本發(fā)明屬于抗性基因的功能鑒定領(lǐng)域，尤其涉及一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法。

背景技術(shù)：
本發(fā)明采用的農(nóng)桿菌GV3101是屬于根癌農(nóng)桿菌，它能在自然條件下感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，將其Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這種特點(diǎn)，如果將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上，通過農(nóng)桿菌侵染植物傷口，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并將其插入到植物基因組中，可以通過減數(shù)分裂穩(wěn)定的遺傳給后代，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。這成為農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)，也是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)與其它轉(zhuǎn)化體系相比，具有許多突出的優(yōu)點(diǎn)：①農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的機(jī)理研究得最清楚，方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；②該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是模仿或利用天然的轉(zhuǎn)化載體體系，成功率高，效果好；③該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好；④該轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡單，易于推廣。農(nóng)桿菌浸潤瞬時(shí)共表達(dá)方法是一個(gè)可靠的和靈活的工具來研究植物抗性基因和TMV復(fù)制酶基因相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生防御反應(yīng)，使植物獲得系統(tǒng)抗性。農(nóng)桿菌浸潤法不僅在基因功能鑒定、蛋白質(zhì)互作及基因沉默抑制子鑒定等研究方面得到廣泛應(yīng)用，目前還應(yīng)用在小RNA的研究中。本發(fā)明首先將目的基因和病毒復(fù)制酶基因分別連接到雙元表達(dá)載體，再導(dǎo)人農(nóng)桿菌GV3101后浸潤三生煙或本生煙。根據(jù)能否產(chǎn)生過敏性反應(yīng)（HR）來判斷其是否具有抗性，可以快速、穩(wěn)定地對(duì)目的基因進(jìn)行功能鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提拱一種快速、簡便、有效的在煙草葉片上瞬時(shí)共表達(dá)目的基因和TMV復(fù)制酶基因產(chǎn)生過敏性反應(yīng)的抗性基因的鑒定方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）、將含有目的基因和TMV復(fù)制酶基因的兩個(gè)表達(dá)載體分別通過電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101(pMP90)感受態(tài)細(xì)胞；（2）、加1mL左右SOC培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，在28℃左右恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h左右；（3）、將所得培養(yǎng)物涂布于含有25mg/mL左右卡那霉素和50mg/mL左右利福平的LB固體平板培養(yǎng)基上，在28℃左右過夜培養(yǎng)2晚；(4)、挑取單菌落于含有25mg/mL左右卡那霉素和50mg/mL左右利福平的5mLLB液體培養(yǎng)基中，在28℃左右的搖床上震蕩培養(yǎng)1-2天至對(duì)數(shù)生長期，得過夜培養(yǎng)物；（5）、取0.3mL左右過夜培養(yǎng)物置于含50mg/mL左右卡那霉素、10mmol/L左右pH5.6的MES和20mmol/L左右乙酰丁香酮的5mL左右LB液體培養(yǎng)基中，28℃左右培養(yǎng)3-4h；（6）、在室溫、3000rpm條件下將所得產(chǎn)物離心30min左右，沉淀物用含10mmol/L左右氯化鎂、10mmol/L左右pH5.6的MES和150mmol/L左右乙酰丁香酮的5mL左右浸潤緩沖液重懸至OD600約為0.5的農(nóng)桿菌懸濁液；（7）、等體積兩種農(nóng)桿菌懸濁液混和在一起，放置室溫下靜置培養(yǎng)2-3h，得實(shí)驗(yàn)用農(nóng)桿菌懸濁液；(8)、選用6-8周齡健壯煙草為材料，用針尖輕輕在葉片背腹面劃一小口；(9)、用1mL無針注射器將實(shí)驗(yàn)用農(nóng)桿菌懸濁液浸潤到煙草葉片，在20-28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行抗性反應(yīng)觀察；(10)、如果出現(xiàn)過敏性反應(yīng)，則表明該目的基因?qū)ζ湎鄳?yīng)的病毒具有抗性；如果不出現(xiàn)過敏性反應(yīng)，則說明其不具有抗性。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（1)的電擊法使用伯樂公司的電轉(zhuǎn)化儀，其轉(zhuǎn)化條件為0.1cm電擊杯、輸出25mF、電壓1.8kV和抗性200W。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（3）的培養(yǎng)基是常規(guī)的LB培養(yǎng)基，所加抗生素卡那霉素和利福平的濃度分別為25mg/mL和50mg/mL。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（5）的培養(yǎng)基中含有50mg/mL卡那霉素、10mmol/LpH5.6MES和20mmol/L乙酰丁香酮。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（6）的浸潤緩沖液5mL中含有10mmol/L氯化鎂、10mmol/LpH5.6MES和150mmol/L乙酰丁香酮，且最終OD600為0.5。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（8）的含有目的基因和TMV復(fù)制酶基因的農(nóng)桿菌懸濁液按1:1混和。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（9）的農(nóng)桿菌浸潤法用1mL無針注射器將農(nóng)桿菌懸濁液浸潤到活體煙草葉片。所述的一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，其特征在于：步驟（10）的抗性反應(yīng)觀察中，所述的過敏性反應(yīng)（HR）指的是煙草感染部位局部的細(xì)胞死亡形成壞死斑。本發(fā)明的原理為：1、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所用的農(nóng)桿菌株系為GV3101(pMP90),屬根癌農(nóng)桿菌，在煙草的遺傳轉(zhuǎn)化中效果比較好。采用的轉(zhuǎn)化方法是電擊轉(zhuǎn)化法，而不是常用的凍融法或熱激法，使用伯樂公司的電轉(zhuǎn)化儀，其轉(zhuǎn)化參數(shù)為0.1cm電擊杯、輸出25mF、電壓1.8kV和抗性200W，提高了轉(zhuǎn)化效率；2、本發(fā)明所用的培養(yǎng)基是最常用的LB培養(yǎng)基，而不是較復(fù)雜的YEP或YEB培養(yǎng)基，且所加抗生素分別為25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平，可以有效的殺死沒有轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌，節(jié)省了篩選時(shí)間；3、本發(fā)明使用了農(nóng)桿菌的再培養(yǎng)過程，將處于對(duì)數(shù)生長期的農(nóng)桿菌置于含50mg/mL卡那霉素、10mmol/LMES(pH5.6)和20mmol/L乙酰丁香酮的LB液體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3-4小時(shí)，提高農(nóng)桿菌的浸染力；4、本發(fā)明所用的浸潤緩沖液中含有10mmol/L氯化鎂、10mmol/LMES(pH5.6)和150mmol/L乙酰丁香酮，且最終OD600約為0.5，提高的農(nóng)桿菌共表達(dá)效果；5、本發(fā)明所用的浸潤方法是用針尖輕輕在煙草葉片背腹面劃一小口，然后用無針注射器將農(nóng)桿菌混和懸濁液浸潤到煙草葉片，提高浸潤效率。這種方法操作簡便，根據(jù)是否出現(xiàn)HR現(xiàn)象快速、有效地鑒定該基因是否對(duì)相應(yīng)的病毒具有抗性。附圖說明圖1為農(nóng)桿菌浸潤法鑒定抗性基因的模式圖。圖2為在Nicotianatabacum葉片上農(nóng)桿菌共浸潤誘導(dǎo)HR。（左圖為對(duì)照，右圖為抗性基因與病毒復(fù)制酶基因互作引起過敏性反應(yīng)。）圖3為在Nicotianabenthamiana葉片上農(nóng)桿菌共浸潤誘導(dǎo)HR。（左圖為對(duì)照，右圖為抗性基因與病毒復(fù)制酶基因互作引起過敏性反應(yīng)。）具體實(shí)施方式、一種快速鑒定煙草抗性基因的有效方法，包括以下步驟：（1）、將含有目的基因和TMV復(fù)制酶基因的兩個(gè)表達(dá)載體分別通過電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101(pMP90)感受態(tài)細(xì)胞；（2）、加1mLSOC培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h；（3）、將培養(yǎng)物涂布于含25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的LB固體平板培養(yǎng)基上，在28℃下過夜培養(yǎng)2晚；(4)、挑取單菌落于含25mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的5mLLB液體培養(yǎng)基中，在28℃搖床上震蕩培養(yǎng)1-2天至對(duì)數(shù)生長期；（5）、取0.3mL過夜培養(yǎng)物置于含50mg/mL卡那霉素、10mmol/LMES(pH5.6)和20mmol/L乙酰丁香酮的5mLLB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)4h；（6）、在室溫、3000rpm條件下離心30min，沉淀物用含10mmol/L氯化鎂、10mmol/LMES(pH5.6)和150mmol/L乙酰丁香酮的5mL浸潤緩沖液重懸至OD600約為0.5；（7）、等體積兩種農(nóng)桿菌懸濁液混和在一起，放置室溫下靜置培養(yǎng)2h；(8)、選用7周齡健壯煙草為材料，用針尖輕輕在葉片背腹面劃一小口，便于懸濁液浸入葉片；(9)、用1mL無針注射器將農(nóng)桿菌懸濁液浸潤到煙草葉片，在25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察過敏性反應(yīng)（HR）；(10)、如果出現(xiàn)HR，則表明該目的基因?qū)ζ湎鄳?yīng)的病毒具有抗性；如果不出現(xiàn)HR，則說明其不具有抗性。