專利名稱：一種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及糖胺聚糖，尤其是一種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法。
背景技術(shù)：
目前糖胺聚糖(GAG)的提取方法主要有三種第一非降解法，指用水或鹽溶液從動、植物組織中提取糖胺聚糖的方法；第二堿提取法，基于蛋白多糖中糖肽鍵對堿的不穩(wěn)定性，用堿提法使糖與蛋白質(zhì)分開；第三酶降解法，蛋白酶將蛋白聚糖的蛋白質(zhì)部分降解，使糖鏈得到分離，三種方法中以酶降解法效果最好，因其條件溫和，且符合目前節(jié)能減排的需要。然而，即使同屬于酶降解法，由于不同提取材料所含的糖胺聚糖的組成、含量和功能活性不同，提取方法有異，況且還需考慮到生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用。本發(fā)明選取渤海灣最常見的低
值貝類-泥螺為原材料，提取，分離，純化糖胺聚糖，以期為醫(yī)藥、保健品行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)
原材料，為海珍動物養(yǎng)殖提供優(yōu)良的免疫增強劑。通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下三篇與本專利申請相關(guān)的公開專利文獻(xiàn)1、本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)包括糖胺聚糖的組合物的方法(CN1021M032A)，所述的方法包括利用膜吸附器形式層析基質(zhì)將包括糖胺聚糖的動物材料勻漿進行層析。2、一種具有血管保護效應(yīng)的活性物質(zhì)——椅孔扇貝糖胺聚糖的提取制備方法(CN1746191)，其提取制備工藝如下將櫛孔扇貝內(nèi)臟團稱重，加水制成勻漿液，在勻漿液中加入蛋白酶，加熱反應(yīng)得酶解液；將酶解液在離心機中離心，棄去沉淀物，對離心液加二次乙醇溶液，形成沉淀；將分離后的沉淀物加蒸餾水配成水溶液后加熱并加入活性炭，冷卻后經(jīng)離心，收集上清液，對上清液抽濾，得清液；將清液用濾膜超濾，得分子量為證 IOOk的濾液；將濾液冷凍干燥即制得櫛孔扇貝糖胺聚糖。該方法操作簡單、反應(yīng)條件溫和、成本低廉、得率及純度高，在提取糖胺聚糖的同時還可大量回收蛋白質(zhì)，有利于櫛孔扇貝內(nèi)臟團的綜合利用，提取的物質(zhì)對于防治心臟血管性疾病有重要價值。3、一種玉足海參糖胺聚糖的提取方法(CN1016M426)，方法一、玉足海參粉與純化水混合，經(jīng)酶解和離心后得沉淀A ；二、沉淀A與純化水混合，經(jīng)加熱、和離心后得沉淀B ；三、沉淀B與純化水混合，離心取沉淀用純化水溶解，經(jīng)離心和洗滌得沉淀C ；四、 沉淀C與緩沖液混合，經(jīng)層析、洗滌、洗脫和離心后得沉淀D ；五、沉淀D與生理鹽水混合，經(jīng)離心后得沉淀E ；六、沉淀E與注射用水混合，透析或超濾截流后取固相產(chǎn)物，冷凍干燥后即得。本發(fā)明提取的玉足海參糖胺聚糖質(zhì)量純度高達(dá)93 % 99 %，能夠直接用于制備注射劑。通過比對，上述公開專利文獻(xiàn)的技術(shù)方案及提取客體均與本專利申請有本質(zhì)的不同，本專利申請具有新穎性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種從泥螺中提取高純度糖胺聚糖的方法，該方法的原料來源充足、提取成本低，為滿足醫(yī)藥、保健品行業(yè)及海珍動物養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用提供了可能。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的—種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，提取包括以下步驟(1)原料處理將泥螺去殼，軟體部分洗凈后，加入2-2. 5倍體積的蒸餾水勻漿，形成勻漿液；(2)酶解向上述勻漿液中加胰蛋白酶，在45°C水浴條件下酶解7-8小時，酶解液煮沸滅酶后，4000r/min離心lOmin，取上清液；(3)脫色加入雙氧水脫色；(4)調(diào)pH值去沉淀先用HCl調(diào)pH至2.0，離心除去沉淀；再用NaOH調(diào)pH至7. 0， 離心除去沉淀；(5)醇沉法提取粗糖胺聚糖上清液在不斷攪拌下緩緩加入乙醇至醇含量為 60%，于4°C條件下靜置M小時，移去上清液，4000r/min離心IOmin后回收粗糖胺聚糖；(6)超濾將粗糖胺聚糖溶于蒸餾水，配成糖液，4000r/min離心IOmin除去不溶物后進行超濾；(7)溶液絡(luò)合后解離加入3倍體積的5%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，40°C下沉淀1-2小時，8000r/min離心30min，收集沉淀，40°C下將沉淀溶于2mol/L的NaCl溶液， 使GAG-CTAB絡(luò)合物解離，形成解離液；(8)醇沉、超濾、再醇沉上述解離液加入乙醇，使醇量達(dá)60%，8000r/min離心 lOmin，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水，用中空纖維膜超濾，在超濾后的溶液中加入乙醇-乙酸鈉試劑，使醇量達(dá)60%，按醇沉法回收糖胺聚糖，將沉淀物烘干，即制得純泥螺糖胺聚糖。而且，所述步驟O)中胰蛋白酶的添加量為勻漿液總重量的0. 8_1%。而且，所述步驟(3)中雙氧水的添加量為上清液重量的6-8%。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是1、本方法反應(yīng)條件溫和、糖胺聚糖得率及純度高，與其他貝類的糖胺聚糖提取相比，工藝簡化，時間縮短。2、本方法采用泥螺作為提取客體，泥螺是渤海灣常見的低值貝類，原材料成本低， 而糖胺聚糖得率不降低，大大降低了提取成本。3、本方法在提取糖胺聚糖的同時還可大量回收蛋白質(zhì)，有利于泥螺的綜合利用， 所提取的糖胺聚糖對于清除自由基、抗氧化及抗凝血具有重要作用；所得的糖胺聚糖還可為海珍動物養(yǎng)殖業(yè)提供優(yōu)良的免疫增強劑。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。本實施例所采用的提取客體是選自渤海灣廣泛分布的低值貝類-泥螺。一種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，包括以下步驟(1)原料處理將泥螺去殼，軟體部分洗凈后，加入2-2. 5倍體積的蒸餾水勻漿，形成勻漿液；(2)酶解向上述勻漿液中加胰蛋白酶，該胰蛋白酶的添加量為勻漿液總重量的0. 8-1% ；在45°C水浴條件下酶解7-8小時，酶解液煮沸滅酶后，4000r/min離心lOmin，取
上清液；(3)脫色加入雙氧水脫色，雙氧水的添加量為上清液重量的6-8% ；(4)調(diào)pH值去沉淀先用HCl調(diào)pH至2. 0，離心除去沉淀；再用NaOH調(diào)pH至7. 0， 離心除去沉淀；(5)醇沉法提取粗糖胺聚糖上清液在不斷攪拌下緩緩加入乙醇至醇含量為 60%，于4°C條件下靜置M小時，移去上清液，4000r/min離心IOmin后回收粗糖胺聚糖，得率為1. 22% ；(6)超濾將粗糖胺聚糖溶于蒸餾水，配成1 %糖液，4000r/min離心IOmin除去不溶物后進行超濾；(7)溶液絡(luò)合后解離加入3倍體積的5%重量濃度的CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，40°C下沉淀1-2小時，8000r/min離心30min，收集沉淀，40°C下將沉淀溶于2mol/L的 NaCl溶液，使GAG-CTAB絡(luò)合物解離，形成解離液；(8)醇沉、超濾、再醇沉上述解離液加入乙醇，使醇量達(dá)60%，8000r/min離心 lOmin，收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水，用中空纖維膜超濾，在超濾后的溶液中加入乙醇-乙酸鈉試劑，使醇量達(dá)60%，按醇沉法回收糖胺聚糖，將沉淀物烘干，即制得純泥螺糖胺聚糖。 通過檢驗，得到的糖胺聚糖純度可達(dá)90%。
權(quán)利要求
1.一種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于提取包括以下步驟(1)原料處理將泥螺去殼，軟體部分洗凈后，加入2-2.5倍體積的蒸餾水勻漿，形成勻漿液；(2)酶解向上述勻漿液中加胰蛋白酶，在45°C水浴條件下酶解7-8小時，酶解液煮沸滅酶后，4000r/min離心lOmin，取上清液；(3)脫色加入雙氧水脫色；(4)調(diào)pH值去沉淀先用HCl調(diào)pH至2.0，離心除去沉淀；再用NaOH調(diào)pH至7. 0，離心除去沉淀；(5)醇沉法提取粗糖胺聚糖上清液在不斷攪拌下緩緩加入乙醇至醇含量為60%，于 4°C條件下靜置M小時，移去上清液，4000r/min離心IOmin后回收粗糖胺聚糖；(6)超濾將粗糖胺聚糖溶于蒸餾水，配成糖液，4000r/min離心IOmin除去不溶物后進行超濾；(7)溶液絡(luò)合后解離加入3倍體積的5%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，40°C下沉淀1-2小時，8000r/min離心30min，收集沉淀，40°C下將沉淀溶于2mol/L的NaCl溶液，使 GAG-CTAB絡(luò)合物解離，形成解離液；(8)醇沉、超濾、再醇沉上述解離液加入乙醇，使醇量達(dá)60%，8000r/min離心lOmin， 收集沉淀，將沉淀溶于蒸餾水，用中空纖維膜超濾，在超濾后的溶液中加入乙醇-乙酸鈉試劑，使醇量達(dá)60%，按醇沉法回收糖胺聚糖，將沉淀物烘干，即制得純泥螺糖胺聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于所述步驟(2) 中胰蛋白酶的添加量為勻漿液總重量的0. 8-1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，其特征在于所述步驟(3) 中雙氧水的添加量為上清液重量的6-8%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從泥螺中提取糖胺聚糖的方法，其主要技術(shù)特點是采用渤海灣廣泛分布的低值貝類-泥螺作為糖胺聚糖的提取原材料，其提取制方法為將泥螺去殼后稱重，加水制成勻漿液，在勻漿液中加入胰蛋白酶酶解，將酶解液離心除去沉淀，上清液加雙氧水脫色，離心，調(diào)pH值，離心除去酸性、中性蛋白質(zhì)，上清液醇沉，得粗糖胺聚糖粗品，得率為1.22％，粗品加超純水溶解，超濾，醇沉，加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，離心，將沉淀溶于NaCl溶液中，得解離液，再超濾、醇沉，回收較高純度糖胺聚糖。本方法反應(yīng)條件溫和、糖胺聚糖得率及純度高，與其他貝類的糖胺聚糖提取相比，工藝簡化，時間縮短，得到的糖胺聚糖純度可達(dá)90％。
文檔編號C08B37/00GK102276751SQ20111022854
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者崔青曼, 袁春營, 許江鷺 申請人:天津科技大學(xué)