專利名稱：一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，屬于食品エ業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素(CS)，作為糖胺聚糖的ー種，是三種最重要的糖胺聚糖之一。它由D-葡糖醛酸與N-こ酰-D-氨基半乳糖酸硫酸酯組成，是廣泛存在于人類和動(dòng)物的喉骨、鼻中隔、氣管等軟骨組織中的ー類酸性黏多糖。高分子質(zhì)量的CS表現(xiàn)出高的生物活性，如抗癌癥、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等，不僅在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、分化、増殖、識(shí)別以及組織形成等生物過程中起到了重要的作用，并已用于醫(yī)藥及臨床的應(yīng)用。但由于高分子量，高表觀粘度、低水溶性及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，大部分高分子多糖很難通過組織屏障與細(xì)胞內(nèi)部的受體結(jié)合。且由于細(xì)胞膜的選擇透過性等因素，臨床應(yīng)用中大部分糖胺聚糖面臨生物利用率較低的主要問題。最近幾年，低分子質(zhì)量CS的功能特性越來越受到人們的重視。與其它糖胺聚糖，如透明質(zhì)酸，硫酸類肝素相比，低分子量CS的研究相對(duì)落后。目前國內(nèi)對(duì)CS的研究主要集中于CS的提取、生理活性及衍生物等方面，對(duì)CS寡糖的研究未見報(bào)道，國際上對(duì)CS寡糖的分離提純報(bào)道也不多，単一寡糖的研究較少。本發(fā)明涉及的ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素ニ糖、四糖及六糖，首次實(shí)現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時(shí)制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的エ業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)；為糖類化合物的糖庫的建立及糖類藥物的篩選提供重要的分離手段；可為臨床藥物的生產(chǎn)提供一定的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案ー種硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的制備方法，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素ニ糖、四糖及六糖。步驟為
(1)硫酸軟骨素的酶法降解
將O. 2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達(dá)到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶HAase，使其酶活為I. 4X IO5u/L，以150轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩速度振蕩反應(yīng)22h-24h ;反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%こ醇沉淀，靜置，用IOmL無水こ醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素寡糖；
(2)硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離
將處理好的Sephadex G_25裝成I. 6 X 150 cm的玻璃層析柱,用去離子水將硫酸軟骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液,上樣量I mL,用5倍柱體積的超純水以4 mL/min流速洗脫，用分布收集器Redfrac95定時(shí)自動(dòng)收集，4mL/管，用咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量以確定糖的出峰位置；
(3)G-10脫鹽收集到的樣品40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后經(jīng)S印hadexG-10,1.6X150 cm，脫鹽分離以后，濃縮樣品到約50mL，再凍干，以捕獲自由基能力為檢測指標(biāo)，篩選出抗氧化活性最高的硫酸軟骨素寡糖，作為下一歩分離對(duì)象；
(4)硫酸軟骨素寡糖的陰離子交換分離
裝柱將浸泡好的DEAE纖維素52，沿玻璃棒緩慢加入到層析柱中2cmX20cm，避免膠中氣泡產(chǎn)生(如果產(chǎn)生氣泡，可用玻璃棒輕輕攪拌，使氣泡溢 出)，根據(jù)重力作用使凝膠慢慢沉降，并保持表面平整；
預(yù)平衡層析柱接好恒流泵后，用超純水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脫3_5個(gè)柱體積至基線平穩(wěn)；
樣品處理將步驟(3)篩選出的硫酸軟骨素寡糖用超純水溶解至10 mL，上樣到DEAE纖維素52陰離子交換柱；
洗脫上樣lmL，用0-lmol/L NaCl梯度洗脫75min，洗脫速率為2mL/min，210nm紫外檢測；收集各洗脫峰；
(4)硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的天然制備凝膠電泳分離 溶液配制
A液:硼酸O. lmol/L，Tris O. lmol/L，こニ胺四こニ酸O. 01 mol/L，加水溶解使ρΗ8· 3。質(zhì)量濃度5%的濃縮膠每100 mL濃縮膠含丙烯酰胺4. 75 g、甲叉雙丙烯酰胺O. 25g，并用鹽酸調(diào)PH 6. 3 ;每3mL濃縮膠加入10%過硫酸銨水溶液100 μ L，TEMEDIO μし質(zhì)量濃度35%的分離膠每100 mL分離膠含丙烯酰胺31. 82 g、甲叉雙丙烯酰胺
3.18 g和蔗糖15 g0每IOmL分離膠加入10%過硫酸銨水溶液200 μ L，TEMED 20 μし分離膠和濃縮膠均用A液配制。電極緩沖液甘氨酸I. 25 mol/L, Tris O. 2 mol/L，加水溶解使pH 8. 3。上樣將經(jīng)DEAE-52陰離子交換色譜分離的洗脫峰上樣。電泳條件室溫，400V，4_5h。染色0. 5%甲苯胺藍(lán)溶于2%こ酸溶液中，染色lOmin。脫色2%こ酸脫色。樣品收集樣品脫色后，分別將電泳條帶中含量最多組分剪下，搗碎，置于ImL PBS溶液中震蕩。12h后離心，取上清液，置于4°C保存。沉淀繼續(xù)置于ImL PBS溶液中震蕩。重復(fù)三次后，將三次所得上清液過AKTA superdex P印tide柱脫鹽，冷凍干燥即得硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法首次實(shí)現(xiàn)了硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖三種硫酸軟骨素寡糖的制備，首次實(shí)現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時(shí)制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的エ業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)。


圖I :硫酸軟骨素寡糖的DEAE纖維素52層析圖。
圖2 :硫酸軟骨素寡糖的制備PAGE電泳圖。A為圖I中A峰的PAGE電泳圖，B為圖I中B峰的PAGE電泳圖，C為圖I中C峰的PAGE電泳圖；圖中畫圈部分為提供下ー步經(jīng)凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分子量鑒定的組分a、b、C。圖3:硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖分子量測定圖。a為圖2中組分a (硫酸軟骨素ニ糖)分子量測定圖、b為圖2中組分b (硫酸軟骨素四糖)分子量測定圖、c為圖2中組分c (硫酸軟骨素六糖)分子量測定圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
I、酶法降解制備硫酸軟骨素寡糖
將O. 2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達(dá)到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶(HAase，來自牛睪丸)，使其酶活為1.4X105 u/L，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩反應(yīng)22h。反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%こ醇沉淀，靜置，用IOmL無水こ醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素低聚糖A，并測定所得降解產(chǎn)物的總抗氧化活性(Τ0Α)。2、總抗氧化活性的測定
據(jù)總抗氧化能力(TOA)測定試劑盒說明書測定。測定原理機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì)，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。在37°C時(shí)，毎分鐘每毫升溶液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加O. 01，為ー個(gè)總抗氧化能力単位。3、硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離
將處理好的Sephadex G-25裝成I. 6 X 150 cm的玻璃層析柱,用去離子水將o_CS配制成40 mg/mL的溶液,上樣量I mL,用5倍柱體積的超純水以4 mL/min流速洗脫,用分布收集器(Redfrac95)定時(shí)自動(dòng)收集，4mL/管，用咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量以確定糖的出峰位置。收集到的樣品40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后經(jīng)Sephadex G-IO (I. 6X150 cm)脫鹽。分離以后濃縮樣品到一定的體積再凍干。以總抗氧化活性(TOA)為檢測指標(biāo)篩選出抗氧化活性最高的低分子量CS作為下一步分尚對(duì)象。4、咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量
咔唑試液的配制咔唑O. 0625g，加無水こ醇50mL，震蕩使溶解，即得。硼砂硫酸液四硼酸鈉2. 385g，溶于濃硫酸500mL，即得。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
CS標(biāo)準(zhǔn)品500mg溶于IOmL水中。精密量取CS標(biāo)準(zhǔn)液O. OmL,O. ImL,O. 2mL，0. 3mL,O. 4mL,0. 5mL，置于具塞試管中，各加水至ImL搖勻，冷卻至4°C左右。后振搖下緩緩加入硼砂硫酸液5mL,將試管置于沸水浴中加熱IOmin,置常溫水中冷卻至室溫。精密加入咔唑試液O. 2mL，混勻，置沸水浴中再加熱15min，冷卻至室溫。在波長530nm處測定吸光度A，以吸光度A對(duì)濃度C作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、硫酸軟骨素寡糖的陰離子交換分離
裝柱將浸泡好的DEAE纖維素52，沿玻璃棒緩慢加入到層析柱中(2cmX20cm)，避免膠中氣泡產(chǎn)生(如果產(chǎn)生氣泡，可用玻璃棒輕輕攪拌，使氣泡溢出)。根據(jù)重力作用使凝膠慢慢沉降，并保持表面平整。預(yù)平衡層析柱接好恒流泵后，用超純水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脫3_5個(gè)柱體積至基線平穩(wěn)。樣品處理經(jīng)凝膠過濾分離篩選出的抗氧化活性最高的組分凍干粉用超純水溶解至10mL，上DEAE纖維素52陰離子交換柱進(jìn)行進(jìn)ー步分離。洗脫上樣lmL，用0-lmol/L NaCl梯度洗脫75min，洗脫速率為2mL/min，210nm紫外檢測；收集各洗脫峰(圖I)。6、硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的天然制備電泳分離 溶液配制
A液:硼酸O. lmol/L,Tris O. lmol/L,こニ胺四こニ酸O. 01 mol/L，加水溶解使ρΗ8· 3。5%濃縮膠每100 mL濃縮膠含丙烯酰胺4. 75 g、甲叉雙丙烯酰胺O. 25 g，并用鹽酸調(diào)pH 6. 3。每3mL濃縮膠加入10%過硫酸銨水溶液100 μ L，TEMEDIO μし35%分離膠姆100 mL分離膠含丙烯酰胺31. 82 g、甲叉雙丙烯酰胺3. 18 g和蔗糖15 g。每IOmL分離膠加入10%過硫酸銨水溶液200 μ L，TEMED20 μし分離膠和濃縮膠均用A液配制。電極緩沖液甘氨酸I. 25 mol/L, Tris 0. 2 mol/L，加水溶解使pH 8. 3。上樣將經(jīng)DEAE-52陰離子交換色譜分離的洗脫峰上樣。電泳條件室溫，400V, 4_5h。染色0. 5%甲苯胺藍(lán)溶于2%こ酸溶液中，染色lOmin。脫色2%こ酸脫色。樣品收集樣品脫色后，分別將電泳條帶中含量最多組分剪下，搗碎，置于Iml PBS溶液中震蕩。12h后離心，取上清液，置于4°C保存。沉淀繼續(xù)置于Iml PBS溶液中震蕩。重復(fù)三次后，將三次所得上清液過AKTA superdex P印tide柱脫鹽，冷凍干燥即得硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖(圖2)。
7、硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖的分子量的測定
采用高效凝膠過濾色譜(HPGPC)法測定分離所得硫酸軟骨素ニ糖、四糖、六糖(圖3)。色譜柱Ultrahydrogel Linear 300mmX7. 8mmidX2 ;流動(dòng)相:0. lmol/L NaNO3 ;流速:0. 9mL/min ;柱溫45°C ;檢測器2410示差折光檢測器。
權(quán)利要求
1. 一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，其特征在于，以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-IO脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離，制備得到硫酸軟骨素二糖、四糖及六糖；具體步驟為 (1)硫酸軟骨素的酶法降解 將0.2 g硫酸軟骨素溶解于10 mL pH 5. 9的磷酸鹽緩沖液中，置于37°C保溫10 min,使其與反應(yīng)溫度達(dá)到一致，后向底物溶液中加入透明質(zhì)酸酶HAase，使其酶活為I. 4X IO5u/L，以150轉(zhuǎn)/分鐘的振蕩速度振蕩反應(yīng)22h-24h ;反應(yīng)結(jié)束后，加熱煮沸20min使酶失活，4000r/min離心15min，取上清液加3倍體積95%乙醇沉淀，靜置，用IOmL無水乙醇脫水3次，真空干燥得硫酸軟骨素寡糖； (2)硫酸軟骨素寡糖的凝膠過濾分離 將處理好的Sephadex G_25裝成I. 6 X 150 cm的玻璃層析柱,用去離子水將硫酸軟骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液,上樣量I mL,用5倍柱體積的超純水以4 mL/min流速洗脫，用分布收集器Redfrac 95定時(shí)自動(dòng)收集，4mL/管，用咔唑反應(yīng)檢測糖醛酸含量以確定糖的出峰位置； (3)G-10脫鹽收集到的樣品40°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后經(jīng)S印hadexG-10,1.6X150 cm，脫鹽分離以后，濃縮樣品到50mL，再凍干，以捕獲自由基能力為檢測指標(biāo)，篩選出抗氧化活性最高的硫酸軟骨素寡糖，作為下一步分離對(duì)象； (4)硫酸軟骨素寡糖的陰離子交換分離 裝柱將浸泡好的DEAE纖維素52，沿玻璃棒緩慢加入到層析柱中2cmX20cm，避免膠中氣泡產(chǎn)生，如果產(chǎn)生氣泡，用玻璃棒輕輕攪拌，使氣泡溢出，根據(jù)重力作用使凝膠慢慢沉降，并保持表面平整； 預(yù)平衡層析柱接好恒流泵后，用超純水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脫3_5個(gè)柱體積至基線平穩(wěn)； 樣品處理將步驟(3)篩選出的硫酸軟骨素寡糖用超純水溶解至10 mL，上樣到DEAE纖維素52陰離子交換柱； 洗脫上樣lmL，用0-lmol/L NaCl梯度洗脫75min，洗脫速率為2mL/min，210nm紫外檢測；收集各洗脫峰； (4)硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的天然制備凝膠電泳分離 溶液配制 A液硼酸0. lmol/L，Tris 0. lmol/L，乙二胺四乙二酸0. 01 mol/L，加水溶解使pH8. 3 ； 質(zhì)量濃度5%的濃縮膠每100 mL濃縮膠含丙烯酰胺4. 75 g、甲叉雙丙烯酰胺0. 25 g，并用鹽酸調(diào)PH 6. 3 ;每3mL濃縮膠加入10%過硫酸銨水溶液100 u L，TEMED10 u L ； 質(zhì)量濃度35%的分離膠每100 mL分離膠含丙烯酰胺31. 82 g、甲叉雙丙烯酰胺3. 18g和蔗糖15 g ;每IOmL分離膠加入10%過硫酸銨水溶液200 u L，TEMED 20 u L ； 分離膠和濃縮膠均用A液配制； 電極緩沖液甘氨酸I. 25 mol/L, Tris 0. 2 mol/L，加水溶解使pH 8. 3 ； 上樣將經(jīng)DEAE-52陰離子交換色譜分離的洗脫峰上樣；電泳條件室溫，400V，4-5h ； 染色0. 5%甲苯胺藍(lán)溶于2%乙酸溶液中，染色I(xiàn)Omin ； 脫色2%乙酸脫色； 樣品收集樣品脫色后，分別將電泳條帶中含量最多組分剪下，搗碎，置于ImL PBS溶液中震蕩，12h后離心，取上清液，置于4°C保存，沉淀繼續(xù)置于ImL PBS溶液中震蕩，重復(fù)三次后，將三次所得上清液過AKTA superdex p印tide柱脫鹽，冷凍干燥即得硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖。
全文摘要
一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，屬于食品技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以硫酸軟骨素為原料，采用透明質(zhì)酸酶降解制備得到硫酸軟骨素寡糖，經(jīng)G-25凝膠過濾分離、G-10脫鹽、DEAE纖維素52陰離子交換色譜柱分離、天然制備凝膠電泳分離等，制備得到硫酸軟骨素二糖、四糖及六糖。本發(fā)明涉及的一種硫酸軟骨素二糖、四糖、六糖的制備方法，首次實(shí)現(xiàn)了三種硫酸軟骨素寡糖的同時(shí)制備，為單一聚合度硫酸軟骨素寡糖的工業(yè)制備提供了技術(shù)依據(jù)。
文檔編號(hào)C08B37/08GK102676613SQ201210159448
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月22日
發(fā)明者周星, 張蓮, 徐學(xué)明, 楊哪, 焦愛權(quán), 王金鵬, 田耀旗, 謝正軍, 趙建偉, 金征宇, 陳曉明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)