專利名稱：：疏水蛋白作為相穩(wěn)定劑的用途的制作方法疏水蛋白作為相穩(wěn)定劑的用途本發(fā)明涉及疏水蛋白和/或其衍生物之一用于在包含至少兩種液體相，特別是油和水的組合物中穩(wěn)定相的用途。疏水蛋白是約100到150個(gè)氨基酸的小蛋白質(zhì)，其是絲狀真菌，例如裂褶菌(Schizophyllmncommune)特有的。它們通常具有8個(gè)半胱氨酸單位。疏水蛋白都對(duì)界面具有顯著的親和力并且因此適于涂布表面，例如，以便通過(guò)形成兩親性膜改變界面的性質(zhì)。例如，可以通過(guò)疏水蛋白涂布特氟隆以得到親水表面?？梢詮奶烊粊?lái)源分離疏水蛋白。此外，疏水蛋白和它們的衍生物的生產(chǎn)方法是已知的。例如，德國(guó)專利申請(qǐng)DE102005007480乂>開(kāi)了疏水蛋白和其^t生物的生產(chǎn)方法?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)提出了疏水蛋白對(duì)于多種應(yīng)用的用途。WO96/41882提出使用疏水蛋白作為乳化劑、增稠劑、表面活性物質(zhì)，用于使疏7K表面親水、提高親水基質(zhì)的防水性，產(chǎn)生水包油乳劑或者油包水乳劑。還提出了藥學(xué)應(yīng)用，如生產(chǎn)軟骨劑或者乳骨，和美容應(yīng)用，如護(hù)膚或者生產(chǎn)洗發(fā)劑或者染發(fā)液。WO96/41882還描述了包含疏水蛋白的組合物，特別是用于藥物應(yīng)用的組合物。EP-A1252516公開(kāi)了用包含疏水蛋白的溶液在30到80。C的溫度下涂布窗戶、隱形眼鏡、生物傳感器、醫(yī)學(xué)裝置、用于進(jìn)行測(cè)試或者貯存的容器、船體、固體顆粒或者交通工具的框架或者底盤。WO03/53383描述了疏水蛋白在美容應(yīng)用中用于處理角蛋白物質(zhì)的用途。WO03/10331公開(kāi)了疏水蛋白具有表面活性性質(zhì)。例如，公開(kāi)了疏水蛋白涂布的傳感器，例如測(cè)試電極，其非共價(jià)結(jié)合其他物質(zhì)，例如，電活性200680016796.3說(shuō)明書第2/25頁(yè)物質(zhì)、抗體或者酶。WO2004/000880給出了用疏水蛋白或者疏水蛋白樣物質(zhì)涂布表面。WO01/74864涉及疏水蛋白樣蛋白質(zhì)，也陳述它們可以用于穩(wěn)定^lt體和乳劑。蛋白質(zhì)用于相分離的用途原則上也是已知的。例如，EP-A05016962描述了使用蛋白質(zhì)改進(jìn)例如油/水或者燃料/水混合物的相分離。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知取決于使用濃度和周圍的介質(zhì)，兩親性分子對(duì)相界面可以具有穩(wěn)定或者去穩(wěn)定作用。GB195,876公開(kāi)了使用膠體破裂油包水乳劑的方法。提到的膠體是例如蛋白質(zhì)如明膠、酪蛋白、白蛋白或者多糖，如阿拉伯膠或西黃蓍膠。JP-A11-169177描述了使用具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)破裂乳劑的用途。WO01/60916描述了至少一種水溶性蛋白質(zhì)、至少一種水溶性多糖和至少一種水溶性聚合物，例如，聚氧乙烯的無(wú)表面活性劑的混合物的用途，關(guān)于多種用途，也包括用于去乳化原油。然而，所引用的文獻(xiàn)沒(méi)有一種公開(kāi)了使用疏水蛋白防止再乳化的用途。使用蛋白質(zhì)具有普遍的優(yōu)點(diǎn)，它們是天然存在的物質(zhì)，可以生物降解，所以不導(dǎo)致環(huán)境的持久污染。在許多工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用中，例如，在原油-水乳液的分離中，一個(gè)重要的因素是非?？焖傧喾蛛x，另一種因素是避免或者防止相的再乳化。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過(guò)使用蛋白質(zhì)穩(wěn)定相的改進(jìn)方法。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在包含至少兩種液相，特別是油和水的組合物中使用至少一種疏水蛋白實(shí)現(xiàn)了該目的。根據(jù)本發(fā)明，疏水蛋白原則上可以以任何量使用，條件是確保提高包含至少兩種液相的組合物中的相穩(wěn)定。在本發(fā)明的上下文中，"相穩(wěn)定的提高"理解為指對(duì)于向混合物中加入物質(zhì)的情況，兩種液相的再乳化比不加入該物質(zhì)的相同混合物中進(jìn)行的更慢，或者加入該物質(zhì)防止兩種液相的再乳化。在本發(fā)明的上下文中，還將疏水蛋白理解為指其衍生物或者經(jīng)修飾的疏水蛋白。經(jīng)修飾或衍生的疏水蛋白可以例如是疏水蛋白融合蛋白或者M(jìn)酸序列與疏水蛋白的序列有至少60%,例如至少70%,尤其至少80%，更優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%同一性的蛋白質(zhì)，并且其還在50%程度上，例如60%程度上，尤其70%程度上，更優(yōu)選80%程度上滿足疏水蛋白的生物學(xué)性質(zhì)，特別是這樣的性質(zhì)通過(guò)用這些蛋白質(zhì)涂布改變表面性質(zhì)使得用所迷蛋白質(zhì)涂布玻璃表面前后水滴的接觸角增加至少20°,優(yōu)選至少25°，尤其至少30°。已經(jīng)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)相分離完成后，疏水蛋白或者其衍生物減小或者防止新形成乳液。當(dāng)長(zhǎng)期存在兩相或者將防止新乳液的發(fā)生時(shí)，也是特別有利的。在該上下文中，即使少量的疏水蛋白也是非常有效的。對(duì)于疏水蛋白的定義，其對(duì)于結(jié)構(gòu)特異性是關(guān)鍵的并且對(duì)于疏水蛋白的序列特異性不是關(guān)鍵的。天然疏水蛋白的M酸序列非常多樣化，但是它們都具有8個(gè)保守半胱氨酸殘基的高度特征性模式。這些殘基形成四個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。N末端和C末端在相對(duì)寬范圍內(nèi)可變。這里可能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)技術(shù)加到具有10到500個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的融合配偶體蛋白上。此外，在本發(fā)明上下文中將疏水蛋白和其衍生物理解為指具有相似結(jié)構(gòu)和功能等價(jià)性的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"疏水蛋白"將在下文中理解為指結(jié)構(gòu)通式(I)的多肽Xn-C，-Xi-50-C2-Xo-5-C3-Xi-ioo-C4-Xi-ioO-C5-Xi.50國(guó)C6國(guó)Xo-5-C7-Xi-5(rC8國(guó)Xm(I)其中X可以是20種天然存在的氨基酸(Phe，Leu，Ser，Tyr，Cys，Trp，Pro,His，Gln，Arg，Ile，Met，Thr，Asn，Lys，Val,Ala，Asp，Glu,Gly)的4壬一種。在該式中，X在每種情況下可以是相同或不同的。X旁的下標(biāo)都是氨基酸數(shù)目，c是半胱氨酸、丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或者蘇氨酸，其中用C表示的至少四個(gè)殘基是半胱氨酸，并且下標(biāo)n和m各自獨(dú)立地是0到500,優(yōu)選15到300之間的自然數(shù)。式(I)的多肽的特征還為這樣的性質(zhì)，在室溫下，涂布玻璃表面后，在每種情況下與同等大小的水滴和未涂布的玻璃表面的接觸角相比，它們引起水的接觸角增加至少20°，優(yōu)選至少25。，更優(yōu)選30°。用d到CS表示的M酸優(yōu)選為半胱氨酸；然而，它們還可以用具有相似空間填充的其他氨基酸替換，優(yōu)選用丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲疏氨酸或者甘氨酸替換。然而，d到<:8位的至少4個(gè)，優(yōu)選至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，尤其至少7個(gè)位置應(yīng)該由半胱氨酸組成。在本發(fā)明蛋白質(zhì)中，半胱氨酸可以以還原的形式存在或者相互形成二石危橋。尤其優(yōu)選分子內(nèi)形成C-C橋，特別具有至少一個(gè)分子內(nèi)二硫橋，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選3個(gè)，最優(yōu)選4個(gè)分子內(nèi)二硫橋。對(duì)于上述半胱氨酸用具有相似空間填充的氨基酸交換的情況，此類C位置有利地成對(duì)交換，其可以相互形成分子內(nèi)二石克橋。如果在稱作X的位置中也使用半胱氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸或者蘇氨酸，那么可以對(duì)應(yīng)地改變通式中各個(gè)C位置的編號(hào)。優(yōu)選使用通式(II)的疏水蛋白<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(II)進(jìn)行本發(fā)明，其中當(dāng)X,C和X和C旁的下標(biāo)每個(gè)如上定義時(shí)，下標(biāo)n和m每個(gè)是0到300之間的數(shù)字，并且該蛋白質(zhì)額外特征是上述接觸角的改變，和此外至少6個(gè)用C表示的殘基是半胱氨酸。更優(yōu)選地，所有C殘基是半胱氨酸。尤其優(yōu)選使用通式(III)的疏水蛋白<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(III)其中當(dāng)X，C和X旁的下標(biāo)每個(gè)如上定義時(shí)，下標(biāo)n和m每個(gè)是O到200之間的數(shù)字，并且該蛋白質(zhì)額外特征是上述接觸角的改變，和至少6個(gè)用C表示的殘基是半胱氨酸。更優(yōu)選地，所有C殘基是半胱氨酸。Xn和Xm殘基可以是天然地也結(jié)合到疏水蛋白的肽序列。然而，一個(gè)或兩個(gè)殘基也可以是天然不結(jié)合疏水蛋白的肽序列。這理解為指那些Xn和/或Xm殘基，其中在疏水蛋白中天然存在的肽序列通過(guò)在疏水蛋白中天然不存在的肽序列加長(zhǎng)。如果Xn和/或Xm是天然不結(jié)合到疏水蛋白的肽序列，那么此類序列長(zhǎng)為通常至少20個(gè)，優(yōu)選至少35個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)，最優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸。此類不天然結(jié)合到疏水蛋白的殘基在下文中也稱作融合配偶體。這意在表達(dá)蛋白質(zhì)可以由至少一個(gè)疏水蛋白部分和在自然中不以該形式一起發(fā)生的融合配偶體部分組成。融合配偶體部分可以選自多種蛋白質(zhì)。還可能的是多個(gè)融合配偶體將結(jié)合到一個(gè)疏水部分，例如，在疏水蛋白部分上的氨基末端(Xn)和羧基末端(Xm)。然而，還可能例如兩個(gè)融合配偶體將結(jié)合到本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)位置(Xn或Xm)。尤其適宜的融合配偶體是在微生物，特別在大腸桿菌(E.COli)或者枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中天然存在的蛋白質(zhì)。此類融合配偶體的實(shí)例;Uf列yaad(SEQIDNO:15和16)、yaae(SEQIDNO:17和18)，和石充氧還蛋白。還非常適宜的是這些序列的片段或衍生物，其包含所提到序列的僅僅一些，例如，70到99%，優(yōu)選5到50%，更優(yōu)選10到40%，或者其中與所提到的序列相比個(gè)別氨基酸或者核苷酸已經(jīng)改變，在該情況中百分?jǐn)?shù)各自^于狄酸數(shù)目。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合疏水蛋白，以及作為Xn和Xm基團(tuán)的融合配偶體，也具有所稱作的親和結(jié)構(gòu)域(親和標(biāo)記/親和尾)。以原理上已知的方式，這包含錨定基團(tuán)，其可以與特定互補(bǔ)基團(tuán)相互作用并且可以用于蛋白質(zhì)的更容易的操作和純化。此類親和結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包含(His)k、(Arg)k、(Asp)k、(Phe)k或(Cys)k基團(tuán)，其中k通常是從1到10的自然數(shù)。它可以優(yōu)選是(His)k基團(tuán)，其中k為4到6。序列中修飾，例如，通過(guò)糖基化、乙?；蛘咄ㄟ^(guò)化學(xué)交聯(lián)，例如，用戊二醛化學(xué)交聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明使用的疏水蛋白或者其衍生物的一個(gè)性質(zhì)是當(dāng)用該蛋白質(zhì)涂布表面時(shí)，表面性質(zhì)改變?？梢酝ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)確定表面性質(zhì)的改變，例如，通過(guò)測(cè)量用蛋白質(zhì)涂布表面之前和之后水滴的接觸角，并確定這兩次測(cè)量的差異。接觸角測(cè)量的進(jìn)行原則上是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。測(cè)量是基于室溫和5nl水滴和使用玻璃板作為基質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)部分給出了測(cè)量接觸角的合適方法的實(shí)例的確切的實(shí)驗(yàn)條件。在所提到的條件下，在每種情況下與相等大小具有增加接觸角至少20°,優(yōu)選至少25。，更優(yōu)選至少30。的性質(zhì)。用于進(jìn)行本發(fā)明的尤其優(yōu)選的疏水蛋白是dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basfl、basf2型疏水蛋白，其結(jié)構(gòu)特征在于下面的序列表。它們也可以僅僅是其部分或者衍生物。還可能的是多個(gè)、優(yōu)選2或者3個(gè)相同或者不同結(jié)構(gòu)的疏水蛋白部分相互結(jié)合和結(jié)合到對(duì)應(yīng)的合適的多肽序列，該多肽序列在自然中不結(jié)合疏水蛋白。才艮據(jù)本發(fā)明還尤其合適的是融合蛋白yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA國(guó)his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)，其多肽序列在括號(hào)中指出，和編碼所述多肽序列的核酸序列，特別是根據(jù)SEQIDNO:19，21，23的序列。這樣的蛋白質(zhì)也是尤其優(yōu)選的實(shí)施方案，所述蛋白質(zhì)通過(guò)交換、插入或者缺失至少一個(gè)到10個(gè)，優(yōu)選5個(gè)氨基酸，更優(yōu)選5%的所有氨基酸，從SEQIDNO:20，22或24中所示的多肽序列加工而來(lái)，并且仍然在至少50%的程度上保留起始蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)。蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)在本文中理解為指接觸角改變至少20°，其已經(jīng)描述。尤其適于進(jìn)4亍本發(fā)明的衍生物是從yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA國(guó)his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)通過(guò)截短yaad融合配偶體衍生的殘基。代替具有294個(gè)氨基酸的完整的yaad融合配偶體(SEQIDNO:16)，可以有利地使用截短的yaad殘基。然而，截短的殘基將包含至少20，更優(yōu)選至少35個(gè)氣基酸。例如，可以4吏用具有20到293，優(yōu)選25到250,更優(yōu)選35到150,例如35到100個(gè)氨基酸的截短的基團(tuán)。疏水蛋白和一個(gè)或多個(gè)融合配偶體之間的切割位點(diǎn)可以用于以非衍生的形式釋放純的疏水蛋白(例如，通過(guò)在甲石危氨酸BrCN切割，因子X(jué)a切割，腸激酶切割，凝血酶切割，TEV切割，等等)。還可能從一個(gè)融合配偶體，例如，yaad或者yaaed，和甚至不同序列的多個(gè)疏水蛋白，如DewA-RodA或者Sc3-DewA，Sc3-RodA連續(xù)產(chǎn)生融合蛋白。同樣可能使用疏水蛋白片段(例如，N-或C-末端截短)或者突變蛋白，其具有高達(dá)70%同源性。在每種情況下，最佳的構(gòu)建體都關(guān)于特定用途，即將分離的液相來(lái)選擇。肽合成方法，例如，通過(guò)Merrifield固相合成化學(xué)制備。通過(guò)合適的方法可以從天然來(lái)源分離天然存在的疏水蛋白。參考例如，Wiistenet.al"Eur.JCellBio.63，122-129(1994)或WO96/41882。優(yōu)選通過(guò)遺傳工程方法可以制備融合蛋白，其中編碼融合配偶體的一種核酸序列，特別是DNA序列與編碼疏水蛋白部分的一種核酸序列以這樣的方式組合使得由于組合的核酸序列的基因表達(dá)的結(jié)果，在宿主生物中產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)。此類制備方法例如公開(kāi)在德國(guó)專利申請(qǐng)DE102005007480.4中。用于所提到的制備方法的合適的宿主生物(生產(chǎn)生物)可以是原核生物(包括古細(xì)菌)或者真核生物，特別是包括嗜鹽菌和methanococcia的細(xì)菌、真菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)、米曲霉(Aspergillusoryzea)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、假單胞菌(Pseudomonasspec.)、乳桿菌(Lactobacilli)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)、里氏木霉(Trichodermareesei)、SF9(或相關(guān)細(xì)胞)，等等。^研究還涉;MJ^建體的用途，所述構(gòu)建體包含處于調(diào)節(jié)核酸序列的遺傳控制下的核酸序列，其編碼用于本發(fā)明的多肽，和包含至少一個(gè)這些表達(dá)構(gòu)建體的載體。使用的構(gòu)建體優(yōu)選包含從特定編碼序列的5'上游的啟動(dòng)子，和3'下游的終止子序列，和如果合適，其他常用的調(diào)節(jié)元件，在每種情況下有效連接到編碼序列。在本發(fā)明上下文中，"有效連接"理解為指啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和如果合適，其他調(diào)節(jié)元件的順序排列，使得每個(gè)調(diào)節(jié)元件可以完成它的如在編碼序列的表達(dá)中預(yù)期的功能?？捎行нB接的序列的實(shí)例是尋耙序列，和增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)，等等。其他調(diào)節(jié)元件包括選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)，等等。合適的調(diào)節(jié)序列例長(zhǎng)口描述于Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,CA(1990)。除了這些調(diào)節(jié)序列外，這些序列的天然調(diào)節(jié)可以存在于實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因的上游，并且如果合適，已經(jīng)被遺傳修飾以便關(guān)閉天然調(diào)節(jié)和增加所述基因的表達(dá)。優(yōu)選的核酸構(gòu)建體也有利地包含一個(gè)或多個(gè)所稱作的"增強(qiáng)子"序列，其功能上連接啟動(dòng)子，能夠增加核酸序列的表達(dá)。還在DNA序列的3，末端，可能插入額外的有利的序列，如其他調(diào)節(jié)元件或者終止子。核酸可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于構(gòu)建體中。如果合適，在構(gòu)建體中還可能存在其他標(biāo)記，如抗生素抗性或者互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的基因的其他標(biāo)記用于構(gòu)建體的選擇。用于制備的有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如啟動(dòng)子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp誦lac、Iaclq曙T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR或imlambda-P啟動(dòng)子，其有利地用于革蘭氏陰性細(xì)菌中。其他有利的調(diào)節(jié)序列存在于例如革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SP02和酵母或者真菌啟動(dòng)子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。還可能使用合成的啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)。為了在宿主生物中表達(dá)，將核酸構(gòu)建體有利地插入到載體，如質(zhì)?；蛘呤删w中，其能夠在宿主中最佳地表達(dá)基因。除了質(zhì)粒和噬菌體外，還將載體理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有其他載體，如病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、粘粒、和線性或環(huán)狀DNA，以及農(nóng)桿菌系統(tǒng)。這些載體可以在宿主生物中自主復(fù)制或者在染色體中復(fù)制。合適的質(zhì)粒為例如，在大腸桿菌中，pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR2卯、pIN-III"3陽(yáng)Bl、tgtll或pBdCI、在鏈霉菌中，pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361,在芽孢桿菌中，pUB110、pC194或pBD214，在棒桿菌中，pSA77或pAJ667、在真菌中，pALSl、pIL2或pBB116，在酵母中，2alpha、pAG-l、YEp6、YEpl3或pEMBLYe23或在植物中，pLGV23、pGHIac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所提到的質(zhì)粒構(gòu)成了可能的質(zhì)粒的一小部分。其他質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以例如從書籍CloningVectors(Eds.PouwelsP.H.等人Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985，ISBN0444卯4018)4尋到。有利地，用于表達(dá)存在的其他基因的核酸構(gòu)建體還包含用于增強(qiáng)表達(dá)的3，-和/或5，-末端調(diào)節(jié)序列，其取決于所選的宿主生物和基因被選擇用于最佳表達(dá)。這些調(diào)節(jié)序列意在使得能夠控制基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)。取決于宿主生物，這可以指例如僅在誘導(dǎo)后基因表達(dá)或過(guò)表達(dá)，或者它可以立即表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)。調(diào)節(jié)序列或者因子可以優(yōu)選地積極地影響從而增加所導(dǎo)入的基因的基因表達(dá)。從而，通過(guò)使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，可以在轉(zhuǎn)錄水平上有利地實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)元件的擴(kuò)增。此外，還可能通過(guò)例如提高mRNA的穩(wěn)定性增強(qiáng)翻譯。在載體的另一實(shí)施方案中，包含核酸構(gòu)建體或者核酸的栽體還可以有利地以線性DNA的形式被導(dǎo)入微生物中并且通過(guò)異源或者同源重組整合到宿主生物的基因組中。該線性DNA可以由線性化的栽體如質(zhì)粒組成，或者僅僅由核酸構(gòu)建體或者核酸組成。對(duì)于異源基因在生物中的最佳表達(dá)，有利地根據(jù)該生物中使用的特定"密碼子選擇"改變核酸序列。按照其他已知基因在所述生物中的計(jì)算機(jī)評(píng)估，可以容易地確定"密碼子選擇"。通過(guò)合適的啟動(dòng)子與合適的編碼核苷酸序列和終止子信號(hào)或者多聚腺苷酸化信號(hào)的融合，可以制備表達(dá)盒。為此，使用常規(guī)的重組和克隆技術(shù)，例:i口見(jiàn)T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)和Ausubel，F(xiàn).M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)。為了在合適的宿主生物中表達(dá)，有利地將重組核酸構(gòu)建體或者基因構(gòu)建體插入到宿主特異性載體中，該載體使得所述基因在宿主中最佳表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以例如從"CloningVectors"(PouwelsP.H.等人，編著，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)得到。借助載體，可能制備重組微生物，其已經(jīng)例如用至少一種載體轉(zhuǎn)化并且可以用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用的疏水蛋白或者其衍生物。有利地，將上述重組構(gòu)建體導(dǎo)入合適的宿主系統(tǒng)中并表達(dá)。優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的克隆和轉(zhuǎn)染方法，例如，共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等等，以便引起所提到的核酸在特定表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。合適的系統(tǒng)描述于例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人，編著，WileyInterscience,NewYork1997或Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989。還可能制備同源重組的微生物。為此，制備包含至少一部分將使用的基因或者編碼序列的載體，其中如果合適，已經(jīng)導(dǎo)入至少一個(gè)^J^酸缺失、添加或者替代以便改變，例如功能性破壞該序列("敲除"載體)。所導(dǎo)入的序列例如還可以是相關(guān)^t生物的同源物或者來(lái)自哺乳動(dòng)物、酵母或者昆蟲(chóng)來(lái)源。用于同源重組的載體可以備選地這樣構(gòu)造使得對(duì)于同源重組的情況，內(nèi)源基因已經(jīng)以另一種方式突變或者改變，但是仍然編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)使得內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)改變)。根據(jù)本發(fā)明使用的基因的改變的部分在同源重組栽體中。用于同源重組的合適的載體的構(gòu)建描迷于例如Thomas,K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell51:503中。原則上，對(duì)于此類核酸或者此類核酸構(gòu)建體，所有原核或者真核生物都可以用作重組宿主生物。有利地，使用的宿主生物是孩i生物，如細(xì)菌、真菌或者酵母。有利地，使用革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選來(lái)自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、假單月包菌科(Pseudomonadaceae)、才艮瘤菌科(Rhizobiaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)或i若卡氏菌科(Nocardiaceae)，更優(yōu)選埃希氏菌屬(Escherichia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)或紅球菌屬(Rhodococcus)的細(xì)菌。用于上述融合蛋白的制備方法中的生物取決于宿主生物，以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式生長(zhǎng)或培養(yǎng)。微生物通常在液體培養(yǎng)基中在0到100。C,優(yōu)選10到60。C的溫度下用氧氣噴射下生長(zhǎng)，該培養(yǎng)基包含碳源(通常為糖的形式)、氮源(通常為有機(jī)氮源的形式，如酵母抽提物)，或者鹽，如硫酸銨、微量元素，如鐵、錳和鎂鹽，以及如果合適，維生素。營(yíng)養(yǎng)物液體的pH可以保持在固定值，即在生長(zhǎng)期間受到調(diào)節(jié)或者不受調(diào)節(jié)?？梢砸苑峙?、半分批式或者連續(xù)發(fā)酵式實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)物可以在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)導(dǎo)入或者半連續(xù)或者連續(xù)補(bǔ)充。酶可以通過(guò)實(shí)施例中描述的方法從生物分離或者作為粗提物用于反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)用于重組制備的方法制備用于本發(fā)明的疏水蛋白、或者其功能性的生物活性片段，在該方法中，培養(yǎng)產(chǎn)生多肽的^:生物，如果合適"^秀導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，并將它們從培養(yǎng)物分離。如果希望，還可以在工業(yè)M^上以這種方式生產(chǎn)蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)已知的方法培養(yǎng)和發(fā)酵重組微生物。細(xì)菌可以例如在TB或者LB培養(yǎng)基中和20到4(TC的溫度和6到9的pH下繁殖。合適的培養(yǎng)條件特別描述于例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)。如果蛋白質(zhì)不分泌到培養(yǎng)基中，那么將細(xì)胞破碎并通過(guò)已知的蛋白質(zhì)分離方法從裂解物得到產(chǎn)物，如果需要，可以通過(guò)高頻超聲波、通過(guò)高壓、例如，在弗氏壓碎器中，通過(guò)滲透裂解，通過(guò)去污劑的作用，裂解酶或者有機(jī)溶劑，通過(guò)勻漿器或者通過(guò)多種所列方法的組合破碎細(xì)胞。通過(guò)已知的層析方法可以純化蛋白質(zhì)，所述方法為諸如分子篩層析(凝膠過(guò)濾)，如Q瓊脂糖(S印harose)層析、離子交換層析和疏水層析，以及使用其他常規(guī)的方法，如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析和非變性凝膠電泳。合適的方法描迷于例如Cooper,F.G.，BiochemischeArbeitsmethoden生物化學(xué)技術(shù)j，VerlagWaterdeGruy國(guó)ter，Berlin,NewYork或Scopes,R.，ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin?？梢杂绕溆欣氖峭ㄟ^(guò)對(duì)融合疏水蛋白提供特定的錨定基團(tuán)而容易分離和純化所述融合疏水蛋白，所述錨定基團(tuán)可以結(jié)合到固相支持體，特別是合適的聚合物上對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)基團(tuán)。此類固相支持體可以例如用作層析柱的填料，并且以這種方式一般可以顯著提高分離效率。此類分離方法也稱作親和層析。為了摻入錨定基團(tuán)，在蛋白質(zhì)的制備中，可以使用載體系統(tǒng)或者寡核苷酸，其延長(zhǎng)cDNA特定的核苷酸序列并且因此編碼改變的蛋白質(zhì)或者融合蛋白。為了更容易純化，經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)包含作為錨的所稱作的"標(biāo)記"，例如稱作六組氨酸錨的修飾。用組氨酸錨修飾的融合疏水蛋白可以層析純化，例如，使用鎳-瓊脂糖(Sepharose)作為柱填料?？梢酝ㄟ^(guò)合適的洗脫劑，如咪唑溶液從柱子隨后再次洗脫融合疏水蛋白。在筒化的純化方法中，可以免除層析純化。為此，通過(guò)合適的方法，例如，首先通過(guò)微濾或者通過(guò)離心從培養(yǎng)液除去細(xì)胞。隨后，通過(guò)合適的方法，例如，通過(guò)已經(jīng)在上面提到的方法破碎細(xì)胞，可以分離細(xì)胞碎片和內(nèi)含體。所述分離可以有利地通過(guò)離心實(shí)現(xiàn)。最后，可以原則上以已知的方式破碎內(nèi)含體以便釋放融合疏水蛋白。這可以例如通過(guò)酸、堿和/或去污劑進(jìn)行。具有用于本發(fā)明的融合疏水蛋白的內(nèi)含體可以一般完全溶解，甚至使用0.1MNaOH在約1小時(shí)內(nèi)完全溶解。以這種簡(jiǎn)化的方法得到的融合疏水蛋白的純度基于所有蛋白質(zhì)的量按重量計(jì)一般為60到80%。通過(guò)所述簡(jiǎn)化的純化方法得到的溶液可以不用進(jìn)一步純化而用于進(jìn)行該發(fā)明。如所述的制備的疏水蛋白可以直接用作融合蛋白，或者脫離和除去融合配偶體后，用作"純的"疏水蛋白。當(dāng)意在除去融合配偶體時(shí)，適當(dāng)?shù)氖窃谌诤系鞍字惺杷鞍撞糠趾腿诤吓渑俭w部分之間摻入潛在的切割位點(diǎn)(蛋白酶的特定識(shí)別位點(diǎn))。合適的切割位點(diǎn)特別是在疏水蛋白部分和在融合配偶體部分中都不發(fā)生的那些肽序列，其可以用生物信息學(xué)工具容易地確定。特別合適的實(shí)例是曱疏氨酸處的BrCN切割，或者蛋白酶介導(dǎo)的切割與因子X(jué)a切割，腸激酶切割，凝血酶切割，TEV(煙草蝕紋病毒蛋白酶)切割。根據(jù)本發(fā)明，疏水蛋白或者其衍生物可以用于穩(wěn)定包含至少兩個(gè)液相的組合物中已經(jīng)分離的相。組合物原則上可以是任何組合物，只要它們具有至少兩種液相。具體地，組合物可以是這樣的組合物，在加入至少一種疏水蛋白或者其衍生物前，組合物以乳液的形式存在，然后在延長(zhǎng)的過(guò)程(優(yōu)選大于1分鐘，特別大于5分鐘)中分離成兩相，然后僅僅與疏水蛋白混合。在本發(fā)明上下文中，組合物以及至少兩個(gè)液相可以原則上還包含其他相。所述至少兩種液相是不同密度的兩種液相，優(yōu)選油和水，不同密度的兩種有機(jī)溶液，燃料和水或者溶劑和水。在本發(fā)明上下文中，水性溶液是包含水，任選與其他溶劑組合的溶液。在本發(fā)明上下文中，每種液相可以包含其他物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，油優(yōu)選原油。合適的溶劑是與水形成兩相混合物的所有液體，特別是有機(jī)溶劑，如醚、芳族化合物，如甲苯或者苯，醇、烷、烯、環(huán)烷、環(huán)烯、酯、酮、環(huán)烷或者面化烴。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明因此涉及至少一種疏水蛋白或者其至少一種衍生物的如上述的用途，所述組合物包含油，優(yōu)選原油，和水，或者其他燃料和水。在本發(fā)明上下文中，組合物可以還包含其他相，如固相或者液相，特別是固相。疏水蛋白或者其衍生物可以用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有用途。具體地，在本發(fā)明上下文中，應(yīng)該提及用作汽油燃料/水混合物、其他燃料/水混合物、原油提取或者原油運(yùn)輸中的原油和水相，和通過(guò)用7JC提取原油對(duì)原油脫鹽和隨后所得相的進(jìn)一步處理中的相穩(wěn)定劑?？赡芡ㄟ^(guò)加入破乳劑破乳。例如，提取的原油通常以相對(duì)穩(wěn)定的油包水乳液存在，根據(jù)沉積的類型，可以占高達(dá)水重量的卯％。在原有的操作和純化中，除去大部分水后，原油將仍然包含按重量計(jì)約2到3%的所得到的水。這與油形成穩(wěn)定的乳液，其甚至通過(guò)離心和加入常規(guī)的破乳劑也不能完全除去。這是有問(wèn)題的，因?yàn)樗紫染哂懈啕}含量，因此具有腐蝕作用，并且殘留的水還增加將運(yùn)輸和儲(chǔ)存的體積，其導(dǎo)致成本增加。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以使用疏水蛋白或者其衍生物以便改善這些組合物中的相分離。實(shí)現(xiàn)了非?？焖俚姆蛛x。在該情況中，必須根據(jù)將乳化的油和脂肪和存在的任何乳化劑和表面活性劑調(diào)節(jié)破乳劑，以便實(shí)現(xiàn)最佳的作用。乳液的破碎還可以額外通過(guò)升高溫度來(lái)促進(jìn)，例如0到100'C,例如，10到80。C,特別是20到60。C的溫度。另一發(fā)明性用途是水包油或者油包水混合物中的相穩(wěn)定，例如，二相系統(tǒng)，其已經(jīng)用作冷卻潤(rùn)滑劑并且將被回收。還例如在船上得到7K/油混合物作為船底污水。在該情況中，乳液的分離和分離相的保持是必要的，以便能夠可靠地除去水。使用的疏水蛋白或衍生物的量可以在寬范圍內(nèi)改變，有利地將根據(jù)組合物自身和組合物中存在的任何其他組分調(diào)節(jié)用量。當(dāng)例如組合物包含延遲或者惡化至少兩種液相的相分離的物質(zhì)，如表面活性劑或者乳化劑時(shí)，有利地使用更大量的疏水蛋白或者衍生物。因?yàn)橛停貏e是原油由許多化合物組成，由于油的不同的化學(xué)組成，水和鹽含量和乳液分裂的特定條件，如溫度、乳液分裂的持續(xù)時(shí)間、定量加入的類型和與混合物中其他組分的相互作用，必須根據(jù)特定條件調(diào)節(jié)破乳劑。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，甚至少量的疏水蛋白或者其衍生物也可導(dǎo)致相穩(wěn)定的提高。根據(jù)本發(fā)明，疏水蛋白或者其衍生物可以以任何合適的量使用。通常，至少一種疏水蛋白或者其衍生物基于總體組成以0.001到100ppm的量；優(yōu)選0.001到80ppm的量，更優(yōu)選0.001到20ppm，最優(yōu)選0.01到10ppm的量使用。在本發(fā)明的上下文中，單位卯m指mg/kg。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明因此涉及如上述的用途，其中疏水蛋白或者其至少一種衍生物基于總體組成以0.001到100ppm的量使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待穩(wěn)定的相組合物的類型確定使用的濃度。當(dāng)組合物是包含燃料和水的組合物時(shí)，疏水蛋白或者其衍生物通常以0.001到20ppm，優(yōu)選0.005到2ppm，特別0.01到lppm,更優(yōu)選0.05到lppm的量4吏用。當(dāng)組合物是包含原油和水的組合物時(shí)，疏水蛋白或者其衍生物通常以0.01到100ppm，優(yōu)選0.1到80ppm，特別0.1到50ppm,更優(yōu)選0.1到20ppm的量^吏用。根據(jù)本發(fā)明，還可能的是所述組合物以及至少一種疏水蛋白或者其衍生物包含提高相穩(wěn)定的其他化合物。所述化合物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于此類應(yīng)用的所有化合物。用于提高相穩(wěn)定，特別用作原油生產(chǎn)中的乳液破碎劑的合適的其他化合物的實(shí)例是烷氧基化的苯酚-甲醛樹(shù)脂、EO/PO嵌段共聚物、交聯(lián)的雙環(huán)氧化合物、聚酰胺或者其烷氧基化物，磺酸鹽、乙氧基化脂肪胺、琥珀酸鹽和DE102005006030.7中指出的用于此類用途的化合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上述的用途，其中使用提高相穩(wěn)定的至少一種其他化合物以及至少一種疏水蛋白或者其至少一種衍生物。在另一方面，本發(fā)明還涉及穩(wěn)定包含至少兩種液相的組合物中液相的方法，其包括向該組合物中加入至少一種疏水蛋白或者其至少一種衍生物。組合物可以是如上述的組合物，包含至少兩種液相，例如，包含油，優(yōu)選原油，和水的組合物，或者包含燃料和水的組合物。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包含其他步驟，例如，首先進(jìn)行乳液的相分離或者破碎，隨后向7jC相中加入疏水蛋白。根據(jù)本發(fā)明，可以將疏水蛋白或者其衍生物加入2相系統(tǒng)的水相中，或者加入包含燃料的制劑中。該制劑與水接觸時(shí)，這使得穩(wěn)定相或者防止再乳化。同樣有利的是向原油_水相中加入疏水蛋白或者其衍生物以便例如，在運(yùn)輸過(guò)程中防止乳液的再次形成。在本發(fā)明的上下文中，包含燃料的制劑可以包含通常存在于此類制劑中的其他添加劑。合適的添加劑例如在WO2004/087808中指出。在本發(fā)明的上下文中，將燃料理解為指輕的、中等的或者重的燃料油。在本發(fā)明的上下文中，將燃料理解為指汽油燃料、柴油^U燃料或者氣輪機(jī)燃料。燃料更優(yōu)選是汽油燃料。所提到的添加劑以本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為適合具體應(yīng)用的量使用。本發(fā)明的制劑可以還與其他常規(guī)組分和添加劑組合。這里應(yīng)該提到例如沒(méi)有顯著的去污劑作用的載體油。合適的礦物載體油是原油加工中得到的餾分，如例如來(lái)自SN500-2000類的具有粘性的光亮油或者基油；以及芳香烴、石蠟烴和烷氧基鏈烷醇。根據(jù)本發(fā)明同樣合適的是稱作"加氫裂解油"并且在石油精煉中得到的餾分(具有360到500。C沸騰范圍的真空切取餾分，可以從天然石油催化加氫和異構(gòu)化以及在高壓下脫蠟得到)。同樣合適的是上述礦物載體油的混合物。根據(jù)本發(fā)明使用的合成的載體油的實(shí)例選自聚烯烴(聚a-烯烴或者聚內(nèi)烯烴)、聚酯、聚烷氧化物、聚醚、脂族聚醚胺、烷基酚-開(kāi)始的聚醚、烷基酚-開(kāi)始的聚醚胺和長(zhǎng)鏈鏈烷醇的氛基酯。其他合適的栽體油系統(tǒng)例如在DE-A3826608、DE-A4142241、DE-A4309074、EP誦A0452328和EP誦A0548617中描述，將它們明確引入作為參考。其他合適的合成的載體油是烷氧基化烷基酚，如DE-A10102913.6中所述。所提到的載體油以本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)于具體應(yīng)用認(rèn)為合適的量使用。其他常規(guī)的添加劑是腐蝕抑制劑，如基于有機(jī)羧酸的銨鹽的腐蝕抑制劑，所述銨鹽傾向于形成膜，或者對(duì)于非鐵的金屬腐蝕保護(hù)，基于雜環(huán)芳香化合物的腐蝕抑制劑；抗氧化劑或者穩(wěn)定劑，例如基于胺如對(duì)-苯二胺、二環(huán)己胺或者其衍生物的抗氧化劑或者穩(wěn)定劑，或者基于酚，如2，4-二-叔丁基笨酚或者3，5-二叔丁基-4-羥基苯基丙酸的抗氧化劑或者穩(wěn)定劑；其他常規(guī)破乳劑；抗靜電劑；金屬茂，如二茂鐵；甲基環(huán)戊二烯三g錳；潤(rùn)滑性改進(jìn)劑(潤(rùn)滑性添加劑)，如特定脂肪酸，烯基琥珀酸酯，二(羥基烷基)月旨肪胺，羥基乙酰胺或者蓖麻油；和染料(標(biāo)記)。如果合適，還加入胺以降低燃料的pH。將所提到的具有極性部分(a)到(i)的去污劑添加劑通常以按重量計(jì)10到5000卯m，特別按重量計(jì)50到1000ppm的量加入到燃料中。如果需要，將所提到的其他組分和添加劑以常規(guī)量加入。根據(jù)本發(fā)明，合適的燃料是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有燃料，例如，汽油，如Ullmann的EncyclopediaofIndustrialChemistry,第五版1990，A16巻，p.719ff中所述。根據(jù)本發(fā)明，合適的燃料是內(nèi)燃機(jī)燃料、煤油和噴氣式飛機(jī)燃料。具體地，具有按體積計(jì)不多于60%，例如按體積計(jì)不多于42%的芳香族化合物含量和按重量計(jì)不多于2000ppm，例如按重量計(jì)不多于150ppm的硫含量的汽油燃料是合適的。汽油燃料中的芳香族化合物含量為例如按體積計(jì)10到50%,例如，按體積計(jì)30到42%,特別按體積計(jì)32到40%汽油燃料中的石危含量為例如按重量計(jì)2到500ppm，例如，按重量計(jì)5到150%，或者按重量計(jì)10到100ppm。此外，合適的汽油燃料可以具有例如按體積計(jì)高達(dá)50%,例如按體積計(jì)6到21%,特別按體積計(jì)7到18%的烯烴含量；按體積計(jì)高達(dá)5%，例如按體積計(jì)0.5到1.0%,特別按體積計(jì)0.6到0.9%的苯含量，和/或按重量計(jì)高達(dá)25%,例如按重量計(jì)高達(dá)10%，或者按重量計(jì)1.0到2.7%，特別按重量計(jì)1.2到2.0%的氧含量。具體地，作為實(shí)例可以提及那些汽油燃料，其通常具有按體積計(jì)不多于38%的芳香族化合物含量，按體積計(jì)不多于21%的烯烴，按重量計(jì)不多于50ppm硫含量，按體積計(jì)不多于1.0%的苯含量和按重量計(jì)1.0到2.7%的氧含量。汽油燃料中醇和醚的含量可以在寬范圍內(nèi)變動(dòng)。典型的最大含量的實(shí)例是按體積計(jì)15%甲醇，按體積計(jì)65%乙醇，按體積計(jì)20%異丙醇，按體積計(jì)15%叔丁醇，按體積計(jì)20%異丁醇和按體積計(jì)30%的在分子中具有5個(gè)或更多碳原子的醚。根據(jù)本發(fā)明合適的汽油燃料的夏天蒸汽壓通常不大于70kPa，特別60kPa(每種情況下在37°C)。汽油燃料的RON通常為75到105。對(duì)應(yīng)的MON的常規(guī)范圍為65到95。所提到的規(guī)格通過(guò)常規(guī)方法(DINEN228)確定。在下文通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)闡明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1克隆yaad-His6/yaaE-His6的準(zhǔn)備用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal572/Hal573)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用的模板DNA是枯草芽孢桿菌的基因組DNA。所得的PCR片段包含枯草芽孢桿菌yaaD/yaaE基因的編碼序列，在每端分別具有Ncol和BgUI限制性切割位點(diǎn)。純化PCR片段并用限制性內(nèi)切核酸酶Ncol和BglII切割。該DNA片段用作插入片段并克隆到來(lái)自Qiagen的栽體pQE60中，其已經(jīng)事先用限制性內(nèi)切核酸酶Ncol和BglII線性化。所形成的載體pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5可以用于表達(dá)由YAAD::HIS6或YAAE::HIS6組成的蛋白質(zhì)。Hal570:gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571:gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572:ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573:gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc實(shí)施例2克隆yaad疏水蛋白DewA-His6用寡核苷酸KaM416和KaM417進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。使用的模板DNA是構(gòu)巢曲霉的基因組DNA。所得的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的編碼序列和N-末端因子X(jué)a蛋白酶切割位點(diǎn)。純化PCR片段并用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI切割。該DNA片段用作插入片段并克隆到事先用限制性內(nèi)切核酸酶BglII線性化的載體pQE60YAAD#2中。所形成的載體#508可以用于表達(dá)由YAAD::Xa::dewA::HIS6組成的融合蛋白。KaM416:GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT-GAAGTTCTCCGTCTCCGC實(shí)施例3克隆yaad疏水蛋白R(shí)odA-His6類似地4吏用寡核香酸KaM434和KaM435將質(zhì)粒#513克隆到質(zhì)粒#518中。KaM434:GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGCKaM435:CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG實(shí)施例4克隆yaad疏水蛋白BASF1-His6類似地使用寡核苷酸KaM417和KaM418將質(zhì)粒#507克隆到質(zhì)粒#508中。使用的模板DNA是合成的DNA序列(疏水蛋白BASF1)(見(jiàn)附件，SEQIDNO:ll和12)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實(shí)施例5克隆yaad疏水蛋白BASF2-His6類似地4吏用寡核苷酸KaM417和KaM418將質(zhì)粒#506克隆到質(zhì)粒#508中。使用的模板DNA是合成的DNA序列(疏水蛋白BASF2)(見(jiàn)附件，SEQIDNO:13和14)。KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGCKaM418:CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG實(shí)施例6克隆yaad疏水蛋白SC3-His6類似地〗吏用寡核苷酸KaM464和KaM465將質(zhì)粒#526克隆到質(zhì)粒#508中。使用的模板DNA是來(lái)自Schyzophyllumcommune的cDNA(見(jiàn)附件,SEQIDNO:9和10)。KaM464:CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGCKaM465:GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT實(shí)施例7重組大腸桿菌菌林yaad疏水蛋白DewA-His6的發(fā)酵在15mlGreiner管中的3mlLB液體培養(yǎng)基中接種表達(dá)yaad疏水蛋白DewA-His6的大腸桿菌菌林。在搖床上37。C下以200rpm(轉(zhuǎn)/分鐘)培養(yǎng)8小時(shí)。在每種情況下，兩個(gè)1升的帶擋板的錐形瓶和25011111^培養(yǎng)基(+100jig/ml氨千青霉素)在每種情況下接種lml初步培養(yǎng)物并在搖床上以180rpm在37。C下培養(yǎng)9小時(shí)。在20升發(fā)酵罐中用0.5升初步培養(yǎng)物(OD柳礎(chǔ)1:10，對(duì)1120測(cè)量)接種13.5升LB培養(yǎng)基(+100jig/ml氨千青霉素)。在~3.5的OD6。。nm下，加入140ml100mMIPTG。3小時(shí)后，冷卻發(fā)酵罐到IO'C并離心除去發(fā)酵液。細(xì)胞沉淀用于進(jìn)一步純化。實(shí)施例8純化重組的疏水蛋白融合蛋白將100g細(xì)胞沉淀(IOO-500mg疏水蛋白)用pH7.5的50mM磷酸鈉緩沖液補(bǔ)充到總體積200ml，并重懸浮。將懸浮液用Ultraturrax型T25(Janke和Kunkel;IKA-Labortechnik)處理10分鐘并隨后在室溫下用500單位Benzonase(Merck,Darmstadt;訂單號(hào)L01697.0001)溫育1小時(shí)以降解核酸。細(xì)胞破碎前，用玻璃柱體(P1)實(shí)現(xiàn)過(guò)濾。對(duì)于細(xì)胞破碎和斷裂剩余的基因組DNA，在1500巴下進(jìn)行兩次勻漿器循環(huán)(MicrofluidizerM-110EH;MicrofluidicsCorp.)。離心勾漿物(SorvallRC-5B，GSA-轉(zhuǎn)子，250ml離心杯，60分鐘，4'C,12000rpm，23000g),將上清液置于冰上并將沉淀物重懸浮在100ml磷酸鈉緩沖液，pH7.5中。重復(fù)離心和重懸浮3次，在第三次重復(fù)時(shí)磷酸鈉緩沖液包含1%SDS。重懸浮后，攪拌混合物1小時(shí)并進(jìn)行最后的離心(SorvallRC-5B，GSA-轉(zhuǎn)子，250ml離心杯，60分鐘，4'C，12000rpm，23000g)。根據(jù)SDS-PAGE分析，最后離心后，在上清液中存在疏水蛋白(圖1)。實(shí)驗(yàn)表明疏水蛋白可能以內(nèi)含體的形式存在于對(duì)應(yīng)的大腸桿菌細(xì)胞中。向用50mMTris-CIpH8.0緩沖液平衡的50ml鎳-瓊脂糖HP(SepharoseHighPerformance)17-5268-02柱(Amersham)應(yīng)用50ml包含疏水蛋白的上清液。用50mMTris-CIpH8.0緩沖液洗潦柱子并隨后用包含200mM咪唑的50mMTris-CIpH8.0緩沖液洗脫疏水蛋白。為了除去咪唑，對(duì)50mMTris-CIpH8.0緩沖液透析溶液。圖l顯示了所制備的疏水蛋白的純化泳道A:應(yīng)用于鎳-瓊脂糖柱(l:IO稀釋)泳道B:穿過(guò)液-洗滌步驟洗脫液泳道C-E:OD280最大值的洗脫級(jí)分(WP1，WP2，WP3)泳道F顯示了應(yīng)用的標(biāo)記。圖1的疏水蛋白具有約53kD的分子量。一些較小的帶代表疏水蛋白的降解產(chǎn)物。實(shí)施例9性能測(cè)試；通過(guò)玻璃上水滴的接觸角的改變表征疏水蛋白基質(zhì)玻璃(窗玻璃，StiddeutscheGlas，Mannheim):使用根據(jù)實(shí)施例8純化的疏水蛋白。-溶液中疏水蛋白的濃度lOOjig/ml,溶液還包含50mM乙酸鈉緩沖液和0.1Vo聚氧乙烯(20)-單月桂酸山梨聚糖(Tweei^20),溶液的pH:4-將玻璃板浸入該溶液中過(guò)夜(溫度80°C)-然后將疏水蛋白涂布的玻璃板從溶液取出并用蒸餾水洗滌，-然后溫育10分鐘/80。C/蒸餾水中1%SDS溶液-用蒸餾水再次洗滌在空氣中干燥樣品，并在室溫下測(cè)定5^il水滴與經(jīng)涂布的玻璃表面的接觸角(度)。在DataphysicsOCA15+接觸角系統(tǒng)，軟件SCA20.2.0.(2002年11月)上測(cè)量接觸角。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明書實(shí)現(xiàn)測(cè)量。未處理的玻璃得到30±5°的接觸角。用根據(jù)實(shí)施例8的疏水蛋白(yaad-dewA-his6)涂布的玻璃板得到75±5°的接觸角。=>接觸角增加45°實(shí)施例10疏水蛋白的相穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)在每種情況下，向snaplid玻璃瓶中引入SOml原石油(同質(zhì)的原石油，WintershallAG，Emiichheim,才笨頭60、64、83、87、301和507)的乳液和水。通過(guò)UUraturrax攪拌器(2^00rpm下4分鐘的攪拌時(shí)間)在約50ml水中乳化1000ppm原石油制備乳液。向該乳液中力p入在A例中不加入破乳劑，在B例中10ppm來(lái)自實(shí)施例8的疏水蛋白在C例中10ppmPolyDADMAC(固體含量為28到32%的破乳劑(IS03251),粘度從200到800mPas(IS02595))在D例中10ppmLupasolSK(用聚乙烯亞胺接枝的聚^J^胺，生產(chǎn)商N(yùn)ipponShokubai，Japan)之后，讓樣品靜置3天，期間乳液分離(見(jiàn)圖2中的圖示，上排)。然后用手通過(guò)多次圓形移動(dòng)輕微搖動(dòng)樣品。在A、C和D例中，這再次形成高不透明性(乳液形成)；對(duì)于B例(包含疏水蛋白)，保留相分離。在各例中，在包含10卯m的疏水蛋白的樣品B中還形成薄片，但是它們立即上升到上面的油相(見(jiàn)圖2圖示的下排)。這些實(shí)驗(yàn)表明疏水蛋白比商業(yè)破乳劑更好地穩(wěn)定已經(jīng)分離成兩個(gè)分離相的乳液。也可以在乳液分裂后向水相中加入疏水蛋白。實(shí)施例11相穩(wěn)定化的比較首先以3:1二曱苯/異丙醇混合物(基于體積)制備表中所列的破乳劑的按重量計(jì)5%的溶液。加入前1小時(shí)，將實(shí)施例8的疏水蛋白用蒸餾水制備為1%溶液(0.25%活性物質(zhì))。例如，使用的破乳劑為PluronicPE6800:(氧化乙烯/氧化丙烯共聚物)BasorolP380:(三元醇多元醇聚醚)BasorolHP:(四元醇-氧化乙烯/氧化丙烯共聚物)將原油乳液((WintershallAG，Emlichheim，探頭60、64、83、87、301和507,水含量按體積計(jì)為62%，通過(guò)DINISO3733蒸餾方法測(cè)定)在密封容器中水浴中加熱到52。C約2小時(shí)。通過(guò)搖動(dòng)原油乳液約30秒勻漿并且在每種情況中，將100ml原油乳液填充到100ml搖動(dòng)圓筒中。將裝油的搖動(dòng)圃筒置于水浴中。將Eppendorf移液器在每種情況中用于計(jì)量50pl按重量計(jì)50%的上述破乳劑溶液到包舍原油乳液的搖動(dòng)圓筒中，將圓筒用玻璃塞封住。之后，從水浴取出搖動(dòng)圓筒，搖動(dòng)60次并減壓。然后將搖動(dòng)圓筒放回到水浴中(52'C)并在30和240分鐘讀出分離的水的體積。結(jié)果在下面的表中給出。240分鐘后，通過(guò)注射器將表中陳述的疏水蛋白的量導(dǎo)入在每種情況下通過(guò)一次性注射器分離的水中。隨后，在每種情況下?lián)u動(dòng)混合物30秒。之后，讓樣品在52。C靜置1分鐘，然后測(cè)定分離的水的量。結(jié)果在表中編輯。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>可以清楚地看出疏水蛋白的加入加速了相的再分離。因此，通過(guò)該蛋白質(zhì)似乎減小了水相向油相的再乳化。還令人驚奇的是從O.l到1ppm低濃度的疏水蛋白足夠?qū)崿F(xiàn)所述結(jié)果。權(quán)利要求1.至少一種疏水蛋白在包含至少兩種液相的組合物中用于相穩(wěn)定的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求i的用途，其中該組合物具有水相和有才;^目。3.根據(jù)權(quán)利要求1和2任一項(xiàng)的用途，其中疏水蛋白是融合疏水蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的用途，其中所述融合疏水蛋白是選自yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA陽(yáng)his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的至少一種，其中yaad也可以是yaad的具有20到293個(gè)氨基酸的截短的融合配偶體。5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的用途，其中所述包含至少兩種液相的組合物是包含油和水的組合物或者包含燃料和水的組合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的用途，其中至少一種疏水蛋白以基于總的組合物0.001到80ppm的量使用。7.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物是原油-水組合物并且疏水蛋白以基于總的組合物0.001到20ppm的量使用。8.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的用途，其中所述組合物是燃料-水組合物并且疏水蛋白以基于總的組合物0.01到10ppm的量使用。9.根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的用途，其中使用提高相穩(wěn)定性的至少一種其他化合物以及至少一種疏水蛋白。10.在包含至少兩種液相的組合物中穩(wěn)定液相的方法，其包括向組合物中加入至少一種疏水蛋白。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述疏水蛋白是融合疏水蛋白或者其衍生物。12.根據(jù)權(quán)利要求10和11任一項(xiàng)的方法，其中所述融合疏水蛋白是選自yaad-Xa國(guó)dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的至少一種，其中yaad也可以是yaad的具有20到293個(gè)氨基酸的截短的融合配偶體。13.根據(jù)權(quán)利要求10到12任一項(xiàng)的方法，其中所述包含至少兩種液相的組合物是包含油和水的組合物或者包含燃料和水的組合物。14.根據(jù)權(quán)利要求10到13任一項(xiàng)的方法，其中所述疏水蛋白以基于總的組合物0.001到80ppm的量使用。15.根據(jù)權(quán)利要求10到14任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物是原油-水組合物并且疏水蛋白以基于總的組合物0.001到20ppm的量使用。16.根據(jù)權(quán)利要求10到14任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物是燃料-水組合物并且疏水蛋白以基于總的組合物0.001到20ppm的量使用。17.根據(jù)權(quán)利要求10到16任一項(xiàng)的方法，其中首先將相分裂，然后向7jc相中加入疏水蛋白。18.制劑，其包含由燃料和/或原油組成的至少一種有機(jī)相和包含至少一種疏水蛋白的水相。19.根據(jù)權(quán)利要求18的制劑，其中所述疏水蛋白以基于總的制劑0.001到80ppm的量存在。20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的制劑，其中所述制劑包含至少一種燃料并且所述疏水蛋白或者其衍生物以基于總的制劑0.01到lppm的量存在于制劑中。21.根據(jù)權(quán)利要求20的制劑，其中所述燃料是選自汽油燃料、柴油機(jī)燃料或者氣輪機(jī)燃料的燃料。22.根據(jù)權(quán)利要求18到21任一項(xiàng)的制劑，其中所述疏水蛋白是融合疏水蛋白或者其衍生物。23.根據(jù)權(quán)利要求18到22任一項(xiàng)的制劑，其中所述融合疏水蛋白是選自yaad-Xa-dewA-his(SEQIDNO:20)、yaad-Xa-rodA誦his(SEQIDNO:22)或yaad-Xa-basfl-his(SEQIDNO:24)的至少一種，其中yaad也可以是yaad的具有20到293個(gè)氨基酸的截短的融合配偶體。全文摘要本發(fā)明涉及尤其適于穩(wěn)定雙相液體系統(tǒng)的疏水蛋白。文檔編號(hào)B01D17/05GK101175540SQ200680016796公開(kāi)日2008年5月7日申請(qǐng)日期2006年3月29日優(yōu)先權(quán)日2005年4月1日發(fā)明者M(jìn)·古茨曼,P·?？?U·鮑斯申請(qǐng)人:巴斯福股份公司