專利名稱：基于物理化學(xué)相結(jié)合的新型多糖硫酸化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多糖化學(xué)改性方面的工藝，具體的說是基于物理化學(xué)相結(jié)合的新型多糖硫酸化方法。
背景技術(shù)：
從藥用真菌中提取的多糖具有多種生物活性，特別是免疫刺激和抗腫瘤的功能，使其成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域。這種生物大分子不會對細(xì)胞產(chǎn)生直接毒害作用，而是通過作用于防御和免疫系統(tǒng)來發(fā)揮作用。通常有四個(gè)因素影響多糖的生物活性分別為水溶解性，分子量，分子鏈結(jié)構(gòu)和取代基團(tuán)。通過化學(xué)改性的手段可以使多糖獲得新的生物學(xué)活性從而開發(fā)新的藥用領(lǐng)域。多糖是由單糖殘基通過糖苷鍵相連的聚合體，相對于其它生物大分子，其具有承載更多生物信息的能力。多糖的活性直接或間接地受其分子結(jié)構(gòu)的影響，采取一定的方法對多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可以提高或賦予多糖活性、降低其毒副作用。目前對多糖進(jìn)行修飾的常見方法有硫酸化、磷酸化、乙?；?、烷基化、磺酰化、羧甲基化等。這些改性方法不僅改變了多糖的理化性質(zhì)，還能改變其生理活性。直到二十世紀(jì)七十年代，多糖的硫酸化活性才被認(rèn)識，然而在當(dāng)今，硫酸化是改變多糖生物學(xué)活性最主要，也是最有效的手段。國外有研究表明硫酸化的香菇多糖對HIV病毒有抑制作用。多糖中的硫酸基慢慢的增加，免疫活性逐漸變小，當(dāng)硫酸基的量增加到某一值時(shí)，免疫活性完全消失，轉(zhuǎn)變?yōu)榭共《净钚浴ＭǔＡ蛩峄男苑椒?，是使用一些硫酸化試劑，通過化學(xué)反應(yīng)，在多糖的單元羥基上連上硫酸基團(tuán)。常用的硫酸化體系有氯磺酸一吡啶，三氧化硫一三乙胺，濃硫酸。而反應(yīng)是通過直接加熱的手段來完成硫酸化的過程。一些研究表明，溫度越高，硫酸化的取代度越高，然而過高的溫度會影響分子的高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生物學(xué)活性的喪失。因此只能在溫和的溫度下，通過延長反應(yīng)的時(shí)間，來達(dá)到硫酸化高取代度的目的，現(xiàn)在一般的硫酸化反應(yīng)都要經(jīng)過8-10小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，才能達(dá)到理想的硫酸化程度。微波可以對介質(zhì)材料瞬時(shí)加熱升溫，能耗也很低。另一方面，微波的輸出功率隨時(shí)可調(diào)，介質(zhì)溫升可無惰性的隨之改變，不存在“余熱”現(xiàn)象，極有利于自動控制和連續(xù)化生產(chǎn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用化學(xué)物理結(jié)合的手段進(jìn)行多糖硫酸化生產(chǎn)的工藝，這種工藝可以達(dá)到傳統(tǒng)工藝的硫酸化程度，而且保持了較高的生物學(xué)活性，同時(shí)大大縮短了硫酸化的時(shí)間。本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下步驟進(jìn)行I、以香菇多糖作為參與反應(yīng)的底物，香菇胞外多糖通過氣升式發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液中提取，純化而獲得的均一純品多糖。
2、硫酸化試劑的制備采用取代率較高的硫酸化體系一氯磺酸-吡啶體系將氯磺酸緩慢滴加到裝有吡啶的容器中，滴加過程應(yīng)在冰鹽浴中進(jìn)行，并用磁力攪拌器攪拌，控制溫度在O攝氏度至4攝氏度以防過熱。3、微波輔助法將純品多糖溶解在甲酰胺中，硫酸化試劑緩慢滴加，攪拌均勻。利用微波爐進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，混合液調(diào)節(jié)至pH中性，并用酒精沉淀，離心復(fù)溶于水，濃縮透析，凍干，獲得硫酸化產(chǎn)品。4、紅外檢測KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測，400-4000^^1觀察硫酸取代的特殊峰。5、SD 檢測
碳水化合物含量的檢測采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的檢測采用氯化鋇明膠法。6、體外抗氧化活性的檢測。超氧根自由基清除能力模擬黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)和griess顯色劑，在550nm比色。測試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的超氧陰離子清除能力。氫氧根自由基清除能力利用fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，給與電子受體后，用griess顯色，550nm比色，測試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的羥基陰離子清除能力。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于微波輔助法相對于傳統(tǒng)方法,耗時(shí)更短。傳統(tǒng)方法需要10小時(shí)左右，而新工藝只需要短短6分鐘就完成反應(yīng)。利用微波的特性，即達(dá)到加熱的目的，采用間歇處理的手段防止過度加熱導(dǎo)致的失活。同時(shí)由于微波的特點(diǎn)，使得分子在溶劑中充分舒展，更好的與硫酸化試劑接觸。經(jīng)過檢測，新工藝獲得的樣品同樣達(dá)到了硫酸化的結(jié)果，其取代率高，同時(shí)未失去生物活性。


圖I為KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測對比圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合具體例通過以下步驟進(jìn)行I、以香菇多糖作為參與反應(yīng)的底物，香菇胞外多糖通過氣升式發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液中提取，純化而獲得的均一純品多糖。2、硫酸化試劑的制備采用取代率較高的硫酸化體系一氯磺酸-吡啶體系將5ml的氯磺酸緩慢滴加到裝有25ml吡啶的三頸燒瓶中，滴加過程應(yīng)在冰鹽浴中進(jìn)行，并用磁力攪拌器攪拌，控制溫度在O攝氏度至4攝氏度以防過熱。3、微波輔助法IOOmg純品多糖溶解在20ml甲酰胺中，硫酸化試劑緩慢滴加，攪拌均勻。利用普通微波爐進(jìn)行反應(yīng)。將功率調(diào)制溫和(約100W)，反應(yīng)體系加熱2分鐘后停止，取出冷卻。再重復(fù)兩次，結(jié)束硫酸化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，混合液調(diào)節(jié)至PH中性，并用酒精沉淀，離心復(fù)溶于水，濃縮透析，凍干，獲得硫酸化樣品sLNT-2。
4、產(chǎn)物的理化性質(zhì)檢驗(yàn)以下所述中sLNT_l為傳統(tǒng)方法所得硫酸化樣品、sLNT-2為本發(fā)明方法所得硫酸化樣品。I)紅外檢測，KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測，400-40000^1觀察硫酸取代的特殊峰。如圖I所示，為與傳統(tǒng)方法產(chǎn)品的比較9770^1為β糖苷鍵，1650and 1415CHT1為羰基和羧基的伸縮振動，1132和IOeOcnT1S (C-O-C)和(C-OH)的伸縮振動，3361CHT1的(-0H)和2933cm—1的(C-H)是糖環(huán)的特征峰。在硫酸化產(chǎn)物上，1246/1225cm^處的S = O伸縮振動和855/854CHT1處的C-O-S伸縮振動表明硫酸化形成硫酸酯。2) SD檢測，碳水化合物含量的檢測采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的檢測采用氯化鋇明膠法。以下為與傳統(tǒng)方法產(chǎn)品的比較。
權(quán)利要求
1.基于物理化學(xué)相結(jié)合的新型多糖硫酸化方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 1)以香菇多糖作為參與反應(yīng)的底物，香菇胞外多糖通過氣升式發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液中提取，純化而獲得的均一純品多糖； 2)硫酸化試劑的制備采用取代率較高的硫酸化體系——氯磺酸-吡啶體系將氯磺酸緩慢滴加到裝有吡啶的容器中，滴加過程應(yīng)在冰鹽浴中進(jìn)行，并用磁力攪拌器攪拌，控制溫度在O攝氏度至4攝氏度以防過熱； 3)微波輔助法將純品多糖溶解在甲酰胺中，硫酸化試劑緩慢滴加，攪拌均勻，利用微波爐進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，混合液調(diào)節(jié)至PH中性，并用酒精沉淀，離心復(fù)溶于水，濃縮透析，凍干，獲得硫酸化產(chǎn)品； 4)紅外檢測KBr壓片法傅立葉紅外光譜儀檢測，400-40000^1觀察硫酸取代的特殊峰； 5)SD檢測碳水化合物含量的檢測采用苯酚硫酸法，硫酸根含量的檢測采用氯化鋇明膠法； 6)體外抗氧化活性的檢測 超氧根自由基清除能力模擬黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，加入電子傳遞物質(zhì)和griess顯色劑，在550nm比色，測試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的超氧陰離子清除能力； 氫氧根自由基清除能力利用fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，給與電子受體后，用griess顯色，550nm比色，測試管中加入不同濃度的樣品，計(jì)算樣品的羥基陰離子清除能力。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種采用化學(xué)物理結(jié)合的手段進(jìn)行多糖硫酸化生產(chǎn)的工藝，本發(fā)明實(shí)施的步驟是1、純化而獲得均一純品多糖；2、硫酸化試劑的制備；3、微波輔助法；4、紅外檢測；5、SD檢測；6、體外抗氧化活性的檢測。這種工藝可以達(dá)到傳統(tǒng)工藝的硫酸化程度，而且保持了較高的生物學(xué)活性，同時(shí)大大縮短了硫酸化的時(shí)間。
文檔編號C08B37/00GK102659955SQ20121010525
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者李衛(wèi)旗 申請人:浙江大學(xué)