專利名稱：快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及將多硫酸軟骨素從肝素鈉中分離出去的方法。
背景技術(shù)：
肝素鈉來源于豬小腸粘膜，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖，是典型的抗凝血藥，能阻止血液的凝結(jié)過程，防止血栓的形成。因?yàn)楦嗡剽c在α-球蛋白參與下，能抑制凝血酶 原轉(zhuǎn)變成凝血酶。肝素鈉還具有澄清血漿脂質(zhì)，降低膽固醇和增強(qiáng)抗癌藥物的效用等作用。 臨床廣泛用作外科手術(shù)前后防止血栓形成和栓塞，輸血時(shí)預(yù)防血液凝固和作為保存新鮮血 液的抗凝劑，廣泛用于預(yù)防血栓疾病、治療心機(jī)梗塞和腎病患者的滲血治療，還可以用于清 除小兒腎病形成的尿毒癥。肝素軟膏在皮膚病的治療與化妝美容中也廣泛應(yīng)用。我國是肝 素鈉產(chǎn)量最大的國家，國際市場的肝素鈉產(chǎn)品原料70%以上均來自中國。隨著需求的增加， 肝素鈉的價(jià)格這幾年一路攀升，因此有些肝素鈉中被人為的加入多硫酸軟骨素。多硫酸軟 骨素是一種類肝素物質(zhì)，具有與肝素鈉一樣的抗凝血性質(zhì)，其結(jié)構(gòu)性質(zhì)與肝素鈉基本相似， 經(jīng)檢測與肝素鈉的區(qū)別在于1、肝素鈉是右旋結(jié)構(gòu)，多硫酸軟骨素是左旋結(jié)構(gòu)；2、多硫酸 軟骨素的絕對分子量比肝素鈉的大；3、核磁檢測其峰值比肝素鈉后出現(xiàn)。2008年2月，美國因注射肝素鈉出現(xiàn)4例死亡，多例不良反應(yīng)的醫(yī)療事故，成為震 驚世界的“肝素鈉事件”。經(jīng)有關(guān)專家分析，上述事故可能是因?yàn)楦嗡剽c中含有多硫酸軟骨 素有關(guān)聯(lián)。我國政府十分重視并關(guān)注事態(tài)發(fā)展，國家藥監(jiān)局召開專門會議，要求加強(qiáng)管理， 一律召回含有多硫酸軟骨素的肝素鈉。從肝素鈉中分離多硫酸軟骨素，迄今為止，除了有機(jī)溶劑萃取分離法外，未見其它 有關(guān)分離技術(shù)的報(bào)道。而有機(jī)溶劑萃取分離法存在以下缺陷一是由于多硫酸軟骨素與肝 素鈉同屬多糖類物質(zhì)，對乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的溶解性非常低，因此有機(jī)溶劑萃取法分離 效果不好，特別是肝素鈉中多硫酸軟骨素較高時(shí)分離效果更不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方 法，利用多硫酸軟骨素的絕對分子量比肝素鈉大的特點(diǎn)，在酒精中多硫酸軟骨素比肝素鈉 沉淀快，而肝素鈉仍然留在上清酒精中，從而實(shí)現(xiàn)多硫酸軟骨素與肝素鈉的分離。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方法，包括下列步驟(1)溶解在攪拌狀態(tài)下，將粗品肝素鈉加入反應(yīng)釜內(nèi)的水中，粗品肝素鈉與水的 重量比為1 9-20，升溫至55°C 士5°C，攪拌4-6小時(shí)，使肝素鈉完全溶解；(2)過濾過濾，收集濾液。(3)樹脂吸附將濾液泵入處理好的吸附柱，流出的液體循環(huán)泵入吸附；(4)清洗待流出液效價(jià)檢測恒定后，停止吸附；用水清洗干凈樹脂；再用3-5倍 樹脂體積的1. 0-1. 5mol/L鹽水清洗樹脂；
(5)洗脫配制2-3倍樹脂體積的3-4mol/L鹽水洗脫樹脂，收集洗脫液；(6) 一次醇沉將洗脫液泵入醇沉罐，按體積的1-1. 5倍加入重量濃度為95%、或95%以上的酒精，攪拌約半小時(shí)，靜置約12小時(shí)，收集肝素鈉沉淀；(7)氧化將肝素鈉沉淀按10000-20000IU/L溶解于0. 5-0. 7mol/L氯化鈉溶液 中，用堿調(diào)PH10-12，再按體積的2-3%加入雙氧水，在30-40°C下，氧化8-12小時(shí)；(8)快速沉淀氧化結(jié)束后，降溫至10-20°C，將PH調(diào)至5-6，澄清過濾，收集濾液； 攪拌下緩慢加入酒精至溶液中酒精的重量濃度為30-38%，再攪拌30分鐘，靜置；用攪拌棒 試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀罐，收集沉淀；再靜置，用攪 拌棒試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀罐，再收集沉淀物；如 此重復(fù)，直至連續(xù)靜止4小時(shí)罐底沒有沉淀，再向溶液中補(bǔ)加酒精至溶液中酒精的重量濃 度為45-50%，靜止沉淀10-12小時(shí)，將肝素鈉完全沉淀；分別將每次收集的沉淀物送檢測，不含多硫酸軟骨素的沉淀物合并后進(jìn)入下一工 序；(9)脫水烘干將步驟⑶的沉淀物加入酒精中，攪拌搗碎，溶液中的酒精重量濃 度在85%以上，靜止12小時(shí)，真空抽濾，得到的固體物在70-80°C真空干燥，即得到不含多 硫酸軟骨素的肝素鈉。步驟(8)所述的將沉淀物取樣烘干檢測，吸光度0D260應(yīng)小于0. 1，若不合格，應(yīng)重 復(fù)氧化和快速沉淀這兩道工序過程，如合格才能進(jìn)入下一工序。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明采用離子交換法去除大量雜質(zhì)，結(jié)合雙氧水氧化法，大大提高肝素鈉的色 澤、效價(jià)，再用酒精快速沉淀法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素，保證肝素鈉的收率達(dá)到85% 以上，效價(jià)在180u/mg以上，各項(xiàng)指標(biāo)完全符合USP、EP標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明快速沉淀法分離多硫酸軟骨素比報(bào)道的丙酮萃取法效果更加顯著，因?yàn)槎?硫酸軟骨素與肝素鈉同屬多糖類物質(zhì)，對乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的溶解性非常低，因此有機(jī) 溶劑萃取法分離效果不好，特別是肝素鈉中多硫酸軟骨素較高時(shí)分離效果更不明顯。而快 速沉淀法是根據(jù)多硫酸軟骨素絕對分子量比肝素鈉大、結(jié)構(gòu)上又有差異等特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，本 發(fā)明操作簡單、分離效果顯著。經(jīng)分離后的肝素鈉符合注射級肝素鈉原料質(zhì)量要求。


圖1為分離前含有多硫酸軟骨素的肝素鈉核磁圖譜；圖2為分離后的肝素鈉核磁圖譜；圖3為多硫酸軟骨素核磁圖譜。圖1中峰①為肝素鈉，峰②為多硫酸軟骨素峰③為硫酸皮膚素。圖2中峰①為肝 素鈉。圖3中峰②為多硫酸軟骨素。如圖1所示，沒有分離前含多硫酸軟骨素的肝素鈉核磁圖譜中，多硫酸軟骨素峰 非常明顯，顯示含量較高。如圖2所示，分離后的肝素鈉核磁圖譜中，已沒有圖1、圖3所示 的相應(yīng)峰值位置的峰，說明本發(fā)明的快速沉淀法不僅能夠分離除去肝素鈉中的多硫酸軟骨 素，而且除去了其他雜質(zhì)。
具體實(shí)施例方式(1)溶解開啟水閥，向反應(yīng)釜內(nèi)加入1500L飲用水，邊攪拌邊將150億總效價(jià)粗品肝素鈉(粗品肝素鈉效價(jià)為100IU/毫克，粗品肝素鈉與水的重量比為1 10)加入反應(yīng) 釜中，開啟蒸汽，升溫至55°c 士5°C，攪拌5小時(shí)，使肝素鈉完全溶解；(2)過濾100目濾網(wǎng)過濾，少量水清洗濾渣，收集濾液和洗液(兩者合并)；(3)樹脂吸附將濾液泵入處理好的共有3000L陰離子交換樹脂吸附柱，控制流速 50L/h，流出液接入桶內(nèi)循環(huán)泵入吸附24小時(shí)；(4)清洗待流出液效價(jià)檢測恒定后，停止吸附。吸附殘液排空。用水清洗干凈樹 月旨，再配制10000L1. Omol/L鹽水清洗樹脂；(5)洗脫配制10000L的3mol/L鹽水洗脫樹脂，洗脫液收集；(6) 一次醇沉將洗脫液泵入醇沉罐，加入12000L重量濃度為95%的酒精，攪拌半 小時(shí)，靜置12小時(shí)，收集肝素鈉沉淀；(7)氧化將肝素鈉沉淀加入3000L飲用水中，攪拌使其溶解完全，接著加入氯化 鈉lOOKg，混合均勻后用重量濃度為20%的氫氧化鈉調(diào)PH至11，再加入重量濃度為20%的 雙氧水80L，并保持在35°C的溫度下，氧化10小時(shí)；(8)快速沉淀氧化結(jié)束后，降溫至15°C，用鹽酸將PH調(diào)至5. 5，澄清過濾，收集濾 液；攪拌下緩慢加入重量濃度為95%的酒精，使溶液中酒精的重量濃度為35%，再攪拌30 分鐘，靜置；用攪拌棒試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀罐，收 集沉淀；再靜置，用攪拌棒試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀 罐，再收集沉淀物；如此重復(fù)，直至連續(xù)靜止4小時(shí)罐底沒有沉淀，再向溶液中補(bǔ)加重量濃 度為95%的酒精至溶液中酒精的重量濃度為47%，靜止沉淀11小時(shí)，將肝素鈉完全沉淀； 分別將每次收集的沉淀物送QA檢測，不含多硫酸軟骨素的沉淀物合并后進(jìn)入下一工序；(9)脫水烘干將步驟(8)的沉淀物加入酒精中，攪拌搗碎，溶液中的酒精重量濃 度在85%以上，靜止12小時(shí)，真空抽濾，得到的固體物在55°C真空干燥，得到不含多硫酸軟 骨素的肝素鈉72. 8Kg，效價(jià)180IU/mg，其它指標(biāo)均符合美國藥典、歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)。(10)粉碎包裝將步驟(9)的產(chǎn)品取出，進(jìn)行120目粉碎，并稱重包裝，同時(shí)取樣 送檢。
權(quán)利要求
快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方法，其特征在于包括下列步驟(1)溶解在攪拌狀態(tài)下，將粗品肝素鈉加入反應(yīng)釜內(nèi)的水中，升溫至55℃±5℃，攪拌4-6小時(shí)，使肝素鈉完全溶解；(2)過濾過濾，收集濾液。(3)樹脂吸附將濾液泵入處理好的吸附柱，流出的液體循環(huán)泵入吸附；(4)清洗待流出液效價(jià)檢測恒定后，停止吸附；用水清洗干凈樹脂；再用3-5倍樹脂體積的1.0-1.5mol/L鹽水清洗樹脂；(5)洗脫配制2-3倍樹脂體積的3-4mol/L鹽水洗脫樹脂，收集洗脫液；(6)一次醇沉將洗脫液泵入醇沉罐，按體積的1-1.5倍加入重量濃度為95％、或95％以上的酒精，攪拌半小時(shí)，靜置12小時(shí)，收集肝素鈉沉淀；(7)氧化將肝素鈉沉淀按10000-20000IU/L溶解于0.5-0.7mol/L氯化鈉溶液中，用堿調(diào)PH10-12，再按體積的2-3％加入雙氧水，在30-40℃下，氧化8-12小時(shí)；(8)快速沉淀氧化結(jié)束后，降溫至10-20℃，將PH調(diào)至5-6，澄清過濾，收集濾液；攪拌下緩慢加入酒精至溶液中酒精的重量濃度為30-38％，再攪拌30分鐘，靜置；用攪拌棒試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀罐，收集沉淀；再靜置，用攪拌棒試探罐底，只要有沉淀沉底，即可以將上層酒精轉(zhuǎn)移至另一沉淀罐，再收集沉淀物；如此重復(fù)，直至連續(xù)靜止4小時(shí)罐底沒有沉淀，再向溶液中補(bǔ)加酒精至溶液中酒精的重量濃度為45-50％，靜止沉淀10-12小時(shí)，將肝素鈉完全沉淀；分別將每次收集的沉淀物送檢測，不含多硫酸軟骨素的沉淀物合并后進(jìn)入下一工序；(9)脫水烘干將步驟(8)的沉淀物加入酒精中，攪拌搗碎，溶液中的酒精重量濃度在85％以上，靜止12小時(shí)，真空抽濾，得到的固體物在70-80℃真空干燥，即得到不含多硫酸軟骨素的肝素鈉。
2.如權(quán)利要求1所述的快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方法，其特征在于步 驟(3)所述的樹脂為陰離子交換樹脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了快速沉淀分離肝素鈉中多硫酸軟骨素的方法，本發(fā)明采用離子交換法去除大量雜質(zhì)，結(jié)合雙氧水氧化法，大大提高肝素鈉的色澤、效價(jià)，再用酒精快速沉淀法分離肝素鈉中的多硫酸軟骨素，保證肝素鈉的收率達(dá)到85％以上，效價(jià)在180u/mg以上，各項(xiàng)指標(biāo)完全符合USP、EP標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明比報(bào)道的丙酮萃取法效果更加顯著，因?yàn)槎嗔蛩彳浌撬嘏c肝素鈉同屬多糖類物質(zhì)，對乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的溶解性非常低，因此有機(jī)溶劑萃取法分離效果不好，特別是肝素鈉中多硫酸軟骨素較高時(shí)分離效果更不明顯。而快速沉淀法是根據(jù)多硫酸軟骨素絕對分子量比肝素鈉大、結(jié)構(gòu)上又有差異等特點(diǎn)設(shè)計(jì)的，本發(fā)明操作簡單、分離效果顯著。
文檔編號C08B37/10GK101824098SQ20101011206
公開日2010年9月8日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者劉榜惠, 張志斌, 袁紅英 申請人:淮安麥德森化學(xué)有限公司