專利名稱：葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯及制法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及藥用高分子葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基
氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA)的制法及其應用，屬嵌段共聚物。
背景技術：
納米粒為固態(tài)膠體顆粒，粒徑為l 1000nm，其具有小尺寸效應、量子尺寸效應、表面效應以及宏觀量子隧道效應等特性，可以被組織及細胞吸收，從而使其可能成為優(yōu)良的藥物傳遞系統(tǒng)。目前廣泛使用的低分子和大分子藥物存在各自缺點(l)低分子藥物通過口服或注射給藥，短時間內(nèi)體內(nèi)藥物濃度遠超過實際需求量，且缺乏進入人體的選擇性；新陳代謝快、半衰期短、體內(nèi)濃度很快降低而影響療效，故需要大劑量給藥，而過高的藥物濃度又會增強藥物的副作用；(2)生物大分子藥物在體內(nèi)易被酶降解或失活，生物半衰期短，需重復給藥；還收到如免疫系統(tǒng)、組織、細胞膜等的限制，多數(shù)不易通過這些生物屏障，因而大分子藥物的生物利用度較低。近年來，載藥納米粒作為新型的藥物傳遞和控制釋放系統(tǒng)，受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，它既能保護藥物免遭破壞，又與某些細胞組織有特殊親和性，能被器官組織的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所內(nèi)吞(吞噬、胞飲)或被細胞融合，集中于靶區(qū)并逐步釋放藥物。納米粒在藥學方面的研究應用具有非常突出的意義。
制備納米粒的材料較多，大致可分為聚合物和脂質(zhì)材料，前者制成的納米粒稱為聚合物納米粒(polymeric nanoparticles)，后者稱為固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles， SLN)。由于水溶性藥物的SLN包封率低，且生物大分子藥物SLN面臨胃腸環(huán)境因素的滅活，使得SLN的應用受到限制，而可降解的生物型材料為載體的聚合物納米粒受到越來越多的關注。
在過去的幾年里，將生物可降解的聚合物納米粒發(fā)展成為高效的藥物釋放體系引起了人們的廣泛興趣，其中以PLGA、 PLA、 PCL聚合物最為常用，其制備的載藥納米粒不僅保持了藥物活性，提高藥物穩(wěn)定性，降低毒性，還體現(xiàn)了顯著的緩釋效果，但事實上，血管內(nèi)注射納米粒一般難以主動作用于靶位，仍會從血管中迅速清除并被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取，對于與RES有關的疾病是有利的，但多數(shù)疾病并不在此系統(tǒng)中。因此研究如何減少RES攝入是研究者的關注的問題。最近研究趨勢是對納米粒載體修飾，聚乙二醇(PEG)有許多優(yōu)勢而且得到FDA批準可用于人體內(nèi)。有鑒于此，近年來，有大量關于將PEG作為親水組分引入納米粒載體的研究報道表明，親水性PEG修飾的納米粒，用于靜脈給藥時，血液清除和RES攝取顯著減小。并且PEG引入會影響納米粒的生物降解行為，調(diào)節(jié)釋藥方式。從藥物活性角度出發(fā)分析，這種由PEG形成微環(huán)境，也將有利于藥物在儲存和給藥過程中保持其活性。
PEG修飾的聚合物是其有目標的合成水溶性嵌段共聚物或接枝共聚物，使之同時具有親水性基團和疏水性基團，在水中溶解后自發(fā)形成高分子膠束(polymeric micelles),完成對藥物的增溶和包裹，因為具有親水性外殼及疏水性內(nèi)核，適合于攜帶不同性質(zhì)的藥物，使其與周圍介質(zhì)相隔離以免過快降解，并能在需要時釋放活性物質(zhì)，且其親水性的外殼還具備"隱形"的特點。另外，聚合物納米粒具有良好的貯藏穩(wěn)定性和生物相容性。近年來，將可生物降解的聚合物制成納米粒，這種聚合物的納米?？煽蒯屗幬?，避免藥物降解或泄漏，提高藥物穩(wěn)定性和療效，降低不良反應。藥物包入納米粒中能降低毒性的原因有兩點(l)藥物位于納米粒內(nèi)核，減少藥物與細胞的直接接觸，并且親水PEG外殼能減小納米粒之間及納米粒與細胞之間作用。(2)藥物從PEG修飾的共聚物納米粒中持續(xù)釋放的特性有利于細胞的存活。Peracchia等發(fā)現(xiàn)PHDCA經(jīng)PEG修飾后毒性降低。經(jīng)過納米粒培養(yǎng)，50%巨噬單核細胞存活，而沒有經(jīng)過PEG修飾的PHDCA納米粒培養(yǎng)，只有20%巨嗜單核細胞存活。這說明經(jīng)PEG修飾的共聚物納米粒更有利于降低細胞毒性。
大量文獻表明葉酸受體(FR)是一種通過聚糖磷脂酰肌醇(GPI)錨著于膜上的糖蛋白，對葉酸(folicacid， FA)具有高度親和力，在正常組織分布較少，而在90%以上的卵巢癌和許多上皮細胞及髓細胞來源的惡性腫瘤有過度表達。FR對葉酸偶聯(lián)的藥物同樣具有高度親和力，這為FR介導藥物靶向于腫瘤細胞的研究奠定了基礎。氰基丙烯酸酯類聚合物是國內(nèi)外廣泛應用的生物粘附劑，該類載體具有良好的生物相容性、可生物降解性等特點，該類載體納米粒的主要優(yōu)點有緩釋、降低藥物毒性、防止藥物降解、增加藥物對生物膜的通透性、延長藥物半衰期等。PEG-PHDCA本身為 一 長循環(huán)輔料，通過調(diào)整FA的比例可以得到不同外表面FA覆蓋率的聚合物，而使得最終產(chǎn)物即具有主動靶向性又具有長循環(huán)被動靶向性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類葉酸(FA)偶聯(lián)的聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)(簡稱FA-PEG-PHDCA)的合成及其應用。這類聚合物在水中能自組裝成納米?；蚰z東，其中疏水性的烷基段聚集成核，親水性的聚乙二醇段形成親水殼；同時，該聚合物由于其優(yōu)良的表面活性和葉酸的腫瘤靶向性還可以應用于修飾固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì)體、亞微乳等納米微粒制劑。
本發(fā)明的FA-PEG-PHDCA共聚物具有式(1)所示結構，其分子量為1. Ox 103-1. Ox 1()6;PEG含量為1-98% )式中Q和K是0或N原子，x， m， n4為正整數(shù)。x范圍為1-1000, m范圍ij 1-1000000000， n范圍為1-1000000000。<formula>formula see original document page 6</formula>
(1)
制備FA-PEG-PHDCA共聚物所用的PEG具有式(11)、 (III)、 (IV) 所示結構
<formula>formula see original document page 6</formula> (iv)
(其分子量為1.0xl02-1.0xl06)式中n均為正整數(shù)。
以上述PEG、十六醇、氰基乙酸、葉酸為合成材料，葉酸-聚乙二醇 fe基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯由上述PEG和十六醇分別與氰基乙酸脫水縮合而成。將得到的聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯(摩
爾比l: 1-1: 100)在甲醛及二甲胺存在下，通過Michael加成反應后，得 到的粗品用二氯甲烷反復萃取，有機相用無水硫酸鎂或無水硫酸鈉干燥, 過濾，濾液減壓濃縮至粘稠狀，室溫減壓放置固化，得到淡黃色葉酸-聚 乙二醇-聚烷基氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA )純品。
將FA-PEG-PHDCA溶于一定體積的有機溶劑(氯仿、二氯甲烷、丙 酮、四氫呋喃之一或任意組合物)中，在攪拌下滴加入含有0.01-50%乳 化劑(磷脂類、脂肪酸山梨坦類、聚山梨酯類、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚 物類、聚氧乙烯脂肪酸酯類、聚氧乙烯脂肪醇醚類及其任意組合)，攪拌 揮發(fā)除去有機溶劑，得到納米?；蚰z束水分散體。粒徑5-1000nm。
本發(fā)明的聚合物可用于血管內(nèi)給藥、肌肉注射給藥和口服給藥，適用 于水溶性和水不溶性的藥物同時可以應用于修飾固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì) 體、亞微乳等納米微粒制劑。
本發(fā)明為葉酸偶聯(lián)的新型兩親性輔料——葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基 氰基丙烯酸酯(FA-PEG-PHDCA)。該聚合物具有親油端，因而能夠容易 的與脂質(zhì)納米?；蚪Y構脂質(zhì)載體等疏水性粒子結合，而其同時具有親水 端，這使得連接在其之上的靶向基團——葉酸能夠被暴露在納米粒的最 外層，發(fā)揮最大的靶向作用；FA-PEG-PHDCA是一個比較理想的載體材 料，其主要特點是聚合度可控，毒性更小，降解速度慢；由于PEG鏈具 有親水性、柔性的特點賦予了共聚物納米粒的長循環(huán)特點；由于FA基團 的腫瘤趨向性使聚合物具有腫瘤耙向性，從而改變了被包載藥物的體內(nèi) 藥動學行為。本聚合物可用于血管內(nèi)給藥、肌肉注射給藥和口服給藥， 適用于水溶性和水不溶性的藥物。本發(fā)明制備方法工藝成熟，適于大規(guī) 模連續(xù)生產(chǎn)。


圖l葉酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯紅外光譜 圖2葉酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯核磁共振'H譜 圖3葉酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯核磁共振13C譜 圖4實施例1中以葉酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯制備的納米 粒粒徑
圖5實施例2中以葉酸-聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酸酯制備的納米 粒粒徑
具體實施例方式
下面再以實施例對本發(fā)明加以進一步的說明。 實施例1:
葉酸-聚乙二醇氰乙酸酯的合成單氨聚乙二醇5000 6mmo1和氰乙酸 12mmo1置250ml三頸瓶中，加入二氯甲烷50ml，超聲溶解。攪拌下加入 縮合劑DCC 12mmol及少量DMAP,通入氮氣條件下室溫攪拌12h。加入正 己烷30ml，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌(15ml x 3),合并濾液及洗液， 減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化得淡黃色蠟狀固體，加入葉酸6mmo1,加入二氯甲烷50ml。攪拌下加入縮合劑DCC 12mmol及少量DMAP,通入氮 氣條件下室溫攪拌12h。加入正己烷30ml，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌 (15ml x 3)，合并濾液及洗液，減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化得淡黃 色蠟狀固體。
十六烷基氰乙酸酯的合成用十六醇5. 5mmo1和氰乙酸llmmol投料， 操作同上，得到乳白色固體。
FA-PEG-PHDCA聚合物的合成精密稱取十六烷基氰乙酸酯6憩o1,加 入葉酸-聚乙二醇氰乙酸酯2mmo1,加入乙醇-二氯甲烷(l : 1)混合溶液 60ml，超聲溶解。加入37%甲醛溶液20mmol及33%二甲胺溶液20,ol， 氮氣保護下室溫反應12h。減壓濃縮，剩佘物傾入水中，用二氯甲烷萃取 (15ml x 3)，有機相用無水硫鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至粘稠狀， 室溫減壓下放置固化，得淡黃色蠟狀固體聚合物。
納米粒的制備將FA-PEG-PHDCA 200mg溶于2ml 二氯甲烷中，在攪 拌下滴加入含有1% poloxamer188的水中，攪拌揮發(fā)除去有機溶劑，得 到納米粒水分散體。粒徑129nra。
實施例2:
葉酸-聚乙二醇氰乙酸酯的合成聚乙二醇2000 6mmo1和氰乙酸 12mmol置250ml三頸瓶中，加入二氯甲烷50ml，超聲溶解。攪拌下加入 縮合劑DCC 12咖o1及少量DMAP,通入氮氣條件下室溫攪拌12h。加入正 己烷30ml，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌(15ml x 3),合并濾液及洗液， 減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化得淡黃色蠟狀固體，加入葉酸6mmo1,加 入二氯甲烷50ml。攪拌下加入縮合劑DCC 12mmol及少量DMAP，通入氮 氣條件下室溫攪拌12h。加入正己烷30ml，過濾，濾餅用二氯甲烷洗滌 (15ml x 3)，合并濾液及洗液，減壓濃縮至粘稠狀，室溫下固化得淡黃 色蠟狀固體。
十六烷基氰乙酸酯的合成用十六醇5. 5mmo1和氰乙酸ll隨ol投料， 操作同上，得到乳白色固體。
FA-PEG-PHDCA聚合物的合成精密稱取十六烷基氰乙酸酯3mmo1,加 入葉酸-聚乙二醇氰乙酸酯3咖o1，加入乙醇-二氯甲烷(l : 1)混合溶液 60nil,超聲溶解。加入37%甲醛溶液20mmol及33%二甲胺溶液20mmol, 氮氣保護下室溫反應12h。減壓濃縮，剩余物傾入水中，用二氯甲烷萃取 (15ml x 3),有機相用無水硫鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至粘稠狀， 室溫減壓下放置固化，得淡黃色蠟狀固體聚合物。
修飾固體脂質(zhì)納米粒將單硬脂酸甘油酯300mg、 FA-PEG-PHDCA 60mg 溶解于2mL乙醇中，微熱形成有機相。另取處方量的大豆磷脂50mg和 tween-80 10mg溶于約8mL水中，構成水相。在高速攪拌(1 OOOr. min—1) 下將有機相用針頭注入水相中，整個過程保持溫度75土2。C，濃縮體積至 原來的約1/2。將所得的半透明體系快速混于另一 0-2'C的lOmL水相中， 繼續(xù)攪拌2小時，0. 8pm微孔濾膜過濾，即得FA-PEG-PHDCA修飾的固體 脂質(zhì)納米粒。粒徑126nm。
權利要求
1、一種葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于這類聚合物具有式(I)所示的結構其分子量為1.0×103-1.0×106；PEG含量為1-98％，式中Q和K是O或N原子，x，m，n均為正整數(shù)，x范圍為1-1000，m范圍為1-1000000000，n范圍為1-1000000000。
2、根據(jù)權利要求1所述的葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于所述的聚乙二醇具有式(11)、 (III)、 (IV)所示結構其分子量為1.0xl02-1.0xl06，式中n均為正整數(shù)。
3、 一種制備權利要求1所述的葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯的方法，其特征在于以PEG、十六醇、氰基乙酸、葉酸為合成材料，通過如下方法制備(1) 葉酸-聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯由PEG和十六醇分別與氰基乙酸脫水縮合而成；(2) 將得到的摩爾比為1: 1-1: 100的聚乙二醇氰基乙酸酯和十六烷基氰基乙酸酯在甲醛及二甲胺存在下，通過Michael加成反應；(3) 將步驟(2)得到的粗品用二氯甲烷反復萃取，有機相用無水硫酸鎂或無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至粘稠狀，室溫減壓放置固化，得到淡黃色葉酸-聚乙二醇-聚烷基氰基丙烯酸酯純品。
4、 根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述的甲醛及二甲胺為偶聯(lián)劑。
5、 根據(jù)權利要求1所述的葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于該聚合物能夠在水中自組裝形成納米?；蚰z東；將葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯溶于一定體積的有機溶劑中，在攪拌下滴加入含有0.01-50%乳化劑，攪拌揮發(fā)除去有機溶劑，得到納米?；蚰z東水分散體，粒徑5-1000nm。
6、 根據(jù)權利要求5所述的葉酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于所述的有機溶劑為氯仿、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃中的一種或任意組合物；所述的乳化劑為磷脂類、脂肪酸山梨坦類、聚山梨酯類、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物類、聚氧乙烯脂肪酸酯類、聚氧乙烯脂肪醇醚類及其任意組合。
7、 根據(jù)權利要求l所述的酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于該聚合物可用于血管內(nèi)給藥、肌肉注射給藥和口服給藥，適用于水溶性和水不溶性的藥物。
8、 根據(jù)權利要求l所述的酸偶聯(lián)聚乙二醇聚烷基氰基丙烯酸酯，其特征在于該聚合物用于修飾固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì)體、亞微乳等納米微粒制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類葉酸(FA)偶聯(lián)的聚乙二醇聚氰基丙烯酸酯(PEG-PHDCA)(簡稱FA-PEG-PHDCA)的合成及其應用。這類聚合物是以葉酸-聚乙二醇氰基乙酸酯和烷基氰乙酸酯在甲醛及二甲胺存在下，通過Michael加成反應得到的兩親性嵌段共聚物。這類聚合物在水中能自組裝成納米?；蚰z束，其中疏水性的烷基段聚集成核，親水性的聚乙二醇段形成親水殼；同時，該聚合物由于其優(yōu)良的表面活性和葉酸的腫瘤靶向性還可以應用于修飾固體脂質(zhì)納米粒、脂質(zhì)體、亞微乳等納米微粒制劑。本聚合物可用于血管內(nèi)給藥、肌肉注射給藥和口服給藥，適用于水溶性和水不溶性的藥物。本發(fā)明制備方法工藝成熟，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號C08G65/00GK101684177SQ20091001174
公開日2010年3月31日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權日2009年5月27日
發(fā)明者翔 李, 潘衛(wèi)三, 王東凱, 邱立朋 申請人:沈陽藥科大學