焦在Pharmacia Consort裝置(E752型)上實施。等電聚焦的程序是300伏特4小時，1000伏特4小時，2500伏特4小時和5000伏特4-5小時。最大產(chǎn)生35-40KVh。
實施例10IPG條的均衡在第二向凝膠電泳開始之前，將環(huán)丁砜提取液中的大腸桿菌(E.coli)樣品和大鼠肝臟樣品以均衡溶液(6M尿素、2％w/v SDS、1×Tris-HCl凝膠緩沖液pH8.8、20％甘油，2.5％丙烯酰胺，5mM TBP)均衡2×5分鐘、1×10分鐘。人血漿(天然)樣品以1×Tris-HCl凝膠緩沖液pH8.8、20％甘油均衡20分鐘。所有以常規(guī)提取液再水合的IPG條在均衡緩沖液(6M尿素、2％w/vSDS、1×Tris-HCl凝膠緩沖液pH8.8、20％甘油、2.5％丙烯酰胺、5mM TBP)中均衡1×20分鐘。
實施例11第二向凝膠適用于大腸桿菌(E.coli)和大鼠肝臟樣品的第二向凝膠是Novex 4-12％1.5mm厚，雙-Tris凝膠。采用含0.5％瓊脂糖的1×MOPS緩沖液(50mMMOPS，50mM Tris，0.1％SDS，1mM EDTA)和痕量溴酚藍(lán)，將IPG條嵌在上述凝膠上。第二向采用持續(xù)的電流以5mA/凝膠工作30分鐘、10mA/凝膠工作30分鐘、20mA/凝膠工作1小時和25mA/凝膠工作2小時。當(dāng)溴酚藍(lán)染料前沿已經(jīng)從凝膠中移動出來時第二向電泳結(jié)束。人血漿樣品在Noverx3-8％1.5mM Tris-乙酸鹽凝膠上分離。用含0.5％瓊脂糖的1×Tris-乙酸鹽凝膠流動緩沖液(無SDS的50mM麥角胺(Tricine)、50mM Tris，以保持血漿的天然狀態(tài))和痕量溴酚藍(lán)，將IPG凝膠條嵌在上述凝膠上。第二向采用持續(xù)的電流以2mA/凝膠工作1小時，5mA/凝膠工作1小時，10mA/凝膠工作2小時，和15mA/凝膠工作2小時。染料前沿移出凝膠后，使凝膠電泳再持續(xù)30分鐘。
實施例12蛋白質(zhì)檢測用于本實驗的所有樣品以膠體考馬斯(Colloidal Coomassie)G-250檢測。在凝膠電泳結(jié)束后，凝膠自盒中移走并以G-250染色。在染色持續(xù)一夜之前更換一次染料。凝膠接著在1％乙酸中脫色24小時，然后掃描(惠普Scanjet5200以150dpi)并成像。
實施例13丙烯酰胺和DMA IPG條的結(jié)果結(jié)果表明環(huán)丁砜提取液優(yōu)于常規(guī)提取液，由于它提取更多的蛋白質(zhì)并顯示對提取蛋白質(zhì)的更好的溶解，尤其在IPG堿性末端。DMA IPG防止蛋白質(zhì)在IPG堿性末端沉淀，表明堿性水解顯著減少了，從而改善了凝膠圖像質(zhì)量。同樣不具有DMA的IPG具有在IPG條內(nèi)保留蛋白質(zhì)的傾向(明顯示于圖1)，然而在含DMA的IPG帶中未發(fā)現(xiàn)，因此在2D圖像上有更廣泛種類的蛋白質(zhì)和更多的原始蛋白質(zhì)提取物。
實施例14AAP和DMA IPG條的結(jié)果參考圖1和圖2，在這些IPG條上的用常規(guī)提取液和環(huán)丁砜提取液的大腸桿菌(E.coli)均產(chǎn)生良好的分離。這里顯示在所有的IPG條內(nèi)有蛋白質(zhì)保留，然而可在均衡步驟中由于多次洗滌而溶解。如果使用常規(guī)的和環(huán)丁砜提取液的凝膠有重疊，很明顯，不同的蛋白質(zhì)以不同的比率從這些溶液中提取出來。這表明需要兩種提取方法以分開更大量集合的蛋白質(zhì)。
參考圖3，天然人血漿副本已經(jīng)獲得和采用Pharmacia 3-10IPG帶時觀察到的相似的分離性能。將其與電泳(Electrophoresis)(T Manabe等1999，20，830-835)中公開的一個凝膠圖像比較時，顯示很少有拖尾。然而這種公開的凝膠是天然血漿的大凝膠(18cm IPG條和20cm的第二向)，通過采用更高填充，就會出現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)斑點。
含AAP和DMA的IPG條的新配方已在與不同類型提取液再水合中成功。這些樣品溶液包括常規(guī)的和環(huán)丁砜提取液以及適于天然凝膠的水基提取液。它們還成功聚焦這些蛋白質(zhì)并產(chǎn)生良好溶解的雙向凝膠。這種IPG條配方具有制備多用途IPG條的極大潛力。
參考圖7，其中常規(guī)提取液使用Pharmacia 4-7 IPG條，環(huán)丁砜提取液用于再水合在實驗室制備的丙烯酰胺/DMA 4-7 IPG條，常規(guī)的和環(huán)丁砜提取液在彼此類似濃度提取類似蛋白質(zhì)。相反，變化的環(huán)丁砜提取液在非常低的濃度下提取較少數(shù)量的蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，對如具體實施方案所示的本發(fā)明可進(jìn)行許多變化和修正，而并不背離本發(fā)明所概括描述的精神或范圍。因此，此處的實施方案被認(rèn)為在所有方面是說明性的和非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種適用于電泳的固定pH梯度(IPG)的凝膠，該凝膠包括聚合單體單元(I)CH2＝CR1-CO-NR2R3和(II)CH2＝CR4-CO-NR5R6，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6相同或不同，并且是氫或C1-C4烷基，其限制條件是R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一種是C1-C4烷基。
2.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R2和R3是C1-C4烷基。
3.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R2和R3是CH3。
4.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R1是H，R2和R3是CH3。
5.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R5和R6相同或不同，并且是氫或丙醇。
6.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R4、R5和R6是H。
7.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中R4和R5是H，R6是丙醇。
8.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中單元(I)和單元(II)的摩爾比是1∶10至10∶1。
9.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中單元(I)和單元(II)的摩爾比是1∶5至5∶1。
10.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中單元(I)和單元(II)的摩爾比是1∶2至2∶1。
11.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中單元(I)和單元(II)的摩爾比是1∶1。
12.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中該凝膠包括丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺(DMA)的混合物，或者N-丙烯?；被?AAP)和二甲基丙烯酰胺(DMA)的混合物。
13.按照權(quán)利要求12的固定pH梯度(IPG)的凝膠，包括摩爾比為1∶1的丙烯酰胺∶DMA或AAP∶DMA。
14.按照權(quán)利要求1的固定pH梯度(IPG)的凝膠，其中該IPG凝膠附著在固體支持物或襯板上。
15.一種分離或分析樣品內(nèi)至少一種大分子的方法，包括采用權(quán)利要求1的IPG凝膠對樣品進(jìn)行等電聚焦。
16.按照權(quán)利要求15的方法，該方法進(jìn)一步包括增溶樣品中至少一種大分子。
17.按照權(quán)利要求15的方法，其中樣品選自由細(xì)胞外液、組織樣品、細(xì)胞樣品、微生物樣品和培養(yǎng)樣品組成的組。
18.按照權(quán)利要求15的方法，其中大分子是蛋白質(zhì)。
19.按照權(quán)利要求16的方法，其中通過包括混合樣品和疏水性溶劑的方法進(jìn)行增溶。
20.按照權(quán)利要求19的方法，其中疏水性溶劑包括活性組分、表面活性劑和還原劑，其中活性組分選自由環(huán)丁砜、環(huán)丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亞砜、二甲基甲酰胺組成的組。
21.按照權(quán)利要求19的方法，其中疏水性溶劑包括環(huán)丁砜或環(huán)丁烯砜或者它們的混合物。
22.按照權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括在SDS-聚酰胺凝膠上對樣品進(jìn)行電泳。
23.按照權(quán)利要求1的IPG凝膠應(yīng)用于分離或分析樣品中的至少一種大分子。
24.一種用于分離和/或分析樣品中至少一種大分子的試劑盒，該試劑盒包括增溶劑、按照權(quán)利要求1-14中任何一項的固定pH梯度(IPG)的凝膠和可選配的使用說明書。
25.按照權(quán)利要求24的試劑盒，其中增溶劑是疏水性溶劑。
26.按照權(quán)利要求24的試劑盒，其中疏水性溶劑包括活性組分、表面活性劑和還原劑，其中活性組分選自由環(huán)丁砜、環(huán)丁烯砜、尿素、硫脲、丁基脲、二甲基脲、磷酸三丁基酯、二甲亞砜、二甲基甲酰胺組成的組。
27.按照權(quán)利要求26的試劑盒，其中疏水性溶劑包括環(huán)丁砜或環(huán)丁烯砜或者它們的混合物。
28.適用于電泳的固定pH梯度(IPG)的凝膠，該凝膠包括丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺(DMA) 的聚合單體單元，或者N-丙烯?；被?AAP)和二甲基丙烯酰胺(DMA)的聚合單體單元，其中所述聚合單體單元的摩爾比是1∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及適用于電泳的固定pH梯度(IPG)的凝膠，這種凝膠包括聚合單元(I)CH
文檔編號C08F120/56GK1537116SQ02809845
公開日2004年10月13日 申請日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者本·赫伯特, 杰思明·格林耶, 皮爾·喬奇·雷蒂, 格林耶, 喬奇 雷蒂, 本 赫伯特 申請人:普羅托姆系統(tǒng)知識產(chǎn)權(quán)有限公司