專利名稱：一種完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種簡單的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，屬再生資源化學生物學領域。
背景技術：
水溶性殼聚糖是殼聚糖經(jīng)過乙?；罂刂泼撘阴６?0-60％的產(chǎn)物。任何分子量的水溶性殼聚糖在低濃度時都可以溶于水，而低分子量水溶性殼聚糖和殼寡糖可以在較高濃度時也溶于水，且具有比大分子量水溶性殼聚糖更好的生物相容性。不同分子量的水溶性殼聚糖具有不同的生物生理活性，所以制備不同分子量的水溶性殼聚糖對于其應用于食品、醫(yī)藥等方面具有重要意義。目前制備低分子量水溶性殼聚糖/殼寡糖的方法主要是先將殼聚糖用化學法降解為不同分子量，然后再進行乙酰化進一步改善其水溶性。此反應過程繁瑣，不容易控制。尤其是化學法降解過程劇烈，不容易獲得低分子量殼聚糖/殼寡糖，而且產(chǎn)物結構被修飾。

發(fā)明內容
針對上述現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種簡單的制備完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的方法，該方法不僅反應過程簡單可控，而且可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明提供的技術方案是采用如下步驟制備這種完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖(1)將殼聚糖溶于1％-10％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025-0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液，在磁力攪拌下將醋酸酐的無水乙醇溶液緩慢加入到上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌反應1-5小時，得到水溶性殼聚糖溶液，其中醋酸酐與殼聚糖的摩爾比為5∶2～5∶4，無水乙醇與醋酸溶液的體積比為3∶2～3∶5。
(2)將所得水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用1-5mol/l氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液調節(jié)其pH到8-9，裝入透析袋中用水透析24-72小時，過濾透析液除去不溶物，然后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮、乙醇沉淀、乙醇洗滌、真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。
(3)將所得水溶性殼聚糖粉末溶解于0.5-1.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025-0.040g/ml的水溶性殼聚糖溶液，用0.05-1mol/l的氫氧化鉀或氫氧化鈉調整溶液pH值到4.0-5.0，加入酶底比為0.5-5％(w/w)的非專一性水解酶，在50-60℃連續(xù)振蕩0.2-6小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸5-10分鐘除酶，然后過濾溶液，將濾液真空濃縮后用1-5mol/l的氫氧化鉀或氫氧化鈉調節(jié)其pH值到8-9，再經(jīng)乙醇沉淀、乙醇洗滌、真空干燥即可獲得自由氨基形式的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖。其中，所用原料殼聚糖的分子量范圍為30萬-85萬，脫乙酰度范圍為75-95％；非專一性水解酶為纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶或中性蛋白酶。若將中間產(chǎn)物水溶性殼聚糖的脫乙酰度控制在40-60％，最后可制得重均分子量在18萬～1500的自由氨基形式完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖。
本發(fā)明提供的制備方法是先將殼聚糖乙?；?，控制脫乙酰度為40-60％，得到水溶性殼聚糖，然后用催化量的非專一性的纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶或中性蛋白酶催化水解水溶性殼聚糖，控制酶用量和反應時間，獲得不同分子量的水溶性殼聚糖/殼寡糖。此法先通過控制脫乙酰度改善殼聚糖的水溶性，然后以此水溶性殼聚糖為酶解底物，制備不同分子量的完全水溶性的殼聚糖。通過控制脫乙酰度和分子量可改善殼聚糖的水溶性，簡化反應過程，實現(xiàn)了反應的可控性。用非專一性的商品酶降解水溶性殼聚糖，則可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、降低成本、保證品質穩(wěn)定。
盡管殼聚糖經(jīng)過乙?；磻?，破壞了殼聚糖分子鏈的規(guī)整性，改善了水溶性，使任何分子量的水溶性殼聚糖在低濃度時都可以溶于水，但由于分子內和分子間的相互作用，大分子量的水溶性殼聚糖在高濃度時并不能完全溶于水。而本發(fā)明不僅改善了殼聚糖的水溶性，而且降低了水溶性殼聚糖的分子量，使水溶性殼聚糖既可以完全溶解于水，還可以溶解于水和有機溶劑(如二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺)的混合溶液中，拓寬了殼聚糖的應用范圍。且低分子量的水溶性殼聚糖具有促進傷口愈合、抑制腫瘤細胞生長和提高人體免疫力的活性，在農業(yè)、食品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應用前景。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明提供的制備完全水溶的低分子量殼聚糖、殼寡糖的方法作詳細說明。
實施例1將脫乙酰度75％，重均分子量85萬的殼聚糖溶于100毫升10％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液。將與殼聚糖摩爾比為5∶3的醋酸酐溶于80毫升無水乙醇中。在磁力攪拌下將此混合溶液緩慢加入上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌5小時，得到水溶性殼聚糖溶液。水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用3mol/l氫氧化鈉溶液調pH到8-9，裝入透析袋中用水透析24小時，透析液過濾除去不溶物，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。將水溶性殼聚糖溶解于100毫升1.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.035g/ml的殼聚糖醋酸溶液，用0.8mol/l的氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到4.0，此溶液在60℃保溫，加入0.02克纖維素酶，連續(xù)振蕩3小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸10分鐘除酶，溶液過濾，濾液真空濃縮后用1mol/l的氫氧化鈉調pH8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為18萬的自由氨基形式完全水溶低分子量殼聚糖。
實施例2將脫乙酰度82％，重均分子量60萬的殼聚糖溶于100毫升3％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.030g/ml的殼聚糖醋酸溶液。將與殼聚糖摩爾比為5∶4的醋酸酐溶于60毫升無水乙醇中。在磁力攪拌下將此混合溶液緩慢加入上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌3小時，得到水溶性殼聚糖溶液。水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用2mol/l氫氧化鈉溶液調pH到8-9，裝入透析袋中用水透析48小時，透析液過濾除去不溶物，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。將水溶性殼聚糖溶解于100毫升1.0％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.030g/ml的水溶性殼聚糖醋酸溶液，用0.10mol/l的氫氧化鉀溶液調整溶液pH值到4.5，此溶液在55℃保溫，加入0.025克半纖維素酶，連續(xù)振蕩2小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸10分鐘除酶，溶液過濾，濾液真空濃縮后用3mol/l的氫氧化鉀調pH8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為11萬的自由氨基形式完全水溶低分子量殼聚糖。
實施例3將脫乙酰度89％，重均分子量44萬的殼聚糖溶于100毫升1％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025g/ml的殼聚糖醋酸溶液。在磁力攪拌下將與殼聚糖摩爾比為5∶2的醋酸酐溶于150毫升無水乙醇中。將此混合溶液緩慢加入上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌1小時，得到水溶性殼聚糖溶液。水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用5mol/l氫氧化鈉溶液調pH到8-9，裝入透析袋中用水透析36小時，透析液過濾除去不溶物，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。將水溶性殼聚糖溶解于100毫升0.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025g/ml的水溶性殼聚糖醋酸溶液，用0.05mol/l的氫氧化鉀溶液調整溶液pH值到4.0，此溶液在50℃保溫，加入0.1克纖維素酶，連續(xù)振蕩0.2小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸5分鐘除酶，溶液過濾，濾液真空濃縮后用5mol/l的氫氧化鉀調pH8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為6萬的自由氨基形式完全水溶低分子量殼聚糖。
實施例4將脫乙酰度95％，重均分子量30萬的殼聚糖溶于100毫升8％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液。將與殼聚糖摩爾比為5∶3的醋酸酐溶于100毫升無水乙醇中。在磁力攪拌下將此混合溶液緩慢加入上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌3小時，得到水溶性殼聚糖溶液。水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用5mol/l氫氧化鉀溶液調pH到8-9，裝入透析袋中用水透析72小時，透析液過濾除去不溶物，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。將水溶性殼聚糖溶解于100毫升0.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液，用0.5mol/l的氫氧化鉀溶液調整溶液pH值到4.5，此溶液在55℃保溫，加入0.16克淀粉酶，連續(xù)振蕩5小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸8分鐘除酶，溶液過濾，濾液真空濃縮后用3mol/l的氫氧化鉀調pH8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為1萬的自由氨基形式完全水溶低分子量殼聚糖。
實施例5將脫乙酰度95％，重均分子量30萬的殼聚糖溶于100毫升5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液。將與殼聚糖摩爾比為5∶3的醋酸酐溶于100毫升無水乙醇中。在磁力攪拌下將此混合溶液緩慢加入上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌5小時，得到水溶性殼聚糖溶液。水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用1mol/l氫氧化鈉溶液調pH到8-9，裝入透析袋中用水透析48小時，透析液過濾除去不溶物，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。將水溶性殼聚糖溶解于100毫升1.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液，用1.00mol/l的氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到5.0，此溶液在60℃保溫，加入0.2克中性蛋白酶，連續(xù)振蕩6小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸10分鐘除酶，溶液過濾，濾液真空濃縮后用3mol/l的氫氧化鈉調pH8-9，乙醇沉淀，乙醇洗滌，真空干燥獲得重均分子量為1500的自由氨基形式完全水溶殼寡糖。
權利要求
1.一種完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，其特征在于采用如下具體步驟(1)將殼聚糖溶于1％-10％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025-0.040g/ml的殼聚糖醋酸溶液，在磁力攪拌下將醋酸酐的無水乙醇溶液緩慢加入到上述殼聚糖溶液中，室溫連續(xù)攪拌反應1-5小時，得到水溶性殼聚糖溶液，其中醋酸酐與殼聚糖的摩爾比為5∶2～5∶4，無水乙醇與醋酸溶液的體積比為3∶2～3∶5。(2)將所得水溶性殼聚糖溶液旋轉蒸發(fā)除去反應溶劑無水乙醇，然后用1-5mol/l氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液調節(jié)其pH到8-9，裝入透析袋中用水透析24-72小時，過濾透析液除去不溶物，然后將濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮、乙醇沉淀、乙醇洗滌、真空干燥獲得水溶性殼聚糖粉末。(3)將所得水溶性殼聚糖粉末溶解于0.5-1.5％(v/v)醋酸溶液中，制得濃度為0.025-0.040g/ml的水溶性殼聚糖溶液，用0.05-1mol/l的氫氧化鉀或氫氧化鈉調整溶液pH值到4.0-5.0，加入酶底比為0.5-5％(w/w)的非專一性水解酶，在50-60℃連續(xù)振蕩0.2-6小時，水解產(chǎn)物熱水浴煮沸5-10分鐘除酶，然后過濾溶液，將濾液真空濃縮后用1-5mol/l的氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液調節(jié)其pH值到8-9，再經(jīng)乙醇沉淀、乙醇洗滌、真空干燥即可獲得自由氨基形式的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，其特征在于將中間產(chǎn)物水溶性殼聚糖的脫乙酰度控制在40-60％，最后可制得重均分子量在18萬～1500的自由氨基形式完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，其特征在于所用原料殼聚糖的分子量范圍在30萬-85萬。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，其特征在于所用原料殼聚糖的脫乙酰度范圍在75％-95％。
5.根據(jù)權利要求1或2所述的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，其特征在于非專一性水解酶為纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶或中性蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡單的完全水溶的低分子量殼聚糖/殼寡糖的制備方法，該方法將殼聚糖乙?；频盟苄詺ぞ厶?，然后用非專一性的水解酶降解水溶性殼聚糖，控制酶用量和酶解反應時間，降解產(chǎn)物用氫氧化鉀或氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至8－9，乙醇沉淀、洗滌、真空干燥獲得自由氨基形式的完全水溶的分子量為18萬－1500的低分子量殼聚糖/殼寡糖。本發(fā)明工藝簡單，操作簡便，成本低，適用于工業(yè)生產(chǎn)，與現(xiàn)有技術相比較具有操作方便、反應過程容易控制的特點。而且所得低分子量的水溶性殼聚糖具有促進傷口愈合、抑制腫瘤細胞生長和提高人體免疫力的活性，在食品和醫(yī)藥工業(yè)具有廣泛的應用前景。
文檔編號C08B37/00GK1803849SQ20051002006
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權日2005年12月16日
發(fā)明者杜予民, 李瑾 申請人:武漢大學