一種不同分子量β-C-6-硫酸酯-殼聚糖類化合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體講是一種不同分子量β?C?6?硫酸酯?殼聚糖類化合物及其制備方法。不同分子量β?C?6?硫酸酯?殼聚糖類化合物結(jié)構(gòu)式如下，其中n為聚合度：2?400；該化合物的活性基團(tuán)為硫酸酯基(OSO3－)，硫含量為12?21％。本發(fā)明制備方法屬均相反應(yīng)，原料利用率高。
【專利說明】
一種不同分子量PC-6-硫酸酯-殼聚糖類化合物及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體講是一種不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖 類化合物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲殼素是世界第二大纖維素資源，由于來源不同，其構(gòu)型可分為α-甲殼素、β-甲殼 素、γ-甲殼素，目前研究最多的為α-甲殼素，為反平行結(jié)構(gòu)，其次為β-甲殼素，為平行結(jié)構(gòu)， 不同構(gòu)型的甲殼素可能顯示不同的功效。殼聚糖是由甲殼素脫乙酰得到的產(chǎn)物，其生物相 容性好，但由于其難溶于水和大部分有機(jī)溶劑而限制了其應(yīng)用；天然制備的殼聚糖分子 量通常在2000kDa以上，因而粘度很大不方便應(yīng)用，其衍生化產(chǎn)物得到了越來越大的重視與 關(guān)注。許多研究報(bào)道表明，硫酸多糖具有非常好的活性，而硫酸酯基的位點(diǎn)和硫酸多糖的分 子量又決定了其不同的活性。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了不同分子量的C6位硫酸酯化的β-殼 聚糖硫酸酯，該產(chǎn)物具有非常好的水溶性，使其應(yīng)用范圍更加廣泛。且硫酸酯基的引入使得 殼聚糖在許多活性方面如抑菌、促生長、免疫調(diào)節(jié)等方面顯示了不同的活性，因而本發(fā)明制 備了定位殼聚糖硫酸酯，從而改善其生物活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是要提供一種不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖類化合物及其制備 方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0005] -種不同分子量β-〇6_硫酸酯-殼聚糖類化合物:不同分子量β-〇6_硫酸酯-殼聚 糖類化合物結(jié)構(gòu)式為：
[0007] 其中，η為聚合度：2-400;該化合物的活性基團(tuán)--硫酸酯基(0S0〇，硫含量為 12-21 %〇
[0008] 不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的制備方法：
[0009] (1)磺化試劑的制備:將N，N-二甲基甲酰胺在冰水浴中冷卻，然后在攪拌下滴加 氯磺酸，使其在0-5 °C進(jìn)行磺化反應(yīng);其中N，N-二甲基甲酰胺與氯磺酸的體積比為(5:1)-(1〇：1);
[0010] (2 )i3-C_2，3-位殼聚糖銅螯合物的制備：以β-殼聚糖原料加入甲酸溶液(使溶液中 甲酸溶液終濃度為1-3% (體積）），攪拌使其溶解呈粘稠狀，然后加入原料殼聚糖1.5-2倍質(zhì) 量的CuS〇4 · 5H20(CuS〇4 · 5H20經(jīng)蒸餾水溶解后加入），并在室溫下攪拌3h-4h，反應(yīng)結(jié)束后 調(diào)節(jié)PH值至6.0 - 6.5，再于室溫下繼續(xù)攪拌3h-4h，攪拌后用無水乙醇與丙酮混合溶劑沉淀 得螯合物;其中，甲酸溶液與殼聚糖的體積重量比為:6~30:1;
[0011] 其中，無水乙醇與丙酮按1:1的體積混合；
[0012] (3)不同分子量i3-C-2，3-β-殼聚糖銅螯合物的磺化反應(yīng):取上述獲得i3-C-2，3-位 殼聚糖銅螯合物，加入N，N-二甲基甲酰胺溶劑并攪拌均勻，再加入上述磺化劑，在40-70Γ 下攪拌反應(yīng)〇. 5-3小時(shí)，反應(yīng)完畢后加入反應(yīng)液2-4倍體積量的無水乙醇進(jìn)行醇沉，而后于4 °(：冷藏沉化30-60min，得到白色絮狀沉淀，將上述沉淀物抽濾，濾餅用蒸餾水溶解，用2M NaOH溶液將其中和得藍(lán)色溶液，透析、濃縮得不同分子量的藍(lán)色殼聚糖銅螯合物的磺化產(chǎn) 物；
[0013] (4)脫銅制備β-c-e-殼聚糖硫酸酯：將上述獲得不同分子量的殼聚糖銅鰲合物的 磺化產(chǎn)物用蒸餾水溶解后，用強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂柱吸附，溶液顏色由藍(lán)色變 為黃色，Cu即被脫掉，用2M的NaOH溶液中和，濃縮，透析，冷凍干燥即得不同分子量白色C6位 殼聚糖硫酸酯。
[0014] 所述β-殼聚糖原料的分子量為2000-4574kDa。
[0015] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明將粘度極大的β-殼聚糖最終反應(yīng)生成不同分子量的β-殼聚糖硫酸酯類化 合物，是殼聚糖經(jīng)定位磺化后所得6位殼聚糖硫酸酯衍生物，具有強(qiáng)聚陰離子性質(zhì)。同時(shí)本 發(fā)明采用的殼聚糖硫酸酯類化合物的含硫量高，對(duì)殼聚糖原料利用率高，活性得到了顯著 提高;制備過程采用均相反應(yīng)，制備方法簡單快速，操作成本低，污染少。
【附圖說明】
[0017]圖1為β-殼聚糖的紅外表征譜圖。在1652cm-1附近，β-殼聚糖只有一個(gè)氨基峰，而另 一氨基峰則位于ΙδδδαιΓ1附近，符合β-殼聚糖結(jié)構(gòu)特征。
[0018]圖2為i3-C-6-硫酸酯-殼聚糖的紅外表征譜圖，在1212.81(31^1處出現(xiàn)了S = 0的非對(duì) 稱伸縮振動(dòng)，在804.19cnf1處出現(xiàn)了 C-0-S的對(duì)稱伸縮振動(dòng)，證明了分子中硫酸酯基（-0S03_)的存在。
[0019]圖3為β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的核磁共振氫譜?？梢钥闯?，殼聚糖的C6位引入硫酸 酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使Η的化學(xué)位移明顯向低場(chǎng)漂移。
[0020] 圖4為β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的的核磁共振碳譜?？梢钥闯?，在殼聚糖的C6位引入 硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使C6的化學(xué)位移由59.83ppm明顯向低場(chǎng)漂移至 66.55ppm，而C2-N-位和C3-0-位的化學(xué)位移無明顯變化。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于 以下實(shí)施例。
[0022] 實(shí)施例1 [0023] β_殼聚糖的制備
[0024] 將日本槍烏賊軟骨表面的組織殘留物洗凈、烘干，稱取97g魷魚骨置于過量的4% 的鹽酸中浸泡7h，用蒸餾水洗至中性;然后置于過量的1%的氫氧化鈉溶液中，90°C水浴反 應(yīng)2h，用蒸餾水洗凈至中性并烘干，即得β-甲殼素，稱重為30.7g，產(chǎn)率為31.6%。稱取31.6g β-甲殼素，將其粉碎后與45(wt) %的氫氧化鈉溶液按照質(zhì)量體積比1:8的比例混合95°C反 應(yīng)6小時(shí)，獲得26. Igi3-殼聚糖，產(chǎn)率為85.02 %，紫外光譜法測(cè)定脫乙酰度為87.58 %、高效 液相法測(cè)定分子量為4574KDa。
[0025] 實(shí)施例2
[0026] β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的制備：
[0027] (1)酯化試劑的制備:將N，N-二甲基甲酰胺在冰水浴中冷卻，然后在攪拌下緩慢 滴加氯磺酸，使其在小于5°C的溫度下進(jìn)行磺化反應(yīng);其中N，N-二甲基甲酰胺與氯磺酸的 體積比為(5:1) -(10:1);
[0028] (2)C-2,3_位殼聚糖銅螯合物的制備:稱取適量β-殼聚糖原料，加3%的甲酸溶液， 使其與殼聚糖的體積(ml)/重量(g)比為26:1，攪拌使其溶解成粘稠狀，然后將適量蒸餾 水溶解（l〇_15ml)的4.65克CuS04 · 5H20慢慢滴加到上述粘溶液中，并在室溫下攪拌3h。然 后用氨水調(diào)節(jié)PH值至6.0 - 6.5,室溫繼續(xù)攪拌3h。攪拌后用1:1體積比的無水乙醇與丙酮混 合溶劑沉淀螯合物，于4°C冷藏柜中放置少許時(shí)間，抽濾，烘干，粉碎待用。
[0029] (3)C-2,3_i3-殼聚糖銅螯合物的磺化反應(yīng)
[0030] 取一定量的β-殼聚糖銅螯合物，加入30-80mL甲酰胺溶劑并攪拌均勻，然后加入適 量磺化劑，在45-65 °C下攪拌反應(yīng)0.5-3小時(shí)，反應(yīng)完畢后將上述反應(yīng)液用2-4倍體積量的無 水乙醇沉淀，放到4°C冷藏柜中沉化約30min，得到白色絮狀沉淀。將上述沉淀物抽濾，濾餅 用蒸餾水溶解，用2M NaOH溶液將其中和得藍(lán)色溶液，透析，透析液濃縮，冷凍干燥得藍(lán)色殼 聚糖銅螯合物的硫酸酯化產(chǎn)品。
[0031] (4)脫銅制備C-6-β-殼聚糖硫酸酯
[0032] 將殼聚糖銅鰲合物的磺化產(chǎn)物用蒸餾水溶解后，用強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹 脂柱吸附，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，Cu即被脫掉，用2M的NaOH溶液中和，濃縮，透析，冷凍 干燥即得白色C6位β-殼聚糖硫酸酯產(chǎn)品。
[0033]表1 50°C各反應(yīng)時(shí)間下，甲酸對(duì)硫含量和分子量的影響
[0035] 表2不同溫度對(duì)磺化產(chǎn)物的影響(反應(yīng)時(shí)間1.5小時(shí)）
[0037] 表3不同時(shí)間對(duì)磺化產(chǎn)物的影響(反應(yīng)溫度50°C)
[0039] 實(shí)施例3
[0040] 將上述獲得不同分子量的C6位β-殼聚糖硫酸酯，進(jìn)行免疫增強(qiáng)活性的檢測(cè)，其中 以巨噬細(xì)胞為模型，具體為：
[0041 ] 取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1 X 106個(gè)/mL，96孔板每孔接種 100ul。在5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，加入不同濃度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其終濃 度分別為〇，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做陽性對(duì)照，終濃度為lug/ml，均設(shè)置3個(gè) 復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔取lOOul上清液到新的96孔板，加入等體積的Griess試 劑，室溫避光放置l〇min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm下測(cè)吸光度，平行重復(fù)3次，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求 出N0量。（參見表4)
[0042] 表4: β-〇6-硫酸酯-殼聚糖對(duì)N0表達(dá)量的影響分子量
[0044]不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖均具有非常好的水溶性，且由于硫酸酯基的加 入，尤其是殼聚糖分子中硫酸酯基、氨基和羥基的同時(shí)存在，使其具有非常好的免疫增強(qiáng)活 性。具體從上表4可以看出，β-C-e-硫酸酯-殼聚糖促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生的N0量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對(duì)照， 表明其具有良好的免疫增強(qiáng)活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖類化合物，其特征在于:不同分子量β-c-e-硫 酸酯-殼聚糖類化合物結(jié)構(gòu)式為：其中，η為聚合度：2-400;該化合物的活性基團(tuán)--硫酸酯基（〇S〇n，硫含量為12-21%〇2. 按權(quán)利要求1所述的不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的制備方法，其特征在于： (1) 磺化試劑的制備：將N，N-二甲基甲酰胺在冰水浴中冷卻，然后在攪拌下滴加氯磺 酸，使其在0-5°C磺化反應(yīng);其中N，N-二甲基甲酰胺與氯磺酸的體積比為(5:1)-(10:1); (2) i3-C-2,3-位殼聚糖銅螯合物的制備：以β-殼聚糖原料加入甲酸溶液，攪拌使其溶解 呈粘稠狀，然后加入原料殼聚糖1.5-2倍質(zhì)量的CuS〇4 · 5Η20,并在室溫下攪拌3h-4h，反應(yīng)結(jié) 束后調(diào)節(jié)pH值至6.0 - 6.5，再于室溫下繼續(xù)攪拌3h-4h，攪拌后用無水乙醇與丙酮混合溶劑 沉淀得螯合物;其中，甲酸溶液與β-殼聚糖的體積重量比為:6~30:1; (3) 不同分子量β-(：-2,3-β-殼聚糖銅螯合物的磺化反應(yīng):取上述獲得i3-C-2,3-位殼聚 糖銅螯合物，加入N，N-二甲基甲酰胺溶劑并攪拌均勻，再加入上述磺化劑，在40-70°C下攪 拌反應(yīng)0.5-3小時(shí)，反應(yīng)完畢后加入反應(yīng)液2-4倍體積量的無水乙醇進(jìn)行醇沉，而后于4°C冷 藏沉化30-60min，得到白色絮狀沉淀，將上述沉淀物抽濾，濾餅用蒸餾水溶解，用2M NaOH溶 液將其中和得藍(lán)色溶液，透析、濃縮得不同分子量的藍(lán)色殼聚糖銅螯合物的磺化產(chǎn)物； (4) 脫銅制備β-c-e-殼聚糖硫酸酯：將上述獲得不同分子量的殼聚糖銅鰲合物的磺化 產(chǎn)物用蒸餾水溶解后，用強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂柱吸附，溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S 色，Cu即被脫掉，用2M的NaOH溶液中和，濃縮，透析，冷凍干燥即得不同分子量白色C6位β-殼 聚糖硫酸酯。3. 按權(quán)利要求2所述的不同分子量β-c-e-硫酸酯-殼聚糖的制備方法，其特征在于：所 述β-殼聚糖原料的分子量為2000-4574kDa。
【文檔編號(hào)】C08B37/08GK105949352SQ201610575094
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月21日
【發(fā)明人】李鵬程, 楊悅, 邢榮娥, 劉松, 于華華, 陳曉琳, 李克成, 秦玉坤, 岳洋, 范兆乾
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院海洋研究所