專利名稱：角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物功能性材料，具體地涉及一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，以及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
可以大規(guī)模生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)和性能可調(diào)的人工合成生物材料相對(duì)于重現(xiàn)性較差的天然 生物材料的缺點(diǎn)就是生物性能較差。為了開發(fā)和設(shè)計(jì)新的生物材料，采用生物活性肽對(duì)生物惰性的人工合成材料進(jìn)行改性是改善合成材料生物活性的重要手段。經(jīng)過適當(dāng)?shù)纳锘钚噪男揎棧梢栽鰪?qiáng)細(xì)胞黏附和促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而改善合成材料的生物性能。最常用的黏附肽RGD(氨基酸序列Arg-Gly-Asp)可被細(xì)胞膜上的整合素識(shí)別參與細(xì)胞和基質(zhì)間的黏附。除RGD肽外，KQAGDV、REDV、PHSRN、YIGSR、IKVAV等多種短肽序列也可通過不同的整合素結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的黏附和功能。然而，生產(chǎn)合成肽通常需要毒性很高的溶劑和試劑，造成生產(chǎn)成本和環(huán)境負(fù)擔(dān)都非常高(Guzman, F. , S. Barberis, et al. “Peptide synthesis chemicalor enzymatic.，，Electronic Journal of Biotechnology 2007,10(2) :279-314.)。角蛋白是廣泛存在于生物體組織中的結(jié)構(gòu)蛋白，是構(gòu)成毛發(fā)，羽毛，爪，角，鱗片等的主要成分。角蛋白原料通常被紡織業(yè)和屠宰業(yè)作為廢物丟棄，這種現(xiàn)況已經(jīng)引起了環(huán)境和經(jīng)濟(jì)方面的雙重關(guān)注(Aluigi, A. , M. Zoccola, et al. “Study on the structure andproperties of wool keratin regenerated from formic acid.，’International Journalof Biological Macromolecules 2007,41(3) :266-27)。作為天生擁有生物相容性的可再生天然資源，角蛋白材料已經(jīng)越來越多地得到包括美容、紡織、醫(yī)藥及醫(yī)療等行業(yè)的關(guān)注。通過對(duì)中國(guó)、美國(guó)及歐洲專利數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，關(guān)于角蛋白肽的提取方法和功能研究，以及角蛋白材料的應(yīng)用已經(jīng)有了許多報(bào)道。角蛋白肽的提取和其生物功能的相關(guān)專利有歐洲專利NZ534919，美國(guó)專利”2001047082和日本專利見1113998等。關(guān)于角蛋白材料的應(yīng)用，美國(guó)專利” 6544548B1、US 6165496和US 5932552等報(bào)道了角蛋白膜或水凝膠在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用；中國(guó)專利CN 1634568報(bào)道了角蛋白在制藥領(lǐng)域中的新用途包括在促創(chuàng)面修復(fù)，促組織生長(zhǎng)，促生發(fā)護(hù)發(fā)和養(yǎng)膚美容的藥物中的應(yīng)用；關(guān)于傷口愈合的專利還包括中國(guó)專利CN 1997408、中國(guó)專利CN 101730540和美國(guó)專利US7732574等；其他的應(yīng)用還包括中國(guó)專利CN 1274567報(bào)道了使用人發(fā)角蛋白制作人工腱方法和工藝；歐州專利NZ 534919報(bào)道了如何從角蛋白生物材料形成涂料和生物醫(yī)學(xué)植入物；及中國(guó)專利CN101838466報(bào)道了羽毛角蛋白膜在藥物釋放中的功能。由以上眾多專利可以看出角蛋白是一種很好的生物材料。從羊毛和人發(fā)提取的角蛋白材料已經(jīng)證明含有細(xì)胞黏附肽序列例如RGD和LDV(Tachibana，A.，Y. Furuta 等，“Fabrication of wool keratin sponge scaffolds for long-term cellcultivation. ”，Journal of Biotechnology 2002,93(2) 165-170 ；Verma, V. , P. Verma等，“Preparation of scaffolds from human hair proteins for tissue-engineeringapplications.，，，Biomedical Materials 2008,3(2) :12.)。
角蛋白作為一種天然的生物材料，雖然有很好的生物功能，但是其材料本身的化學(xué)和物理性能有限，且重現(xiàn)性較差。
聚乙二醇是一種pH中性的無毒兩親性高分子，其免疫原性低，生物相容性也通過美國(guó)FDA認(rèn)可。而且聚乙二醇分子量范圍很寬，加上其多種衍生物和共聚物，性能可精細(xì)調(diào)控，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和藥學(xué)材料。生物惰性的聚乙二醇水凝膠需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)纳锘钚噪男揎梺碓鰪?qiáng)細(xì)胞黏附和促進(jìn)細(xì)胞增殖以實(shí)現(xiàn)其在美容，傷口愈合和組織工程的方面的應(yīng)用。目前尚沒有關(guān)于使用天然的角蛋白肽代替合成肽對(duì)聚乙二醇水凝膠進(jìn)行修飾的產(chǎn)品及其應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)合成肽成本高、環(huán)境負(fù)擔(dān)重；天然生物材料重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，提供一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠生物功能性材料。本發(fā)明進(jìn)一步要解決的技術(shù)問題在于，提供一種制備角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備方法，以及該角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的應(yīng)用。為此，本發(fā)明一方面提供一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，包括角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚形成的共聚物，其中所述聚乙二醇丙烯酸酯類單體具有400 40000Da的分子量；所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. 00001 10 : I ;所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的交聯(lián)密度為I % 50 % (wt/vol % )，并且其中所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇由角蛋白肽與乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物通過形成酰胺鍵生成，其中所述角蛋白肽具有200 5000Da的分子量；所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物具有1000 30000Da的分子量。 優(yōu)選實(shí)施方案中，所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為 O. 00001 O. I I。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述聚乙二醇丙烯酸酯類單體選自聚乙二醇雙丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和多臂聚乙二醇丙烯酸酯中的至少一種。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠具有5 30wt/vol%的交聯(lián)密度。優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物具有2000 8000Da 的分子量，并且選自 Acrylate-PEG-NHS、Acrylate-PEG-SCM、Acrylate-PEG-SVA 中的至少一種。優(yōu)選地，所述PEG為直鏈、支鏈、星形或樹形結(jié)構(gòu)的聚乙二醇。本發(fā)明另一方面提供一種制備角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的方法，包括(I)將角蛋白肽粉溶于pH為7 9的緩沖溶液中，形成角蛋白肽溶液；(2)將乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物添加到所述角蛋白肽溶液中，于O 50°C的反應(yīng)溫度避光反應(yīng)O. 5 24小時(shí)，其中所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物與所述角蛋白肽的摩爾比為O. 001 100 I ；(3)從反應(yīng)后的溶液中分離提純乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽；
(4)在可見光或紫外光照射下，使用光引發(fā)劑，使所述比例的乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚，形成角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(I)中的所述角蛋白肽溶液中所述角蛋白肽的濃度為O. Iwt % 飽和。優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(2)中所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物與所述角蛋白肽的摩爾比為O. 01 I : 1，所述反應(yīng)溫度為室溫，并且反應(yīng)時(shí)間為2 8小時(shí)。優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(3)的分離提純方法選自透析法、超濾膜過濾法、凝
優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(4)中所述光引發(fā)劑選自?shī)Z氫型、裂解型、光敏和陽(yáng)離子型引發(fā)劑，并且所述光引發(fā)劑在反應(yīng)溶液中的濃度為0.01% 1% (wt/vol% )0優(yōu)選地，所述光引發(fā)劑為α羥基酮類均裂型光引發(fā)劑。本發(fā)明再一方面提供角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠在制備用于促進(jìn)成纖維細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，既能充分利用角蛋白肽這種廣泛存在的可再生天然生物資源的良好生物性能，變廢為寶降低生物功能性材料的生產(chǎn)成本；又能利用聚乙二醇水凝膠可以大規(guī)模生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)和性能可精細(xì)調(diào)控能力，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的有效促進(jìn)作用。


下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中圖I是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中化合物的結(jié)構(gòu)式(A)聚乙二醇雙丙烯酸酯單體(PEGDA)、(B)乙烯基聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺酯(Acrl-PEG-NHS)和(C)乙烯基聚乙二醇化角蛋白肽(Acrl-PEG-Keratin)；圖2是本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中化合物的FTIR圖譜，從上到下依次為角蛋白肽(Keratin)、乙烯基聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺酯(Acrl-PEG-NHS)和乙烯基聚乙二醇-角蛋白妝(Acrl-PEG-Keratin)；圖3是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植6小時(shí)后的光學(xué)顯微鏡圖片；圖4是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植24小時(shí)后的光學(xué)顯微鏡圖片；圖5是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植6小時(shí)后經(jīng)染色的熒光顯微鏡圖片；圖6是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植24小時(shí)后經(jīng)染色的熒光顯微鏡圖片；圖7是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植6小時(shí)后統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞密度；圖8是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞密度；
圖9是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植6小時(shí)后統(tǒng)計(jì)的單細(xì)胞鋪展面積百分比圖；圖10是是成纖維細(xì)胞在含有不同濃度角蛋白肽的10% w/v PEGDA水凝膠上種植24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)的單細(xì)胞鋪展面積百分比圖.
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明使用天然角蛋白肽，從人或動(dòng)物的毛發(fā)、羽毛、蹄、殼、爪、角、鱗等通過化學(xué)或物理方法降解得到。由于這些物質(zhì)通常被紡織業(yè)和屠宰業(yè)作為廢物丟棄，利用這樣的天然角蛋白肽，既能充分地利用資源，又大大降低了生產(chǎn)成本，并且對(duì)廢物的再利用還能減小 環(huán)境污染的壓力。優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的角蛋白肽來自人發(fā)或羊毛。在用于非抗原性的傷口愈合或組織工程產(chǎn)品中，病人或捐獻(xiàn)者的頭發(fā)是更佳的選擇。角蛋白肽的提取在本領(lǐng)域已有成熟的方法和技術(shù)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，采用鹽酸水解羊毛提取角蛋白肽，具體地，本發(fā)明采用O. I 10mol/L濃度的鹽酸，在20 150°C的溫度范圍，水解羊毛O. 5 72小時(shí)；過濾得到的角蛋白水解物，用堿中和；然后噴霧干燥成粉或凍干保存，得到角蛋白肽粉。角蛋白肽的分子量在200 5000Da之間。然而，應(yīng)理解，實(shí)踐中角蛋白肽的提取并不局限于該方法，而可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)需要選擇恰當(dāng)?shù)奶崛》椒?。本發(fā)明的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠包括一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，包括角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚形成的共聚物，其中所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. 00001 10 : I。其制備則采用兩個(gè)主要步驟完成首先，使角蛋白肽與聚乙二醇琥珀酰亞胺活性酯類衍生物反應(yīng)生成聚乙二醇化的角蛋白肽，角蛋白肽的自由氨基與聚乙二醇琥珀酰亞胺活性酯類衍生物之間通過形成穩(wěn)定的酰胺鍵共價(jià)結(jié)合；然后通過光聚合，使得到的聚乙二醇化的角蛋白肽與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚，形成天然角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。本發(fā)明的乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物是指同時(shí)帶有乙烯基(Vinyl)和N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS ester)兩種反應(yīng)基團(tuán)的聚乙二醇，其分子量范圍在1000 30000Da之間，優(yōu)選在2000 8000Da之間。具體地，將提取的天然角蛋白肽粉加入pH緩沖液中，調(diào)節(jié)其pH值在7. O 9. O之間；添加乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物到角蛋白肽溶液中，乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物與角蛋白肽的摩爾比為O. 001-100 1，并于0°C到50°C的反應(yīng)溫度，避光反應(yīng)O. 5到24小時(shí)；將反應(yīng)混合液分離提純，得到的乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽可以凍干進(jìn)行長(zhǎng)期保存，以備后用。使用光引發(fā)劑在可見光或紫外光照射下光聚合乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽與聚乙二醇丙烯酸酯類單體，使其共聚形成角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. OOOOl 10 I，水凝膠的交聯(lián)密度可以是1%到50% (wt/vol % )。此外，本發(fā)明提供的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠中還可以添加有其他化學(xué)或生物添加劑，或其他天然或合成分子到聚乙二醇水凝膠中，以提高其所需功能。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)用天然角蛋白肽修飾聚乙二醇水凝膠顯著改善了聚乙二醇水凝膠的細(xì)胞親和性，同時(shí)大大降低了生物改性聚乙二醇水凝膠的生產(chǎn)成本。天然角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠在美容，傷口愈合和組織工程方面的應(yīng)用相當(dāng)有潛力。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠通過以下步驟制備將角蛋白肽粉以O(shè). Iwt %到飽和濃度溶解于50mM到IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液中，滴加IM的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH值為7. O到9. O之間，除此之外，pH緩沖液還可以是IOmM到200mM的碳酸氫鈉溶液、磷酸鹽溶液、Tris溶液，或HEPES溶液； 添加乙烯基聚乙二醇-羥基-琥珀酰亞胺酯(Acrl-PEG-NHS)粉(分子量為2000到8000Da)到上述角蛋白肽溶液中，其中Acrl-PEG-NHS與角蛋白肽的摩爾比為0.01 I 1，并于室溫避光反應(yīng)2小時(shí)到8小時(shí)，除此之外，乙烯基聚乙二醇琥珀酰亞胺活性酯類衍生物還可以選自Acrylate-PEG-SCM，Acrylate-PEG-SVA等，其分子量?jī)?yōu)選在2000 8000之間；將反應(yīng)后的溶液用小于所選乙烯基聚乙二醇-羥基-琥珀酰亞胺酯分子量的透析袋透析24小時(shí)以上，例如，當(dāng)所選的Acrl-PEG-NHS分子量為3400Da時(shí)，可以選用2000MWC0的透析袋，透析過后純化的乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽(Acrl-PEG-Keratin)溶液可以凍干后保存，實(shí)踐中，還可以采用超濾膜過濾法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、疏水層析法，以及反相色譜法來分離提純乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽；將乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽和聚乙二醇丙烯酸酯類單體(例如，聚乙二醇雙丙烯酸酯單體(PEGDA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯單體(PEGDMA)或多臂聚乙二醇丙烯酸酯單體(n-PEG-Acr)中的一種或更多種)按照一定比例混合在溶液中，其中，乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽和聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. 00001 O. I 1，使用光引發(fā)劑在紫外光照射下在模具中通過光聚合形成角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其中聚合時(shí)間可以為10秒到O. 5小時(shí)。聚乙二醇丙烯酸酯類單體的分子量可以在400 40000Da之間。光引發(fā)劑可以包括奪氫型，裂解型，光敏和陽(yáng)離子型引發(fā)劑，并且其在混合的反應(yīng)溶液中的濃度為0.01%-I % (wt/vol %)，優(yōu)選的光引發(fā)劑為α羥基酮類均裂性光引發(fā)劑。制備的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的交聯(lián)密度可以是5%到30% (wt/νο I % )。圖I示出本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中化合物的結(jié)構(gòu)式(A)聚乙二醇雙丙烯酸酯單體(PEGDA)、⑶乙烯基聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺酯(Acrl-PEG-NHS)和(C)乙烯基聚乙二醇化角蛋白肽(Acrl-PEG-Keratin)。角蛋白肽通過末端的自由氨基,與乙烯基聚乙二醇琥珀酰亞胺活性酯類衍生物(例如Acrl-PEG-NHS)形成酰胺鍵，而以共價(jià)方式相結(jié)合，得到乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽(例如Acrl-PEG-Keratin)，然后通過光聚合與聚乙二醇丙烯酸酯類單體(例如PEGDA)共聚形成天然角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。圖2示出了角蛋白肽、乙烯基聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺酯(Acrl-PEG-NHS)以及乙烯基聚乙二醇-角蛋白肽的FTIR圖譜。從圖中可見,角蛋白肽(Keratin)在1640CHT1處有明顯的C = O特征峰；乙烯基聚乙二醇-角蛋白肽(ACRL-PEG-Keratin)在1640CHT1處也有很明顯的C = O特征峰。乙烯基聚乙二醇-羥基琥珀酰亞胺酯(ACRL-PEG-NHS)在1735CHT1處有一個(gè)-(C = O)-NHS特征峰。在與角蛋白肽反應(yīng)后，由于-NHS被反應(yīng)成了-NH-，1735cm-1處的特征峰在聚乙二醇丙烯酸酯-角蛋白肽中變得非常不明顯。紅外光譜分析證明了角蛋白肽被成功PEG化。以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。實(shí)施例I-乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備角蛋白肽的提取取60克洗凈烘干的羊毛，并將其加入到4mol/L的400ml鹽酸溶液中。于95°C的恒溫水浴鍋中反應(yīng)24小時(shí)。對(duì)得到的羊毛水解物進(jìn)行過濾，在所得濾液中邊攪拌邊滴氫氧
化鈉溶液調(diào)節(jié)角蛋白肽溶液至中性，然后噴霧干燥成角蛋白肽粉。乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備將角蛋白肽粉溶于IOOmM碳酸氫鈉溶液直到飽和，通過滴加IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)得到的溶液的PH值至8. 2，形成角蛋白肽溶液。使用孔徑為O. 2微米的過濾網(wǎng)過濾。將100mg/ml的Acrl-PEG-NHS (MW3400)粉末添加到pH值調(diào)節(jié)后的角蛋白肽溶液，并于室溫避光反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)后所得的Acrl-PEG-Keratin溶液用透析袋(Sigma Aldrich, 2000MWC0)在磁攪拌下透析24小時(shí)后，將保留在透析袋中的經(jīng)純化的Acrl-PEG-Keratin凍干保存，以備后用。Acrl-PEG-Keratin的分子量通過SDS-PAGE電泳測(cè)定為約4000Da。實(shí)施例2-乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備角蛋白肽的提取取50克洗凈烘干的人發(fā)，并將其加入3mol/L的400ml鹽酸溶液中。于95°C的恒溫水浴鍋中反應(yīng)12小時(shí)。對(duì)得到的人發(fā)水解物進(jìn)行過濾，然后冷凍干燥成角蛋白肽粉。乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備將2g角蛋白肽粉溶于5ml的50mM磷酸鹽溶液，調(diào)節(jié)得到的溶液的pH值至8. 5，形成角蛋白肽溶液。用孔徑為O. 2微米的過濾網(wǎng)過濾。將50mg/ml的Acrl-PEG-SCM(MW2000)粉末添加到PH值調(diào)節(jié)后的角蛋白肽溶液后，于4°C避光反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)后所得的Acrl-PEG-Keratin溶液用凝膠色譜柱進(jìn)行分離。Acrl-PEG-Keratin的分子量通過SDS-PAGE電泳測(cè)定為大約3000Da。實(shí)施例3-乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備角蛋白肽的提取取60克洗凈烘干的羊毛，并將其加入O. 5mol/L的400ml氫氧化鈉溶液中。于100°C的恒溫水浴鍋中反應(yīng)24小時(shí)。對(duì)得到的羊毛水解物進(jìn)行過濾，在所得濾液中邊攪拌邊滴鹽酸溶液調(diào)節(jié)角蛋白肽溶液至中性，然后噴霧干燥成角蛋白肽粉。乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽的制備將角蛋白肽粉溶于IOOmM HEPES溶液直到飽和。通過滴加IM的氫氧化鈉溶液將得到的溶液的PH值調(diào)至7. 5。使用孔徑為O. 2微米的過濾網(wǎng)過濾。將100mg/ml的Acrl-PEG-SVA(MW5000)粉末添加到pH值調(diào)節(jié)后的角蛋白肽溶液后，于室溫避光反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)后所得的Acrl-PEG-Keratin溶液用離子交換層析法純化。Acrl-PEG-Keratin的分子量通過SDS-PAGE電泳測(cè)定為大約6000Da。實(shí)施例4-角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備(O. 05mM角蛋白肽)及其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備將聚乙二醇雙丙烯酸酯單體(PEGDA 700Da)、乙烯基聚乙二醇-角蛋白肽(Acrl-PEG-Keratin，約4000Da)和α羥基酮類均裂性光引發(fā)劑1-[4_(2_羥乙氧基)-苯基]_2_ 輕基 _2_ 甲基丙麗(Irgacure2959, Ciba Specialty Chemicals Inc.)均勻混合，并在PDMS模具中經(jīng)紫外光照射發(fā)生聚合反應(yīng)，生成角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。其中Acrl-PEG-Keratin的添加量為O. 05mM, PEGDA的交聯(lián)度為10% w/v，光引發(fā)劑的添加濃度為 O. I % w/v。 具體反應(yīng)條件如下，在Iml的IXPBS緩沖液中加入IOOmg的PEGDA、200 μ g的Acrl-PEG-Keratirulmg的Irgacure 2959 (需事先配成溶于酒精的原液)，所得混合液以每50 μ L注入內(nèi)孔徑為5mm、厚度為Imm的PDMS模具環(huán)中，模具環(huán)下面是疏水硅烷TPM表面處理過的載玻片，然后上面覆蓋蓋玻片，紫外光照射80秒，光強(qiáng)大約為200mW/cm2，紫外光波長(zhǎng)365nm。聚合完成后，揭去蓋玻片和PDMS模具環(huán)，聚合的水凝膠圓片附著在載玻片上，然后一起轉(zhuǎn)移到有IXPBS緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水凝膠圓片用無菌IXPBS緩沖液沖洗后，浸在緩沖液中放在紫外燈下消毒3個(gè)小時(shí)，然后將緩沖液換成細(xì)胞培養(yǎng)液。HFF-I成纖維細(xì)胞以6X 104cellS/cm2密度種到水凝膠圓片上，然后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱(含5% CO2)中培養(yǎng)。培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)和24小時(shí)后，用PBS緩沖液沖洗后使用倒置相差光學(xué)顯微鏡(Nikon，Eclipse TS100)觀察成纖維細(xì)胞粘附的水凝膠圓片。分析時(shí)每個(gè)水凝膠圓片至少取三個(gè)隨機(jī)區(qū)域(I. 3mm2)，同一個(gè)濃度Acrl-PEG-Keratin至少有三個(gè)水凝膠圓片。粘附細(xì)胞的計(jì)數(shù)和單細(xì)胞鋪展面積由Metamorph成像系統(tǒng)(Nikon)的綜合形態(tài)分析模塊軟件計(jì)算。在水凝膠上粘附的成纖維細(xì)胞也通過染色觀察，染色前用PBS緩沖液沖洗水凝膠，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，然后用O. 1%的TritionX-IOO打孔15分鐘。細(xì)胞的絲狀肌動(dòng)蛋白使用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染成紅色，細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色。染色后的細(xì)胞通過熒光顯微鏡(Nikon，Eclipse80i)觀察。圖3顯示了培養(yǎng)6小時(shí)后成纖維細(xì)胞在不同濃度角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠表面的形態(tài)。6小時(shí)后，在沒有角蛋白肽修飾的對(duì)照水凝膠表面，細(xì)胞數(shù)量少且大多數(shù)呈圓形。在含有0.05mM角蛋白肽的水凝膠表面，貼壁的細(xì)胞明顯比對(duì)照組多，且已開始鋪展。圖4顯示了培養(yǎng)24小時(shí)后成纖維細(xì)胞在不同濃度角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠表面的形態(tài)。24小時(shí)后，沒有角蛋白肽修飾的對(duì)照水凝膠表面，貼壁細(xì)胞仍然數(shù)量稀少且大多呈圓形，而在含有0. 05mM角蛋白肽的水凝膠表面，大多數(shù)貼壁細(xì)胞已伸展成典型的長(zhǎng)梭型。圖5和圖6的熒光照片可以觀察到與細(xì)胞粘附，鋪展和形態(tài)密切相關(guān)的絲狀肌動(dòng)蛋白的分布和構(gòu)型。由圖5所示，6個(gè)小時(shí)后，在無角蛋白肽的聚乙二醇水凝膠表面的細(xì)胞其微絲仍處于無序狀態(tài)，而在含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠表面的細(xì)胞微絲已經(jīng)成束。由圖6觀察到,24小時(shí)后,在含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠表面的細(xì)胞的微絲相對(duì)于對(duì)照組長(zhǎng)度更長(zhǎng)，分布更廣。從貼壁的細(xì)胞密度和單細(xì)胞鋪展面積來看，含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠相比于無角蛋白肽的水凝膠都有大幅提高。圖7和圖8分別是細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)后在含有不同濃度角蛋白肽的水凝膠表面的細(xì)胞密度柱狀圖。在無角蛋白肽的水凝膠表面，6小時(shí)后的細(xì)胞密度為每平方厘米 2700個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后更減少為每平方厘米 1500個(gè)細(xì)胞。而在含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠表面，貼壁的細(xì)胞密度大幅提高到6小時(shí)和24小時(shí)后每平方厘米 9000個(gè)細(xì)胞，粘附細(xì)胞密度相對(duì)于對(duì)照組提高3倍多。圖9和圖10則分別是細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)后在不同濃度角蛋白肽的水凝膠表面單細(xì)胞鋪展面積的柱狀圖。細(xì)胞鋪展程度以單細(xì)胞鋪展面積分為四類，四類分別是 0-1000 μ τα (最少鋪展)、1000-2000 μ m2,2000-3000 μ m2 和〉3000 μ m2 (最多鋪展)，柱狀圖顯示的是細(xì)胞在每一類的百分比。如圖9所示，6小時(shí)后在無角蛋白肽修飾的水凝膠表面有大約80%的細(xì)胞屬于最少鋪展類的，而在含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠表面最少鋪展類細(xì)胞降為大約60%。24小時(shí)后，無角蛋白肽修飾的水凝膠仍有大約40%的細(xì)胞屬于最少鋪展類的，而含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠則大幅降為大約20%。由上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠相對(duì)于無角蛋白肽修飾的水凝膠明顯提高了其細(xì)胞親和性，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的粘附和鋪展。實(shí)施例5-角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備(O. 125mM角蛋白肽)及其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備本實(shí)施例中使用含有O. 125mM ACRL-PEG-Keratin(約4000Da)的水凝膠，除此之外，制備方法與實(shí)施例4相同，此處不再累述。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)HFF-I成纖維細(xì)胞以6X104Cells/Cm2密度種到水凝膠圓片上，然后置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱(含5% CO2)中培養(yǎng)。培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)和24小時(shí)后,進(jìn)行光學(xué)和染色觀察,具體方法見實(shí)施例4。由圖3所示，培養(yǎng)6小時(shí)后在含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠表面，粘附的成纖維細(xì)胞在數(shù)量和鋪展程度都明顯高于含有O. 05mM角蛋白肽的水凝膠。細(xì)胞已多數(shù)成長(zhǎng)梭型。由圖4所示，24小時(shí)后，含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠表面上的細(xì)胞更加鋪展，且數(shù)量明顯高于較低濃度和無角蛋白肽修飾的水凝膠。圖5和圖6的熒光照片也可以觀察到在含有O. 125M角蛋白肽的水凝膠表面上的細(xì)胞其微絲在6個(gè)小時(shí)后已經(jīng)成束且長(zhǎng)度比在含有O. 05M角蛋白肽的水凝膠表面的細(xì)胞長(zhǎng)。24小時(shí)后，由圖6所示,在含有O. 125M角蛋白肽的水凝膠表面的細(xì)胞微絲相對(duì)于對(duì)照組和低濃度組長(zhǎng)度更長(zhǎng)，分布更廣。從貼壁的細(xì)胞密度(圖7和圖8)來看，含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠相比于低濃度角蛋白肽的水凝膠仍有明顯提高。在含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠表面，6小時(shí)后的細(xì)胞密度為每平方厘米 11000個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后增長(zhǎng)為每平方厘米 13000個(gè)細(xì)胞。由圖9和圖10所示的單細(xì)胞鋪展面積來看，6小時(shí)后含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠表面最少鋪展類細(xì)胞只有24%，24小時(shí)后更降為5%，而屬于1000-2000 μ m2和2000-3000 μ τα 各有大約 40 %。由上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠比無角蛋白肽修飾和低濃度O. 05mM角蛋白肽修飾的水凝膠都繼續(xù)大幅提高了細(xì)胞親和性，明顯增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞的粘附，鋪展和生長(zhǎng)。實(shí)施例6-角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備(O. 25mM角蛋白肽)及其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備本實(shí)施例中使用含有O. 25mM ACRL-PEG-Keratin (約4000Da)的水凝膠，除此之外，制備方法與實(shí)施例4相同，此處不再累述。細(xì)胞實(shí)驗(yàn) HFF-I成纖維細(xì)胞以6X104Cells/Cm2密度種到水凝膠圓片上，然后放入37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱(含5% CO2)中培養(yǎng)。培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)和24小時(shí)后,進(jìn)行光學(xué)和染色觀察,具體方法見實(shí)施例4。由圖3和圖4所示，培養(yǎng)6小時(shí)后在含有O. 25mM角蛋白肽的水凝膠表面，粘附的成纖維細(xì)胞多數(shù)已成典型的長(zhǎng)梭型，24小時(shí)后，細(xì)胞更加鋪展，且細(xì)胞密度明顯高于低濃度和無角蛋白肽修飾的水凝膠。圖5和圖6的熒光照片也可以觀察到在含有O. 25mM角蛋白肽的水凝膠表面上的細(xì)胞在6個(gè)小時(shí)后已經(jīng)成長(zhǎng)束，24小時(shí)后，相對(duì)于對(duì)照和低濃度組長(zhǎng)度更長(zhǎng)，分布更廣。由圖7和圖8所示，在含有O. 25mM角蛋白肽的水凝膠表面，6小時(shí)后的細(xì)胞密度為每平方厘米 11000個(gè)細(xì)胞，24小時(shí)后增長(zhǎng)為每平方厘米 12000個(gè)細(xì)胞，其粘附細(xì)胞的密度與含有O. 125mM角蛋白肽的水凝膠相當(dāng)，但明顯優(yōu)于對(duì)照組和低濃度組。由圖9和圖10所示的單細(xì)胞鋪展面積來看，6小時(shí)后含有O. 25mM角蛋白肽的水凝膠表面最少鋪展類細(xì)胞只有18%，24小時(shí)后更降為1%，而屬于1000-2000 μ m2和2000-3000 μ τα 也各有大約 40 %。由上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，含有O. 25mM角蛋白肽的水凝膠比無角蛋白肽修飾和O. 05mM角蛋白肽修飾的水凝膠明顯增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞的粘附，鋪展和生長(zhǎng)，與O. 125mM角蛋白肽修飾的水凝膠相比在細(xì)胞鋪展方面有小幅增強(qiáng)。實(shí)施例7-角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備(O. 5mM角蛋白肽)及其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例于實(shí)施例4在水凝膠制備方法和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上基本相同，相同之處不重述。不同之處為角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠由混合均勻的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA IOOODa, Sigma Aldrich)、Acrl-PEG_Keratin (約 3000Da)和自由基型光引發(fā)劑2，2- 二乙氧基苯乙酮(I % w/v)，在PDMS模具中經(jīng)紫外光照射下聚合形成，紫外光照射20分鐘，光強(qiáng)大約為lOmW/cm2，紫外光波長(zhǎng)365nm ；PEGDMA水凝膠交聯(lián)度為20% w/v ;水凝膠含有 O. 5mMACRL-PEG-Keratin。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明含有O. 5mM角蛋白肽的水凝膠相對(duì)于無角蛋白肽修飾的水凝膠明顯提高了其細(xì)胞親和性，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的粘附和鋪展。
實(shí)施例8-角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的制備(O. 5mM角蛋白肽)及其細(xì)胞實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例于實(shí)施例4在水凝膠制備方法和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上基本相同，相同之處不重述。不同之處為角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠由混合均勻的四臂聚乙二醇甲基丙烯酸酯(4 臂-PEG-Acrylate IOOOODa, laysan Bio)、Acrl-PEG-Keratin(約 6000Da)和
I-羥基環(huán)己基苯基甲酮(I % w/v)，在PDMS模具中經(jīng)紫外光照射下聚合形成，紫外光照射3分鐘，光強(qiáng)大約為100mW/cm2，紫外光波長(zhǎng)365nm ;PEGDMA水凝膠交聯(lián)度為10% w/v ;水凝膠 含有O. 5mM ACRL-PEG-Keratin。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明含有O. 5mM角蛋白肽的水凝膠相對(duì)于無角蛋白肽修飾的水凝膠明顯提高了其細(xì)胞親和性，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的粘附和鋪展。
權(quán)利要求
1.一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，包括角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚形成的共聚物，其中 所述聚乙二醇丙烯酸酯類單體具有400 40000Da的分子量； 所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. 00001 10 I ； 所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的交聯(lián)密度為(Wt/V0l% )，并且其中 所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇由角蛋白肽與乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物通過形成酰胺鍵生成，其中 所述角蛋白肽具有200 5000Da的分子量； 所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物具有1000 30000Da的分子量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其特征在于，所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體的摩爾比為O. 00001 O. I I。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其特征在于，所述聚乙二醇丙烯酸酯類單體選自聚乙二醇雙丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和多臂聚乙二醇丙烯酸酯中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其特征在于，所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠具有5 30wt/Vol%的交聯(lián)密度。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其特征在于，所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物具有2000 SOOODa的分子量，并且選自Acrylate-PEG-NHS> Acrylate-PEG-SCM、Acrylate-PEG-SVA 中的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，其特征在于，所述PEG為直鏈、支鏈、星形或樹形結(jié)構(gòu)的聚乙二醇。
7.一種制備權(quán)利要求1-6的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠的方法，包括 (1)將角蛋白肽粉溶于PH為7 9的緩沖溶液中，形成角蛋白肽溶液； (2)將乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物添加到所述角蛋白肽溶液中，于O 50°C的反應(yīng)溫度避光反應(yīng)O. 5 24小時(shí)，其中所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物與所述角蛋白肽的摩爾比為O. 001 100 : I ； (3)從反應(yīng)后的溶液中分離提純乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽； (4)在可見光或紫外光照射下，使用光引發(fā)劑，使所述比例的乙烯基聚乙二醇化的角蛋白肽與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚，形成角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，所述角蛋白肽溶液中所述角蛋白肽的濃度為O. Iwt% 飽和。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述乙烯基聚乙二醇的琥珀酰亞胺活性酯類衍生物與所述角蛋白肽的摩爾比為O. 01 I : 1，所述反應(yīng)溫度為室溫，并且反應(yīng)時(shí)間為2 8小時(shí)。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(3)的分離提純方法選自透析法、超濾膜過濾法、凝膠過濾層析法、離子交換層析法、疏水層析法和反相色譜法中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述光引發(fā)劑選自?shī)Z氫型、裂解型、光敏和陽(yáng)離子型引發(fā)劑，并且所述光引發(fā)劑在反應(yīng)溶液中的濃度為O. 01% 1%(wt/vol% ) ο
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述光引發(fā)劑為α羥基酮類均裂型光引發(fā)劑。
13.權(quán)利要求1-6的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠在制備用于促進(jìn)成纖維細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠，以及其制備方法與應(yīng)用。所述角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠包括角蛋白肽修飾的聚乙二醇與聚乙二醇丙烯酸酯類單體共聚物。本發(fā)明公開的角蛋白肽修飾的聚乙二醇水凝膠利用天然角蛋白肽的良好生物性能和聚乙二醇水凝膠的可精細(xì)調(diào)控能力，得到對(duì)細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)的有促進(jìn)作用的生物功能材料水凝膠產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C08F2/48GK102952246SQ20111023625
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者李翼, 胡軍巖, 章瑜, 劉璇 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)