專利名稱：一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸分子具有良好的保濕性和黏彈性 ，因而廣泛應(yīng)用于各種化妝品、保健品 眼科手術(shù)、關(guān)節(jié)注射、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、調(diào)節(jié)血管壁的通透性、醫(yī)用整形材料和保健品等方面， 本世紀(jì)90年代中期以來，國際市場透明質(zhì)酸銷量逐漸上升，目前全球藥用透明質(zhì)酸總銷售 額為4. 2-5. 5億美元，到2010年肯定會超過10億美元。目前國內(nèi)研究水平低下，生產(chǎn)能力 僅為10噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場的需求。目前國內(nèi)大部分微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的企業(yè)采用的工藝發(fā)酵周期長，一般 在36-40左右，產(chǎn)物分子量低，產(chǎn)品透光率差(一般在90%左右)，蛋白質(zhì)含量高，其成品葡 萄糖醛酸含量一般為35-38%，部分廠家透明質(zhì)酸產(chǎn)品形態(tài)為纖維狀，此種透明質(zhì)酸溶解困 難，一般要2天左右，且收率低于75%，為了滿足國內(nèi)不斷擴(kuò)大的需求市場，透明質(zhì)酸的生 產(chǎn)工藝亟待改善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種發(fā)酵周期短、產(chǎn)品溶解性高、成 本低的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其步驟包括(1)搖瓶種子液、(2)種子罐 種子液、(3)發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，還包括以下步驟(4)發(fā)酵液的萃取提純將發(fā)酵液經(jīng)板框過濾后得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液 沉淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行二次板框過濾至澄清，得 到二次澄清液，將二次澄清液經(jīng)0. 3-0. 5微米的濾膜或?yàn)V板過濾后，加入乙酸調(diào)節(jié)pH至 4. 0-5. 0，得到酸處理后的三次澄清液，再用乙醇溶液噴淋三次澄清液，再進(jìn)行沉淀，得到沉 淀物；(5)干燥制粉將上述步驟得到的全部沉淀物經(jīng)無水乙醇脫水后，用乳化泵進(jìn)行 乳化制粉，得粉狀沉淀，進(jìn)一步用無水乙醇脫水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以 下，即得透明質(zhì)酸。而且，所述板框過濾使用的硅藻土的型號為821號和616號。而且，所述821號和616號硅藻土的重量比例為1 1_5。而且，所述乙醇溶液的濃度為95% (ν/ν) 0而且，所述Nacl溶液的濃度為0. lmol/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明采用復(fù)合誘變技術(shù)篩選出莢膜大，透明質(zhì)酸產(chǎn)率高，不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的 菌種的生產(chǎn)菌種，該菌種對發(fā)酵原料適應(yīng)性強(qiáng)，透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率高，可達(dá)到6-7g/L，其回收率高達(dá)92%，其發(fā)酵時間僅為24-26小時，有效節(jié)省能耗。2、本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的噴淋制粉技術(shù)，使產(chǎn)品結(jié)構(gòu)形態(tài)更加細(xì)膩，使用性能更加優(yōu) 越，溶解性更好，其透光率達(dá)到99 %。3、本發(fā)明產(chǎn)品的提純過程采用板框過濾和微孔濾板過濾技術(shù)，替代活性炭吸附和 CPC吸附等復(fù)雜過程，使生產(chǎn)操作更加簡便。4、本發(fā)明采用酸化乙醇噴淋制粉技術(shù)，制成的產(chǎn)品為粉末狀，比絮狀易于溶解。5、本發(fā)明能夠?qū)⑼该髻|(zhì)酸開發(fā)成食品級、化妝品級以及醫(yī)用級產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明使用的發(fā)酵菌種屬于外來菌種，菌種分類是獸疫鏈球菌。一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其工藝過程如下(1)搖瓶種子液將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液400ml的IL錐形瓶中，37°C 培養(yǎng)12-16小時，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染，即可接種于種子罐中；(2)種子罐種子液按搖瓶種子液的配方配制培養(yǎng)液60L，加入種子罐中，通蒸汽 加熱，121°C滅菌30分鐘，冷卻至37°C，用火焰法接種，將搖瓶種子液接種于種子罐中，通氣 量60L/min，攪拌轉(zhuǎn)速120-140/min，37°C培養(yǎng)12-16小時，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌 污染，即可接種于發(fā)酵罐中；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按種子罐的配方，把糖的用量提高到6%，配制培養(yǎng)液600L，加入1 噸的發(fā)酵罐中，通蒸汽加熱，121°C滅菌30分鐘，冷卻至37°C，將種子液通過移種管道接種 于發(fā)酵罐中，維持通氣量400-600L/min，攪拌轉(zhuǎn)速140-160/min，37°C培養(yǎng)24-26小時，發(fā)酵 過程中，糖的濃度下降至0.5%以下，PH下降很慢或不再下降時，即為發(fā)酵終點(diǎn)，得到含有 透明質(zhì)酸發(fā)酵液；(以上3個步驟在馬朝梅(廣西柳州化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司)，發(fā)酵法生 產(chǎn)透明質(zhì)酸工藝研究，廣西工學(xué)院學(xué)報，2007，18 (3) 8-12中有報道，屬于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā) 明申請就不再更加詳細(xì)描述)，本發(fā)明申請還包括(4)發(fā)酵液的萃取提純將發(fā)酵液經(jīng)板框過濾后得濾液，加入3倍的95%乙醇沉 淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的0. lmol/L的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行二次板框過濾 至澄清，得到二次澄清液；將二次澄清液經(jīng)0. 45微米的濾膜或?yàn)V板過濾后，加入乙酸調(diào)節(jié) pH至4. 0-5. 0，得到酸處理后的三次澄清液，再用95%乙醇噴淋三次澄清液，再進(jìn)行沉淀， 得到沉淀物；板框過濾的硅藻土的型號為821號和616號，將兩種硅藻土按比例混合，得到后裝 入板框進(jìn)行過濾，821號和616號硅藻土的重量比例為1 1-5。(5)干燥制粉將得到的全部沉淀物經(jīng)無水乙醇脫水后，用乳化泵進(jìn)行乳化制粉， 得粉狀沉淀，進(jìn)一步用無水乙醇脫水后，50-60°C真空干燥后，含水控制在10%以下，即得透 明質(zhì)酸。經(jīng)本發(fā)明得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率高，可達(dá)到6_7g/L，其回收率為92%。產(chǎn)品性能指標(biāo)性狀白色粉末或細(xì)小顆粒；
氣味無臭無味；pH(lg/L) 6.5-7.0;澄清度(lg/L)透光率> 99% ；干燥失重<10%;分子量>1. 8X106 ；蛋白質(zhì)<0.05%; 葡萄糖醛酸彡44%;鉛<20mg/kg;石申<2mg/kg ；細(xì)菌總數(shù)<10個/克；糞大腸菌群不得檢出；金黃色葡萄球菌不得檢出；綠膿桿菌不得檢出。
權(quán)利要求
一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其步驟包括(1)搖瓶種子液、(2)種子罐種子液、(3)發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，其特征在于還包括以下步驟(4)發(fā)酵液的萃取提純將發(fā)酵液經(jīng)板框過濾后得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液沉淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行二次板框過濾至澄清，得到二次澄清液，將二次澄清液經(jīng)0.3-0.5微米的濾膜或?yàn)V板過濾后，加入乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，得到酸處理后的三次澄清液，再用乙醇溶液噴淋三次澄清液，再進(jìn)行沉淀，得到沉淀物；(5)干燥制粉將上述步驟得到的全部沉淀物經(jīng)無水乙醇脫水后，用乳化泵進(jìn)行乳化制粉，得粉狀沉淀，進(jìn)一步用無水乙醇脫水后，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明質(zhì)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于所述 板框過濾使用的硅藻土的型號為821號和616號。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于所述 821號和616號硅藻土的重量比例為1 1-5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于所述 乙醇溶液的濃度為95% (v/v)
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于所述 Nacl溶液的濃度為0. lmol/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，其步驟包括(1)搖瓶種子液、(2)種子罐種子液、(3)發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，還包括以下步驟(4)發(fā)酵液的萃取提純將發(fā)酵液用乙醇沉淀后，再次溶解得溶解液，經(jīng)二次板框過濾至澄清，再進(jìn)行三次過濾得澄清液，再用乙醇噴淋澄清液，得噴淋沉淀物；(5)干燥制粉將上述步驟得到的全部沉淀物經(jīng)無水乙醇脫水后，用乳化泵進(jìn)行乳化制粉，得粉狀沉淀，進(jìn)一步用無水乙醇脫水后，50-60℃真空干燥后，即得透明質(zhì)酸。本發(fā)明采用復(fù)合誘變技術(shù)篩選出莢膜大，透明質(zhì)酸產(chǎn)率高，不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的菌種的生產(chǎn)菌種，該菌種對發(fā)酵原料適應(yīng)性強(qiáng)，透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率高，可達(dá)到6-7g/L，其回收率高達(dá)92％，其發(fā)酵時間僅為24-26小時，有效節(jié)省能耗。
文檔編號C08B37/08GK101864471SQ20101030106
公開日2010年10月20日 申請日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者劉小兵 申請人:天津市康婷生物工程有限公司