專利名稱：：降低多聚唾液酸中的內(nèi)毒素的制作方法降低多聚唾液酸中的內(nèi)毒素本發(fā)明涉及通過以下方法減少多聚唾液酸(PSA)及其綴合物中的內(nèi)毒素，所述方法即對多聚唾液酸進行強堿孵育，然后回收PSA,所述回收通常是通過陰離子交換柱進行吸收和洗脫實現(xiàn)的。內(nèi)毒素含量降低的經(jīng)純化的PSA可用于衍生化藥物送遞系統(tǒng)、包括蛋白和肽藥物的生物分子，這改善了藥物的藥物代謝動力學(xué)和藥效學(xué)。多聚唾液酸(PSA)是天然的無支鏈的唾液酸聚合物，由某些菌林以及哺乳動物的某些細胞產(chǎn)生[Ro也et.al.，1993。通過有限酸水解或通過神經(jīng)氨酸苷酶消化或通過將所述聚合物的天然、細菌衍生形式分段(fractionation)可以產(chǎn)生這樣的多聚唾液酸，即所述多聚唾液酸的聚合程度可以從n-約80或更多個唾液酸g到低至n=2個唾液酸g。不同多聚唾液酸的組合物也是變化的使得存在均聚形式，即大腸桿菌(五.//)Kl菌林和B群腦膜炎球菌的莢膜多糖中的oc-2，8連接的多聚唾液酸，其也存在于胚胎形式的神經(jīng)細胞粘附分子(N-CAM)上。也存在雜聚形式，如大腸桿菌K92菌林和C群腦膜炎奈瑟氏菌的多糖中的ot-2，8oc-2，9交互多聚唾液酸。唾液酸也以與非唾液酸的單體的交互共聚體的形式存在，如W135群或Y群腦膜炎奈瑟氏菌中。多聚唾液酸具有重要的生物學(xué)功能，包括免疫和4傳系統(tǒng)對病原菌的回避和胎兒發(fā)育中對不成熟神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)粘附的調(diào)控(其中所述聚合物具有抗粘附功能)[Muhlenhoff"tf/.,1998，盡管在哺乳動物中沒有已知的多聚唾液酸受體。大腸桿菌Kl菌林的a-2，8-連接的多聚唾液酸也稱為"多聚乙贈經(jīng)絲酸(CA)"，并(以不同長度)用于舉例說明本發(fā)明。所述細菌多糖中的多聚唾液酸的oc-2，8連接形式，是非免疫原性的(即使當(dāng)綴合于免疫原性載體蛋白時也不引起哺乳動物受試者體內(nèi)的T細胞或抗體反應(yīng))，這可反映其作為哺乳動物(以及細菌)聚合物的狀態(tài)。在細胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂上發(fā)現(xiàn)了較短形式(n最大—)的所述聚合物，所述細JJfe^面神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛地分布在體內(nèi)，并被認為有效地給予和保持了對多聚唾液酸的免疫耐受性。近年來，多聚唾液酸特別是那些cx-2，8連接的均聚唾液酸的生物學(xué)性質(zhì)已被利用來改善蛋白和低分子量藥物分子的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)[Gregoriadis，2006;JainW.2003;US-A-5846，951;WO-A-0187922。4多聚唾液酸的衍生作用使得包括過氧化氬酶和天冬酰胺酶在內(nèi)的若干治療性蛋白的循環(huán)半衰期有了顯著的提高，并使得這些蛋白可在原有抗體的存在下應(yīng)用，所述抗體是因為之前暴露于所述治療性蛋白而產(chǎn)生的不想要(并且有時是不可避免)的后果。在許多方面，多聚唾液酸化的蛋白的改良性質(zhì)可與用聚乙二醇(PEG辦生的蛋白相比。例如，在每種情況下，半衰期都增加，且蛋白和lUp對蛋白水解消化較不敏感，但用PSA的生物活性保留似乎大于用PEGHreczuk-扭rstet.al.，2002。另外，將PEG用于必須慢性給藥的治療性試劑還存在問題，因為PEG的生物降解是非常緩慢的Beranova"2000，并且其高分量形式傾向于積聚在組織中[Bendele"1998;Convers1997。已發(fā)現(xiàn)聚乙二醇修飾的蛋白可生成抗PEG抗體，所述抗體也可影響所述綴合物在血液循環(huán)中的殘留時間[ChengW./.，1999。盡管PEG在傳統(tǒng)上就用作綴合于治療劑的非經(jīng)腸給藥聚合物，然而仍需更好地理解其免疫毒理學(xué)、藥理學(xué)和新陳代謝HunterandMoghimi，2002。同樣，還需考慮PEG在可能大劑量使用的治療劑中的應(yīng)用性，因為PEG的積聚可能導(dǎo)致毒性。因此，所述oc-2，8連接的多聚唾液酸提供了一種很好的PEG替代物，其是一種人體中天然存在的免疫上不可查的生物降解聚合物，并且其通過組高水平的內(nèi)毒素污染，這限制了其治療應(yīng)用。本發(fā)明人的科研組在以前的科學(xué)論文和已授權(quán)專利中已經(jīng)描述了PSA的純化和分級分離，以及其在提高蛋白治療劑的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)上的應(yīng)用[Gregoriadis，2006，Jain&"/，2004;US-A隱05846，951;WO-A-0187922?，F(xiàn)在，本發(fā)明人描述了內(nèi)毒素^J:降低的純化PSA的制備，所述PSA可用于生產(chǎn)PSA衍生的蛋白和其他治療劑。這些新材料和方法特別適于生產(chǎn)用于人類和動物的PSA衍生治療劑，其中由于醫(yī)學(xué)倫理學(xué)以及管理機構(gòu)如FDA和EMEA的安全要求，藥物實體的化學(xué)和分子定義是非常重要的。內(nèi)毒素(一種脂多糖)被RichardPfe股er在1982年首先定義為一種在微生物膜破裂時釋放的熱穩(wěn)定的毒性物質(zhì)。被感染宿主中的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致毒性的產(chǎn)生，這似乎對清除大部分局部感染是最佳的。然而，當(dāng)存在系統(tǒng)性分布的嚴重感染時，也可發(fā)生導(dǎo)致感染性休克和死亡的炎癥反應(yīng)。這種脂多糖(LPS)在將內(nèi)毒素呈遞給免疫系統(tǒng)骨髓細胞和產(chǎn)生炎性細胞因子的過程中發(fā)生的大多數(shù)步驟中起作用。LPS最有效的組分AJ3旨質(zhì)A并與內(nèi)毒素有協(xié)同效應(yīng)。細菌炎癥介質(zhì)如肽聚糖、細菌脂蛋白的二酰甘油基半酸---種無毒的糖。然而，所i^PSA,皮胱氨酸部#細菌核酸指紋，也稱為內(nèi)毒素。最近，已發(fā)現(xiàn)鐘樣受體(TLR4)AJJ旨質(zhì)A炎性信號傳感器。而且，已經(jīng)鑒定出不同炎癥介質(zhì)的信號傳感器。弄清內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu)很重要，這有助于了解如何除去該物質(zhì)。LPS由三部分組成位于近端的將LPS錨定在OM外層小葉上的疏水脂質(zhì)A部分，位于遠端的延伸到水介質(zhì)中的親水O-抗原重復(fù)單元和連接兩端的核心寡糖。盡管對存活不是必須的，但是所述O抗原和核心糖提供了對包括洗滌劑的多種抗菌劑和血清4傳的膜攻擊復(fù)合體的抗性。產(chǎn)生o抗原的野生型細胞由于它們光滑的菌落^皮被稱為"光滑型"，而不含有O抗原的細胞被稱為"M型"。含有O抗原多糖的分子通常被稱為LPS，而如在奈瑟氏菌屬中的不含O抗原的分子被稱為脂，或LOS。由于脂質(zhì)A對于存活是必須的并且也是一種有效的炎癥介質(zhì)，因此其現(xiàn)在是用于開發(fā)抗生素和抗炎藥的耙標。除LPSO卜，許多炎癥介質(zhì)可降解為內(nèi)毒素，包括肽聚糖、細菌脂蛋白的二酰甘油基半胱氨酸部分、細菌核酸指玟和失活內(nèi)毒素(由內(nèi)毒素突變菌林產(chǎn)生)。經(jīng)修飾的脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)已被用于開發(fā)新內(nèi)毒素拮抗劑和免疫助劑[Christe"/.，1995。脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)和功能的生物化學(xué)細節(jié)的確定可幫助理解其在細菌發(fā)病機理中的作用并且有助于開發(fā)新的感染療法[Bishop2005]。已經(jīng)開發(fā)了降低體液中內(nèi)毒素含量的方法。例如，WO87/07531描述了用固定在固相載體上的多粘菌素B從含內(nèi)毒素的體液如血液中除去內(nèi)毒素。US6,942,802B2描述了從蛋白溶液中除去細菌內(nèi)毒素以回收蛋白的方法。在該專利中，使用固定化金屬親和色語。US6，713，611B2涉及一種從含有堿性蛋白的溶液中除去內(nèi)毒素的方法。所述方法包括在所述溶液中加入表面活性劑并將得到的溶液上樣到陽離子交換柱上，然后從所述柱上回收所M性蛋白。US6,617,443描述了一種從要回收其中核酸的材料中除去內(nèi)毒素的方法。所述內(nèi)毒素通過在無鹽洗滌劑溶液中預(yù)孵育所述核酸，然后在觸角陰離子交換劑上進行陰離子交換色譜而除去。US5,169,535描述了一種從含蛋白和內(nèi)毒素的溶液中除去內(nèi)毒素的方法，其中所述溶液的pH被調(diào)至9或更低(所述蛋白的等電點)并使所述溶液通過充滿交聯(lián)的顆粒狀殼聚糖的柱子。所述內(nèi)毒素被吸附而所述蛋白通過。US5，917，022描述了一種從生物產(chǎn)品如治療用蛋白、血液血漿成分和白蛋白溶液中除去內(nèi)毒素的方法。此方法包括將所述生物學(xué)產(chǎn)品中存在的內(nèi)毒素與由丙烯基葡聚糖和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物構(gòu)成的交聯(lián)親水基質(zhì)結(jié)合，所述內(nèi)毒素以某種程度的親和性與其結(jié)合。此方法屬于親和色譜方法。US7,109,322公開了一種從含有治療活性物質(zhì)的組合物中降低或除去內(nèi)毒素的方法，所述活性物質(zhì)通常為通過遺傳工程和或生物技^天然來源提取的核酸。為此，例如，用色譜材料處理從發(fā)酵液回收的組合物。將天然來源的成分如所獲得的大腸桿菌發(fā)酵液離心，用200mMNaOH、1%的十二烷^i^克酸鈉裂解，過濾，然后通過優(yōu)先(與內(nèi)毒素相比)吸附所述核酸的陰離子交換柱。用洗皿沖液洗脫所述核酸并回收。在另一個實例中，先使用內(nèi)毒素的金屬親和吸收劑，然后再使用所述陰離子交換柱。發(fā)明US6，699，386B2提供了一種具有選擇性吸附內(nèi)毒素的較強能力的吸附劑和一種從蛋白溶液中吸附內(nèi)毒素的方法。所述吸附劑由一種通過交聯(lián)劑結(jié)合于堿性材料的堿性物質(zhì)構(gòu)成。發(fā)明US6，774，102描述了具有通過體外吸附^Muk液或血漿中選擇性除去內(nèi)毒素和細胞因子誘導(dǎo)物質(zhì)的能力的血液處理材料，用于感染性休克的治療。他們還提供了用于^A類或動物受試者的血液中除去內(nèi)毒素的方法和設(shè)備，其中使用一種固定在固態(tài)栽體介質(zhì)上的含有本發(fā)明多分歉寡肽的吸附劑。已描述了這些用于從多糖樣品中除去內(nèi)毒素的方法。US5,589,591公開了使用優(yōu)選超濾的粒析技術(shù)生產(chǎn)基本不含內(nèi)毒素的多糖組合物的方法。此方法適于從取自植物來源的甘露聚糖、阿拉伯樹膠和阿拉伯半乳聚糖中除去內(nèi)毒素。US5,039,610描述了從革蘭氏陰性的多糖如磷酸多核糖核醇中除去內(nèi)毒素的方法。將來自革蘭氏陰性細菌發(fā)酵液的含有多糖的粉末溶解以提供內(nèi)毒素的二價反離子。連續(xù)加入乙醇以誘導(dǎo)脂多糖沉淀，并將得到的材料與非離子型樹脂、洗滌劑和螯合劑混合。然而，時至今日，將多聚唾液酸樣品中的內(nèi)毒素^*降低到可藥用的水平仍然是一種挑戰(zhàn)。來自發(fā)酵液的多糖帶有陰離子且分子量與內(nèi)毒素非常接近。該天然化合物也是一種脂多糖。由于這些原因，大部分純化技術(shù)得到的是某種PSA和內(nèi)毒素的共純化。本發(fā)明克服了這些問題。7本發(fā)明的第一方面提供了一種用于降低含有多聚唾液酸和內(nèi)毒素的樣品中內(nèi)毒素含量的方法，步驟如下(i)在樣品中加入pKa至少12的堿以形成pH至少12的堿性溶液，將此溶液在預(yù)定溫度下孵育預(yù)定時間；然后(ii)從所趁液中回收內(nèi)毒素襯降低的多聚唾液酸。在一個實施方案中，從所述溶液中回收PSA的步驟包括(iii)將所逸喊處理的溶液通過陰離子交換柱，其中多聚唾液酸,皮吸附到離子交換樹脂上；(iv)用洗滌緩沖液洗滌所述交換柱，其中多聚唾液酸仍然補:吸附在離子交換樹脂上；而(v)用、^沖液將多聚唾液酸從所ita上^yt下來，從而提供內(nèi)毒素含量降低的多聚唾液酸的產(chǎn)物溶液。一^認為至少部分堿處理的內(nèi)毒素產(chǎn)物在空隙體積中通過了所述離子交換柱。在另一個實施方案中，回收步驟(ii)包括一個脫鹽處理步驟，即基于分子篩色譜，回收不含鹽的高分子量材料如多糖。本發(fā)明特別適用于對微生物發(fā)酵液的處理。用本發(fā)明的堿處理方法處理的含有多聚唾液酸和內(nèi)毒素的溶液優(yōu)選為發(fā)酵液，通常為離心后的上清液或者除去諸如營養(yǎng)物質(zhì)、脂質(zhì)、蛋白和核酸的不想要污染物的預(yù)處理步驟的產(chǎn)物。然而，樣品可能會含有不想在最后產(chǎn)物中存在的蛋白，因為預(yù)計其會被所it^降解且降解產(chǎn)物很容易在所述PSA回收步驟中被除去。此方法可得到內(nèi)毒素^*降低并適用于制藥的PSA樣品。令本領(lǐng)域技術(shù)人員驚訝的是，強堿的應(yīng)用不會導(dǎo)致所述PSA(分子量)的降解或脫乙酰。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)^€1PSA與強堿如NaOH的接觸從而避免脫乙酰作用，參見Moe&fl/.。然而，我們已經(jīng)展示了用堿孵育，然后例如通過在陰離子交換柱上、艦而回收PSA的方法，是一種降低PSA內(nèi)毒素含量而不會導(dǎo)致化學(xué)修飾(例如脫乙酰)和分子量降低的特別有效的方法。本發(fā)明的第二方面提供了一種通過上述方法獲得的內(nèi)毒素含量降低的PSA材料樣品。所述內(nèi)毒素含量應(yīng)被降低到一個可藥用水平。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法獲得的樣品中內(nèi)毒素含量少于25EU/mgPSA材料。因此，本發(fā)明的第三方面提供一種通過LAL試驗測量的、內(nèi)毒素含量為25EU/mgPLA材料或更少的樣品。優(yōu)選地，內(nèi)毒素的含量在0.05-25EU/mgPSA材料的范圍內(nèi)。本發(fā)明提供具有低毒素含量的PSA樣品本身和PSA綴合物(如生物分子或藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)綴合物)(以下統(tǒng)稱為PSA材料)。本發(fā)明的方法在可提供可用的PSA產(chǎn)率的務(wù)降下進行。可通過以下方式避免PSA被親和配體如多粘菌素B或聚陽離子如多聚賴氨酸污染，所述配體常用在4皮設(shè)計用于除去內(nèi)毒素的親和吸附劑中，即通過完全不這些材料或者在基質(zhì)不發(fā)生降解的M下使用(在此條件下內(nèi)毒素的除去可能達不到最佳)。這種"純化的"PSA可用于衍生治療劑如蛋白，以及用于A^體而沒有內(nèi)毒素毒性的危險。用歐洲藥典附錄XIVC(EuropeanPharmacopoeia5.0，AppendixXIVC)中所述的LAL試驗測量所述內(nèi)毒素水平。在本發(fā)明方法的步驟(i)中，將所述樣品加入到pKa至少12的堿中。不受理論制約的，一般認為所逸喊能夠斷開鍵，很可能是內(nèi)毒素中的酯鍵，使其失活，和/或允許除去所述反應(yīng)產(chǎn)物。要在本發(fā)明方法中起作用，所M必須足夠強以與內(nèi)毒素反應(yīng)并將其7jc解。令人驚訝的是，例如通過N-乙?；拿撘阴；蚨嗤僖核岬臄嗔咽顾鰞?nèi)毒素濃度的降低基本不會對所述多聚唾液酸造成破壞。優(yōu)選地，所逸喊的pKa至少13，更優(yōu)選地至少14。所述^>優(yōu)選地形成pH至少13的堿溶液，更優(yōu)選地形成pH至少14的堿溶液。所述樣品通常在合逸喊性緩沖液中孵育，例如HEPES緩沖液，或者水。本發(fā)明適用的堿為NaOH、KOH、Ca(OH)2和LiOH。特別優(yōu)選的是NaOH。NaOH適用的濃度為2N。進行步驟(i)的預(yù)定時間通常在5分鐘到24小時之間，優(yōu)選為30分鐘到6小時。預(yù)定溫度通常為0。C至60。C,優(yōu)選為2。C-40^:。更高的溫度和/或更長的時間可導(dǎo)致PSA本身發(fā)生不想要的降解。在本發(fā)明的一個實施方案中，步驟(i)中的孵育為在20X:下2小時，同時勻速攪拌。步驟(i)可緊隨一個中和所述樣品的附加步驟。中和可用例如HC1進行，使溶液的終pH達到約7.4。發(fā)明人的早期專利公開文本W(wǎng)O2006/016161中描述了一種利用步驟(iv)和(v)中所用的離子交換色譜的合適方法。此方法可用于本發(fā)明，其中在此階段不必將所述PSA分離成具有不同平均分子量的級分。在現(xiàn)有技術(shù)的方法中，PSA被分離成具有不同平均分子量的級分。使PSA的水溶液與柱中的陰離子交換樹脂接觸，由此PSA被吸附。然后用洗脫緩沖7jc溶^t所述PSA進行選擇性洗脫，并將所述PSA從洗脫級分中回收。所i^擇性'^包括用至少一種洗脫緩沖液洗滌柱中的樹脂。如果使用一種以上的洗脫緩沖液，每一種均可具有不同的離子強度和/或pH,其中第二種和后續(xù)緩沖液具有比前一步驟所用的緩沖液更高的離子強度和/或pH。使用離子交換的分級分離方法會導(dǎo)致內(nèi)毒素^*的微小降低。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，所述樣品在被所M處理后通過陰離子交換柱。可能需要在上樣到所#前對所述樣品進行制備，例如，可能需要稀釋。至少部分內(nèi)毒素^t過所g，優(yōu)選地選擇可使PSA被完全吸附且至少部分內(nèi)毒素不被吸附的上樣緩沖液。上樣緩沖液的實例描述如下。本方法的步驟(iv)是洗滌步驟，其中用低離子濃度的洗脫緩沖液沖洗通過所述柱。例如，可用一種鹽濃度為lOOmM或更低的緩沖液進行這種初始洗滌步驟。通常，所述洗滌緩沖含有三乙醇胺且pH為約7.4。此初始步驟可洗滌出低分子量的污染物。所述洗滌步驟所用的緩沖液為所述離子交換樹脂柱體積的至少l倍，優(yōu)選地為至少L5倍。在此步驟中，基本上全部多聚唾液酸都保持在所述離子交換樹脂上?？蛇M行一次以上的洗滌步驟。第二種洗滌緩沖液可與第一種相同，或者含有乙醇和/或表面活性劑。表面活性劑的合適實例為非離子表面活性劑如PEG、Tween20和80以及Triton。所述洗滌步驟可M中進一步除去內(nèi)毒素。應(yīng)注意，陰離子交換樹月旨柱的橫截面的直徑可大于其高度，而傳統(tǒng)柱的高度大于其橫截面的直徑。柱體積可為1-5000ml。所#的高度可為1-5000cm。所述橫截面積可為1-5000cm2。所述橫截面可為任啊形狀，但優(yōu)選圓形。陰離子交換樹脂洗滌步驟之后，用'a緩沖液洗脫所述PSA。步驟(v)所用的洗皿沖液的離子強度通常比所述洗滌緩沖液高，以從所述柱上除去所述PSA。通常，所述洗脫緩沖液包含濃度至少為0.4M的NaCl。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)對于所述優(yōu)選實施方案中的洗脫步驟來說，優(yōu)選地使用至少1.0，優(yōu)選至少1.25,最優(yōu)選至少1.5倍柱體積的對應(yīng)洗脫緩沖液。優(yōu)選地使用不超過3倍柱體積的洗J3^沖液。優(yōu)選地,75ml基質(zhì)的^i^A7ml/min。本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案可包括一個以上，例如至少5個，例如多至20個，通常范圍為6-12個的連續(xù)洗脫步驟，其中所用的洗皿沖液可連續(xù)地提高離子強度。這些必要步驟的第一步中的離子強度通常為1mM到1M。以這種方式，洗脫的PSA被分級分離成具有不同平均分子量的樣品。10優(yōu)選地，洗脫緩沖液的離子強^A通過改變強無機酸和強無機喊的鹽一一優(yōu)選氯化鈉——的水平而改變的。進行步驟(v)并獲得產(chǎn)物溶液后，可重復(fù)步驟(i)和步驟(iii)-(v)。優(yōu)選地，重復(fù)步驟(iii)-(v)。所述PSA可被進一步處理。后續(xù)步驟可包括進一步純化和/或濃縮步驟。這些另外的步驟通常包括其中將所述多糖從任意鹽中分離的步驟，例如使用膜，如超濾膜。這種步^ii使得可以濃縮PSA以形成更加高度濃縮的溶液。可對這種溶液進行額外的膜處理步驟，例如連續(xù)超濾或其他過濾步驟。所述陰離子交換^y^沖液可包括揮發(fā)性酸或堿，在這種情況下所述其他步驟可包括所述揮發(fā)'l!i^所述洗脫級分中的揮發(fā)。盡管可能通過沉淀凈支術(shù)，例如引入PSA的非溶劑，從水溶液中回收PSA，然而優(yōu)選地不使用這種溶劑，因為這可能會使">^目應(yīng)溶劑中的分離更加困難。因此，最后的回收步驟優(yōu)選地包括水的蒸發(fā)，并且優(yōu)選地，任何從所述洗脫步驟中剩下的剩余揮發(fā)性緩沖液成分的蒸發(fā)。在一種其中存在三乙醇胺的優(yōu)選情況中，三乙醇胺陽離子和乙酸陰離子都是揮發(fā)性的并可容易M真空M下被除去。可通過干燥(優(yōu)選iiMM^條件下)將PSAM液中最終分離。這優(yōu)選地是通過冷凍干^i^f亍?？勺鳛橐粋€預(yù)備步驟進行沉淀(優(yōu)選地使用一種非溶劑)以分級分離全部成分的一部分并降低其中較高分子量級分的多*性。優(yōu)選地，使用分級乙醇沉淀。本發(fā)明的方法可在步驟(i)之前、步驟(i)和(ii)之間或步驟(ii)之后包括另一步驟。這可包括疏水相互作用色譜(HIC)、親和色鐠如固定化金屬親和色語(IMAC)或分子篩色樹SEC)。合適的HIC柱能夠吸附內(nèi)毒素但不吸附PSA，如PhenylFF。其上樣緩沖液通常為溶于去離子水或pH調(diào)節(jié)到7.4的去離子水的硫酸銨、氯化鈉等的溶液。HIC優(yōu)選地在步驟(i)之前進行。事實上，發(fā)明A^目信這是首次公開HIC用于從PSA樣品中除去內(nèi)毒素的用途。令人驚訝的是，HIC可用于除去內(nèi)毒素(即以脂多糖形式)而不會一起除去多聚唾液酸，例如從義酵液中回收時，或者反之，例如當(dāng)PSA的綴^f吏其比內(nèi)毒素更加疏水時。通iti^擇合適的柱和條件，內(nèi)毒素將吸附到柱上而PSA通過，或者相反(隨上樣緩沖液)if^空柱或通過用合適的洗皿沖液洗脫。因此，本發(fā)明的另一方面提供一種用于降低含有多聚唾液酸和內(nèi)毒素的樣品中內(nèi)毒素含量的新方法，包括使所述樣品通過可吸附內(nèi)毒素的疏水相互作用柱，其中PSA穿過所述柱并被收集以得到內(nèi)毒素含量降低的多聚唾液酸產(chǎn)物溶液。因此，本發(fā)明的另一方面提供一種用于降低含有多聚唾液酸和內(nèi)毒素的樣品中內(nèi)毒素含量的新方法，包括使所述樣品通過可吸附PSA的疏水相互作用柱，其中內(nèi)毒素穿過所述柱而PSA被吸附，然后PSA被洗脫和收集以得到內(nèi)毒素含量降低的多聚唾液酸產(chǎn)物溶液。優(yōu)選地使用^，因為其可結(jié)合內(nèi)毒素而允許PSA通過。在第一個實施方案中，在含有內(nèi)毒素的柱空體積通過后，可用洗滌緩沖液洗滌所述柱并收集洗下的成分，其也可包含PSA。第二個實施方案特別適用于純化PSA與蛋白的綴合物，例如相對疏水的蛋白。親和過濾基質(zhì)通?？稍诒景l(fā)明方法的步驟(ii)之后使用。應(yīng)選擇與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的親和基質(zhì)。選擇條件以使得上樣所述溶液時PSA不被吸附。通常優(yōu)選地避免使用內(nèi)毒素特異的親和色譜，以避免被所述基質(zhì)的降解產(chǎn)物污染。優(yōu)選地，當(dāng)包括^^r這種方法步驟時，要選擇M以避免這種降解。盡管選擇這些條件可能會損害內(nèi)毒素移除的最優(yōu)化，但當(dāng)在多步過程中組合使用本發(fā)明方法的必要步驟時，內(nèi)毒素水平會降低到可接受的水平。在本發(fā)明的一個實施方案中，含有固定化內(nèi)毒素結(jié)合試劑的親和M被用于純化所述PSA樣品。一種合適的試劑是.多粘菌素B凝膠，特別是Detoxi-Gel。所述Detoxi-GeP內(nèi)毒素去除^M使用固定化多粘菌素B以結(jié)合和除去溶液中的熱原。多粘菌素是一個含有帶脂肪酸鏈的陽離子環(huán)肽的抗生素家族。多粘菌素B通過結(jié)合至細菌脂多糖的脂質(zhì)A部分而中和內(nèi)毒素的生物活性。Kluger等人進行的研究(1985)表明所述固定化多粘菌素B可使部分但非全部內(nèi)毒素失活。所述固定化多粘菌素B^A—種穩(wěn)定的親和基質(zhì)，所述基質(zhì)防止配體濾出到珍貴的制劑中。使用親和基質(zhì)使得可容易地清除緩沖液、細胞培養(yǎng)基、含大分子如蛋白質(zhì)的溶液以及藥理學(xué)重要成分。Detoxi-GeF"內(nèi)毒素去除^也已經(jīng)被用于從核酸(DNA)樣品中除去內(nèi)毒素(Wicks"1995)。通常，多粘菌素B在使用之前必須先M氣。皿可通過以下方法再生，即通常用洗滌劑如去Wa酸鈉洗滌，然后再沖洗以除去所述洗滌劑。一種洗滌所述劍歐的合適試劑為無熱原的水。皿一旦生成，即#入到所#中，并加入無熱原的緩沖液或水。柱的孵育時間通常為一小時。一旦樣品已經(jīng)被收集，則其通常要,皮凍干以防止細菌污染。CeHufineW柱是另一種可用于降低PSA樣品中內(nèi)毒素含量的親和色鐠柱。這種柱通常用2-8倍，例如5倍柱體積的無內(nèi)毒素緩沖液如HEPES緩沖液(pH7.4)平衡。HEPES也可用作上樣緩沖液。Cdlufine是一種特別適用的材料，因為其中PSA非特異性結(jié)合劑4艮少。其他商業(yè)可獲得的內(nèi)毒素選擇性親和色鐠柱為EndoTrap柱。EndoTrapRed"^也可用于降低PSA樣品中的內(nèi)毒素含量。這種柱通常用5-10倍，例如5倍柱體積的無內(nèi)毒素緩沖液如RegenerationBufferRedm和20mMHEPES緩沖液(pH7.4)或者用去離子水(pH7.4)平衡。HEPES或去離子水(pH7.4)也可用作上樣緩沖液。EndoTrapRed""柱也可用于降低PSA樣品中的內(nèi)毒素含量。這種柱通常用5-10倍，例如5倍柱體積的加有50-100pMCa+2的去離子水(pH7.4)平衡。才艮據(jù)本發(fā)明的第一方面，還可對所述樣品進行其他純化方法處理。例如，可在步驟(i)和(ii)之間或步驟(ii)之后對所述樣品進行一個或多個用表面活性劑、螯合劑、堿、有M劑、氧化劑或it^化物酶孵育的預(yù)備步驟。優(yōu)選地，所述表面活性劑是一種陰離子表面活性劑，例如十二烷基琉酸鈉(SDS)?；蛘?，所M明活性劑可以是0.5%TritonX114或者1%的TritonX100或114。也可使用陽離子表面活性劑，例如可有效殺菌的表面活性化合物，如溴化十六烷三曱基銨。合適的孵育時間為一小時。合適的溫度為0-50*C,但優(yōu)選35-37。C。當(dāng)《吏用非離子表面活性劑時，所g液被上樣到陰離子交換柱上以除去非離子表面活性劑。這里可使用20mMTEA緩沖液。在本發(fā)明的一個實施方案中，將PSA樣品用含有1。/。SDS/2NNaOH的HEPES緩沖液孵育1小時，然后將此溶^Ji樣到柱(如GPC柱)上以除去鹽和陰離子表面活性劑，再用一種合適的緩沖液(通常為HEPES緩沖液)分級分離?？墒褂胮d10，S印hadex25柱?；蛘撸部墒褂闷渌哂胁煌琓riton濁點的非離子表面活性劑，如Tween20和Tween80，以降低PSA樣品中內(nèi)毒素的含量。將PSA樣品在室溫下在0.1%Tween80中孵育30分鐘。然后用合適的緩沖液或去離子水(pH7.4)將該溶液上樣到陰離子交換柱中以除去表面活性劑。用7jc和緩沖液(pH7.4)充分地洗滌所述柱以除去表面活性劑。在實施方案中，所述方法包括一個氧化步驟。此步驟旨在氧化唾液酸的末端單元以使其可與例如蛋白或肽^JI。其可同時導(dǎo)致降低內(nèi)毒素含量的降低并因此成為一個可用于完成降低內(nèi)毒素的總體目標的步驟。合適的氧化劑是高碘酸鈉、超氧化物、次氯酸鹽和過氧化物酶。本發(fā)明方法可包括在步驟(i)之前或步驟(ii)之后使用相萃取、滲濾沉淀和/或干熱。當(dāng)使用干熱時，通常在一個小瓶中將PSA樣品加熱到100-200TC，最優(yōu)選地約150匸，并且持續(xù)l-6小時，通常約4小時。這些條件不使PSA失活或降解。滲濾可在用表面活性劑孵育所述PSA樣品后使用，或者也可獨立于表面活性劑處理而使用。所述過濾器應(yīng)足夠小以留存至少較高分子量的PSA并同時允許內(nèi)毒素通過。一個臨，為5kDa球蛋白的典型超濾設(shè)備具有足夠大的孔以允許內(nèi)毒素(10,000Da)通過并同時留存20,000Da及更大的PSA。滲濾步驟優(yōu)選地在所ii^處理后使用，如作為回收步驟(ii)的一部分。本發(fā)明的方法提供內(nèi)毒素含量降低到可藥用水平的PSA，用于人類或動物。理想地，所述PSA產(chǎn)物的內(nèi)毒素^:小于25EU/mgPSA。優(yōu)選地，所述PSA的內(nèi)毒素含量為0.05-25EU/mg。本發(fā)明可用于產(chǎn)生低內(nèi)毒素含量的PSA綴合物。在一個PSA綴合物中，所述綴^P分優(yōu)選地為一個生物分子，更優(yōu)選地為一個蛋白。PSA蛋白綴合物可通過若干方法產(chǎn)生，具體參見發(fā)明人的在先專利申請WO-A-0187922和W092/22331。4艮據(jù)本發(fā)明第一方法的方法通常不適用于PSA-生物分子綴合物，因為所M通常會破壞所述生物分子部分，即在步驟(i)之前不進行任何綴合。本發(fā)明的第四方面提供一個包括以下后續(xù)步驟的方法(v)將PSA綴合物和內(nèi)毒素的混合物與一種非離子表面活性劑在預(yù)定溫度下接觸預(yù)定時間；(vi)將所述表明活性劑處理的樣品通過陰離子交換柱，從而使所述PSA綴合物#皮吸附到所*上；(vii)用'^緩沖液將所述PSA綴合物從所#上^^下來以產(chǎn)生內(nèi)毒素^*降低的PSA綴合物溶液。這一方面中所用的非離子表面活性劑的實例為PEG化合物、去水山梨糖醇單油酸酯、Tween20/80或Triton系列的膜。再次，不希望受理論制約的，一般認為所W面活性劑通過破壞內(nèi)毒素的膠束形成或通iti^解內(nèi)毒素而使內(nèi)毒素水平降低。14本發(fā)明第四或第一方面的產(chǎn)物可為一種藥用組合物，其中所述內(nèi)毒素含量應(yīng)足夠低以在將所述組合物給藥于人類或動物時避免毒副作用。所述組合物可以^L人類或動物的藥用組合物。通常，純化前的PSA樣品一一即第一方面的步驟(i)和第四方面的步驟(v)的起始材料——中的內(nèi)毒素含量為1000-200,000EU/mg。為了成為可藥用的，所述樣品中最后的內(nèi)毒素^t不能超過25EU/mg。所允許的內(nèi)毒素含量與所述PSA的目的用途有關(guān)。如果所述PSA用于衍生一種用作藥物的蛋白，則所允i午的內(nèi)毒素含量隨著用作藥物的蛋白的劑量而變化^——^高的劑量通常要求V格地除去內(nèi)毒素。對于用在人類(動物)劑量為10-500mg的藥物組合物中的PSA-蛋白綴合物，內(nèi)毒素含量不應(yīng)超過0.5EU/mg，優(yōu)選地為0.05-0.5EU/mg。對于人類劑量為1-10mg的PSA-蛋白綴合物，內(nèi)毒素含量不應(yīng)超過5EU/mg,優(yōu)選地為0.5-5EU/mg。對于人類劑量最多為1000yg的PSA-蛋白綴合物，內(nèi)毒素含量不應(yīng)超過25EU/mg,優(yōu)選地為5-25EU/mg。本發(fā)明中含有內(nèi)毒素和PSA的樣品方便地為發(fā)酵液。所述發(fā)酵液可以是重組產(chǎn)生的，或者是天然的產(chǎn)PSA的微生物液體、其水解產(chǎn)物或這些物質(zhì)之一的分解衍生物。所述微生物可為大腸桿菌Kl、腦膜炎奈瑟氏菌或液化性摩拉克氏菌。通常，根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法包括一個預(yù)備步驟，其中所述微生物被發(fā)酵以產(chǎn)生發(fā)酵液。所述PSA可為聚(2，8-連接的唾液酸)、聚(2，9-連接的唾液酸)或2，8-2，9-交互連接的PSA。優(yōu)選地，所述PSA是多聚乙酰神經(jīng)，酸(CA)或者其氧化的、還原的、胺化的和/或酰肼衍生物。所述PSA通常具有至少2個，優(yōu)選地至少5個，更優(yōu)選地至少10個，例如至少50個糖單元。通常，具有大多數(shù)作用的PSA的平均分子量為多至100kDa。所述PSA可來自4^來源，優(yōu)選天然來源如細菌來源(例如大腸桿菌K1或K92、B群腦膜炎球菌)，或者甚至牛奶或N-CAM。所述唾液酸多聚物可為雜聚多聚物如135群或V群奈瑟氏腦膜炎一菌，或可為合成的如酶法合成的。所述PSA可為嵌段共聚物，如均聚(唾液酸)與另一種天然多聚物或合成多聚物的結(jié)構(gòu)單元形成的綴合物。所述PSA可以為鹽或游離酸的形式。其可以為水解形式，從而使得在從細菌來源回收后分子量降低。本發(fā)明方法的起始材料中的PSA可以為具有廣泛分子量的材料，例如具有超過1.3(如高至2或更高)的多M性。優(yōu)選地，分子量的多*性小于1.2，更優(yōu)選地小于l.l，例如j氐至l.Ol。使用純化PSA對蛋白和藥物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的衍生化可造成半衰期增加、穩(wěn)定性提高、免疫原性降低和/或?qū)θ芙庑缘目刂?，并因此改善了生物藥效和藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)，或者可加強溶解性或含有所述衍生活性物質(zhì)的溶液的粘度。優(yōu)選地，本發(fā)明各方法方面的最后產(chǎn)物和新產(chǎn)品中的PSA具有2-1000個唾液酸單元，例如10-500個，更優(yōu)選地為10-50個唾液酸單元。優(yōu)選i也，所述PSA的多^t性小于2，理想地小于1.2,理想地為1.01-1.10。本發(fā)明所用的純化方法除了降低內(nèi)毒素含量以外，還優(yōu)選地降低所述PSA的多^t性。PSA樣品的內(nèi)毒素含量通過本發(fā)明方法被降低至少5倍，優(yōu)選地至少10倍，最優(yōu)選地至少100、200、500倍，并且在某些實施方案中最多至1000、10000、100000或甚至1000000倍。優(yōu)選地，所M處理和回收降4氐內(nèi)毒素含量至少5倍。預(yù)備步驟和多個PSA回收步驟可導(dǎo)致總共降低至少105倍。通常會選擇若干回收步驟的組合從而通過被稱為內(nèi)毒素成分移除的互補步驟使內(nèi)毒素降低最大化同時使PSA回收最大化。實施例的"內(nèi)毒素試驗"(LAL測驗)部分描述了如何測量內(nèi)毒素的含量。實施例內(nèi)毒素的對照測定為進行內(nèi)毒素測定，使用了CharlesRiverLaboratories的Endosaf卜PTS(便攜測試系統(tǒng))。逸基于所述LAL(鱟變形細胞溶解物)測定。儀器操作將所有需要的信息輸入讀數(shù)器。當(dāng)全部測試信息均已輸入后，所述讀數(shù)器顯示"加樣；按回車"。除非另外指出，所述PSA樣品被制備成溶于20mMTEA緩沖液中l(wèi)mg/ml的溶液，pH7.4。將25yL樣品加入4^四個樣品池中并按下所述讀數(shù)器上的回車鍵。泵將樣品小份抽入測試通道中，結(jié)果在15-20分鐘內(nèi)產(chǎn)生。當(dāng)試驗完成后，所述儀器在屏幕上顯示內(nèi)毒素測量結(jié)果和測定驗收標準。所述儀器給出以下技術(shù)指標樣品EU/mL、樣品％CV、尖峰(spike)EU/mL、尖峰。/oCV和。/。尖峰回收。實施例1-用氫氧化鈉降低內(nèi)毒素在0.5MNaOHH印es緩沖液中制備有內(nèi)毒素(31kDa，未氧化的)污染的6mg/ml的多聚乙酰神經(jīng)JUt酸溶液，然后置入室溫下孵育10分鐘。然后將0.5ml溶液上樣至分子篩色鐠脫鹽柱中并棄去所收集的級分。然后用2.5mlHEPES緩沖液洗滌所述柱并收集級分，然后再用HEPES緩沖液收集另外2ml級分。然后通過間苯二酚測定分析所收集的洗出級分的多聚乙,經(jīng)M酸含量。然后將含有多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的級分合并到一起并分析內(nèi)毒素含量。測試所述樣品中PSA的去乙?；潭?。圖1顯示在0.5MNaOH和1%SDSHEPES緩沖液中的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的非變性皿電泳。用NaOH可使內(nèi)毒素含量降低53倍且未檢測到去乙?；?。也絲用NaOH和SDS的PAGE中觀察到CA的^^T降解。實施例2-在堿處理后通過陰離子交換降低內(nèi)毒素在20mMTEA緩沖液(pH7.4)中測量直接取自；^桿菌Kl的發(fā)酵器的樣品(1mg/ml)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素含量大于105EU/mg。然后將NaOH加入所述PSA溶液中以使PSA樣品溶液最終含有2NNaOH，然后在室溫下輕輕攪拌，孵育2小時。記錄所逸溶液的pH。用IO倍柱體積的去離子水(pH7.4)洗滌HiTrapQFF(1ml)柱，然后用10倍柱體積的20mMTEA平衡該柱。測量所述樣品溶液的電導(dǎo)率，并用20mMTEA緩沖液適當(dāng)?shù)叵♂屢耘c緩沖溶液的電導(dǎo)率匹配。然后將所述樣品緩沖液以1ml/min的流量上樣到QFF(1ml柱)上并單獨收集柱空體積(約1/3柱體積)。收集了1ml級分。然后用20mMTEA洗滌所述柱，并每次收集1ml洗出級分。然后用含1MNaCl的20mMTEA洗脫所述樣品并收集洗脫級分。對所述洗脫樣品進行間^1酚測定以計算所述樣品中多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的量，并且測量含多聚乙Wt經(jīng)M酸的合并'3W樣品中的內(nèi)毒素含量。發(fā)現(xiàn)所述產(chǎn)物的內(nèi)毒素水平降低至1407EU/mg，即降低了超過71倍。PSA的回收率為91Vo。重復(fù)對上述產(chǎn)物i^f亍堿處理和通過陰離子交換的回收，觀察到內(nèi)毒素含量進一步降低至小于300,即又降低了5倍。實施例3-在非離子表面活性劑(TritonX-100)處理后通過陰離子交換降低內(nèi)毒素測量溶于20mMTEA緩沖液(pH7.4)中的初始樣品(lmg/ml)的內(nèi)毒素含量。在1%TritonX100中制備多聚乙SU申經(jīng)絲酸溶液(35mg/ml，有內(nèi)毒素污染)，在室溫下孵育2小時。測量所g液的pH。按照實施例2制備HiTrapQFF柱，并按照實施例2制備樣品和上樣。然后用20mMTEA洗滌所i^ti,#^次收集1ml洗出級分。然后用含1MNaCl的20mMTEA洗脫所述樣品并收集洗脫級分。對所述洗JW品進行間苯二酚測定以計算所述樣品中多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的量，并且測定含多聚乙船申經(jīng)氨糖酸的合并'樣品中的內(nèi)毒素^*。當(dāng)上樣7.28mg多聚乙,經(jīng)M酸時，所it^始材料的內(nèi)毒素^J:從4023降低至1511EU/mg,即降4氐了約3倍。回收率為97%。實施例4-通過非離子表面活性劑(TritonX114)處理和陰離子交換降低內(nèi)毒素制備1%TritonX114溶液并JLip入到合適量的通過標準離心、裂解、滲濾和超濾從發(fā)酵液得到的PSA溶液中，使TritonX114的終濃度為0.5%，在室溫下孵育2小時。測量所述溶液的pH。按照實施例3制備、上樣、洗'絲洗脫HiTrapQFF柱，并測定含有多聚乙船申經(jīng)氨糖酸的合并洗脫樣品中的內(nèi)毒素含量。超過105EU/mg的起始內(nèi)毒素水平降低至約2.3x104EU/mg,即降低約4倍。實施例5-通#堿處理/陰離子交^進行非離子表面活性劑處理和陰離子交換來降低內(nèi)毒素按照實施例2的方法用堿處理不同發(fā)酵液的多聚乙,經(jīng)#^酸溶液產(chǎn)物，然后用TritonX114做如下處理，然后進行陰離子交換。制備1%TritonX114溶液并加入到合適量的PSA溶液中使TritonX114的終濃度為0.5%。所*液在室溫(25C)下變渾濁。為使所述溶液澄清，將其置于冰上10-15分鐘。再將所ii^液置于室溫下20分鐘以使其渾濁。所述渾濁溶液被離心并分為兩層含PSA的上層和含內(nèi)毒素的TritonX114下層。保留上層并上樣到所述QFF柱上。按照實施例4制備、上樣、洗^^^6HiTrapQFF柱。在此例中，內(nèi)毒素水平在第一個堿處理步驟中從105EU/mg以上降低至約4.4x103EU/mg,又在第二個表面活性劑步驟和陰離子交M降低至8.2x102EU/mg。實施例6-通過非離子表面活性劑(Tween80)處理和陰離子交換降低內(nèi)毒素在0.1%TritonX80中制備多聚乙Wt經(jīng)絲酸溶液(100mg/ml，有內(nèi)毒素污染的；共2,5g),將pH調(diào)節(jié)到7.4。在室溫下將所ii^液孵育30分鐘，再用pH7.4的:d^釋至500ml。用IO倍柱體積的去離子水(pH7.4)洗滌所述HiTrapQFF(75ml)柱，然后用10倍柱體積的pH7.4的水平衡該柱。然后在室溫下以7ml/min的流量上樣所述樣品溶液。將上樣級分收集到用50mlfalcon管的級分中或視情況而定。單獨收集最先流出的25ml上樣樣品，這部分對應(yīng)所述柱的柱空體積。然后用pH7.4的含0.01%Tween80的水洗滌柱(7ml/min，4CV)，并每次收集75ml洗出級分。然后用pH7.4的水洗滌柱(7ml/min，4CV)，并收集75ml或酌量的洗出級分。然后用pH7.4的150mMNaCl水溶液洗滌柱(7ml/min，8CV),并收集75ml或酌量的洗出級分。然后用pH7.4的500mMNaCl水溶液洗脫柱，并收集75ml或酌量的'M級分。在常溫下收集所述樣品。對所述洗脫樣品進行間苯二酚測定以計算所述樣品中多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的量，并且測定含多聚乙酰神經(jīng)JUt酸的合并#品中的內(nèi)毒素含量。實施例7-通過疏水相互作用色鐠除去內(nèi)毒素將含2M硫酸銨的去離子水/去離子水用作上樣緩沖液。將500pg多聚乙HW申經(jīng)氨糖酸(7kDa，按照比較例1制備)溶解于500Ji1上樣緩沖液中，并將溶液上樣到下表注明的HIC柱中。然后將柱孵育一小時。收集洗脫樣品并進行間苯二酚測定以評估所述洗脫樣品中多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的量。然后將含有多聚乙申經(jīng)氨糖酸的洗脫樣品合并到一起并分析內(nèi)毒素含量。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>內(nèi)毒素含量降低最多至14.5倍。通過不同柱降低內(nèi)毒素的順序為Phenyl>Butyl>Octyl。實施例8-用陰離子表明活性劑(十二)^^酸鈉)除去內(nèi)毒素。在1%SDSHEPES緩沖液中制備6mg/ml多聚乙船申經(jīng)^^酸溶液并在37X:孵育1小時。然后將0.5ml溶^Ji樣到PdlO柱中并丟棄所收集的級分。然后用2.5mlHEPES緩沖液洗滌所述柱，并收集洗出級分。再用2mlHEPES緩沖液洗脫所述柱。然后通過間苯二酚測定分析所收集的洗出級分的多聚乙酰神經(jīng)^Jt酸含量。然后將含有多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的級分合并到一起并分析內(nèi)毒素含量。內(nèi)毒素含量^10exp6EU/mg降低到741.6EU/mg。PSA的回收率為84%。比較實施例1.使用陰離子交換分級分離制備一個新的預(yù)^^(1000ml;QSepharoseFF，GEHealthcare)并用3倍柱體積的去離子水和3倍柱體積的洗滌緩沖液以50ml/min的流量洗滌防腐劑。將蠕動泵管用起始緩沖液(三乙醇胺，pH7.4;20mM)注滿，所述柱與所述泵連接，將數(shù)滴起始緩沖液加到所述柱的頂端以避免將空氣引入所述柱中。在三乙醇胺緩沖液中制備從有內(nèi)毒素污染的;tM桿菌發(fā)酵液中獲得的多聚乙酰神經(jīng)^IUt酸溶液，并將所述溶液的pH調(diào)節(jié)到7.4。然后將所述樣品(從Marukin，Japan獲得的多聚乙財經(jīng)絲酸(CA))以50ml/min的流量加到柱中，再用另外750ml洗滌緩沖液洗滌所述柱。然后用1500ml洗滌緩沖液洗滌所g。用1500ml濃度為100-475mMNaCl的不同洗脫緩沖液洗脫所結(jié)合的CA，收集每輪的洗液并分別將它們轉(zhuǎn)移到不同的容器中。用1500ml1MNaCl除去全部殘留的CA和其他殘留物并收集洗液。然后用3倍柱體積的洗滌緩沖液使所述柱再生。然后將所述柱在室溫下儲存于20%的乙醇中。然后在4X:和4bar壓力下#^長較長的樣品(通過高鹽洗脫劑洗出)在250ml^Jjl管(VivaceU，Vivascience)中，到最小體積。用蒸餾水(用NaOH將pH調(diào)節(jié)到7.4)洗滌所述濃縮物4次。同樣在4'C和加壓下#&長較短的樣品在50ml濃縮管(Vivaflow，Vivascieiice)中濃縮。用蒸餾水洗滌所述濃縮物4次。通過三乙醇胺測定測量多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的含量。然后分析所述樣品的內(nèi)毒素含量。結(jié)果顯示所述內(nèi)毒素水平的值從1.6x10exp5EU/mg降低至3070EU/mg。所述內(nèi)毒素含量降低幾乎5倍。比較實施例2-親和色謙-Detoxi^M^柱純化用無熱原溶液再生所述Detoxi皿柱以防止在所述樣品中引入4^f可內(nèi)以防止氣泡堵塞所g和降低流量。Detoxi內(nèi)毒素去除皿可4吏用至少10次而不喪失活性。4^P溶液和皿在4吏用前都被平衡到室溫。通過將漿體置于帶有磁力攪拌器的抽濾瓶底部將所述^m氣。在攪拌所述漿體的同時，用抽氣器在所述瓶內(nèi)制造真空。所述^R被脫氣約15分鐘。用脫氣的漿體裝填合適尺寸的柱，并使所述皿沉降30分鐘。所述凝M通過以下方法再生的，即用5倍柱體積的1。/。脫IUa酸鈉洗滌，然后用3-5倍柱體積的無熱原水洗滌以除去過量的脫IUa酸鈉。所述^^在每次4吏用前都用相同方法再生。然后將所述樣品加入所述柱中。加入小份的無熱原緩沖液或水并收集流過的液體。所述樣品在柱空體積(94%的柱床體積)收集完成之后從所述柱中脫出。為4吏效率更高，在樣品進入所述^M^后重新蓋上底蓋和頂蓋。將所述柱孵育至少一小時，然后取下底蓋和頂蓋。然后加入無熱原緩沖液或水以收集所述樣品。在全部這些實驗中，注意防止在除去內(nèi)毒素之后樣品被灰塵或臟玻璃器亞所污染。然后將樣品冷凍和儲存。所述柱根據(jù)如上相同方法再生而除去任何結(jié)合的內(nèi)毒素，并在2-8t:下儲存在25%乙醇中。在笫一個實施例中，樣品是WO2008/012525的實施例3所公開方法的產(chǎn)物，其是根據(jù)WO2006/016161所述技術(shù)分級分離的多聚乙船申經(jīng)氨糖酸與GCSF綴合的產(chǎn)物。所述綴合物在親和皿處理前的內(nèi)毒素水平為438EU/mg，處理后其水平降低至10.5EU/mg。使用這種親和色譜材料。PSA-蛋白綴合物的內(nèi)毒素^J:降低了最多至35倍。在第二個實施例中，樣品是在以下條件下使用的純多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸制劑PSA(mg/ml)(三乙醇胺測定)PSA量(mg)體積pHPSA19.3Kda(Manikin)0.17490.1574在Hepes緩沖液中(20mMHepes，150mMNacl;pH7.4)0.9ml7.4內(nèi)毒素^J:的值從初始的16,000EU/mg降4氐至4.2EU/mg。回收率大于90%。在第三個實施例中，起始材料是根據(jù)比較實施例在以下條件下制備的溶液。結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>所述樣品中初始內(nèi)毒素含量為3070EU/mg。內(nèi)毒素含量降低了最多至47倍。結(jié)論內(nèi)毒素特異的親和色謙可用于從多聚唾液酸中及其綴合物中除去內(nèi)毒素，即，發(fā)明人已經(jīng)證明了可以選擇這樣的務(wù)降，即在所述務(wù)降下內(nèi)毒素與所述柱結(jié)合，而PSA不結(jié)合但能以方便的形式被回收并且含有低水平內(nèi)毒素。因此此步驟可用于處理堿(或表面活性劑)處理的PSA產(chǎn)物。比較實施例3-用親和柱(Cellufme)除去內(nèi)毒素此實施例與比較實施例2類似，但使用一種不同的內(nèi)毒素去除親和柱。CellufineET凈化柱(S珠)是通過用5倍柱體積的0.2MNaOH、2MNaCl和無內(nèi)毒素的水洗滌而再生。然后用5倍柱體積的合適的無內(nèi)毒素緩沖液(HEPES緩沖液)平衡所述柱。然后將在比較實施例1中用HEPES緩沖液(lmg/ml)制備的多聚乙Wt經(jīng)^Jt酸溶絲21"C下以0.1-0.2ml/min的流量加入所il^中。上樣總量為218)ig。然后將所述柱孵育1小時，再用HEPES緩沖液洗脫并收集洗脫液。對所述洗脫樣品進行三乙醇胺測定以計算所述樣品中的多聚乙酰神經(jīng)JUt酸含量，并測定含多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的合并、g樣品中的內(nèi)毒素含量。所述內(nèi)毒素水平從3070EU/mg降低至75EU/mg，即降低了40倍。用比較實施例2部分1所用的起始材料GCSF-PSA綴合物重復(fù)該方法，內(nèi)毒素7K平從438EU/mg降低至12.4EU/mg。我們的結(jié)論是Cdlufine柱適于從PSA中除去內(nèi)毒素。比較實施例4:用親和柱(EndoTrapRed)除去內(nèi)毒素此實施例使用另一種親和柱用于吸附內(nèi)毒素。EndotrapRed柱是用pH7.4的去離子7jc再生和平衡。制備有內(nèi)毒素污染的10ml50mg/ml的多聚乙酰神經(jīng)^Jt酸溶液。串聯(lián)兩個柱。將所述樣品溶液上樣到所述柱并收集其柱空體積(約1/3柱體積)。然后收集剩余的上樣溶液。然后用6倍柱體積的pH7.4的去離子水洗滌所述柱并每次收集1ml洗出級分。對所有級分進行三乙醇胺測定以計算多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸含量并測定含多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的樣品中的內(nèi)毒素含量。16kDa多聚乙iib^經(jīng),酸的結(jié)果顯示內(nèi)毒素水平從564EU/mg降低至6EU/mg，降寸氐了約卯倍。所述方法也用于由WO2008/012528所述方法制備的有內(nèi)毒素污染的胰島素-PSA綴合物。所述內(nèi)毒素含量從111EU/mg降低至12.5EU/mg，即降低了9倍。這些實施例顯示另一種柱也可用于從PSA及其綴合物中除去內(nèi)毒素。比較實施例5-用HEPES緩沖液通過親和柱除去內(nèi)毒素EndotrapRed(1ml柱體積)；UI隨柱提供的Red再生緩沖液再生。然后用5倍柱體積的合適的無內(nèi)毒素的20mMHEPES緩沖液平衡所i^。然后將用HEPES緩沖液(750照/ml)制備的有內(nèi)毒素污染的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸溶液在21*€下以0.1-0.2ml/min的流量加入所述柱中。然后用0.3m120mM的HEPES緩沖液洗脫所述柱。對所述洗脫樣品進行三乙醇胺/蛋白測定以計算所述樣品中的多聚乙酰神經(jīng)JUt酸含量，并測定含多聚乙船申經(jīng)J^酸的合并'^J^樣品中的內(nèi)毒素^:。結(jié)果顯示所述內(nèi)毒素水平可降低約2-7倍，且在PSA回收率iiJiJ100%的上樣水平上這受所用PSA上樣量的影響(對所述柱較^氐的上樣量可獲得較大的降^f氐)。比較實施例-用30。/。的IPA通過陰離子交換柱除去內(nèi)毒素、蛋白、DNA和細JlW片通過離心、上清液恢復(fù)、滲濾和超濾回收發(fā)酵液，制備濃度為35mg/ml的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸并測量其pH。用10倍柱體積的去離子水(pH7.4)洗滌HiTrapQFF柱，并用10倍柱體積的20mMTEA平衡。測量所述樣品溶液的導(dǎo)電性并用20mMTEA緩沖液適當(dāng)稀釋以與緩沖液溶液的導(dǎo)電性匹配。然后以1ml/min的流量上樣所述樣品溶液并分別收集流出級分。然后收集1ml的流出級分。然后用30%IPA洗滌柱，并每次收集1ml的洗出級分。然后用含lMNaCI的20mMTEA洗脫所述樣品并收集洗脫級分。對所述洗脫樣品進行三乙醇胺測定以計算所述樣品中的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸含量，并測定含多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸的合并洗脫樣品中的內(nèi)毒素含量。所述發(fā)酵液提取物的初始內(nèi)毒素^1:為3.2x104EU/mg,^短為1.8x103EU/mg，即所述內(nèi)毒素含量降低了18倍。參考文獻Bishop,R.E"InRusssellW，HerwaldH(eds)ConceptsinBacterialVirulence:ContribMicrobiolBasel,Karger,12(2005)1-27.Bendele，A.，Seely，丄，Richey，C.，Sennello，G.，Shopp,G.，Renaltubularvacuolationinanimalstreatedwithpolyethylene-glycolconjugatedproteins,Toxicologicalsciences,42(1998)152-157.Beranova,M.,Wasserbauer,R.，Vancurova,D.，Sti付er,M.，Ocenaskova'丄，Mora,M.，Biomaterials，11(2000)521-524.ChengT，Wu,M.，Wu，P.，Chern，J，Ro付er,SR"Acceleratedclearanceofpolyethyleneglycolmodifiedproteinsbyanti-polyethyleneglycolIgM.Bioconjugatechemistry,10(1999)520-528.ChristWJ,AsanoO，RobidouxAl_,PerezM，WangYA,DubucGR，GavinWE，HawkinsLD，McGuinnessPD'MullarkeyMA,LewisMD，KishiY，KawataT'BristolJR，RoseJR，RossignolDP,KobayashiS，HishinumaL,KimuraA，AsakawaN,KatayamaK，YamatsuI:E5531,apureendotoxinantagonistofhighpotency.Science,268(1995)80~83.Convers,C.D,，Lejeune，L.,Shum，K.，Gilbert,C.,Shorr，R.G丄.，Physiologicaleffectofpolyethyleneglycolconjugationonstroma-freebovinehemoglobininthe:consciousdogafterpartialexchangetransfusion,Artificialorgan,21(1997)369-378.Gregoriadis，G，Spotlight:LipoxenpicTheDrugandVaccineDeliveryCompany,Controlledreleasesocietynewsletter,23(2)(2006>9-10.Hreczuk-Hirst，D.'Jain，S.,Genkin，D.,Laing,P.，Gregoriadis,G.'Preparationandpropertiesofpolysialylatedinterferon-a-2b，AAPSAnnualMeeting,2002，Toronto,Canada,M1056Hunter,A.C，Moghimi,S.M.，Therapeuticsyntheticpolymers',agameofRussianRoulette.DrugDiscoveryToday,7(2002)998-1001.Jain,S.，Hirst,D..H.，McCormack,B.，Mital，M.,Epenetos,A.，Laing，P.，Gregoriadis,G.，Polysialylatedinsulin:synthesis,characterizationandbiologicalactivityinvivo，Biochemicaet.BbphysicaActa,1622(2003)42-49.Jain，S"Hirst,D.H.，Lain'g，P.，Gregoriadis,G.，Polysialylation:Thenaturalwaytoimprovethestabilityandpharmacokineticsofproteinandpeptidedmgs，DrugDeliverySystemsandSciences,4(2)(2004)3-9.Jennings,H.丄，Lugowski，C.，lmmunogenicityofgroupsA，B，andCmeningococalpolysaccharidetetanustoxoidconjugates,JournalofImmunology,127(1981)1011-1018.Kluger，M丄，et.al.，(1985).PolymyxinBusedoesnotensureendotoxirvfreesolution.丄lmmunol.Meth.83:201-7.Moe,D.andGranoff，GInfect.Immun.2005，73(4)2123-2128Muklenholfet.al.,(1988)Curr.Opin.Struct.Bio.8，558-564Poth，J.，Rutisha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