專利名稱：Atrp法構(gòu)建以pgma為骨架的高性能陽離子基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ATRP法構(gòu)建一系列以PGMA (聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)為骨架，具有高的基因轉(zhuǎn)染效率低毒的陽離子基因載體。
背景技術(shù)：
基因治療方法為先天性遺傳疾病和嚴重后天獲得性疾病的治療提供了一條富有前景的新途徑?；蛑委熓且环N將外源基因?qū)肽康募毎⒂行П磉_，從而達到治病目的的治療方法。DNA分子通常以帶負電的疏松狀態(tài)存在，體積較大，滿負電荷與細胞表面之間存在排斥作用，難于進入細胞；另外，血液及細胞內(nèi)存在大量的水解酶尤其是核酸酶，能將裸DNA分子破壞，因此單獨使用DNA轉(zhuǎn)染時，效率較低。為了使DNA有效轉(zhuǎn)染，需要借助物理方法或使用基因載體輔助DNA轉(zhuǎn)染。物理方法需要使用專門的設(shè)備，不能進行全身性使用，并且會對組織和細胞產(chǎn)生嚴重損害，采用基因載體法有望克服物理方法的缺陷。應(yīng)用于基因治療的載體主要分為病毒載體(viral vector)和非病毒載體(non-viral vector)。病毒載體主要為逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒及單純皰疫病毒，其優(yōu)點是轉(zhuǎn)染率高，缺點是缺乏安全性，可能引起致癌作用與不希望的自身免疫反應(yīng)(unexpected immune response)和白細胞的病毒變化,甚至可能造成病人多器官衰竭導(dǎo)致死亡。此外病毒載體還會引起插入突變的現(xiàn)象，可能導(dǎo)致宿主細胞的惡行轉(zhuǎn)化，而且病毒載體攜帶DNA的能力有限，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。由于它的上述弱點，目前科學(xué)界已經(jīng)研究重心轉(zhuǎn)向非病毒載體技術(shù)的研究與開發(fā)。與病毒性載體相比，非病毒載體安全性高，并且具有低免疫原性、能夠攜帶大量DNA分子、容易大批量生產(chǎn)及費用低廉等優(yōu)點，是一個有潛力的替代路線，故人們愈來愈重視人工合成的非病毒載體的研究。陽離子聚合物是目前研究最廣泛的人工合成非病毒載體。陽離子聚合物能夠自發(fā)與帶負電荷的基因通過電荷相互作用，可形成帶正電荷納米級的復(fù)合體(complex),從而協(xié)助基因穿過帶負電的細胞膜。此外，陽離子聚合物載體也能夠保護質(zhì)粒，避免被核酸酶降解，加速基因的細胞轉(zhuǎn)染。近年來，隨著活性/可控自由聚合(living/controlled radicalpolymerization, LRP)研究的快速發(fā)展，LRP技術(shù)在制備具有新穎特定功能的生物高分子材料中也得到了巨大發(fā)展。LRP集活性可控聚合與自由基聚合的優(yōu)點為一身，不但可得到相對分子量分布極窄、相對分子量可控、結(jié)構(gòu)明晰的聞分子，而且可聚合的單體多，反應(yīng)條件溫和易控制。所以，LRP技術(shù)具有極高的實用價值，受到了高分子化學(xué)家們的重視。迄今為止，已有原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atom transfer radical polymerization,ATRP)、穩(wěn)定自由基氮氧游離基調(diào)控(nitroxide mediated free radical polymerization, NMRP)體系和可逆加成 _ 裂解鏈轉(zhuǎn)移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)等LRP體系問世。其中，ATRP近幾年得到了迅速發(fā)展并有著重要應(yīng)用價值。其所用引發(fā)劑 一般為鹵代烷烴，基本原理是通過一交替的“活化-去活”可逆反應(yīng)使體系中游離基濃度極低，迫使不可逆終止反應(yīng)降低到最低程度，而鏈增長反應(yīng)仍可進行，從而實現(xiàn)“活性”聚合。ATRP反應(yīng)溫度適中，適用單體范圍廣，甚至可以在少量氧存在下進行，對高分子材料的分子設(shè)計不需復(fù)雜的合成路線，是現(xiàn)有NMRP、RAFT等其它活性聚合方法無法比擬的，因此可以說ATRP技術(shù)的出現(xiàn)開辟了活性聚合的新領(lǐng)域。隨著高分子科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)以及工程學(xué)等多門學(xué)科的相互交融、相互滲透和迅速發(fā)展，高分子基因載體材料進入一個快速發(fā)展的時期。目前，文獻中報道一系列非病毒陽離子聚合物載體，包括聚-L-賴氨酸(poly (L-Iysine)，PU)、聚乙二胺樹枝狀聚合物(poly (amidoamine), PAMAM)、聚甲基丙烯酸N, N- 二甲氨基乙酯(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate), PDMAEMA)> 聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI)等。其中PEI具有較高的轉(zhuǎn)染效率,是陽離子非病毒載體中公認的“金標(biāo)”。但是上述陽離子聚合物仍具有相當(dāng)高的毒性，大大限制了它們的應(yīng)用。這樣，開發(fā)低毒而高效陽離子聚合物是研究非病毒基因載體的核心內(nèi)容。目前較為流行的方案是在陽離子聚合物中插入生物相容的成份，最常見的是聚乙二醇(PEG)。另一種常見的思路是多糖陽離子化，包括殼聚糖(chitosan)、環(huán)糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)等。但是上述報道的非病毒載體的性能(比如安全性和轉(zhuǎn)染效率)與實際應(yīng)用的要求還有相當(dāng)大的距離。 近幾年研究者致力于ATRP理論和應(yīng)用的研究工作，在ATRP合成生物材料以及ATRP技術(shù)的生物材料應(yīng)用方面開展了廣泛的研究，取得了一定的研究成果。對多種單體(包括DMAEMA、PEGEEMA, PEGMA以及GMA)的ATRP進行了系統(tǒng)的研究，積累了豐富的經(jīng)驗，促進了活性可控聚合在醫(yī)用生物高分子中的應(yīng)用。陽離子基因載體與DNA通過電荷作用將DNA包裹成納米顆粒，這樣就減小了 DNA和細胞表面的排斥。同時陽離子基因載體可以保護DNA防止核酸酶的分解，這樣有利于提高在細胞的轉(zhuǎn)染效率?，F(xiàn)在常用陽離子基因載體有聚乙烯亞胺(PEI)，聚類氨酸(PLL)，聚乙二醇(PEG)等，其中PEI是目前應(yīng)用最廣泛的基因載體，由于它的高的轉(zhuǎn)染效率在陽離子基因載體中PEI被作為黃金標(biāo)準(zhǔn)。但是對于大多數(shù)具有高轉(zhuǎn)染效率的基因載體往往具有較大的毒性。而成功的基因載體不僅要有高的轉(zhuǎn)染效率同時要具有低的毒性。而目前大多數(shù)陽離子基因載體不僅轉(zhuǎn)染效率不高，毒性也很大。對于非病毒基因載體轉(zhuǎn)染效率的提高和毒性的降低，將在臨床上應(yīng)用有巨大的意義，最普遍的方法是通過引入非離子親水基團，來屏蔽陽離子聚合物毒性。最近，有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧族PGMA可以與胺族開環(huán)反應(yīng)，并且合成的PGEA陽離子基因載體通過它在不同細胞中的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)于枝化PEI (25KD)甚至還高。通過一系列的轉(zhuǎn)染和毒性試驗表明了 PGEA系列作為具有高轉(zhuǎn)染效率和低毒性，安全的基因載體對與將來臨床上基因治療具有深遠的意義。綜上所述，盡管在利用活性可控自由基聚合法制備基因載體方面已經(jīng)做了很多工作，但是在技術(shù)方面還有以下問題需要解決I、在制備高性能陽離子基因載體時，隨著單體不斷的接枝到PGMA骨架上，陽離子基因載體的分子量隨之增大，細胞內(nèi)吞作用增大，轉(zhuǎn)染效率增加，但是細胞的毒性也隨之增大，如何最大限度的降低基因載體的毒性成為需要解決的問題。2、在制備高性能陽離子基因載體時，接枝不同單體，可以得到不同性能的陽離子聚合物，但是不同單體的質(zhì)子化能力不同，導(dǎo)致載體的轉(zhuǎn)染效率高低不同，如何篩選出具有高效高性能的單體是需要考慮的問題。
3、在制備高性能陽離子基因載體時，接枝相同的單體，在不同的細胞包括癌細胞和普通細胞中，轉(zhuǎn)染高低不同，如何提高在確定細胞中的轉(zhuǎn)染效率是需要研究的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活性可控自由基聚合法(ATRP法)構(gòu)建的以PGMA (聚甲基丙烯酸縮水甘油酯)為骨架的，其中包括線性PGEA、PGAPU PGAP2、P⑶ED、梳狀PGEAj^狀PGEAPEG的生物可還原高效陽離子基因載體。該陽離子基因載體分子量可控，分布窄、可剪切、毒性低，轉(zhuǎn)染效率高，高效無毒的特點使其具備了投入臨床試驗的可能。所述的線性的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法為 I) 0-60°C無氧條件下,將0. lg-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g_10g四氫呋喃、6g_12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、0. 033g-0. 15g Cufo■混合，各組分添加順序為先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時間為l_9h,反應(yīng)完成后加入水或者甲醇,或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ；所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種；2)0-60°C無氧條件下，將0. 2g-0. 5g步驟I)得到的線性PGMA溶于4g_10g四氫呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3-6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到線性的以PGEA為骨架的陽離子基因載體。步驟2)所述的醇胺為乙醇胺(EA)、2_氨基-I-丙醇(API)、3_氨基-I-丙醇(AP2)、N-N- 二甲基乙二胺(DED)、胱胺中的一種或幾種。所述的梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法為I. 0-60 °C無氧條件下，將0. 05g-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g_10g四氫呋喃、6g-12g GMA、0. 08g-0. 26g 配體、0. 033g-0. 15g CuBr 混合，各組分添加順序為先將 GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時間為l_9h，反應(yīng)完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ;所述的配體為2，2_聯(lián)吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA)、4，4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種；2. 0-60°C無氧條件下，將I. 5g-2. 5g步驟I中制備的線性PGMA溶于7g_10g四氫呋喃或N-N-二甲基甲酰胺中，再加入0.36g-0.37ga-溴異丁酸(BIBA);反應(yīng)12_48h，優(yōu)選24-48h，用乙醚沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得產(chǎn)物為PGMA-Br ；3. 0-60°C無氧條件下，將0. 2g-0. 5g步驟2得到的PGMA-Br、5g-1Og有機溶劑、3g_6g單體、0. 082g-0. 15g配體、0. 033g-0. Ig Cufo■混合，各組分加入順序為先將PGMA-Br溶于有機溶劑，然后加入單體，再加入配體，最后加入CuBr弓I發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將PGMA-Br溶于有機溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；反應(yīng)l_500min，優(yōu)選l_450min，然后加入甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳狀的以PGMA為骨架的聚合物；4. 0_60°C無氧條件下，將0. 1-0. 5g步驟3得到的梳狀的以PGMA為骨架的聚合物溶于5g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3_6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至 除去所有水分即得到梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體。步驟3所述的有機溶劑為N-N- 二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。步驟3所述的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)、甲基丙烯酸N，N- 二甲氨基乙酯(DMEMA)、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇(PEG)中的一種或幾種。步驟3所述的配體為2，2_聯(lián)吡啶(BPY)、1，1，4，7，10，10_六甲基三乙烯四胺(HMTETA)、五甲基二乙烯三胺(PMDTETA) ,4,4-聯(lián)吡啶中的一種或幾種。步驟4所述的醇胺為乙醇胺(EA)、2-氨基-I-丙醇(API)、3_氨基_1_丙醇(AP2)、N-N- 二甲基乙二胺(DED)、胱胺中的一種或幾種。有益效果本發(fā)明利用活性可控自由基聚合法制得分子量大小從20000-100000，分子量分布I. 6-2. I的聚合物。該聚合反應(yīng)平穩(wěn)，易于調(diào)控，并可根據(jù)需要制備出多種不同分子量系列的、窄分子量分布的高性能陽離子基因載體。該基因載體儲存穩(wěn)定性好，放置幾天或幾個月后仍可保持原有性能；并且在tfepg2、Hela、C6、COS7、HEK293等細胞中具有高于PEI (25Kda)的轉(zhuǎn)染效率，使用方法簡單，具有商業(yè)化潛力。


圖I不同的以PGMA為骨架的梳狀陽離子基因載體的合成圖。圖2以PGMA為骨架的線性陽離子基因載體的開環(huán)反應(yīng)圖。圖3轉(zhuǎn)染效率圖；PEI為金標(biāo)，I-PGEA為實施例I得到的線性的以PGMA為骨架的陽離子基因載體PGEA ；c-PGEA, c-PGEAPEG分別為實施例3和是實施例4得到的梳狀的以PGMA為骨架的陽離子基因載體。圖4細胞內(nèi)毒性曲線圖；PEI為金標(biāo)，I-PGEA為實施例I得到的線性的以PGMA為骨架的陽離子基因載體PGEA ;c-PGEA、c-PGEAPEG分別為實施例3和實施例4得到的梳狀的以PGMA為骨架的陽離子基因載體。
具體實施方式
實施例II) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將12gGMA(甲基丙烯酸縮水甘油酯)加入小燒瓶中，然后依次加入IOg的THF(四氫呋喃)、120mg五甲基二乙烯三胺、213. 6mg PMDETA，最后加入86. 4mg CuBr來引發(fā)活性可控自由基聚合；3h后打開瓶塞加速攪拌IOmin,與空氣充分接觸停止反應(yīng)，聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇，即得到線性PGMA，該聚合物數(shù)均分子量(Mn)為580000g/mol，PDI (Mw/Mn)為I. 23。2) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng) ，將0. 3g步驟I)得到的線性PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺(或使用2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N-二甲基乙二胺、或者0. 15g乙醇胺和0. 15g N-N-二甲基乙二胺)，Ig的三乙胺后進行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500MW的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機中冷凍干燥直至除去所有水分，得到線性的以PGMA為骨架的陽離子基因載體，記為PGEA (使用2-氨基-I-丙醇得到的產(chǎn)物記為PGAPl，使用3-氨基-I-丙醇得到的產(chǎn)物記為PGAP2，使用N-N- 二甲基乙二胺得到的產(chǎn)物記為P⑶ED，使用0. 15g乙醇胺和0. 15g N-N- 二甲基乙二胺得到的產(chǎn)物記為PGEADED)。實施例2I) 37°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，在燒瓶中取I. 5克實施例I的步驟I)中得到的線性 PGMA 溶于 IOg 的 THF 中，加入 0. 36 克 BIBA(2-Bromoisobutyric acid)，反應(yīng) 24h 后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-Br (PGMA/BIBA為5 1，分子鏈上每6個GMA鏈段中有一個上面接Br)。2) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g上述步驟I)得到的PGMA-Br加入5gTHF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀PGMA。3) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g步驟2)得到的梳狀PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500Mw的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽離子基因載體。實施例3I) 37°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，在燒瓶中取2. 5克實施例I的步驟I)中得到的線性 PGMA 溶于 IOg 的 THF 中，加入 0. 37 克 BIBA(2-Bromoisobutyric acid)反應(yīng) 24h 后，乙醚沉淀，真空干燥后得到PGMA-Br (PGMA/BIBA為8 I，分子鏈上每8個GMA鏈段中有一個上面接Br)。2) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g上述步驟I)得到的PGMA-Br加入5gTHF中溶解，然后依次加入4gGMA，82mg的HMTETA，最后加入33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀PGMA。3) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g步驟2)得到的梳狀PGMA加入5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500Mw的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ;之后放入冷凍干燥機中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽離子基因載體。實施例4I) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g實施例3中步驟I)得到的PGMA-Br加A 3. 6gTHF 中溶解，然后依次加入 3. 7gGMA, 0. 3g PEGEEMA, 82mg 的 HMTETA，最后加入 33. 5mg的CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，待反應(yīng)4h后打開瓶塞加速攪拌lOmin，與空氣充分接觸停止反應(yīng)；聚合產(chǎn)物用甲醇反復(fù)沉淀直到產(chǎn)物顏色變淺為止，放入真空干燥箱中除去甲醇后得到梳狀P (GMA-PEGEEMA)。
2) 50°C氮氣保護條件下連續(xù)反應(yīng)，將0. 3g步驟I)得到的梳狀P (GMA-PEGEEMA)加A 5. 6g的THF溶解，然后加入3g乙醇胺，Ig的三乙胺后進行開環(huán)反應(yīng)168h，聚合產(chǎn)物用乙醚反復(fù)沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于40ml水放入截留分子量為3500MW的透析袋中，之后轉(zhuǎn)入5L大燒杯中加滿去離子水開始透析，透析6h ；之后放入冷凍干燥機中冷凍干燥直至除去所有水分，得到梳狀的以PGMA為骨架的陽離子基因載體，記為PGEAPEG。通過X射線光電子能譜(XPS)表征聚合物主要組分的含量，用核磁共振譜儀(NMR)對原料、反應(yīng)中間體和產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)分析和驗證。使用激光粒度及電位分析儀表征所得產(chǎn)物的粒徑、zeta電位，用凝膠滲透色譜(GPC)對產(chǎn)物的可剪切性和分子量進行了表征。最后，通過凝膠電泳實驗測試所得基因載體包埋DNA的能力，細胞轉(zhuǎn)染實驗測試了產(chǎn)物載體的轉(zhuǎn)染效率和生物相容性。所得到的陽離子基因載體的轉(zhuǎn)染效率和毒性如圖3和圖4。
權(quán)利要求
1.一種線性的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟為 1)0-60°C無氧條件下，將0.lg-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氫呋喃、6g-12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、0. 033g-0. 15g Cufo■混合，各組分添加順序為先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時間為l_9h,反應(yīng)完成后加入水或者甲醇,或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ； 所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶、I，I，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯三胺、4，4_聯(lián)吡啶中的一種或幾種； 2)0-60°C無氧條件下，將0.2g-0. 5g步驟I)得到的線性PGMA溶于4g-10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg-2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3-6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到線性的以PGEA為骨架的陽離子基因載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種線性的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的醇胺為乙醇胺、2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N- 二甲基乙二胺、胱胺中的一種或幾種。
3.一種梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟為 1)0-60 °C無氧條件下，將0. 05g-0. 2g五甲基二乙烯三胺、5g-10g四氫呋喃、6g_12gGMA、0. 08g-0. 26g配體、0. 033g-0. 15g Cufo■混合，各組分添加順序為先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將GMA溶于四氫呋喃，然后加入五甲基二乙烯三胺，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；聚合反應(yīng)時間為l_9h,反應(yīng)完成后加入水或者甲醇,或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，然后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或者甲醇，所得產(chǎn)物為線性PGMA ； 2)0-60°C無氧條件下，將I. 5g-2. 5g步驟I)中制備的線性PGMA溶于7g_10g四氫呋喃或N-N- 二甲基甲酰胺中，再加入0. 36g-0. 37ga-溴異丁酸；反應(yīng)12_48h，優(yōu)選24_48h，用乙醚沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚，所得產(chǎn)物為PGMA-Br ； 3)0-60°C無氧條件下，將0.2g-0. 5g步驟2)得到的PGMA-Br、5g-1Og有機溶劑、3g_6g單體、0. 082g-0. 15g配體、0. 033g-0. Ig CuBr混合，各組分加入順序為先將PGMA-Br溶于有機溶劑，然后加入單體，再加入配體，最后加入CuBr引發(fā)活性可控自由基聚合，或者先將PGMA-Br溶于有機溶劑中，然后加入單體，再加入CuBr，最后加入配體引發(fā)活性可控自由基聚合；反應(yīng)l_500min，優(yōu)選l_450min，然后加入甲醇，或者暴露在空氣中，使引發(fā)體系失活和終止聚合，最后用乙醚或者甲醇沉淀直到形貌變?yōu)楣腆w，放入真空干燥箱中除去乙醚或甲醇，即得到梳狀的以PGMA為骨架的聚合物；所述的有機溶劑為N-N-二甲基甲酰胺或二甲基亞諷； 4) 0-60 °C無氧條件下，將0. 1-0. 5g步驟3)得到的梳狀的以PGMA為骨架的聚合物溶于5g-10g四氫呋喃或N-N- 二 甲基甲酰胺中，加入2g-4g醇胺和lg_2g三乙胺，開環(huán)反應(yīng)72-168h ;然后用乙醚沉淀直到產(chǎn)物形貌為固體，放入真空干燥箱中除去乙醚；然后將產(chǎn)物溶于水中，加水量與產(chǎn)物的比例為100-300ml/g ;產(chǎn)物溶解后放入截留分子量為2500-4500MW的透析袋中，在去離子水中透析3_6h ;最后將透析袋中的產(chǎn)物冷凍干燥直至除去所有水分即得到梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，所述的配體為2，2-聯(lián)吡啶、I，I，4，7，10，10-六甲基三乙烯四胺、五甲基二乙烯二胺、4,4-聯(lián)批唳中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，步驟3)所述的單體為甲基丙烯酸縮水甘油酯、甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯、N-異丙基丙烯酰胺、聚(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚乙二醇中的一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種梳狀的以PGEA為骨架的陽離子基因載體的制備方法，其特征在于，步驟4)所述的醇胺為乙醇胺、2-氨基-I-丙醇、3-氨基-I-丙醇、N-N- 二甲基乙二胺、胱胺中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于非病毒基因載體技術(shù)領(lǐng)域的一種以ATRP法構(gòu)建一系列以PGMA(聚甲基丙烯酸甘油酯)為骨架，低毒且高效的陽離子基因載體。該ATRP法聚合反應(yīng)平穩(wěn)，易于調(diào)控，并可根據(jù)需要制備出多種不同分子量的、窄分子量分布的高性能陽離子基因載體。制得的陽離子基因載體儲存穩(wěn)定性好，并且在Hepg2、C6、Cos7、HEK293等細胞中具有高于金標(biāo)PEI的轉(zhuǎn)染效率，使用方法簡單，具有商業(yè)化潛力。
文檔編號C08F220/32GK102643374SQ20121012702
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者修可茂, 徐福建, 朱韻, 楊鑫超, 柴明英, 王增輝, 胡楊 申請人:北京化工大學(xué)