專(zhuān)利名稱(chēng)：中藥附子中多糖的提取和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從中藥附子中提取分離純化多糖的方法，屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。
近年來(lái)對(duì)具有生理活性的多糖物質(zhì)，經(jīng)藥理研究與臨床應(yīng)用，確認(rèn)具有降血糖，抗腫瘤與增強(qiáng)免疫功能的作用，受到越來(lái)越多的專(zhuān)家的重視。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于人參多糖、刺五加多糖、豬苓多糖、枸杞多糖、香菇多糖等從中藥中提取的多糖物質(zhì)，已應(yīng)用于臨床，取得令人滿意的效果。附子屬于毛莨科烏頭屬(Aconitum Carmichaeli Debx)植物的側(cè)根，是一種常用的中藥，具有回陽(yáng)救逆、溫補(bǔ)腎陽(yáng)之功能。國(guó)內(nèi)外對(duì)于附子中有效成分的研究，主要集中在附子生物堿方面，而對(duì)附子中多糖的研究則很少。多糖物質(zhì)的提取分離純化方法有多種，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本發(fā)明提供的中國(guó)產(chǎn)附子(黑順片)多糖的提取分離純化方法未見(jiàn)有報(bào)道。發(fā)明人在研究篩選其有效部位時(shí)，反復(fù)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)作用及降血糖作用的實(shí)驗(yàn)，已確證其藥效作用。
本發(fā)明的目的是提供三種從中藥附子根莖炮制品——黑順片中提取附子粗多糖的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供上述粗多糖的純化方法。
本發(fā)明從中藥附子中提取附子粗多糖的方法包括如下步驟1.將中藥附子黑順片分選除雜，粉碎，過(guò)20-50目篩。
2.提取。用下述三種方法之一。
(2.1)置于超聲提取器中，加入pH值為8～10的NaOH水溶液，溫度80～100℃，提取三次，第一次提取(固液比為1∶10～20)0.5～2小時(shí)；濾渣再提取二次(固液比為1∶5～10)，每次0.5～1.5小時(shí)。藥渣可用于制備附子生物堿。
(2.2)加入pH值為8～10的NaOH水溶液，先煮沸1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)于超聲提取器中提取，80～100℃，0.5～1.5小時(shí)，用紗布過(guò)濾；濾渣再超聲提取1～2次(固液比為1∶5～10)，0.5～1.5小時(shí)/次。藥渣可用于制備附子生物堿。
(2.3)提總生物堿將中藥附子黑順片分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，取50g加入95％乙醇800ml，轉(zhuǎn)移至索氏提取器中，80～90℃超聲回流提取2小時(shí)，過(guò)濾，乙醇提取液濃縮，用于制備附子生物堿，回收乙醇。先超聲提取附子總生物堿，藥渣再加入pH值為8～10的NaOH水溶液超聲提取2～3次，第一次提取(固液比為1∶10～20)0.5～2小時(shí)；濾渣再提取1～2次(固液比為1∶5～10)，0.5～1.5小時(shí)/次。
3.紗布過(guò)濾，合并提取液，趁熱置于離心機(jī)中離心(2000～4000r/min)15～25分鐘，過(guò)濾。
4.將濾液濃縮至1/3～1/5體積。
5.加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70～85％，充分?jǐn)嚢瑁o置，得粗多糖沉淀。
6.離心、過(guò)濾、干燥得粗多糖。
附子粗多糖純化方法1.粗多糖用1-2倍(w/w)蒸餾水復(fù)溶。
2.按3∶1～5∶1(v/v)體積加入苯酚/氯仿(1∶1 v/v)試劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置分層。
3.離心(2000～3000r/min)25分鐘，過(guò)濾得濾液。
4.濾液重復(fù)除雜2～4次后，減壓濃縮，醇沉，離心，得多糖沉淀。
依次用3～5倍體積的無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌2～3次，真空干燥后，粉碎得精制附子多糖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于應(yīng)用超聲提取技術(shù)，改進(jìn)除雜工藝，大大縮短了提取時(shí)間，收率高、純度高、成本低。通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明具有免疫調(diào)節(jié)功能及降血糖作用。
下面給出實(shí)施例[例1](1)超聲提取將中藥附子黑順片分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，取50g；加入pH＝9的NaOH水溶液750ml，溫度為90℃的條件下，超聲提取二次。第一次提取(固液比為1∶15)1小時(shí)；濾渣再提取二次(固液比為1∶5)，每次0.5小時(shí)，用四層紗布過(guò)濾，將三次提取液合并，趁熱置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得濾液。藥渣用于制備附子生物堿。
(2)濃縮、醇沉濾液減壓濃縮至1/5體積，加入無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，置于離心機(jī)中離心(3000r/min)10分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(3)復(fù)溶、除雜將所得粗多糖重新溶于2倍體積蒸餾水中，按5∶1(v/v)體積加入苯酚/氯仿(1∶1 v/v)試劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置分層后，離心(3000r/min)25分鐘，過(guò)濾得濾液。濾液重復(fù)(2)、(3)步驟二次除雜。
(4)濃縮、醇沉除雜后的濾液，經(jīng)減壓濃縮至1/2體積，加入無(wú)水乙醇，使終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，將多糖沉淀置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(5)精制將二次醇沉后的多糖沉淀，先后用5倍體積的無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌各兩次，得附子多糖。
(6)干燥將精制多糖移至真空干燥箱。
(7)將干燥后的多糖粉碎，得白色粉末狀附子多糖精品6.2g，裝入密閉容器防潮保存，備用。(1)先水提后超聲將中藥附子黑順片分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，取50g；加入pH＝9的NaOH水溶液750ml(固液比為1∶15)，100℃煮沸0.5小時(shí)，轉(zhuǎn)用超聲提取，90℃提取1小時(shí)，紗布過(guò)濾；濾渣再用超聲90℃提取1小時(shí)(固液比為1∶5)，用四層紗布過(guò)濾，將二次提取液合并，趁熱置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得濾液。藥渣用于制備附子生物堿。
(2)濃縮、醇沉濾液減壓濃縮至1/5體積，加入無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，置于離心機(jī)中離心(3000r/min)10分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(3)復(fù)溶、除雜將所得粗多糖重新溶于2倍體積蒸餾水中，按5∶1(v/v)體積加入苯酚/氯仿(1∶1v/v)試劑，充分?jǐn)嚢杌靹颍o置分層后，離心(3000r/min)25分鐘，過(guò)濾得濾液。濾液重復(fù)(2)、(3)步驟二次除雜。
(4)濃縮、醇沉除雜后的濾液，經(jīng)減壓濃縮至1/2體積，加入無(wú)水乙醇，使終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，將多糖沉淀置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(5)精制將二次醇沉后的多糖沉淀，先后用5倍體積的無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌各兩次，得附子多糖。
(6)干燥將精制多糖移至真空干燥箱。
(7)將干燥后的多糖粉碎，得白色粉末狀附子多糖精品6.7g，裝入密閉容器防潮保存，備用。(1)提總生物堿將中藥附子黑順片分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，取50g加入95％乙醇800ml，轉(zhuǎn)移至索氏提取器中，80～90℃超聲回流提取2小時(shí)，過(guò)濾，乙醇提取液濃縮，用于制備附子生物堿，回收乙醇。
(2)超聲提取藥渣加入pH值為8～10的NaOH水溶液超聲提取2次，第一次加入750ml，提取1小時(shí)，四層紗布過(guò)濾；濾渣再加入500mlNaOH水溶液提取1小時(shí)，四層紗布過(guò)濾，將兩次提取液合并，趁熱置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得濾液。
(3)濃縮、醇沉濾液減壓濃縮至1/5體積，加入無(wú)水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，置于離心機(jī)中離心(3000r/min)10分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(4)復(fù)溶、除雜將所得粗多糖重新溶于2倍體積蒸餾水中，按5∶1(v/v)體積加入苯酚/氯仿(1∶1 v/v)試劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置分層后，離心(3000r/min)25分鐘，過(guò)濾得濾液。濾液重復(fù)(2)、(3)步驟二次除雜。
(5)濃縮、醇沉除雜后的濾液，經(jīng)減壓濃縮至1/2體積，加入無(wú)水乙醇，使終濃度達(dá)到75％，靜置4小時(shí)，使多糖沉淀完全，將多糖沉淀置于離心機(jī)中離心(3000r/min)20分鐘，過(guò)濾得多糖沉淀。
(6)精制將二次醇沉后的多糖沉淀，先后用5倍體積的無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌各兩次，得附子多糖。
(7)干燥將精制多糖移至真空干燥箱。
(8)將干燥后的多糖粉碎，得白色粉末狀附子多糖精品6.0g，裝入密閉容器防潮保存，備用。
權(quán)利要求
1.一種中藥附子中多糖的提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)將中藥附子黑順片分選除雜，粉碎，過(guò)20-50目篩；(2)提取(2.1)置于超聲提取器中，加入pH值為8～10的NaOH水溶液，溫度80～100℃，提取三次，第一次提取(固液比為1∶10～20)0.5～2小時(shí)；濾渣再提取二次(固液比為1∶5～10)，每次0.5～1.5小時(shí)，或(2.2)加入pH值為8～10的NaOH水溶液，先煮沸1～2小時(shí)，再轉(zhuǎn)于超聲提取器中提取，80～100℃，0.5～1.5小時(shí)，用紗布過(guò)濾；濾渣再超聲提取1～2次(固液比為1∶5～10)，0.5～1.5小時(shí)/次，或(2.3)提總生物堿將中藥附子黑順片分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，取50g加入95％乙醇800ml，轉(zhuǎn)移至索氏提取器中，80～90℃超聲回流提取2小時(shí)，過(guò)濾，乙醇提取液濃縮，用于制備附子生物堿，回收乙醇；先超聲提取附子總生物堿，藥渣再加入pH值為8～10的NaOH水溶液超聲提取2～3次，第一次提取(固液比為1∶10～20)0.5～2小時(shí)；濾渣再提取1～2次(固液比為1∶5～10)，0.5～1.5小時(shí)/次；(3)紗布過(guò)濾，合并提取液，趁熱置于離心機(jī)中離心(2000～4000r/min)15～25分鐘，過(guò)濾；(4)將濾液濃縮至1/3～1/5體積；(5)加入無(wú)水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70～85％，充分?jǐn)嚢?，靜置，得粗多糖沉淀；離心、過(guò)濾、干燥得粗多糖。
2.一種中藥附子中多糖的純化方法，其特征在于包括如下步驟(1)粗多糖用1-2倍(w/w)蒸餾水復(fù)溶；(2)按3∶1～5∶1(v/v)體積加入苯酚/氯仿(1∶1v/v)試劑，充分?jǐn)嚢杌靹?，靜置分層；(3)離心(2000～3000r/min)25分鐘，過(guò)濾得濾液；(4)濾液重復(fù)除雜2～4次后，減壓濃縮，醇沉，離心，得多糖沉淀；依次用3～5倍體積的無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌2～3次，真空干燥后，粉碎得精制附子多糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中藥附子多糖的制備方法，中藥附子黑順片經(jīng)分選除雜，用粉碎機(jī)粉碎，于超聲提取器中提取，提取液經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾、濃縮，加入乙醇，使?jié)舛冗_(dá)到75％，充分?jǐn)嚢?，靜置，離心過(guò)濾，得附子粗多糖。粗多糖用蒸餾水復(fù)溶，除雜，二次濃縮、醇沉，再依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚等洗滌后，干燥，得純化附子多糖精品。本發(fā)明生產(chǎn)的附子多糖收率高，純度高，步驟簡(jiǎn)便，成本低廉，通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明具有降低小鼠血糖，提高小鼠免疫功能的作用。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1563104SQ20041002691
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月19日
發(fā)明者吳偉康, 趙馳, 羅一帆 申請(qǐng)人:中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院科技開(kāi)發(fā)中心