專利名稱：一種南瓜多糖分離純化的方法及所得組分的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種糖類分離純化的方法及所得組分的用途，具體講是采用 熱水溶解和乙醇分級沉淀的分離技術從南瓜中分離純化得到南瓜多糖的三種 組分及這三種組分的用途。
背景技術：
南瓜是葫蘆科植物，果實無毒，是藥食兩用植物。據(jù)《滇南本草》記載， 南瓜性溫，味甘無毒，入脾、胃二經(jīng)，能潤肺益氣、化痰排濃、驅(qū)蟲解毒、 治咳止喘，療肺癰與便泌，并有利尿美容等作用。科學研究實驗證表明南 瓜富含多種氨基酸、多糖、蛋白質(zhì)、維生素、淀粉、葫蘆巴堿、纖維素、植 物油以及部分微量元素。南瓜具有補中益氣，排毒，驅(qū)蟲，降低血壓、血脂 和膽固醇等功效，特別是對糖尿病有著非常好的療效。近年來，國內(nèi)外專家對南瓜多糖多有研究，人們通過對多糖的分離和純化使得這一高分子聚合物 在生命科學領域的研究有了重大發(fā)展。傳統(tǒng)的南瓜多糖的分離純化技術是將 南瓜熱水浸提，水提液用有機溶劑沉淀，沉淀用水溶解后，上清液經(jīng)透析或 膜分離，然后^^縮干燥，粗多糖采用離子交換纖維素柱層析和葡聚糖凝膠等分子篩柱層析對其進行純化得到兩種多糖組分pp-i和pp-n。該技術的不足之處是分離純化步驟復雜，所需分離介質(zhì)成本較高。另外有研究表明南瓜多 糖有降低糖尿病小鼠的血糖的作用，但其降糖機制尚不清楚，因此南瓜多糖 的開發(fā)和用途是一個有待于進一步研究的新課題。 發(fā)明內(nèi)容南瓜作為一種藥食兩用植物，資源豐富，價格低廉；作為普通菜肴，受 到食用者青睞，作為長效、無毒、降血糖、調(diào)血脂藥物或食療劑，具有可進 一步開發(fā)利用的價值和研究前景。隨著南瓜多糖在藥理學功效日趨顯現(xiàn)，本發(fā)明的目的旨在提供一種南瓜多糖分離純化的方法。即采用熱水溶解和乙醇 分級沉淀的分離純化方法，從南瓜中分離得到南瓜多糖的三種組分50%乙 醇沉淀物，70%乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物。本發(fā)明的另一 目的是提供上述分離純化得到的三種組分50%乙醇沉淀物 和70%乙醇沉淀物在防治糖尿病的用途；80%乙醇沉淀物可作為一種潛在的 白血病化療藥物的用途。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn) 一種南瓜多糖的分離純化方法，其步驟是(1) 取新鮮成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，經(jīng)0.38%亞硫酸氫鈉溶液 浸泡60min后，取出沖洗干凈，添加3倍重量的蒸餾水，在75 80'C水浴上， 攪拌提取3次，時間分別為6小時，4小時和4小時，過濾；(2) 將上述所得濾液合并后，離心，取上清液真空濃縮，在濃縮液中加 入3倍體積的95%乙醇攪拌均勻，冰箱放置過夜，離心得沉淀物；(3) 取沉淀物以去離子水充分溶解，Sevag法除蛋白即水溶液中加入 1/2體積的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4:1，振蕩使其充分混勻， 然后3000rmin"的轉速離心15min，除去水溶液與有機溶液交界處的灰白色變 性蛋白。水溶液仍按上述方法反復去蛋白，共3次；(4) 水溶液濃縮后，加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量為50 %，，加 入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，無水乙醇， 丙酮依次洗滌，冷凍干燥。得到分離后的南瓜多糖組分50%乙醇沉淀物；上 述50%乙醇溶液中再加入95 %乙醇，使溶液中乙醇含量為70%,，加入乙醇 后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，無水乙醇，丙酮 依次洗滌，冷凍干燥。得到分離后的南瓜多糖組分70%乙醇沉淀物；上述70% 乙醇溶液中再加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量為80%，，加入乙醇后靜置 過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95%乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗 滌，冷凍干燥。得到分離后的南瓜多糖組分80%乙醇沉淀物。50%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有機溶劑，水溶 液為無色透明粘稠狀液體，PH值為6.24，多糖含量為11.9%，茚三酮反應顏色無明顯變化，紫外光譜分析在260nm， 280nm處略有吸收，說明含有微量 蛋白質(zhì)和核酸。70%乙醇沉淀物淡黃色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有機溶劑，水 溶液為無色透明粘稠狀液體，PH值為6.26，多糖含量為19.7%，茚三酮反應 顯紫色，紫外光譜分析在260nm， 280nm處有吸收，說明含有少量蛋白質(zhì)和 核酸。80%乙醇沉淀物白色粉末，易溶于水，不溶于乙醇等有機溶劑，水溶 液為無色透明粘稠狀液體，PH值為6.31，多糖含量為22.5%，茚三酮反應顯 紫色，紫外光譜分析在260nm， 280nm處有吸收，說明含有少量蛋白質(zhì)和核 酸。本發(fā)明經(jīng)分離純化得到的南瓜多糖的三種組分50%乙醇沉淀物，70% 乙醇沉淀物和80%乙醇沉淀物，其用途分述如下本發(fā)明得到的南瓜多糖的分離組分50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物對 糖尿病的防治作用的研究主要通過MTT法測定大鼠胰島P細胞存活率，光學顯 微鏡觀察胰島P細胞形態(tài)等實驗，檢測了南瓜多糖組分50%乙醇沉淀物和70 %乙醇沉淀物對大鼠胰島P細胞的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)50%乙醇沉淀物和70%乙 醇沉淀物對四氧嘧啶損傷的大鼠胰島I3細胞有一定的保護作用(見圖l)，并能 抑制體外培養(yǎng)的大鼠胰島I3細胞的凋亡(見圖2)，由此說明南瓜多糖50%乙醇 沉淀物和70X乙醇沉淀物可能通過保護和修復損傷的胰島p細胞對糖尿病有 一定的防治作用。本發(fā)明的南瓜多糖80%乙醇沉淀物對白血病潛在的治療作用的研究主要 應用生長曲線測定法，檢測不同濃度的80%乙醇沉淀物對人紅白血病細胞株 K562細胞增殖的影響；用流式細胞儀檢測藥物對K562細胞凋亡的影響；根據(jù) 細胞形態(tài)、硝基藍四氮唑(NBT)還原能力來測定K562細胞分化。本發(fā)明發(fā)現(xiàn) 80X乙醇沉淀物能明顯抑制K562細胞的增殖(見圖3)，抑制作用呈時間和濃 度依賴性；并能誘導K562細胞凋亡和分化(見圖4)，由此說明南瓜多糖80% 乙醇沉淀物可作為一種潛在的白血病化療藥物。本發(fā)明的優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果本發(fā)明的特點是分離純化的操作步驟相對簡單，所需分離介質(zhì)成本低，適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；南瓜多糖50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物對糖尿 病有一定的防治作用，80%乙醇沉淀物可作為一種潛在的白血病化療藥物， 具備極高的藥用前景。


圖1.南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)對四氧嘧啶損傷 的大鼠胰島P細胞的保護作用。圖2.不同濃度的南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)對大 鼠胰島P細胞凋亡的保護作用。圖3.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞增殖的抑制作用。圖4.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞分化的作用。
具體實施方式
實施例1取新鮮成熟的南瓜，去皮，去籽，切成厚度為0.2—0.5,的南瓜片，放 入燒杯中，加入0.38。/。亞硫酸氫鈉溶液浸泡60min后，取出南瓜片，沖洗干 凈，放入三角瓶中，添加3倍重量的蒸餾水，在75 80 。C水浴上，用玻璃 棒攪拌提取3次，時間分別為6小時,4小時和4小時。提取后濾液用濾紙過 濾。將所得濾液合并后，倒入燒杯中。離心，取上清液用旋轉蒸發(fā)儀真空濃 縮。濾液真空濃縮后，將濃縮液倒入燒杯中，在濃縮液中加入3倍體積的95 %乙醇，用玻璃棒攪拌均勻，冰箱放置過夜，離心得沉淀物。取沉淀物以去 離子水充分溶解得到水溶液，倒入燒杯中。Sevag法除蛋白即在水溶液中 加入1/2體積的氯仿和正丁醇混合液，氯仿正丁醇=4: 1,振蕩使其充分 混勻，然后3000rmin 1離心15min，除去水溶液與有機溶液交界處的灰白色 變性蛋白。水溶液仍按此法反復去蛋白，共3次。除去蛋白后的水溶液用旋 轉蒸發(fā)儀真空濃縮，濃縮液倒入燒杯中，加入95 %乙醇，用乙醇比重計測 定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇含量為50%，，加入乙醇后靜置過夜，溶 液離心，得到沉淀物，把沉淀物收集到燒杯中，沉淀物用95°/。乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌，冷凍干燥。得到分離后的南瓜多糖組分50%乙醇沉淀物。上述50%乙醇溶液中再加入95 %乙醇，用乙醇比重計測定溶液中的乙醇含 量，使溶液中乙醇含量為70%,，加入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀 物，把沉淀物收集到燒杯中，沉淀物用95%乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌， 冷凍干燥。得到分離后的南瓜多糖組分70%乙醇沉淀物。上述70%乙醇溶液 中再加入95 %乙醇，用乙醇比重計測定溶液中的乙醇含量，使溶液中乙醇 含量為80%，，加入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，把沉淀物收集 到燒杯中，沉淀物用95%乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌，冷凍千燥。得到 分離后的南瓜多糖組分80%乙醇沉淀物。 實驗l南瓜多糖(PP-l和PP-2)的生物活性實驗 (一)胰島細胞分離、純化和培養(yǎng)參照Gotoh等方法，取Wistar大鼠，6%水合氯醛按0.75mL/100g大腿肌 肉注射麻醉，75%乙醇浸泡5min，無菌間超凈工作臺常規(guī)皮膚消毒，沿腹正 中線剪開皮膚，充分暴露腹腔，尋找膽總管，并結扎其十二指腸入口處，逆 行膽總管插管，注入膠原酶V (lg/L)約8-10mL，可見胰腺膨脹，順序分離 胰腺，置預冷的D-Hank，s液(5mL)中，用D-Hank，s液洗兩遍，并用眼科鑷 剪碎胰腺組織。37。C水浴靜置消化20min后，加入4°CD-Hank，s液終止消化， 吹散后過80目網(wǎng)篩，將濾過物800r/min離心5min，棄上清后，沉淀物中加 入Fico11400梯度離心液(25%、 23%、 20%、 11°/。)， 1000r/min離心10min， 對光亮，用裸眼在11%與20%， 20%與23%層面提取白色粒狀懸浮物，用含 血清的培養(yǎng)液離心洗兩遍，棄去上清夜，雙硫腙染色后倒置顯微鏡下細胞計 數(shù)，臺盼藍染色觀察細胞活性。將純化的胰島細胞置于RPMI1640完全培養(yǎng) 基(含15^胎牛血清，100IU/mL青霉素，10(Hig/mL鏈霉素，10mmol/LHEPES): 37"C，含5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并根據(jù)細胞貼壁時間差分離純化胰 島細胞，即培養(yǎng)24小時后觀察細胞生長狀態(tài)，確認細胞生長良好后，將細胞從瓶底輕輕吹下，收集培養(yǎng)液并離心，加入新的培養(yǎng)液，以5X10V孔細胞數(shù) 接種于24孔培養(yǎng)板，每2天換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)7-21天，作為實驗用細胞。(二) 南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)能夠抑制四氧嘧啶 誘導的胰島3細胞的損傷作用觀察對南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)對由四氧嘧啶誘 導胰島e細胞損傷的保護作用在96孔細胞培養(yǎng)板中，接種胰島P細胞(細 胞密度lX106/mL)，分別加入lOpl南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉 淀物)，濃度為0.1—0.6mg/mL，培養(yǎng)2小時，然后加入四氧嘧啶(濃度為 2mmol/L )。培養(yǎng)24小時后，每孔加入lOpl MTT (5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時后，吸取培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液相同量的異丙醇溶液，設置只加培養(yǎng)液 孔為對照組，37。C飽和濕度放置過夜后，在酶聯(lián)免疫測定儀(Bio-Rad550， USA) 570nm測定光密度(OD)，細胞存活率按下面公式計算存活率(％) =藥物組00/空白對照OD xioo。MTT比色試驗表明，南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)與 胰島P細胞共同孵育2小時后，加入四氧嘧啶共同培養(yǎng)24小時，在50%乙 醇沉淀物濃度為0.6mg/mL和70%乙醇沉淀物濃度為0.1mg/mL時，吸光值與 四氧嘧啶誘導損傷對照組的吸光值相比具有顯著性差異(PO.Ol )，說明胰島p 細胞存活率高于誘導損傷對照組，表現(xiàn)出南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙 醇沉淀物)對胰島P細胞損傷的保護作用(如圖l)。圖1柱形圖說明了南瓜多糖對四氧嘧啶損傷的大鼠胰島e細胞的保護作 用。胰島P細胞中加入南瓜多糖孵育2小時，再加入四氧嘧啶(2mmol/L)作用 24小時。MTT比色法檢測細胞存活率。x±s,n=6。 *P<0.01相比于四氧嘧啶 損傷組。光學顯微鏡觀察結果原代分離純化的大鼠胰島細胞，培養(yǎng)7天后，以 胰島細胞團的形式貼壁，折光度強，生長有發(fā)育良好的突起，細胞均貼壁， 形態(tài)完整。加入四氧嘧啶后，可見大部分細胞形態(tài)腫脹，聚集成團，貼壁細 胞縮短或消失，有些細胞輪廓不清，細胞膜的連續(xù)性消失。加入南瓜多糖(50 %乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)處理后，具有完整形態(tài)的細胞數(shù)目增多，細 胞折光度^顯恢復，染色質(zhì)濃縮明顯減少，形態(tài)接近正常。(三) 南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)抑制胰島3細胞的凋亡原代分離純化的大鼠胰島細胞，在體外培養(yǎng)的時候容易出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，所以觀察南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)對胰島^細胞自 身凋亡的保護作用在96孔細胞培養(yǎng)板中，接種胰島P細胞(細胞密度1X 106/mL)，分別加入南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)，濃 度為0.1—0.6mg/mL，培養(yǎng)24小時后，利用MTT法檢測細胞存活率。MTT比色試驗表明，南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)與 胰島P細胞共同培養(yǎng)24小時后，在50 %乙醇沉淀物濃度為0.6mg/mL (PO.01) 和70X乙醇沉淀物濃度為0.1mg/mL和0.3mg/ml(PO.05 )時，吸光值與對照 組的吸光值相比出現(xiàn)顯著性差異，說明胰島P細胞存活率高于對照組，表現(xiàn) 出南瓜多糖(50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉淀物)對胰島p細胞生長的保護作 用，能夠抑制胰島e細胞的凋亡(如圖2)。圖2柱形圖說明了不同濃度的南瓜多糖對大鼠胰島e細胞凋亡的保護作 用。胰島P細胞中加入南瓜多糖孵育24小時，MTT比色法檢測細胞存活率。 ;c土s，n-6。 *P<0.01相比于對照組，**P<0.05相比于對照組。 實驗2南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)的生物活性實驗 (—)南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞增殖的影響采用臺盼藍染色計數(shù)法，繪制K562細胞生長曲線，觀察80%乙醇沉淀 物對K562細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的K562細胞置于RPM1640完全 培養(yǎng)基(含15%小牛血清，100IU/mL青霉素，10(Hig/mL鏈霉素，1Ommol/L HEPES)中，37°C，含5%<302的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24孔細胞培養(yǎng) 板中，接種K562細胞(細胞密度3X10VmL)，分別加入100nl南瓜多糖(80 %乙醇沉淀物)，濃度為0.15—0.4mg/mL，培養(yǎng)96小時。分別在培養(yǎng)第72和 96小時取樣，然后進行臺盼藍染色,計數(shù)活細胞數(shù)(如圖3)。圖3折線圖說明了南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞增殖的抑 制作用。K562細胞(細胞密度3X10VmL)，分別加入南瓜多糖(80%乙醇沉 淀物)，濃度為0.15—0.4mg/mL，培養(yǎng)96小時。分別在培養(yǎng)第72和96小時取樣，然后進行臺盼藍染色，計數(shù)活細胞數(shù)。x±s,n=3。(二) 南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的K562細胞置于RPMI1640完全培養(yǎng)基(含15%小牛血清，100IU/mL青霉素，100pg/mL鏈霉素，1Ommol/LHEPES)中，37°C，含 5%0:02的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種K562細胞(細胞密度3X104 /mL) 于細胞培養(yǎng)瓶中，分別加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，濃度為0.2 — 0.4mg/mL，培養(yǎng)72小時。收集細胞，F(xiàn)ITC/PI雙染，流式細胞儀測定細胞凋 亡率。數(shù)據(jù)表明，南瓜多糖(80X乙醇沉淀物)能誘導K562細胞凋亡(如表1)。表1.南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)作用K562細胞72小時對細胞凋亡率的影響_南瓜多糖(80% 正常早期凋亡晚期凋亡總凋亡率乙醇沉淀物)濃(％) (%) (%) (%)度(mg/mL)0 99.5 0.28 0.11 0.390.2 89.2 1 4.45 5.450.4 76.5 1.43 15.1 16.53(三) 南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞分化的影響 取對數(shù)生長期的K562細胞置于RPMI1640完全培養(yǎng)基中，37°C，含5%032的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種K562細胞(細胞密度3X10VmL)于 細胞培養(yǎng)瓶中，分別加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，濃度為0.2—0.4mg/mL， 培養(yǎng)72小時。收集細胞，NBT染色，檢測K562細胞的分化。南瓜多糖(80 %乙醇沉淀物)作用72小時后，K562細胞的NBT還原能力增加，有分化的 趨勢(如圖4)。圖4柱形圖說明了南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)對K562細胞分化的作用。 K562細胞(細胞密度3X10VmL)，分別加入南瓜多糖(80%乙醇沉淀物)，濃 度為0.15—0.4mg/mL，培養(yǎng)72小時，進行NBT染色，觀察細胞分化程度。jc± ■s, n=3 。
權利要求
1. 一種南瓜多糖的分離純化方法，其特征在于(1).取新鮮成熟的南瓜，去皮，去籽，切片，經(jīng)0.38％亞硫酸氫鈉溶液浸泡60min后，取出沖洗干凈，添加3倍重量的蒸餾水在75～80℃水浴上，攪拌提取3次，時間分別為6小時，4小時和4小時，過濾；(2).將所得濾液合并后，離心，取上清液真空濃縮，在濃縮液中加入3倍體積95％乙醇攪拌均勻，冰箱放置過夜，離心得沉淀物；(3).取沉淀物用去離子水充分溶解得到水溶液，Sevag法除蛋白即在水溶液中加入1/2體積的氯仿和正丁醇混合溶液，氯仿∶正丁醇＝4∶1，振蕩使其充分混勻，然后3000rmin-1離心15min，除去水溶液與有機溶液交界處的灰白色變性蛋白；水溶液仍按此法反復去蛋白，共3次；(4).水溶液濃縮后，加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量為50％，，加入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌，冷凍干燥，得到分離后的南瓜多糖組分50％乙醇沉淀物；上述50％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量為70％，，加入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌，冷凍干燥，得到分離后的南瓜多糖組分70％乙醇沉淀物；上述70％乙醇溶液中再加入95％乙醇，使溶液中乙醇含量為80％，加入乙醇后靜置過夜，溶液離心，得到沉淀物，沉淀物用95％乙醇，無水乙醇，丙酮依次洗滌，冷凍干燥，得到分離后的南瓜多糖組分80％乙醇沉淀物。
2. —種南瓜多糖分離純化得到的三種組分50%乙醇沉淀物和70%乙醇沉 淀物在防治糖尿病方面和80%乙醇沉淀物作為一種潛在的白血病化療藥物的 用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及采用熱水溶解和乙醇分級沉淀的分離技術從南瓜中分離得到南瓜多糖的三種組分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。其步驟是采用熱水浸提獲得南瓜水提液，有機溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液濃縮，除蛋白，經(jīng)乙醇分級沉淀獲得南瓜多糖的三種組分50％乙醇沉淀物，70％乙醇沉淀物和80％乙醇沉淀物。本發(fā)明方法工藝簡單，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)生物活性試驗表明，三種多糖組分無毒副作用，多糖組分50％乙醇沉淀物和70％乙醇沉淀物能抑制大鼠胰島β細胞的凋亡和保護損傷的大鼠胰島β細胞，80％乙醇沉淀物能抑制白血病細胞增殖，誘導其凋亡和分化。
文檔編號C08B37/00GK101220100SQ20071001728
公開日2008年7月16日 申請日期2007年1月10日 優(yōu)先權日2007年1月10日
發(fā)明者燁 于, 靜 劉, 樊瀛哲, 銳 王 申請人:蘭州大學