在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明涉及通過聯(lián)合生物加工方法（consolidatedbioprocessingapproach）從生物質(zhì)材料生產(chǎn)乙醇的方法和重組乳酸菌。乙醇是一種已證實的來自再生資源的替代燃料?，F(xiàn)今主要從糖或淀粉生物質(zhì)生產(chǎn)，限制了環(huán)境益處，并造成對食品工業(yè)的原材料的競爭。在過去十年來，已發(fā)起了用由木質(zhì)素纖維素原料生產(chǎn)的第2代乙醇替代這種第1代乙醇的研究努力，其包括預(yù)處理、酶促水解、糖發(fā)酵和工藝設(shè)計。朝著工業(yè)規(guī)模開發(fā)的大多數(shù)工藝方法包括加入用于纖維素和半纖維素水解的酶和使用經(jīng)改造利用C5和C6糖的特定酵母菌株。實現(xiàn)有效生物質(zhì)水解和完全糖轉(zhuǎn)化兩者對于經(jīng)濟(jì)的工藝是必不可少的。雖然酶生產(chǎn)商在近年來已實現(xiàn)了重大改進(jìn)，但是纖維素酶的成本仍在$0.5-$1.0/加侖第2代乙醇的范圍內(nèi)。旨在規(guī)避這一關(guān)鍵性成本增加項目的方法策略是聯(lián)合生物加工方法。在CBP中，生物體或生物體的混合培養(yǎng)物產(chǎn)生用于水解木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素的酶，并在不加入纖維素分解酶或半纖維素分解酶的情況下使C5和C6糖發(fā)酵成乙醇或其它有價值的產(chǎn)品。幾種具有經(jīng)改造的纖維素酶活性的嗜溫和嗜熱纖維素分解微生物以及非纖維素分解微生物正在研發(fā)中用于CBP的應(yīng)用[OlsonDG等,CurrOpinBiotechnol2011,23:1-10；LaGrangeDCApplMicrobiolBiotechnol2010,87:1195-1208；Svetlitchnyi等,BiotechnologyforBiofuels2013,6:31]。木質(zhì)素纖維素轉(zhuǎn)化成乙醇需要耐乙醇微生物，其能夠?qū)⒛举|(zhì)素纖維素降解成可發(fā)酵糖并使由于木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)水解所致而釋放的各種糖(戊糖和己糖)發(fā)酵。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是一種用于各種工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用的常見乳酸菌。植物乳桿菌在含有木質(zhì)素纖維素植物生物質(zhì)的環(huán)境中茂盛生長。例如，在農(nóng)業(yè)上，這些生物用于保存木質(zhì)素纖維素植物生物質(zhì)以用于動物飼料。在稱為秣草保藏法的過程中，它們快速在微生物群中占首要地位，并產(chǎn)生乳酸和乙酸，因此引起pH下降，這抑制了其它微生物和真菌物種。據(jù)報道，這種細(xì)菌對培養(yǎng)基中的乙醇濃度具有高耐受性(高達(dá)13%(v/v))。植物乳桿菌還能夠代謝來源于木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)的戊糖和己糖。這些特性提供這樣的細(xì)菌，其具有超過常用的產(chǎn)乙醇酵母，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的明顯的優(yōu)勢，在其天然形式下，所述釀酒酵母不代謝戊糖。另一個優(yōu)勢是其耐酸性，這使得能夠在低pH下產(chǎn)生乙醇，因此減少由其它細(xì)菌和真菌引起的可能污染，并由于有時通過預(yù)處理程序強(qiáng)加的酸性條件而節(jié)約處理步驟。此外，這些細(xì)菌的分子生物學(xué)的最新研發(fā)包括新的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)和植物乳桿菌全基因組序列的可得性。方便的遺傳操作和穩(wěn)健的外源基因表達(dá)使這些細(xì)菌的遺傳操作成為可完成的任務(wù)。美國專利申請?zhí)?0100129885教導(dǎo)了經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)纖維素酶和作為丁醇生物合成途徑的一部分的酶的微生物(包括植物乳桿菌)。美國專利申請?zhí)?0120190090教導(dǎo)了經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)纖維素酶和作為丁醇生物合成途徑的一部分的酶的微生物。Solem等[Appl.Environ.Microbiol.2013,79(8):2512]教導(dǎo)了用于乙醇生產(chǎn)的乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的遺傳工程。其它
背景技術(shù)：
：：包括美國專利申請?zhí)?0110230682。發(fā)明概述按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供包含生物質(zhì)成分和乳酸菌群的細(xì)菌培養(yǎng)物，其包含：(i)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)分泌的纖維素酶的第一乳酸菌群；(ii)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中選擇第一群:第二群的比率使得培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4；和(iii)經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生乙醇的第三乳酸菌群。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供包含生物質(zhì)成分和乳酸菌群的細(xì)菌培養(yǎng)物，其包含：(i)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)分泌的纖維素酶的第一乳酸菌群；(ii)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)分泌的木聚糖酶的第二乳酸菌群，其中選擇第一群:第二群的比率使得培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4，其中第一乳酸菌群和/或第二乳酸菌群被進(jìn)一步遺傳修飾以產(chǎn)生乙醇。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供包含以下的制品：(i)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)至少一種纖維溶解酶(fibrolyticenzyme)的第一乳酸菌群；和(ii)經(jīng)遺傳修飾以從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇的第二乳酸菌群，其中將第一乳酸菌群和第二乳酸菌群包裝在單獨的包裝中。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供包含以下的分離的細(xì)胞群：(i)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)至少一種纖維溶解酶的第一乳酸菌群；和(ii)經(jīng)遺傳修飾以從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇的第二乳酸菌群。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)至少一種纖維溶解酶且從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇的乳酸菌的分離的細(xì)胞群。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供包含本文所述分離的細(xì)胞群和生物質(zhì)成分的細(xì)菌培養(yǎng)物。按照本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，提供生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括在允許乙醇產(chǎn)生的條件下使本文所述培養(yǎng)物增殖，從而產(chǎn)生乙醇。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一乳酸菌群表達(dá)纖維素酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，制品另包含經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)木聚糖酶的第三乳酸菌群。按照本發(fā)明的一些實施方案，至少一種纖維溶解酶作為與dockerin的融合蛋白表達(dá)。按照本發(fā)明的一些實施方案，乳酸菌包含植物乳桿菌。按照本發(fā)明的一些實施方案，生物質(zhì)成分包含纖維素和/或半纖維素。按照本發(fā)明的一些實施方案，生物質(zhì)另包含木質(zhì)素。按照本發(fā)明的一些實施方案，生物質(zhì)選自紙、紙制品、廢紙、木、碎料板、鋸屑、農(nóng)業(yè)廢料、污水、青貯飼料、草、稻殼、甘蔗渣、黃麻、大麻、亞麻、竹、劍麻、馬尼拉麻、麥稈、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻類及其混合物。按照本發(fā)明的一些實施方案，選擇第一群:第二群的比率使得培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于10:1或小于1:10。按照本發(fā)明的一些實施方案，至少一種纖維溶解酶包含纖維素酶和/或木聚糖酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，至少一種纖維溶解酶是纖維素酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，分離的細(xì)胞群另包含經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)木聚糖酶的第三乳酸菌群。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一乳酸菌群包含植物乳桿菌。按照本發(fā)明的一些實施方案，第二乳酸菌群包含植物乳桿菌。按照本發(fā)明的一些實施方案，第三乳酸菌群包含植物乳桿菌。按照本發(fā)明的一些實施方案，乳酸菌包含植物乳桿菌。按照本發(fā)明的一些實施方案，纖維素酶是褐色喜熱裂孢菌(Thermobifidafusca)纖維素酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，木聚糖酶是褐色喜熱裂孢菌木聚糖酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，纖維素酶是中溫菌纖維素酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，木聚糖酶是中溫菌木聚糖酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，中溫菌是生黃瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)或白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一群和第二群包含相同的細(xì)菌菌株。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一群和第二群包含不同的細(xì)菌菌株。按照本發(fā)明的一些實施方案，第二乳酸菌群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，第三乳酸菌群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一乳酸菌群和/或第二乳酸菌群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，分離的細(xì)胞群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，醇脫氫酶是運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)醇脫氫酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，丙酮酸脫羧酶是運動發(fā)酵單胞菌丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，丙酮酸脫羧酶是胃八疊球菌(Sarcinaventriculi)丙酮酸脫羧酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，第二乳酸菌群不表達(dá)至少一種L-乳酸脫氫酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，分離的細(xì)胞群經(jīng)遺傳修飾以免表達(dá)至少一種L-乳酸脫氫酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，第三乳酸菌群不表達(dá)至少一種L-乳酸脫氫酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，第一乳酸菌群和/或第二乳酸菌群不表達(dá)至少一種L-乳酸脫氫酶。按照本發(fā)明的一些實施方案，至少一種L-乳酸脫氫酶選自L-乳酸脫氫酶1(Ldh-L1)、L-乳酸脫氫酶2(Ldh-L2)和D-乳酸脫氫酶(Ldh-D)。按照本發(fā)明的一些實施方案，第二乳酸菌群不產(chǎn)生丁醇。按照本發(fā)明的一些實施方案，不產(chǎn)生丁醇。按照本發(fā)明的一些實施方案，第三乳酸菌群不產(chǎn)生丁醇。按照本發(fā)明的一些實施方案，所述方法進(jìn)一步包括在產(chǎn)生乙醇后分離所述乙醇。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管類似或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本發(fā)明的實施方案的實踐或檢驗中，但下面描述了示例性的方法和/或材料。萬一發(fā)生抵觸，將以專利說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實例只是說明性的，并無意必然為限制性的。附圖詳述本文僅通過實施例并參考附圖對本發(fā)明的一些實施方案進(jìn)行描述?，F(xiàn)詳細(xì)地具體參照附圖，要強(qiáng)調(diào)的是示出的細(xì)節(jié)為了舉例，而且目的是說明性地論述本發(fā)明的實施方案。在這點上，隨附圖進(jìn)行的說明使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白如何可實施本發(fā)明的實施方案。附圖中：圖1A-B是說明在37℃或50℃下且在pH5或6下純化的重組Cel6A(A)和Xyn11A(B)酶對PASC或木聚糖的比較酶活性的條線圖。酶活性定義為在30分鐘反應(yīng)期后的總還原糖(mM)。各反應(yīng)一式三份進(jìn)行，注明了標(biāo)準(zhǔn)差。圖2A-B是來自轉(zhuǎn)化的乳桿菌培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)印記分析的照片。A.泳道1-3：分別用Lp1、Lp2和No-Lp質(zhì)粒表達(dá)的Cel6A。B.泳道1-3：分別用Lp1、Lp2和No-Lp質(zhì)粒表達(dá)的Xyn11A。分泌的Cel6A和Xyn11A的計算質(zhì)量分別為46.9kDa和33.2kDa。手工插入圖A（PanelA）中的預(yù)染色的分子量標(biāo)志物的泳道作為印跡的化學(xué)發(fā)光圖像的參照。圖3A-D是說明定量測定分泌的酶的條線圖。A.單位為nM的遞增濃度的純化Cel6A和2μL濃縮的培養(yǎng)上清液的點印跡分析。該圖顯示黑色的校準(zhǔn)曲線的各點的平均強(qiáng)度，而白色圓圈表示Cel6A培養(yǎng)物(No-Lp、Lp1和Lp2)的點的強(qiáng)度。B.以nM為單位的遞增濃度的純化Xyn11A和2μL透析培養(yǎng)上清液的點印跡分析。圖中Lp2和No-Lp樣品之間不相關(guān)的點被修剪。C.對PASC的酶活性。用遞增濃度的純化Cel6A和30μL濃縮的培養(yǎng)上清液進(jìn)行反應(yīng)。酶活性定義為在18小時反應(yīng)期后釋放的可溶性還原糖(mM)。各反應(yīng)一式三份進(jìn)行，注明了標(biāo)準(zhǔn)差。D.對木聚糖的酶活性。用遞增濃度的純化Xyn11A和30μL透析培養(yǎng)上清液進(jìn)行反應(yīng)。酶活性定義為在2小時反應(yīng)期后的可溶性還原糖(mM)。各反應(yīng)一式三份進(jìn)行，并標(biāo)明了木聚糖水解的標(biāo)準(zhǔn)差。圖4是說明分泌的酶對各種底物的活性的條線圖。來源于產(chǎn)生纖維素酶(灰色條形)或木聚糖酶(白色條形)的培養(yǎng)物的上清液的比較酶活性。將底物、PASC、木聚糖或預(yù)處理小麥麥稈與30μl上清液(濃縮至約16.5nM的酶)一起孵育。Cel6A的酶活性用灰色條形表示，Xyn11A用白色條形表示。酶活性定義為在pH5和37℃下對于木聚糖在2小時反應(yīng)期后、對于PASC在18小時孵育后或?qū)τ谛←滬湺?4小時孵育后的可溶性還原糖(mM)。各反應(yīng)一式三份進(jìn)行，注明了標(biāo)準(zhǔn)差。圖5是說明產(chǎn)生纖維素酶和木聚糖酶的共培養(yǎng)物的上清液中的酶活性的條線圖。底物是預(yù)處理的小麥麥稈，將測量的活性與相應(yīng)的理論相加效應(yīng)進(jìn)行比較。使用以下不同的比率(Cel6A/Xyn11A)接種細(xì)胞：1/500、1/100、1/50、1/10、1/1、10/1、50/1、100/1和500/1(其中10/1細(xì)胞比率相當(dāng)于近似1:1摩爾比率的分泌的酶，因為纖維素酶生產(chǎn)約低10倍；參見正文和圖3)。反應(yīng)中預(yù)處理小麥麥稈(干物質(zhì))的濃度為3.5g/l。假設(shè)所有檢測的還原末端屬于二聚體，則最高檢測的產(chǎn)物濃度(1:500比率)表示27.6%多糖轉(zhuǎn)化。酶活性定義為在37℃和pH5下在24小時反應(yīng)期后的可溶性還原糖(mM)。各反應(yīng)一式三份進(jìn)行，注明了標(biāo)準(zhǔn)差。理論相加效應(yīng)定義為各個分泌Cel6A和分泌Xyn11A的培養(yǎng)物的活性總和(有關(guān)詳細(xì)解釋參見材料和方法部分)，協(xié)同作用計算為測量的活性和假定相加的理論活性之間的比率。圖6是說明如通過RT-PCR測定的在生長期后培養(yǎng)物中Lp1-Cel6A和Lp2-Xyn11A之間的比率的條線圖。使用以下不同的比率(Cel6A/Xyn11A)接種培養(yǎng)物：1/500、1/100、1/50、1/10、1/1、10/1、50/1、100/1和500/1。測定各共培養(yǎng)物的各質(zhì)粒的總拷貝數(shù)，并計算比率。本發(fā)明具體實施方案的描述在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明涉及通過聯(lián)合生物加工方法從生物質(zhì)材料生產(chǎn)乙醇的方法和重組乳酸菌。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，要了解本發(fā)明不必在其應(yīng)用方面局限于以下描述列出或?qū)嵤├e例說明的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實施方案或以不同方式實施或進(jìn)行。木質(zhì)素纖維素生物質(zhì)是一種用于產(chǎn)生糖的重要的可再生資源。這些糖的發(fā)酵可產(chǎn)生商業(yè)上有價值的最終產(chǎn)品，包括生物燃料和目前來源于石油的化學(xué)品。雖然單糖發(fā)酵成乙醇是相對簡單的，但是纖維素類生物質(zhì)高效轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖富有挑戰(zhàn)性。通常，酵母用作主要的生產(chǎn)生物。然而，酵母具有缺點，包括其生長和發(fā)酵的速率慢、其僅使少數(shù)糖自然發(fā)酵的能力及其對高溫的耐受性差。另外，木質(zhì)素纖維素預(yù)處理釋放諸如乙酸鹽等化合物，其對酵母細(xì)胞是抑制性的。乳酸菌(LAB)使己糖和戊糖自然發(fā)酵，耐受高濃度的有機(jī)酸，并耐受嚴(yán)峻條件。另外，LAB對乙醇具有內(nèi)在的高耐受性，常常作為污染物存在于生物乙醇植物中。它們能夠生長在低pH下，并且一些還在高溫下健壯生長(對于避免污染是重要的兩種性質(zhì))，此外它們滿足同時糖化和發(fā)酵(SSF)的要求。本發(fā)明人提出遺傳修飾的乳酸菌的產(chǎn)生，所述乳酸菌能夠消化木質(zhì)素纖維素的纖維素和半纖維素成分，然后在不加入纖維素分解酶或半纖維素分解酶的情況下利用釋放的戊糖和己糖合成乙醇。在簡化本發(fā)明用以實施的同時，本發(fā)明人產(chǎn)生兩種單獨的乳酸菌群，第一群經(jīng)遺傳工程改造以表達(dá)纖維素酶，第二群經(jīng)遺傳工程改造以表達(dá)木聚糖酶。分別證實了每個單獨的群對纖維素和木聚糖的酶活性(圖4)。當(dāng)混合在一起形成分泌纖維素酶和木聚糖酶兩者的基于兩種菌株細(xì)胞的聚生體時，它們在可溶性糖從小麥麥稈的總釋放中顯示協(xié)同活性(圖5)。對于1/5或更大的摩爾比觀察到協(xié)同性(>1)，其比分泌任一種酶的細(xì)菌有利。在Xyn11A分泌株占強(qiáng)主導(dǎo)地位的反應(yīng)中，觀察到最高總體活性和最大協(xié)同效應(yīng)，其達(dá)到1.8的協(xié)同因子，并產(chǎn)生高達(dá)27.6%的可用糖（availiablesugars）。本發(fā)明人提出在上述基于兩種菌株細(xì)胞的聚生體的骨架上通過加入第3細(xì)胞群構(gòu)建以產(chǎn)生基于三種菌株細(xì)胞的聚生體，籍此對第3菌株進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)乙醇途徑的酶。本發(fā)明人進(jìn)一步考慮能夠即分解木質(zhì)素纖維素材料又使用該反應(yīng)的最終產(chǎn)品以從中產(chǎn)生乙醇的乳酸菌群的其它排列（permutations）。因此，按照本發(fā)明的一個方面，提供包含以下的制品：(i)經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)至少一種纖維溶解酶的第一乳酸菌群；和(ii)經(jīng)遺傳修飾以從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇的第二乳酸菌群，其中將第一乳酸菌群和第二乳酸菌群包裝在單獨的包裝中?？紤]用于本發(fā)明的乳酸菌的實例包括但不限于植物乳桿菌、乳酸乳球菌、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)。按照一個具體的實施方案，乳酸菌包含植物乳桿菌。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明的分離群體不必是純的群體，可包含污染量的其它細(xì)菌菌種或菌株。此外，在描述細(xì)菌的聚生體時(即其中以與第2細(xì)菌群和任選第3細(xì)菌群不同的方式對第1細(xì)菌群進(jìn)行遺傳修飾)，應(yīng)認(rèn)識到，各群可包含相同的細(xì)菌菌株和/或菌種，或備選第1和第2(任選第3)群可包含不同的細(xì)菌菌種/菌株。如所提及的，第1細(xì)菌群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)纖維溶解酶。本文所用術(shù)語“纖維溶解酶”是指包括纖維素酶和木聚糖酶兩者的酶類。術(shù)語“纖維素酶”是指內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶兩者。內(nèi)切葡聚糖酶將纖維素鏈隨機(jī)切成較小單位。外切葡聚糖酶包括纖維二糖水解酶，它從纖維素鏈的末端釋放葡萄糖二聚體(纖維二糖)；葡聚糖水解酶，它從纖維素鏈的末端釋放葡萄糖單體；和β-葡糖苷酶，它從纖維二糖二聚體和可溶性纖維糊精釋放D-葡萄糖。術(shù)語“外切葡聚糖酶”、“外切纖維二糖水解酶”或“CBH”是指歸類為E.C.3.2.1.91的一組纖維素酶。這些酶從纖維素的還原或非還原末端水解纖維二糖。外切纖維二糖水解酶包括但不限于歸類于GH5、GH6、GH7、GH9和GH48GH家族的酶。術(shù)語“內(nèi)切葡聚糖酶”或“EG”是指歸類為E.C.3.2.1.4.的一組纖維素酶。這些酶水解纖維素的內(nèi)部β-1,4糖苷鍵。內(nèi)切葡聚糖酶包括但不限于歸類于GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH12、GH44、GH45、GH48、GH51、GH61和GH74GH家族的酶。術(shù)語“木聚糖酶”是指將線性多糖β-1,4-木聚糖降解成為木糖的酶類，因此分解半纖維素，植物細(xì)胞壁的主要成分之一。木聚糖酶包括相當(dāng)于酶委托號3.2.1.8的那些酶。木聚糖酶包括但不限于歸類于GH5、GH8、GH10、GH11和GH43GH家族的酶。應(yīng)認(rèn)識到，第1細(xì)菌群可包含2個亞群，第1亞群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)纖維素酶，第2亞群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)木聚糖酶?；蛘?，第1細(xì)菌群可經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)至少2種纖維溶解酶，第1種是纖維素酶，第2種是木聚糖酶。合適的纖維素酶的一些實例包括但不限于來自以下的纖維素酶：嗜熱細(xì)菌褐色喜熱裂孢菌(DNA：SEQIDNO:12，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:13)、解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)(蛋白質(zhì)：SEQIDNO:28)、雙孢嗜熱雙孢菌(Thermobisporabispora)(DNA：SEQIDNO:29，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:30)和彎曲高溫單孢菌(Themomonosporacurvata)(DNA：SEQIDNO:31，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:32)。合適的木聚糖酶的一些實例包括但不限于來自以下的木聚糖酶：嗜熱細(xì)菌褐色喜熱裂孢菌(DNA：SEQIDNO:14，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:15)、Clostridiumclariflavum(DNA：SEQIDNO:18，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:19)、熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)(DNA：SEQIDNO:20，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:21)、Thermobifidahalotolerans(DNA：SEQIDNO:22，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:23)、雙孢嗜熱雙孢菌(DNA：SEQIDNO:24，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:25)、Thermopolysporaflexuosa(DNA：SEQIDNO:26，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:27)。本發(fā)明進(jìn)一步考慮來自是反芻動物腸生態(tài)系統(tǒng)的棲息菌的纖維降解細(xì)菌的纖維素酶和木聚糖酶。這類細(xì)菌包括生黃瘤胃球菌或白色瘤胃球菌，這些菌種每一個的菌株的基因組均已測序并部分表征[Rincon等,2010,PLoSONE5,e12476]。還考慮了來自其它中溫環(huán)境(但非反芻動物)來源的合適酶的替代來源。這些包括來自下列產(chǎn)多纖維素酶體細(xì)菌的酶：解纖維素醋弧菌(Acetivibriocellulolyticus)、溶纖維素擬桿菌(Bacteroidescellulosolvens)、溶紙梭菌(Clostridiumpapyrosolvens)和解纖維素梭菌(Clostridiumcellulolyticum)。如所提及的，第2細(xì)菌群經(jīng)遺傳修飾以從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇。為了從C5或C6糖產(chǎn)生乙醇，本發(fā)明這個方面的細(xì)菌群可經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶。術(shù)語“丙酮酸脫羧酶”(pdc)是指用于在發(fā)酵期間指導(dǎo)丙酮酸流向乙醛的酶。示例性的pdc序列是Conway等人(J.Bacteriol.169(3),949-954(1987))描述并以GenBank登錄號AAA27696列出的運動發(fā)酵單胞菌pdc。術(shù)語“醇脫氫酶”是指醇脫氫酶A(adhA)、醇脫氫酶B(adhB)和醇脫氫酶E(adhE)的至少一種，并且是指在發(fā)酵條件下將乙醛轉(zhuǎn)化成乙醇的酶。示例性的adhA序列是Keshav等人(J.Bacteriol.172(5),2491-2497(1990))描述并以GenBank登錄號AAA27682列出的運動發(fā)酵單胞菌adhA。示例性的adhB序列是Conway等人(J.Bacteriol.169(6),2591-2597(1987))描述并以GenBank登錄號AAA27683列出的運動發(fā)酵單胞菌adhB。示例性的adhE序列是Fischer等(J.Bacteriol.175(21),6959-6969(1993)描述并以GenBank登錄號CAA51344列出的大腸桿菌(E.coli)adhE。因此，合適的醇脫氫酶的實例來自運動發(fā)酵單胞菌(DNA：SEQIDNO:33，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:34)。SEQIDNO:39列出了編碼優(yōu)化醇脫氫酶的DNA序列的另一個實例。合適的丙酮酸脫羧酶的實例來自運動發(fā)酵單胞菌(DNA：SEQIDNO:35，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:36)或來自胃八疊球菌(DNA：SEQIDNO:37，蛋白質(zhì)：SEQIDNO:38)。SEQIDNO:40列出了編碼優(yōu)化丙酮酸脫羧酶的DNA序列的另一個實例。技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到，具有與來自許多其它來源的序列相同的序列的酶可用于本發(fā)明。此外，應(yīng)認(rèn)識到，在本發(fā)明的乳酸菌中表達(dá)的酶的序列不必與來自其源生物的序列100%同源。因此，在本發(fā)明的乳酸菌中表達(dá)的酶可以是同源物和包括序列的特定氨基酸的添加或缺失的其它修飾(例如，如使用默認(rèn)參數(shù)應(yīng)用國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI)的BlastP軟件測定，與源生物的天然氨基酸序列有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少91%、至少93%、至少95%或更高比如說100%同源的多肽)。同源物還可以是指其直向同源物(ortholog)、缺失、插入或取代變體，包括氨基酸取代及其生物活性多肽片段。因為本文所述酶是眾所周知的，且因為基因組測序的普遍性，所以本領(lǐng)域的技術(shù)人員可采用生物信息學(xué)方法，基于序列相似性容易地鑒定合適的酶(例如纖維素酶、木聚糖酶、醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分了解，許多水平的序列同一性在鑒定來自其它物種的多肽中是有用的，其中所述多肽具有相同或類似的功能或活性。百分比同一性的有用實例包括但不限于：24%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%，或從24%到100%的任何整數(shù)百分比可用于描述本發(fā)明，例如25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。生物信息學(xué)方法通常包括使用可市購獲得的或獨立研發(fā)的序列分析軟件。典型的序列分析軟件會包括但不限于1.)程序GCG套件(WisconsinPackage9.0版，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wis.)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,Wis.)；4.)Sequencher(GeneCodesCorporation,AnnArbor,Mish.)；和5.)并入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.](1994),MeetingDate1992,111-20.編輯:Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,N.Y.)。在本申請的文本中，應(yīng)了解其中序列分析軟件用于分析，分析結(jié)果會基于所引用的程序的“默認(rèn)值”，除非另有說明。本文所用“默認(rèn)值”會意指在最初的初始化時最初與軟件一起加載的任何值或參數(shù)組。通常應(yīng)用具有已知纖維素酶/木聚糖酶/醇脫氫酶/丙酮酸脫羧酶氨基酸序列(例如本文提供的序列)的可公開獲取的數(shù)據(jù)庫的BLAST(上文所述)搜索鑒定可用于本發(fā)明菌株的酶及其編碼序列?？赏ㄟ^用編碼酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，來實現(xiàn)異源酶例如纖維素酶、木聚糖酶、醇脫氫酶和丙酮酸脫羧酶的表達(dá)。通常編碼序列是用于轉(zhuǎn)化的嵌合基因的一部分，其包括與編碼序列有效連接的啟動子以及核糖體結(jié)合部位和終止調(diào)控區(qū)。如果編碼序列與對于編碼酶的天然基因不是天然的調(diào)節(jié)序列組合，則即使它包括來自用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的酶的編碼序列，嵌合基因也是異源的。本文所用術(shù)語“多核苷酸”是指以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或混合多核苷酸序列(例如上述的組合)的形式分離并提供的單鏈或雙鏈核酸序列。術(shù)語“分離的”是指至少部分從天然環(huán)境(例如從細(xì)菌細(xì)胞)分離。本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物中，導(dǎo)致遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化的”生物。術(shù)語“啟動子”是指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子可以其整體來源于天然基因，或由來源于天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員要了解，不同的啟動子可指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中表達(dá)，或在不同的發(fā)育階段表達(dá)，或在響應(yīng)不同的環(huán)境或生理條件時表達(dá)。引起基因在大多數(shù)時間內(nèi)在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。要進(jìn)一步認(rèn)識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切界限尚未完全界定，不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。密碼子簡并是指允許核苷酸序列變化而不影響編碼多肽的氨基酸序列的遺傳密碼的性質(zhì)。技術(shù)人員充分了解特定寄主細(xì)胞在選擇核苷酸密碼子用以規(guī)定給定氨基酸時表現(xiàn)出的“密碼子偏倚”。因此，當(dāng)合成用于改進(jìn)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時，合乎需要的是設(shè)計基因使得其密碼子選擇的頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子選擇的頻率。因此，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，可根據(jù)選定宿主的密碼子選擇，使密碼子優(yōu)化用于表達(dá)。術(shù)語“密碼子優(yōu)化”，當(dāng)它涉及用于轉(zhuǎn)化不同宿主的核酸分子的編碼區(qū)或基因時，是指改變核酸分子的編碼區(qū)或基因的密碼子以反映宿主生物的典型密碼子選擇而不改變由DNA編碼的多肽?？捎糜谵D(zhuǎn)化多種宿主細(xì)胞的載體是常見的并描述于文獻(xiàn)中。通常載體含有允許在所需宿主中自主復(fù)制或染色體整合的選擇標(biāo)志物和序列。另外，合適的載體可包含帶有轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的啟動子區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止調(diào)控區(qū)，它們之間可插入編碼區(qū)DNA片段以提供插入編碼區(qū)的表達(dá)。2個調(diào)控區(qū)都可來源于與待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因，盡管應(yīng)理解，所述調(diào)控區(qū)還可來源于對選擇作為生產(chǎn)宿主的具體物種不是天然的基因。本文所用術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”是指常常攜帶不是細(xì)胞中心代謝一部分的基因并且一般呈環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的染色體外元件。所述元件可以是來源于任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀、單鏈或雙鏈的DNA或RNA，其中多個核苷酸序列連接或重組入獨特的構(gòu)建體中，所述構(gòu)建體能夠?qū)幼悠魏瓦x定的基因產(chǎn)物的DNA序列以及合適的3’非翻譯序列引入細(xì)胞中。起始調(diào)控區(qū)或啟動子(其可用于驅(qū)動纖維素酶或木聚糖酶編碼區(qū)在乙醇中表達(dá)（whichareusefultodriveexpressionofacellulaseorxylanasecodingregioninethanol-）)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉。一些實例包括amy、apr和npr啟動子；nisA啟動子(可用于在革蘭氏陽性菌中表達(dá)(Eichenbaum等,Appl.Environ.Microbiol.64(8):2763-2769(1998))和合成的P11啟動子(可用于在植物乳桿菌中表達(dá)，Rud等,Microbiology152:1011-1019(2006))。另外，植物乳桿菌的ldhL1和fabZ1啟動子可用于在LAB中表達(dá)嵌合基因。fabZ1啟動子指導(dǎo)具有編碼(3R)-羥基肉豆蔻酰-[?；d體蛋白質(zhì)]脫水酶的第1基因fabZ1的操縱子轉(zhuǎn)錄。終止調(diào)控區(qū)還可來源于不同的基因，通常對優(yōu)選的宿主是天然的基因。任選終止位點可為非必需的?？捎糜谌樗峋妮d體包括具有允許在大腸桿菌和乳酸菌兩者中復(fù)制和選擇的2個復(fù)制起點和2個選擇標(biāo)志物的載體。一個實例為pFP996，其可用于植物乳桿菌和其它乳酸菌(LAB)中。用于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和鏈球菌(Streptococcus)轉(zhuǎn)化的許多質(zhì)粒和載體一般可用于乳酸菌。合適載體的非限制性實例包括pAMβ1及其衍生物(Renault等,Gene183:175-182(1996)；和O’Sullivan等,Gene137:227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等,Appl.Environ.Microbiol.62:1481-1486(1996))；pMG1，一種接合質(zhì)粒(Tanimoto等,J.Bacteriol.184:5800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等,Appl.Environ.Microbiol.63:4581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等,Appl.Environ.Microbiol.67:1262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等,Antimicrob.AgentsChemother.38:1899-1903(1994))。還報道了來自植物乳桿菌的幾種質(zhì)粒(例如vanKranenburgR,GolicN,BongersR,LeerRJ,deVosWM,SiezenRJ,KleerebezemM.Appl.Environ.Microbiol.2005March；71(3):1223-123)。用于產(chǎn)生適用于本發(fā)明的載體的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual（分子克?。簩嶒炇沂謨裕?第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)(下文為"Maniatis")；和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions（使用基因融合的實驗）,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984)；以及Ausubel,F.M.等,CurrentProtocolsinMolecularBiology（分子生物學(xué)現(xiàn)行方案）,由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。按照一個實施方案，在乳酸菌中表達(dá)的纖維溶解酶被錨定在細(xì)胞壁上。按照另外又一個實施方案，在乳酸菌中表達(dá)的纖維溶解酶作為與dockerin分子一起的分泌融合蛋白表達(dá)。以這種方式，可產(chǎn)生包含錨定細(xì)胞的纖維素酶和木聚糖酶的多纖維素酶體。多纖維素酶體復(fù)合物的特征在于“黏結(jié)蛋白”和“dockerin”模件之間強(qiáng)的雙模蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，其將各種酶整合到復(fù)合物中。黏結(jié)蛋白模件是“支架蛋白”亞基(非酶蛋白質(zhì)成分)的一部分，它通過其常駐dockerin將酶并入到復(fù)合物中。主要的支架蛋白亞基還包括糖類(例如纖維素)結(jié)合模件(CBM)，通過它復(fù)合物識別并結(jié)合纖維素類底物。有關(guān)如何制備所述多纖維素酶體的詳情參見例如Alber等,2009,ProteinSci77,699-709；Bayer等,2009,Biotechnologyoflignocellulosedegradationandbiomassutilization(木質(zhì)素纖維素降解和生物質(zhì)利用的生物技術(shù))(Sakka,K.,Karita,S.,Kimura,T.,Sakka,M.,Matsui,H.,Miyake,H.和Tanaka,A.編輯),第183-205頁.ItoPrintPublishingDivision,ISBN978-4-9903-219-6-3C-3845；Berg等,2009,PLoSONE4,e6650以及Maki等,2009,IntJBiolSci.2009；5(5):500-516。由于本發(fā)明考慮分泌在細(xì)菌中表達(dá)的纖維素酶和木聚糖酶，通常編碼酶的多核苷酸編碼該酶的前蛋白質(zhì)形式。按照一個具體的實施方案，用于表達(dá)纖維素酶和木聚糖酶的載體基于pSIP系統(tǒng)，其進(jìn)一步描述于Sorvig等,2005,Microbiology151:2439-2449；以及MathiesenG等,Journalofappliedmicrobiology105:215-226。本發(fā)明人進(jìn)一步考慮也使用pSIP系統(tǒng)以表達(dá)醇合成酶。術(shù)語“前蛋白質(zhì)”是指連接有氨基端信號肽區(qū)的分泌的蛋白質(zhì)。信號肽在分泌前被信號肽酶從前蛋白質(zhì)中切除以產(chǎn)生“成熟的”或“分泌的”蛋白質(zhì)。信號肽對于具體的酶序列可以是或不是同源的。示例性的信號肽包括來源于植物乳桿菌WCFS1蛋白pLp_2145s(SEQIDNO:16)和pLp_3050s(SEQIDNO:17)的信號肽。可用采本領(lǐng)域已知方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述方法例如：電穿孔(Cruz-Rodz等,MolecularGeneticsandGenomics（分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)）224:1252-154(1990)；Bringel等,Appl.Microbiol.Biotechnol.33:664-670(1990)；Alegre等,FEMSMicrobiologyletters241:73-77(2004))和綴合(Shrago等,Appl.Environ.Microbiol.52:574-576(1986))。還可使用整合載體將嵌合基因整合到乳酸菌的染色體中(Hols等,Appl.Environ.Microbiol.60:1401-1403(1990)；Jang等,Micro.Lett.24:191-195(2003))。應(yīng)認(rèn)識到，所述方法進(jìn)一步包括使編碼干擾或以別的方式降低通過乙醇生產(chǎn)基因產(chǎn)生的乙醇的量的多肽的一種或多種基因失活。按照本發(fā)明，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多方法中的任一種使所述基因失活，籍此防止基因編碼其既定多肽或編碼其既定多肽的活性形式。因此，通過例如突變、缺失、插入、重復(fù)、錯義、移碼、重復(fù)、無義突變或其它改變或修飾使所述基因失活，使得基因活性(即轉(zhuǎn)錄)被阻斷或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生功能上無活性的多肽。按照本發(fā)明有利的實施方案，通過缺失使基因失活。因此，重組細(xì)菌可具有其它酶的表達(dá)降低、敲除或不表達(dá)，所述酶包括但不限于丙酮酸氧化酶(EC1.2.2.2)、D-乳酸脫氫酶(EC1.1.1.28；參見例如U.S.20110230682，通過引用結(jié)合到本文中)、L-乳酸脫氫酶(EC1.1.1.27)、乙酸激酶(EC2.7.2.1)、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.3.1.8)、檸檬酸合酶(EC2.3.3.1)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC4.1.1.31)。這些操作所達(dá)到的程度有必要通過存在于生物反應(yīng)器或搖瓶中的觀察到的副產(chǎn)物來確定。例如，觀察到乙酸將表明丙酮酸氧化酶、乙酸激酶和/或磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶酶活性的缺失。在另一個實例中，觀察到D-乳酸將表明D-乳酸脫氫酶酶活性的缺失，而觀察到琥珀酸、蘋果酸、富馬酸、草酰乙酸或檸檬酸將表明檸檬酸合酶和/或PEP羧化酶酶活性的缺失。在一個實施方案中，本發(fā)明考慮使用乳酸菌群的組合，各群經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)不同的酶或不同組的酶。特定系統(tǒng)中不同的群可包含相同的乳酸菌菌株。因此，例如第1細(xì)菌群可包含經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)纖維素酶的植物乳桿菌，第2細(xì)菌群可包含經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)木聚糖酶的植物乳桿菌，第3細(xì)菌群可包含植物乳桿菌經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)乙醇生物合成途徑的酶。還應(yīng)認(rèn)識到，不同的細(xì)菌細(xì)胞群可以是或不是純的群(即包含單一細(xì)菌菌株)，但可以是兩個或更多個細(xì)菌菌株的混合群。特定的細(xì)胞群可以單一制品提供，各群單獨包裝。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供經(jīng)遺傳修飾以分泌至少一種纖維溶解酶(如上文所述)且另外經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)乙醇生物合成途徑的酶(如上文所述)的乳酸菌群。各細(xì)菌細(xì)胞群的培養(yǎng)物包含生物質(zhì)成分和任選發(fā)酵培養(yǎng)基。本文所用術(shù)語“生物質(zhì)成分”是指包含纖維素和木聚糖(或可被降解以產(chǎn)生纖維素或木聚糖的其它聚合物)的生物材料。按照一個實施方案，生物質(zhì)成分包含纖維素和半纖維素。纖維素是植物細(xì)胞壁中最豐富的聚合物，構(gòu)成其含量的30-40%。第2種是半纖維素，構(gòu)成20-25%。纖維素聚合物由以線性方式通過β-(1-4)糖苷鍵連接的D-葡萄糖亞基組成。葡萄糖的重復(fù)二聚體被稱為纖維二糖，并且被視作基本纖維素亞單元。半纖維素由多種系列（aversatilearray）的支鏈糖聚合物組成，其中木聚糖最為豐富。通過β-(1-4)糖苷鍵連接的2單位的D-木糖單體構(gòu)成稱為木二糖的木聚糖的基本亞單元。除了這些基本單位以外，木聚糖通常含有與之連接的各種糖側(cè)鏈。這2種聚合物合起來占了植物細(xì)胞壁的大部分。生物材料可以是活的或死的。生物質(zhì)成分可另包括木質(zhì)素纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、甘露聚糖和常見于生物質(zhì)中的其它材料。生物質(zhì)成分來源的非限制性實例包括草(例如柳枝稷、芒屬植物(Miscanthus))、稻殼、甘蔗渣、棉、黃麻、桉樹、大麻、亞麻、竹、劍麻、馬尼拉麻、麥稈、樹葉、草屑、玉米秸草、玉米芯、酒糟、豆科植物、高粱、甘蔗、甜菜漿、木屑、鋸屑和生物質(zhì)作物(例如兩節(jié)薺屬植物)。生物質(zhì)聚合物的來源可以是非精制的植物原料(例如離子性液體處理的植物生物質(zhì))或精制的生物質(zhì)聚合物(例如山毛櫸材木聚糖或磷酸溶脹纖維素)。生物質(zhì)成分的其它來源包括紙、紙制品、廢紙、木、碎料板、鋸屑、農(nóng)業(yè)廢料、污水、青貯飼料、草、稻殼、甘蔗渣、黃麻、大麻、亞麻、竹、劍麻、馬尼拉麻、麥稈、玉米芯、玉米秸草、柳枝稷、苜蓿、干草、椰子棕、棉、海草、藻類及其混合物。除生物質(zhì)材料以外，發(fā)酵培養(yǎng)基可含有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于培養(yǎng)物生長的合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖劑和其它成分。通常使細(xì)胞在范圍為約25℃-約40℃的溫度下在合適的培養(yǎng)基中生長。用于使乳酸菌生長的合適培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的。選擇用于特定細(xì)菌菌株生長的培養(yǎng)基會是微生物學(xué)或發(fā)酵學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。還可將已知直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝產(chǎn)物阻抑的劑(例如環(huán)腺苷2’:3’-單磷酸鹽)的使用并入發(fā)酵培養(yǎng)基中。可用于遺傳修飾的細(xì)菌增殖的示例性培養(yǎng)基可包含至少10、至少20、至少30、至少40、至少50種或全部本文下表1所列成分—參見例如Wegkamp等,LettersinAppliedMicrobiology,50(2010)57-64。表1還提供各成分的示例性濃度。表1培養(yǎng)基成分g/lK2HPO421.68KH2PO412.93葡萄糖11乙酸鈉(*3H2O)1.0(1.65)檸檬酸銨0.6抗壞血酸0.5丙氨酸0.24精氨酸0.125天冬氨酸0.42半胱氨酸0.13谷氨酸0.5甘氨酸0.175組氨酸0.15異亮氨酸0.21亮氨酸0.475賴氨酸0.44甲硫氨酸0.125苯丙氨酸0.275脯氨酸0.675絲氨酸0.34蘇氨酸0.225色氨酸0.05酪氨酸0.25纈氨酸0.3256,8-二硫辛酸(thioticacid)(α-硫辛酸(α-lipoicacid))0.001生物素0.0025煙酸0.001泛酸(泛酸鈣)0.001對氨基苯甲酸0.01吡哆胺0.005吡哆醇0.002核黃素0.001硫胺0.001維生素B120.001腺嘌呤0.01鳥嘌呤0.01肌苷0.005黃嘌呤0.01乳清酸0.005胸嘧啶0.005尿嘧啶0.01MgCl2(*6H2O)0.02(0.426)CaCl2(*2H2O)0.05(0.066)MnCl2(*2H2O)0.016(0.02)FeCl3(*6H2O)0.003(0.005)FeCl2(*4H2O)0.005(0.0078)ZnSO40.005CoSO4(CoCl2*6H2O)0.0025(0.003)CuSO40.0025(NH4)6Mo7O24(*4H2O)0.0025(0.0026)用于發(fā)酵的合適的pH范圍介于pH4.5與pH7.0之間，其中優(yōu)選pH5.0-pH6.0作為初始條件。發(fā)酵可在需氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中優(yōu)選厭氧或微需氧條件。選擇培養(yǎng)物中各群的相對比率使得培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于4:1或小于1:4。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于4:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于5:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于6:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于7:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于8:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于9:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于10:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于20:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于30:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于40:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中纖維素酶:木聚糖酶的比活大于50:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于4:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于5:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于6:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于7:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于8:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于9:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于10:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于20:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于30:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于40:1。按照一個具體的實施方案，培養(yǎng)物中木聚糖酶:纖維素酶的比活大于50:1。本文所用術(shù)語“比活”是指在規(guī)定時間內(nèi)和在規(guī)定溫度下每規(guī)定量的蛋白質(zhì)所消耗的底物和/或所產(chǎn)生的產(chǎn)物的量。本發(fā)明的培養(yǎng)物還可包含能夠降解木質(zhì)素的酶。所述酶包括苯酚氧化酶，例如木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶，其可包括在諸如黃孢原毛平革菌(P.chrysosporium)、糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)和變色栓菌(Trametesversicolor)等白腐真菌中。漆酶具有寬泛的底物特異性，并隨氧自由基的形成氧化酚類和木質(zhì)素亞結(jié)構(gòu)。參與木質(zhì)素降解過程的其它酶是產(chǎn)H2O2的酶和氧化還原酶，其可位于胞內(nèi)或胞外。細(xì)菌和真菌阿魏酸酯酶和對香豆酸酯酶是能夠釋放阿魏酰基和對香豆?；南鄬π碌拿福⒃诤瘫究浦参飯杂布?xì)胞壁（recalcitrantcellwall）的生物降解中起重要作用。本發(fā)明的細(xì)胞可能具有至少約200、約250、約300、約346、約350、約400、約500、約600、約750或約1000mg木糖/g細(xì)胞/小時的特定的木糖降解速率。按照一個實施方案，細(xì)胞可具有至少1-29%的木糖轉(zhuǎn)化收率。本發(fā)明的細(xì)胞可具有至少約200、約250、約300、約346、約350、約400、約500、約600、約750或約1000mg纖維素/g細(xì)胞/小時的特定的纖維素降解速率。按照一個實施方案，細(xì)胞可具有至少1-8%的纖維素轉(zhuǎn)化收率。本發(fā)明的細(xì)胞可具有基于木質(zhì)素纖維素(或其組成糖)的乙醇收率，其是宿主細(xì)胞的乙醇收率的至少約40、約50、約55、約60、約70、約80、約85、約90、約95、約98或約99%。本發(fā)明的培養(yǎng)物可用于發(fā)酵過程以產(chǎn)生乙醇。發(fā)酵過程可以是需氧或厭氧發(fā)酵過程。厭氧發(fā)酵過程在本文定義為在缺氧下運行或其中基本不耗氧、優(yōu)選消耗小于約5、約2.5或約1mmol/L/小時、更優(yōu)選0mmol/L/小時(即檢不出氧消耗)且其中有機(jī)分子既用作電子供體又用作電子接納體的發(fā)酵過程。在缺氧時，在糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的NADH不能被氧化磷酸化所氧化。為了解決這個問題，許多微生物利用丙酮酸或其衍生物之一作為電子和氫接納體從而使NAD+再生。一種優(yōu)選的方法是用于產(chǎn)生乙醇的方法，所述方法以此包括以下步驟：(a)將含有纖維素和/或半纖維素源的培養(yǎng)基用上文定義的修飾的宿主細(xì)胞發(fā)酵，籍此宿主細(xì)胞使纖維素和/或半纖維素發(fā)酵成乙醇；和任選，(b)回收乙醇。發(fā)酵培養(yǎng)基還可包含同樣發(fā)酵成乙醇的葡萄糖源。在所述方法中，體積乙醇產(chǎn)率優(yōu)選為至少約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約5.0或約10.0g乙醇/升/小時。在所述方法中，對纖維素和/或半纖維素的乙醇收率，優(yōu)選為至少約50、約60、約70、約80、約90、約95或約98%。乙醇收率在本文定義為理論最大收率的百分比。本發(fā)明的方法還可包括回收(即分離)乙醇。乙醇產(chǎn)生的證實可采用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)進(jìn)行。因此例如，代謝產(chǎn)物可在等度溫度(例如65℃)和等度流(0.8ml/分鐘)條件下在2.5mMH2SO4中在柱(例如Phenomenex)中分離，然后通過折射率(RI)檢測器?？赏ㄟ^與標(biāo)準(zhǔn)物的比較保留時間來進(jìn)行鑒定。本文所用術(shù)語“約”是指±10%。術(shù)語“包含”、“含有”、“包括”、“含”、“具有”及其變化形式意指“包括但不限于”。術(shù)語“由……組成”意指“包括并限于”。術(shù)語“基本由……組成”意指組成、方法或結(jié)構(gòu)可包括其它成分、步驟和/或部分，但只要其它成分、步驟和/或部分不物質(zhì)上改變所要求保護(hù)的組成、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新的特征。本文所用單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有明確規(guī)定。例如，術(shù)語“化合物”或“至少一種化合物”可包括多種化合物，包括其混合物。在本申請中，本發(fā)明的不同的實施方案可以范圍形式存在。應(yīng)了解，范圍形式的描述僅出于方便和簡潔，不應(yīng)解釋為本發(fā)明范圍的不可變更的限制。因此，范圍的描述應(yīng)視為具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍的各個數(shù)值。例如，范圍例如1-6的描述應(yīng)視為具體公開了例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等子范圍，以及該范圍的各個數(shù)，例如1、2、3、4、5和6。不論范圍寬度均適用。每當(dāng)本文標(biāo)示數(shù)值范圍時，均意指包括該標(biāo)示范圍的任何引述的數(shù)值(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語“介于”第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字“之間的一個范圍/多個范圍”和“從”第一標(biāo)示數(shù)字“到”第二標(biāo)示數(shù)字“的一個范圍/多個范圍”在本文互換使用，意指包括第一標(biāo)示數(shù)字和第二標(biāo)示數(shù)字和其間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。本文所用術(shù)語“方法”是指用于完成指定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)人員已知或容易由他們從已知的方式、手段、技術(shù)和程序開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和程序。要認(rèn)識到，為了清楚起見，在單獨的實施方案的背景下描述的本發(fā)明的某些特征，也可在單一實施方案中組合提供。相反，出于簡潔起見，在單一實施方案的背景下描述的本發(fā)明的不同特征，也可單獨提供或以任何合適的亞組合提供或適用于本發(fā)明的任何其它描述的實施方案的方式提供。在不同實施方案的背景下描述的某些特征不視為所述實施方案的必需特征，除非該實施方案在無所述要素時是無效的。在下面的實施例中，得到對上文描述和隨附權(quán)利要求書部分要求保護(hù)的本發(fā)明的不同實施方案和方面的實驗支持。實施例現(xiàn)參照以下實施例，其連同上文的描述，以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實施方案。一般而言，本文所用命名法和用于本發(fā)明的實驗室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。參考文獻(xiàn)中全面闡釋了所述技術(shù)。參見例如"MolecularCloning:ALaboratoryManual（分子克?。簩嶒炇沂謨裕?Sambrook等(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology（分子生物學(xué)現(xiàn)行方案）"第I-III卷Ausubel,R.M.編輯(1994)；Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology（分子生物學(xué)現(xiàn)行方案）",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning（分子克隆的實踐指南）",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等,"RecombinantDNA（重組DNA）",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(編輯)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries（基因組分析：實驗室指南系列）",第1-4卷,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美國專利號4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057列出的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook（細(xì)胞生物學(xué)：實驗手冊）",第I-III卷Cellis,J.E.編輯(1994)；Freshney,"CultureofAnimalCells-AManualofBasicTechnique（動物細(xì)胞培養(yǎng)-基礎(chǔ)技術(shù)指南）",Wiley-Liss,N.Y.(1994),第3版；"CurrentProtocolsinImmunology（免疫學(xué)當(dāng)前方案）"第I-III卷ColiganJ.E.編輯(1994)；Stites等(編輯),"BasicandClinicalImmunology（基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)）"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯),"SelectedMethodsinCellularImmunology（細(xì)胞免疫學(xué)選擇的方法）",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980)；可用的免疫測定法大量描述于專利和科學(xué)文獻(xiàn)中，參見例如美國專利號3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；"OligonucleotideSynthesis（寡聚核苷酸合成）"Gait,M.J.編輯(1984)；“NucleicAcidHybridization（核酸雜交）"Hames,B.D.和HigginsS.J.,編輯(1985)；"TranscriptionandTranslation（轉(zhuǎn)錄和翻譯）"Hames,B.D.和HigginsS.J.,編輯(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.編輯(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes（固定的細(xì)胞和酶）"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning（分子克隆的實踐指南）"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology（酶學(xué)方法）"第1-317卷,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications（PCR方案：方法和應(yīng)用指南）",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual（蛋白質(zhì)純化和表征的策略-實驗過程指南）"CSHLPress(1996)；其全部通過引用予以結(jié)合就像在本文完全闡述一樣。在該整個文件中提供其它通用參考文獻(xiàn)。其中的方法被視為是本領(lǐng)域眾所周知的，出于方便讀者而提供。其中所含全部信息通過引用結(jié)合到本文中。材料和方法克?。喝缜八鰪暮稚矡崃焰呔蚪MDNA克隆野生型酶Cel6A和Xyn11A(21，22)。設(shè)計pET28a中的酶構(gòu)建體以含有His標(biāo)簽用于后續(xù)純化。對于植物乳桿菌中的表達(dá)和分泌，使用SalI或XhoI(SalI與XhoI相容)和HindIII限制位點，通過用合適的擴(kuò)增基因片段置換這些質(zhì)粒中的淀粉酶基因，將糖苷水解酶克隆到模塊式分泌質(zhì)粒pLp_2145sAmy和pLp_3050sAmy(15)中。為了此目的，使用正向引物5’-tcttCTCGAGatggcatcccccagacctct-3’(SEQIDNO:1)和反向引物5’-aatAAGCTTtcagctggcggcgcaggtaag-3’(SEQIDNO:2)(XhoI和HindIII位點為大寫字母)，擴(kuò)增Cel6A編碼基因。使用5’-tcttGTCGACatggccgtgacctccaacgag-3’(SEQIDNO:3)和5’-aatAAGCTTctagttggcgctgcaggaca-3’(SEQIDNO:4)引物(SalI和HindIII位點為大寫字母)，克隆擴(kuò)增的Xyn11A編碼基因。pLp_2145s構(gòu)建體稱為Lp1，而含有pLP_3050s的構(gòu)建體稱為Lp2。pLp_2145sAmy和pLp_3050sAmy是pSIP400系列的一部分(13)。作為對照，將2種酶也克隆到pSIP407(稱為No-Lp)中，它含有與Lp1和Lp2相同的復(fù)制子和啟動子但沒有前導(dǎo)肽(13)。為了制備這些構(gòu)建體，將存在于pSIP407中的pepN基因用含有cel6A基因的NcoI-XbaI片段或含有xyn11A基因的BspHI-XbaI片段置換，這導(dǎo)致該基因與啟動子轉(zhuǎn)錄融合(BspHI與NcoI相容)。為了此目的，使用正向引物5’-atatatCCATGGatggcatcccccagacctcttcgc-3’(SEQIDNO:5)和反向引物5’-atatatTCTAGAtcactccaggctggcggcgcagg-3’(SEQIDNO:6；NcoI和XbaI位點為大寫字母)，擴(kuò)增Cel6A編碼基因。使用5’-tcagtcTCATGAatggccgtgacctccaacgagaccgg-3’(SEQIDNO:7)和5’-agcgtaTCTAGActagttggcgctgcaggacacc-3’引物(SEQIDNO:8；BspHI和XbaI位點為大寫字母)，克隆擴(kuò)增的Xyn11A編碼基因。為了產(chǎn)生空的pLP_2145s和pLP_3050s，使用SalI和EcoRI限制性酶切除Amy基因。將線性化質(zhì)粒純化，并使用QuickBluntingKit(NEB，MA，USA)平端化。平端片段自連產(chǎn)生空質(zhì)粒。PCR反應(yīng)使用PhusionHighFidelityDNA聚合酶F530-S(NewEnglandBiolabs，Inc)進(jìn)行，使用HiYieldTMGel/PCRFragmentsExtractionKit(RealBiotechCorporation，RBC，Taiwan)純化DNA樣品。限制性酶購自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)，T4DNA連接酶購自Fermentas(Vilnius，Lithuania)。使植物乳桿菌質(zhì)粒亞克隆入大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞(LucigenCorporation，WI，USA)中。植物乳桿菌菌株WCFS1按照Aukrust等人的方案轉(zhuǎn)化(23)。對于植物乳桿菌和大腸桿菌，用于陽性克隆選擇并加入培養(yǎng)基中的抗生素分別為10μg/ml和200μg/ml紅霉素。大腸桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)和純化：如較早的報道，使質(zhì)粒pCel6A和pXyn11A在大腸桿菌BL21(lDE3)pLysS細(xì)胞中表達(dá)，并在Ni-NTA柱(Qiagen)中純化帶His標(biāo)簽的酶(24)。在10%丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE測試重組蛋白質(zhì)的純度，使用Amicon離心過濾器(Millipore，F(xiàn)rance)合并和濃縮含有純的重組蛋白質(zhì)的流分。以用Protparam工具計算的理論消光系數(shù)，通過測量280nm處的吸光度，確定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)在50%(v/v)甘油中保存在-20℃下。用于純的酶的活性測定法：在含有0.5μM酶和7.5g/l磷酸溶脹的維素(PASC，按Lamed等人所述制備(25))或50mM檸檬酸鹽緩沖液pH5或6中的2%燕麥斯佩耳特小麥木聚糖(SigmaChem.Co,St.LouisMO)的反應(yīng)物中測試純化的重組Cel6A和Xyn11A的活性。將樣品在37或50℃下孵育30分鐘，通過置于冰上冷卻至0℃，然后在4℃下以14000rpm離心5分鐘。通過下述DNS方法，測定上清液中可溶性還原糖的量。植物乳桿菌中的蛋白質(zhì)表達(dá)：使帶有pSIP衍生的表達(dá)質(zhì)粒的植物乳桿菌WCFS1的新接種的培養(yǎng)物在37℃下MRS液體培養(yǎng)基(BDDifcoTM，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA)，含有10μg/ml紅霉素)中生長。通過加入用于sakacinP生產(chǎn)的誘導(dǎo)肽(CasloLaboratory，Denmark)(26)至25ng/ml的終濃度在OD600為0.3時誘導(dǎo)基因表達(dá)，并在37℃下另孵育3小時。對于共培養(yǎng)實驗，將產(chǎn)生纖維素酶或木聚糖酶的菌株分別以相等的OD或以不同的比率混合，然后生長并以相同的方式誘導(dǎo)。蛋白質(zhì)印記法：在SDS-PAGE凝膠(10%丙烯酰胺)上分離培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)，并使用Trans-Blot?CellMini(Bio-RadLaboratoriesLtd，Israel)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。通過將膜與5%BSA(在TrisBufferSaline-Tween20，TBS-T中制備)一起孵育1小時，封閉非特異性蛋白質(zhì)相互作用。然后將膜用TBS-T漂洗2次(1分鐘)。將針對各種酶的兔抗體(由Sigma，Israel制備)在含有1%BSA的TBS-T中與合適的膜一起孵育1小時。再次將膜用TBS-T漂洗2次(1分鐘)，然后與1:10000稀釋度的第二抗體小鼠抗兔辣根過氧化物酶(HRP)一起孵育1小時。如上述將膜漂洗，然后用TBS+1%TritonX-100漂洗2次(30分鐘)。通過將膜與等量的ECL溶液A和B(Ornat，Israel)一起孵育1分鐘，使印跡顯影。采用發(fā)光影像分析儀ImageQuantLAS4000Mini(DanyelBiotech，Israel)，定量測定化學(xué)發(fā)光。點印跡法：采用Amicon離心過濾器(Millipore，F(xiàn)rance)，將表達(dá)Cel6A酶、在OD600=1下的50ml體積培養(yǎng)物(Lp1、Lp2或No-Lp)濃縮50倍。對于Xyn11A酶，將1ml在OD600=1下的各培養(yǎng)物(Lp1、Lp2或No-Lp)在TBS中透析以除去MRS培養(yǎng)基。通過將2μl合適的溶液(在TBS中)施加到硝化纖維膜(Whatman)上，以對于纖維素酶以0.5-20nM或?qū)τ谀揪厶敲敢?.1-10nM的濃度范圍對純化的酶進(jìn)行印跡。通過施加2μl培養(yǎng)物對濃縮的和/或透析的培養(yǎng)上清液進(jìn)行印跡。然后進(jìn)行用于蛋白質(zhì)印跡的上述方案。剛果紅測定法：遵照Anbar的方案并加以修改(27)。對于木聚糖酶活性檢測使用燕麥斯佩耳特小麥木聚糖(0.3%)而不是羧甲基纖維素(CMC)。將轉(zhuǎn)化的植物乳桿菌細(xì)胞鋪展在含有紅霉素(10μg/mL)的MRS板上，并在37℃下孵育過夜。將板用含有0.3%(w/v)CMC或燕麥斯佩耳特小麥木聚糖(用于纖維素酶或木聚糖酶活性檢測)、0.7%瓊脂和200μl檸檬酸鹽緩沖液(25mM，pH5.0)中的0.1μg/mlpSIP誘導(dǎo)肽的20ml軟瓊脂覆蓋。將板在37℃下孵育2小時以誘導(dǎo)酶表達(dá)和活性。然后將板用新的剛果紅溶液(0.25%)染色10分鐘，在1MNaCl中脫色。菌落周圍暈圈的形成表示內(nèi)切葡聚糖酶或內(nèi)切木聚糖酶活性的產(chǎn)生?；钚詼y定法：通過將從0到100nM(終濃度)變化的純的重組Cel6A或30μl體積的濃縮培養(yǎng)物上清液(如上所述)在200μl最終體積的50mM乙酸鹽緩沖液pH5.0中與150μl7.5g/l磷酸溶脹纖維素(PASC)混合，來測定PASC降解。將樣品在37℃下孵育18小時，并通過將樣品管浸入冰水中終止反應(yīng)。以14000rpm將樣品離心2分鐘以除去底物。木聚糖酶測定混合物由100μl含純化的Xyn11A酶(0-5nM)的緩沖液(50mM檸檬酸鹽緩沖液pH6.0)或50mM同一緩沖液中、體積為30μl的透析的培養(yǎng)物上清液組成。加入100μl2%燕麥斯佩耳特小麥木聚糖開始反應(yīng)，在37℃下繼續(xù)2小時。將管轉(zhuǎn)移到冰水浴中終止反應(yīng)，接著以14000rpm離心2分鐘。如前所述將由Valagro(Poitiers，F(xiàn)rance)提供的小麥麥稈(0.2–0.8mm)洗滌(28，29)。然后在室溫下對材料進(jìn)行次氯酸鈉(12%)預(yù)處理1小時(30)。在200μl含有3.5g/l預(yù)處理小麥麥稈和30μl濃縮的或透析的培養(yǎng)上清液的50mM乙酸鹽/檸檬酸鹽緩沖液pH5-6.0中進(jìn)行降解測定。在來自分泌Cel6A和Xyn11A酶的菌株的共培養(yǎng)物(50ml，在OD600=1時)的上清液的情況下，采用Amicon離心過濾器(Millipore，F(xiàn)rance)濃縮50倍。使反應(yīng)物在37℃下孵育24小時。所有測定一式三份進(jìn)行。通過二硝基水楊酸(DNS)方法測量從多糖底物釋放的可溶性還原糖，來定量地測定酶活性(31，32)。將DNS溶液(150μl)加入100μl樣品中，在煮沸反應(yīng)混合物10分鐘后，測量540nm處的吸光度。利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測定糖濃度。協(xié)同作用的評價：為了測定共培養(yǎng)物中的理論酶活性(相加效應(yīng))，自兩個不同的測定法計算酶活性。在各測定法中，使酶分泌株之一連同各自攜帶空質(zhì)粒的對照菌株的共培養(yǎng)物生長(并如上所述誘導(dǎo))，針對酶活性對其上清液進(jìn)行分析。通過計算各個測量的酶的每一種的活性總和，計算理論相加活性。例如，對于1/500比率，將1體積的Cel6A分泌株(Lp1)和500體積的攜帶空pLp_3050s質(zhì)粒的菌株(作為Xyn11A分泌株(Lp2)的替換)共培養(yǎng)。平行地，將1體積的攜帶空pLp_2145s質(zhì)粒的菌株(作為Cel6A分泌株(Lp1)的替換)和500體積的Xyn11A分泌株(Lp2)共培養(yǎng)。分別測定30μl來自各共培養(yǎng)物的濃縮上清液(如上針對共培養(yǎng)物實驗所述)對小麥麥稈底物的酶活性，加在一起，并定義為理論相加效應(yīng)。然后將這些值與相應(yīng)的纖維素酶分泌株和木聚糖酶分泌株的合并的共培養(yǎng)物的值進(jìn)行比較。質(zhì)粒提取：如上所述使纖維素酶分泌株和木聚糖酶分泌株的共培養(yǎng)物生長。在OD600=1下，通過在4℃下以5000g離心10分鐘，使細(xì)胞從5ml的培養(yǎng)物中沉淀，并在200μlHigh-SpeedPlasmidMiniKit(Geneaid，NewTaipeiCity，TW)的PD1緩沖液中重新懸浮。將溶菌酶加入懸液中至3mg/ml的終濃度。使懸液在37℃下孵育15分鐘，然后如下進(jìn)行5個凍融循環(huán)：使樣品浸沒在液氮中3分鐘，轉(zhuǎn)移到70℃水浴維持另外3分鐘，然后輕輕但徹底地混合。在該步驟后，按照生產(chǎn)商說明書實施方案。實時PCR：進(jìn)行定量實時PCR分析以驗證細(xì)菌聚生體中纖維素酶分泌株和木聚糖酶分泌株之間的比率。使用正向引物5’-ATTTAGCTGGCTGGCGTAAAGTATG-3’(SEQIDNO:9)用于兩種質(zhì)粒和反向引物5’-TCATTTCAGGATTGATCATTGTTGC-3’(SEQIDNO:10)用于pLP_2145s(Lp1)和5’-GACGACCCCGAAGACACAACTAG-3’(SEQIDNO:11)用于pLP_3050s(Lp2)，使各質(zhì)粒的特定片段(對于pLP_2145s和pLP_3050s分別為140和124bp)擴(kuò)增。通過擴(kuò)增系列10倍稀釋的通過各片段擴(kuò)增獲得的量化的凝膠提取的PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生適于各質(zhì)粒量化的各個標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用4個稀釋點獲得，并應(yīng)用Rotorgene6000系列軟件(Qiagen，Hilden，Germany)計算。利用所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用相同程序計算隨后的定量。作為陽性對照，將用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的具有已知濃度的一種純化的產(chǎn)物加入各定量反應(yīng)中。這還用來評價反應(yīng)的再現(xiàn)性并將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。實施了2個陰性對照；第1個含有質(zhì)粒之一的純化產(chǎn)物和另一個的引物。實施它是為了排除引物交叉反應(yīng)性的可能性。第2對照不含任何DNA模板。所有所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合所需的效率標(biāo)準(zhǔn)(R2>0.99，90%<E<115%)。評價了培養(yǎng)物中各質(zhì)粒的拷貝數(shù)，并且確定質(zhì)粒間的比率。在10μl含有5μlAbsoluteBlueSYBRGreenMasterMix(ThermoScientific，MA，USA)、0.5μl各引物(10μM工作濃度)、2μl不含核酸酶的水和2μl10ng/μlDNA模板的反應(yīng)混合物中進(jìn)行實時PCR。擴(kuò)增包括在95℃下15分鐘的一個保持循環(huán)用于初始變性和熱啟動聚合酶系統(tǒng)的激活，然后30個循環(huán)：在95℃下10s，接著在53.3℃下退火20s和在72℃下延伸20s。為了測定擴(kuò)增的特異性，通過以1℃的增額從45℃到99℃慢慢加熱并收集熒光，來監(jiān)測PCR產(chǎn)物的解鏈曲線。結(jié)果木質(zhì)素纖維素分解酶的選擇。用于植物乳桿菌轉(zhuǎn)化的精選酶來源于極充分表征的纖維素分解細(xì)菌褐色喜熱裂孢菌。該細(xì)菌產(chǎn)生僅6種纖維素酶和4種木聚糖酶的一組酶。已知這些適度嗜熱的酶具有寬泛的溫度-活性和pH-活性(37)，這可能與乳酸桿菌發(fā)酵期間預(yù)期的條件相容。對于最初的研究，我們聚焦于褐色喜熱裂孢菌(T.fusca)內(nèi)切葡聚糖酶Cel6A(這是由纖維二糖高度誘導(dǎo)的(38))和內(nèi)切木聚糖酶Xyn11A，其為在木聚糖中的生長期間產(chǎn)生的最豐富的木聚糖酶(39)。除其催化模件外，Cel6A具有與纖維素選擇性結(jié)合的C端家族2CBM，Xyn11A含有結(jié)合纖維素和木聚糖兩者的C端家族2CBM。酶的分子質(zhì)量對于Cel6A和Xyn11A分別為46,980Da和33,168Da。Cel6A和Xyn11A的選擇還基于在酸性條件(在pH5.0下的活性>在pH6.0下的活性的90%)和在37℃下(對于Cel6A和Xyn11A分別為在50℃下的活性的~40%和~70%)的其可觀的殘留活性和其簡單的模塊式結(jié)構(gòu)，這與植物乳桿菌的正常生長相符(圖1)。通過植物乳桿菌進(jìn)行的酶分泌。使用針對各酶的特異性抗體，通過蛋白質(zhì)印跡法觀察到培養(yǎng)基中分泌的酶的存在(圖2A-B)。在攜帶Lp1和Lp2分泌質(zhì)粒的菌株的胞外部分中可觀察到酶，所觀察到的條帶與其理論質(zhì)量十分相符。還觀察到降解產(chǎn)物，即較小的條帶。攜帶沒有分泌肽的表達(dá)質(zhì)粒的菌株的上清液中未檢出胞外酶(圖2，泳道3)。通過剛果紅方法(數(shù)據(jù)未顯示)和通過培養(yǎng)上清液的活性測定法(圖3A-D；見下)，檢出轉(zhuǎn)化菌落中的胞外纖維素酶和木聚糖酶活性。采用剛果紅測定法，具有各酶的胞內(nèi)表達(dá)的對照培養(yǎng)物不顯示任何活性，而且其上清液對木聚糖或PASC不顯示水解活性。通過點印跡分析或通過測量PASC或木聚糖底物中的還原糖形成，比較胞外部分與系列稀釋的純化酶來計算不同培養(yǎng)物中分泌的酶的濃度。估計OD600=1時的纖維素酶濃度對于Lp1和Lp2分泌質(zhì)粒分別為0.33nM和0.27nM。對于木聚糖酶，估計這些值分別為2.7nM和3.3nM(圖3C，D)。通過點印跡法定量或酶活性方法計算的濃度對于2種酶是相似的，表明了分泌的酶的主要部分是有功能的，并且表達(dá)和分泌過程基本上不影響其活性。在不加入蛋白酶抑制劑的情況下在4℃下保存幾天后，培養(yǎng)上清液保持完全（full）纖維素酶/木聚糖酶活性。具有胞內(nèi)表達(dá)的菌株的培養(yǎng)上清液不顯示酶活性的事實(圖3C和D)，表明所Lp1和Lp2構(gòu)建體檢出的活性正確地反映了分泌的酶，并且不來源于細(xì)胞裂解。小麥麥稈降解：在酶促降解前，用起降低木質(zhì)素含量的作用的次氯酸鈉對小麥麥稈進(jìn)行化學(xué)預(yù)處理同時保留纖維素/半纖維素流分以促進(jìn)酶促降解。預(yù)處理的小麥麥稈的化學(xué)組成為63%纖維素、31%半纖維素和3%木質(zhì)素(30)。分泌的纖維素酶和分泌的木聚糖酶兩者顯示對預(yù)處理的小麥麥稈的酶活性(圖4)。當(dāng)在小麥麥稈上孵育時，Cel6A分泌株(Lp1)和Xyn11A分泌株(Lp2)的共培養(yǎng)物的上清液顯示出活性(圖5)。對于1/50和更大比率觀察到協(xié)同活性(>1)，其比分泌任一酶的細(xì)菌有利。在Xyn11A分泌株占強(qiáng)主導(dǎo)地位的反應(yīng)中，觀察到最高總體活性和最大協(xié)同效應(yīng)并產(chǎn)生高達(dá)27.6%的可得糖(圖5)，表明了通過Xyn11A進(jìn)行的木聚糖降解是一個比通過Cel6A進(jìn)行的纖維素降解更快的過程。這個觀察結(jié)果進(jìn)一步表明，與纖維素降解對于木聚糖可得性的有益性相比，木聚糖降解對于纖維素可得性的有益性更大。在生長期結(jié)束時不同質(zhì)粒的RT-PCR顯示細(xì)菌菌株的比率保持與接種比率相似(圖6)，因此表明2種蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌對細(xì)菌的生長速率不具有差異影響。討論在該實施例中，公開了通過植物乳桿菌成功地產(chǎn)生并分泌纖維素酶和木聚糖酶。盡管采用相同的克隆策略，但是酶以不同水平產(chǎn)生。使用小麥麥稈降解的效率作為輸出參數(shù)，建立了包含2種所得菌株的優(yōu)化細(xì)胞聚生體。這些結(jié)果提供針對先進(jìn)的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行乳桿菌工程改造的原理證明。褐色喜熱裂孢菌酶顯示范圍為50-60℃的最適溫度，但仍選擇其在37℃和pH5下相當(dāng)大的殘留活性(圖1)，所述37℃和pH5即在植物乳桿菌培養(yǎng)物中常用的條件。作為通向更復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化的第一步，本發(fā)明人研究了分泌2種酶的重組細(xì)菌的共培養(yǎng)物。這種方法是可行的，因為異源酶的表達(dá)不影響細(xì)菌生長，意味著在生長期內(nèi)菌株比率保持得相當(dāng)穩(wěn)定。使用共培養(yǎng)物的優(yōu)勢是可通過在接種期間調(diào)節(jié)各個細(xì)胞類型的比率容易地優(yōu)化細(xì)胞聚生體。在最新的出版物中，具有優(yōu)化內(nèi)切葡聚糖酶:外切葡聚糖酶:β-葡糖苷酶比率的釀酒酵母細(xì)胞的混合物與由等量的各個細(xì)胞類型組成的細(xì)胞相比產(chǎn)生1.3倍的乙酸，表明了用于木質(zhì)素纖維素生物加工的細(xì)菌聚生體的有用性(44)。還可采用這類方法平衡可能不同的生產(chǎn)水平，如本研究中針對Cel6A和Xyn11A所觀察的一樣。轉(zhuǎn)化的植物乳桿菌細(xì)胞能夠降解木聚糖或纖維素和小麥麥稈。有趣的是，對于與大量木聚糖酶的組合，共培養(yǎng)顯示明顯的協(xié)同效應(yīng)，其協(xié)同因子達(dá)到1.8。這些結(jié)果表明木聚糖酶在解構(gòu)底物中的作用使纖維素可接近纖維素酶，如之前的研究所述(45-47)。對其它細(xì)菌的若干研究表明產(chǎn)生這些木質(zhì)素纖維素分解酶的植物乳桿菌可能具有有吸引力的應(yīng)用。例如，將來自芽孢桿菌ATCC21833的纖維素酶整合到植物乳桿菌的基因組中導(dǎo)致苜蓿青貯飼料發(fā)酵的效率提高(48)。報道了用Neocallimastixsp.纖維素酶轉(zhuǎn)化的乳酸乳球菌菌株的類似結(jié)果(49)。編碼纖維溶解酶的基因在乳桿菌中的表達(dá)對于腸益生菌菌株的生長也是有益的(50-52)。最近，報道了β-葡聚糖酶和木聚糖酶在路氏乳桿菌(L.reuteri)中的共表達(dá)(52)，且轉(zhuǎn)化的菌株顯示對可溶性β-葡聚糖和木聚糖的酶活性。提供具有高分泌的木質(zhì)素纖維素分解酶的植物乳桿菌細(xì)胞是通向可以用于直接從植物生物質(zhì)生產(chǎn)工業(yè)品(例如聚乳酸或乙醇)的代謝上經(jīng)工程改造的細(xì)菌的步驟。將植物乳桿菌工程改造以從植物生物質(zhì)產(chǎn)生乙醇的構(gòu)思是非常誘人的，因為這種細(xì)菌在低pH(在3.2-4的范圍內(nèi))條件下具有對乙醇的高耐受性(高達(dá)13%(v/v))(6)。這些特征以及利用己糖和戊糖的能力可為該細(xì)菌提供與經(jīng)改造用于此目的的其它類型的微生物系統(tǒng)(例如熱纖維梭菌、釀酒酵母或大腸桿菌)的競爭性備選物(53-55)。因此，用于將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物燃料的植物乳桿菌的新的生物加工系統(tǒng)的研發(fā)可對綠色能源領(lǐng)域具有重大意義，這將對全球經(jīng)濟(jì)和環(huán)境顧慮具有巨大影響。盡管本發(fā)明結(jié)合其具體的實施方案加以描述，但是顯然許多替換、修改和變動對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。因此，本發(fā)明意圖包括所有落入所附權(quán)利要求書的精神和大范圍中的這些替換、修改和變動。本說明書所提及的所有出版物、專利和專利申請都通過引用以其整體結(jié)合到本說明書中，其程度與每個獨立出版物、專利或?qū)＠暾埦唧w而單獨指明通過引用結(jié)合到本文中一樣。另外，在本申請中，任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)識(identification)都不得解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)是有效的。就使用章節(jié)標(biāo)題的程度而言，它們不應(yīng)解釋為必然限制性的。參考文獻(xiàn)1.BayerEA,LamedR,WhiteBA,FlintHJ.2008.Fromcellulosomestocellulosomics.ChemRec8:364-377。2.TeusinkB,WiersmaA,MolenaarD,FranckeC,deVosWM,SiezenRJ,SmidEJ.2006.AnalysisofgrowthofLactobacillusplantarumWCFS1onacomplexmediumusingagenome-scalemetabolicmodel(使用基因組規(guī)模代謝模型分析復(fù)合培養(yǎng)基上植物乳桿菌WCFS1的生長).TheJournalofbiologicalchemistry281:40041-40048。3.KlockeM,MundtK,IdlerC,McEniryJ,O'KielyP,BarthS.2006.MonitoringLactobacillusplantarumingrasssilageswiththeaidof16SrDNA-basedquantitativereal-timePCRassays(借助基于16SrDNA的定量實時PCR測定法監(jiān)測牧草青貯中的植物乳桿菌).Systematicandappliedmicrobiology29:49-58。4.RoachDR,KhatibiPA,BischoffKM,HughesSR,DonovanDM.2013.Bacteriophage-encodedlyticenzymescontrolgrowthofcontaminatingLactobacillusfoundinfuelethanolfermentations(噬菌體編碼的分解酶控制存在于燃料乙醇發(fā)酵中污染性乳桿菌的生長).Biotechnologyforbiofuels6:20。5.LimayemA,HanningIB,MuthaiyanA,IlleghemsK,KimJW,CrandallPG,O'BryanCA,RickeSC.2011.AlternativeantimicrobialcompoundstocontrolpotentialLactobacilluscontaminationinbioethanolfermentations(控制生物乙醇發(fā)酵中潛在乳桿菌污染的備選抗微生物化合物).Journalofenvironmentalscienceandhealth.Part.B,Pesticides,foodcontaminants,andagriculturalwastes46:709-714。6.AlegriaEG,LopezI,RuizJI,SaenzJ,FernandezE,ZarazagaM,DizyM,TorresC,Ruiz‐LarreaF.2004.HightoleranceofwildLactobacillusplantarumandOenococcusoenistrainstolyophilisationandstressenvironmentalconditionsofacidpHandethanol(野生植物乳桿菌和酒酒球菌菌株對冰凍干燥和酸性pH和乙醇的應(yīng)激環(huán)境條件的高耐受性).FEMSMicrobiolLett230:53-61。7.NicholsNN,DienBS,BothastRJ.2003.EngineeringlacticacidbacteriawithpyruvatedecarboxylaseandalcoholdehydrogenasegenesforethanolproductionfromZymomonasmobilis(用丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶基因改造乳酸菌用于從運動發(fā)酵單胞菌生產(chǎn)乙醇).Journalofindustrialmicrobiology&biotechnology30:315-321。8.DomagkGF,HoreckerBL.1958.PentosefermentationbyLactobacillusplantarum.V.Fermentationof2-deoxy-D-ribose(植物乳桿菌的戊糖發(fā)酵。V.2-脫氧-D-核糖的發(fā)酵).TheJournalofbiologicalchemistry233:283-286。9.KleerebezemM,BoekhorstJ,vanKranenburgR,MolenaarD,KuipersOP,LeerR,TarchiniR,PetersSA,SandbrinkHM,FiersMW,StiekemaW,LankhorstRM,BronPA,HofferSM,GrootMN,KerkhovenR,deVriesM,UrsingB,deVosWM,SiezenRJ.2003.CompletegenomesequenceofLactobacillusplantarumWCFS1(植物乳桿菌WCFS1的全基因組序列).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica100:1990-1995。10.GanzleMG,VermeulenN,VogelRF.2007.Carbohydrate,peptideandlipidmetabolismoflacticacidbacteriainsourdough(發(fā)酸面團(tuán)中乳酸菌的碳水化合物、肽和脂質(zhì)代謝).Foodmicrobiology24:128-138。11.OkanoK,YoshidaS,YamadaR,TanakaT,OginoC,FukudaH,KondoA.2009.Improvedproductionofhomo-D-lacticacidviaxylosefermentationbyintroductionofxyloseassimilationgenesandredirectionofthephosphoketolasepathwaytothepentosephosphatepathwayinL-Lactatedehydrogenasegene-deficientLactobacillusplantarum(通過在L-乳酸脫氫酶基因缺陷型植物乳桿菌中引入木糖同化基因并將磷酸酮醇酶途徑重新引導(dǎo)至戊糖磷酸途徑來提高通過木糖發(fā)酵的高-D-乳酸生產(chǎn)).ApplEnvironMicrobiol75:7858-7861。12.CantarelBL,CoutinhoPM,RancurelC,BernardT,LombardV,HenrissatB.2009.TheCarbohydrate-ActiveEnZymesdatabase(CAZy):anexpertresourceforGlycogenomics(碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(CAZy)：糖原組學(xué)的專家資源).NucleicAcidsRes37:D233-238。13.SorvigE,MathiesenG,NaterstadK,EijsinkVGH,AxelssonL.2005.High-level,induciblegeneexpressioninLactobacillussakeiandLactobacillusplantarumusingversatileexpressionvectors(使用多種表達(dá)載體的清酒乳桿菌和植物乳桿菌中的高水平誘導(dǎo)型基因表達(dá)).Microbiology151:2439-2449。14.SorvigE,GronqvistS,NaterstadK,MathiesenG,EijsinkVGH,AxelssonL.2003.ConstructionofvectorsforinduciblegeneexpressioninLactobacillussakeiandL.plantarum(用于清酒乳桿菌和植物乳桿菌中的誘導(dǎo)型基因表達(dá)的載體的構(gòu)建).FEMSMicrobiolLett229:119-126。15.MathiesenG,SveenA,BrurbergMB,FredriksenL,AxelssonL,EijsinkVGH.2009.Genome-wideanalysisofsignalpeptidefunctionalityinLactobacillusplantarumWCFS1(植物乳桿菌WCFS1中信號肽功能性的全基因組分析).BMCgenomics10:425。16.MierauI,KleerebezemM.2005.10yearsofthenisin-controlledgeneexpressionsystem(NICE)inLactococcuslactis(乳酸乳球菌中nisin控制的基因表達(dá)系統(tǒng)(NICE)的十年).Appliedmicrobiologyandbiotechnology68:705-717。17.KleerebezemM,BeerthuyzenMM,VaughanEE,deVosWM,KuipersOP.1997.Controlledgeneexpressionsystemsforlacticacidbacteria:transferablenisin-inducibleexpressioncassettesforLactococcus,Leuconostoc,andLactobacillusspp(用于乳酸菌的受控基因表達(dá)系統(tǒng)：用于乳球菌、明串珠菌和乳桿菌的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