專利名稱：電泳用凝膠及其用途和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及電泳用凝膠及其用途和制備方法，更具體的，本發(fā)明涉及一種分離膠、一種用于制備分離膠的方法、一種用于制備分離膠的組合物、一種用于電泳的凝膠、一種制備用于電泳的凝膠的方法和一種生物樣品分析方法。
背景技術(shù)：
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acrylamide)單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)通過(guò)化學(xué)催化劑過(guò)硫酸銨(Ammonium persulfate),四甲基乙二胺(TEMED)作為催化劑通過(guò)聚合作用形成三維空間的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，因此而被廣泛的應(yīng)用于遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，微生物學(xué)，植物學(xué)，動(dòng)物學(xué)，以及醫(yī)學(xué)等各個(gè)學(xué)科領(lǐng)域中蛋白質(zhì)分子量測(cè)定及分尚。 然而，目前的聚丙烯酰胺凝膠仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問(wèn)題之一或至少提供一種有用的商業(yè)選擇。本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的在生物技術(shù)領(lǐng)域，通常根據(jù)所期望分離的蛋白質(zhì)的情況，需要通過(guò)改變丙烯酰胺單體溶液濃度或增減交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺雙體比例的辦法制成孔度大小不同的凝膠(參見(jiàn)圖I)。通常針對(duì)不同分子量大小蛋白質(zhì)，尤其是分子量差異比較大的蛋白質(zhì)，需要選擇適當(dāng)濃度的膠百分比濃度。正如圖I所示，8%凝膠僅能獲得5個(gè)分離范圍(200KD、116KD、97KD、66KD和45KD)，10%凝膠能獲得6個(gè)分離(200KD、116KD、97KD、66KD、45KD 和 31KD) 12% 凝膠能獲得 8 個(gè)分離(200KD、116KD、97KD、66KD、45KD、31KD、21. 5KD和14. 4KD)，雖然15%凝膠可獲得9個(gè)分離范圍，即可以看到所有蛋白質(zhì)分子標(biāo)記(marker )條帶，但是該濃度的凝膠對(duì)于大分子量的蛋白得不到很好的分離效果，尤其是對(duì)小分子量的蛋白質(zhì)，條帶往往表現(xiàn)Smeared的缺點(diǎn)，因此不適合用于分離分子量大的蛋白質(zhì)以及小分子量的蛋白。因此在實(shí)驗(yàn)中，如果需要同時(shí)分離小分子量和大分子量的蛋白質(zhì)樣品，則需要使用4 一 15%和4 一 20%線性梯度凝膠來(lái)分離。雖然這種梯度凝膠可以獲得 9 個(gè)分離(2001 、1161(0、971(0、661(0、451(0、311(0、21· 5KDU4. 4KD 和 6. 4KD),但它們的配置過(guò)程非常繁瑣復(fù)雜，需要通過(guò)特殊的梯度混合器來(lái)配置，耗時(shí)且不易在普通實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。發(fā)明人通過(guò)對(duì)凝膠配方尤其是分離膠的配方進(jìn)行了深入的研究，得到了新型的凝膠配方，則可以使用單一濃度的電泳凝膠就能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)多種分子量的蛋白質(zhì)樣品的良好分離效果，并且可以獲得和4 一 15%和4 一 20%線性梯度凝膠相媲美的分離效果O在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離膠。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該分離膠是通過(guò)下列步驟制備的將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml 2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用該分離膠，在對(duì)生物樣品進(jìn)行分離時(shí)，能夠有效地對(duì)大范圍分子量的生物樣品例如蛋白質(zhì)，進(jìn)行有效地分離，例如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以使用的水的類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的水為去離子水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一緩沖液的類(lèi)型也不受特別限制，只要其PH可以為8. 8即可。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施示例，可以采用的第一緩沖液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解 質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩沖液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選所述第一緩沖液為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、羥乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯酰胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀酰亞胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯酰胺等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體溶液，優(yōu)選為40重量％的丙烯酰胺。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催化劑的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催化劑優(yōu)選為T(mén)EMED (N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)。由此，可以進(jìn)一步提高利用分離膠對(duì)生物樣品進(jìn)行分離的效率，尤其是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率。另外，關(guān)于使所得到的混合物固化成型，可以通過(guò)任何已知的方式實(shí)施。例如，可以將所得到的混合物置于適當(dāng)?shù)娜萜髦校o置一段時(shí)間即可固化成型。例如，可以通過(guò)在玻璃板或者塑料板與上部具有凹狀切口的同尺寸玻璃板或者塑料板之間夾著厚度O. 7mm或者1_的間隔物和防止單體液泄漏的硅密封墊來(lái)形成用于固化成型的容器。需要說(shuō)明的是，在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者更多個(gè)該特征。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種用于制備分離膠的方法，其特征在于，包括以下步驟將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml 2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。利用該方法，能夠有效地，用于制備前面所述的分離膠，從而可以效地對(duì)大范圍分子量的生物樣品例如蛋白質(zhì)，進(jìn)行有效地分離，例如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質(zhì)，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以使用的水的類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的水為去離子水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一緩沖液的類(lèi)型也不受特別限制，只要其PH可以為8. 8即可。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施示例，可以采用的第一緩沖液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩沖液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選所述第一緩沖液為I. 5M Tris pH8. 8。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、羥乙基 (甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯酰胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀酰亞胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯酰胺等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體溶液，優(yōu)選為40重量％的丙烯酰胺。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催化劑的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催化劑優(yōu)選為T(mén)EMED (N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)。由此，可以進(jìn)一步提高利用分離膠對(duì)生物樣品進(jìn)行分離的效率，尤其是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。另外，關(guān)于使所得到的混合物固化成型，可以通過(guò)任何已知的方式實(shí)施。例如，可以將所得到的混合物置于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，靜置一段時(shí)間即可固化成型。例如，以通過(guò)在玻璃板或者塑料板與上部具有凹狀切口的同尺寸玻璃板或者塑料板之間夾著厚度為O. 7mm或者1_的間隔物和防止單體液泄漏的硅密封墊來(lái)形成用于固化成型的容器，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種用于制備分離膠的組合物，其特征在于，所述組合物由下列構(gòu)成水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS，其中，所述第一緩沖液的pH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。由此，利用該組合物能夠有效地用于制備前面所述的分離膠。從而可以效地對(duì)大范圍分子量的生物樣品例如蛋白質(zhì)，進(jìn)行有效地分離，例如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質(zhì)，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以使用的水的類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的水為去離子水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一緩沖液的類(lèi)型也不受特別限制，只要其pH可以為8. 8即可。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施示例，可以采用的第一緩沖液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩沖液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選所述第一緩沖液為I. 5M Tris pH8. 8。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、羥乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯酰胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀酰亞胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯酰胺等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一自由基聚合性單體溶液，優(yōu)選為40重量％的丙烯酰胺。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催化劑的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第一氧化還原催 化劑優(yōu)選為T(mén)EMED (N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)。由此，可以進(jìn)一步提高利用分離膠對(duì)生物樣品進(jìn)行分離的效率，尤其是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種用于電泳的凝膠。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該凝膠包括分離膠和濃縮膠，其中分離膠為前面所述，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，濃縮膠是通過(guò)下列步驟制備的將水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量9(505、第二氧化還原聚合引發(fā)劑、10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠，其中，所述第二緩沖液的PH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ I。利用該凝膠，可以效地對(duì)大范圍分子量的生物樣品例如蛋白質(zhì)，進(jìn)行有效地分離，例如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質(zhì)，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以使用的水的類(lèi)型并不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的水為去離子水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二緩沖液的類(lèi)型也不受特別限制，只要其PH可以為6. 8即可。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施示例，可以采用的第二緩沖液可以是含有三(羥甲基)氨基甲烷和鹽酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸和兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷、鹽酸、甘氨酸和甘氨酸以外的兩性電解質(zhì)的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和硼酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和乙酸的緩沖液、含有三(羥甲基)氨基甲烷和甘氨酸的緩沖液、或者含有雙Tris和鹽酸的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選所述第二緩沖液為O. 5Μ Tris ρΗ6.8。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二自由基聚合性單體的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二自由基聚合性單體可以為(甲基)丙烯酰胺、N-甲基(甲基)丙烯酰胺、N-羥甲基(甲基)丙烯酰胺、N-乙基(甲基)丙烯酰胺、N-異丙基(甲基)丙烯酰胺、N, N- 二甲基(甲基)丙烯酰胺、N，N-二乙基(甲基)丙烯酰胺、羥甲基(甲基)丙烯酰胺、羥乙基(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羥乙酯、羥丙基(甲基)丙烯酰胺、二甘醇單(甲基)丙烯酸酯、N-乙烯基咔唑、N-乙烯基琥珀酰亞胺、N-乙烯基甲酰胺、N-乙烯基乙酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、雙丙酮丙烯酰胺等。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二自由基聚合性單體溶液，優(yōu)選為40重量％的丙烯酰胺。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二氧化還原催化劑的類(lèi)型并不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以采用的第二氧化還原催化劑優(yōu)選為T(mén)EMED (N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺)。由此，可以進(jìn)一步提高利用分離膠對(duì)生物樣品進(jìn)行分離的效率，尤其是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種制備用于電泳的凝膠的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法可包括以下步驟將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠；將水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)劑、10重量％APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠，其中，所述分離膠和所述濃縮膠相連，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體 溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為:4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ 1，所述第二緩沖液的pH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS的體積比為3. 12ml 1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ I,任選地,所述水為去離子水，所述第一和第二緩沖液分別為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8和O. 5Μ Tris ρΗ6. 8，所述第一和第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第一和第二氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。由此，利用該方法，能夠有效地制備前面所述的用于電泳的凝膠，從而利用該凝膠，可以效地對(duì)大范圍分子量的生物樣品例如蛋白質(zhì)，進(jìn)行有效地分離，例如根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的分離膠，可以有效地分離從6KD至200KD的蛋白質(zhì)，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種生物樣品分析方法。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，其包括使用前面所述的分離膠或者電泳用凝膠，對(duì)所述生物樣品進(jìn)行電泳，所述生物樣品含有蛋白質(zhì)和核酸的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述生物樣品含有蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的分子量為6-200KD。由此，利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的方法，可以有效提高對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的效率，減少成本，避免誤差。前面所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)也均適用該方法，不再贅述。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方法，在分離蛋白質(zhì)時(shí)，就不用根據(jù)所要分離的蛋白質(zhì)分子量的大小來(lái)選擇不同濃度的凝膠，而是可以用這種單一濃度的凝膠電泳，來(lái)分離各種大小的蛋白質(zhì)(最適線性分離范圍6_200KD)，(如圖2所示)。此外，這種凝膠對(duì)于分析限制性蛋白酶解(如圖2所示)，以及2-D SDS-PAGE和Western Blot而言，更是非常理想的選擇。本發(fā)明通過(guò)采用一種改進(jìn)的SDS-PAGE凝膠電泳的獨(dú)特配方來(lái)分離蛋白質(zhì)，操作簡(jiǎn)便，分辨率高。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用改進(jìn)后的SDS-PAGE EZ-凝膠不僅可以使小分子量的6. 4kDa蛋白肽得到較好的分離，而且通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠濃度，也使大分子量蛋白得到了很好的分離，分離范圍比較寬，并為在6-200kD分子量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)提供最佳的分離度。因此，該方法所用體系對(duì)于檢測(cè)難分離的分子量大小不一的蛋白混合物有顯著優(yōu)勢(shì)，可以說(shuō)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的電泳用凝膠可用于各種大小分子量的蛋白質(zhì)的分離，而不再象傳統(tǒng)的單一濃度的凝膠那樣，只能看到有限的幾個(gè)分離范圍，并且比梯度膠操作簡(jiǎn)便，并能達(dá)到相同的分離效果，因此可廣泛用于蛋白分析?？诖送?傳統(tǒng)的SDS-PAGE凝膠電泳系統(tǒng)的缺點(diǎn)在于凝膠基質(zhì)的穩(wěn)定性隨著時(shí)間推移而降低。這是由于SDS水解聚丙烯酰胺所造成，且4度冰箱放置SDS容易結(jié)晶析出，從而影響蛋白質(zhì)分離膠的分離效果，并大大縮短凝膠的保存時(shí)間。而根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的電泳用凝膠中，分離膠內(nèi)沒(méi)有加入SDS，只是在濃縮膠中加入SDS，因此在并不影響分離效果的同時(shí)，大大延長(zhǎng)了蛋白質(zhì)分離膠的保存時(shí)間，可長(zhǎng)達(dá)半年到I年之久且結(jié)果的重現(xiàn)性極好。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的不同濃度的丙烯酰胺所能夠分離的蛋白質(zhì)的范圍；圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的不同濃度的丙烯酰胺與本發(fā)明技術(shù)方案(EZ-Gel)所能夠分離的蛋白質(zhì)的范圍的示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的，蛋白質(zhì)標(biāo)記在不同濃度的凝膠以及EZ-Gel上分辨效果;圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，EZ-凝膠用于分析限制性蛋白酶解的結(jié)果示意圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，EZ-凝膠(在本文中有時(shí)，稱為“EZ-Gel”或者簡(jiǎn)單標(biāo)注為“EZ”，其含義均相同)用于分析工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是，這些實(shí)施例，僅僅是為了說(shuō)明目的，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例II.材料聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(6. 4 200KD)均為Bio-RAD產(chǎn)品，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(M)含有200、116、97、66、45、31、21· 5,14. 4,6. 4KD共9種蛋白質(zhì)成分。2.儀器口
蛋白質(zhì)微量電泳儀(Bio-RadLab, USA) > Mini-PROTEAN II 垂直電泳槽(Bio-radLab, USA)?！?.電泳溶液配制口 3. I 5X 電泳緩沖液Tris-base 12. 2g, glycine 72. Og,補(bǔ)足 ddH20 到 1000ml,力口SDS 5g溶解，此時(shí)pH應(yīng)為8· 3?！?. 2 陽(yáng)極緩沖液(I. 5Μ Tris pH8. 8) :90. 8g Tris-base, ddH20 400ml，用 HCl 調(diào) pH值 8. 8，補(bǔ)足 ddH20 到 500ml?？?. 3 陰極緩沖液(O. 5M Tris ρΗ6· 8) :12. 2g Tris-base，加 ddH20 溶解后，用 HCl調(diào)節(jié)pH至6. 8,然后定容至200毫升.。□
4.樣品處理液及樣品制備2 X 樣品處理液由 4%SDS、20% 甘油(v/v)、IOOmM Tris ρΗ6· 8、2% β -巰基乙醇(ν/ν)、0· 01%溴酹藍(lán)(w/v)組成,調(diào)pH = 6. 8,室溫存放。取5-10ul樣品，加入等體積的樣品處理液，沸水浴5min，高速離心后于-20攝氏度凍保存?zhèn)溆?。?.凝膠的制備口51 O. 75mm 分離膠
權(quán)利要求
1.一種分離膠，其特征在于，所述分離膠是通過(guò)下列步驟制備的 將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量9^3混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠， 其中，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離膠，其特征在于，所述水為去離子水，所述第一緩沖液為I. 5Μ Tris ρΗ8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第一氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。
3.一種用于制備分離膠的方法，其特征在于，包括以下步驟 將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠， 其中，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述水為去離子水，所述第一緩沖液為1.5Μ Tris ρΗ8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第一氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。
5.一種用于制備分離膠的組合物，其特征在于，所述組合物由下列構(gòu)成 水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量 ％APS， 其中，所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和 10 重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ I。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述水為去離子水，所述第一緩沖液為I.5Μ Tris ρΗ8，所述第一自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第一氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。
7.一種用于電泳的凝膠，其特征在于，包括分離膠和濃縮膠， 其中，所述分離膠為權(quán)利要求I或2任一項(xiàng)所述的分離膠， 所述濃縮膠是通過(guò)下列步驟制備的 將水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)齊[1、10重量9^5混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠， 其中，所述第二緩沖液的PH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％， 所述水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)劑和 10 重量 %APS 的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ 1， 任選地，所述水為去離子水，所述第二緩沖液為O. 5Μ Tris ρΗ6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第二氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。
8.一種制備用于電泳的凝膠的方法，其特征在于，包括以下步驟 將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量％APS混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠； 將水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)齊[1、10重量9^5混合；以及 使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述濃縮膠， 其中， 所述分離膠和所述濃縮膠相連， 所述第一緩沖液的PH為8. 8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量 %APS 的體積比為4. 3ml :2. 5ml :3. 5ml :20 μ I :75 μ 1， 所述第二緩沖液的pH為6. 8，所述第二自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量％，所述水、第二緩沖液、第二自由基聚合性單體溶液、10重量％SDS、第二氧化還原聚合引發(fā)劑和 10 重量 ％APS 的體積比為3. 12ml :1. 26ml :0. 5ml :50 μ I :5 μ I :50 μ 1， 任選地，所述水為去離子水，所述第一和第二緩沖液分別為I. 5Μ TrispH8. 8和O. 5MTris pH6. 8，所述第一和第二自由基聚合性單體溶液為40重量％的丙烯酰胺，所述第一和第二氧化還原聚合引發(fā)劑為T(mén)EMED。
9.一種生物樣品分析方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8所述的凝膠，對(duì)所述生物樣品進(jìn)行電泳，所述生物樣品含有蛋白質(zhì)和核酸的至少之一。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述生物樣品含有蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的分子量為6-200KD。
全文摘要
本發(fā)明提出了電泳用凝膠及其用途。其中分離膠是通過(guò)下列步驟制備的:將水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量%APS混合；以及使所得到的混合物固化成型，以便獲得所述分離膠，其中，所述第一緩沖液的pH為8.8，所述第一自由基聚合性單體溶液的濃度為40重量%，所述水、第一緩沖液、第一自由基聚合性單體溶液、第一氧化還原聚合引發(fā)劑和10重量%APS的體積比為4.3ml2.5ml3.5ml20μl75μl。利用該電泳凝膠能夠有效分離6-200KD的蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)C08F20/56GK102875712SQ201210353119
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者姜夫國(guó) 申請(qǐng)人:姜夫國(guó)