技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及改變細(xì)胞的基因組的方法。以電子方式遞交的序列表的引用通過EFS-Web以電子方式將序列表的正式文本作為ASCII格式的序列表遞交，該文件名稱為“20140815_BB2344PCT_ST25_SequenceListing”，創(chuàng)建日期為2014年8月15日，文件大小為82千字節(jié)，并且該文件與本說明書同時(shí)提交。該ASCII格式文檔中所含的序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
：：重組DNA技術(shù)已使得可以將外來DNA序列插入到生物體的基因組中，從而改變?cè)撋矬w的表型。一種插入或修飾DNA序列的方法涉及通過引入側(cè)接有與基因組靶標(biāo)同源的序列的轉(zhuǎn)基因DNA序列來進(jìn)行的同源DNA重組。美國專利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的預(yù)定序列的DNA序列轉(zhuǎn)化真核生物細(xì)胞。具體地，討論了使用位點(diǎn)特異性重組。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過使用選擇性標(biāo)記來鑒定，該選擇性標(biāo)記作為所引入的DNA序列的一部分而被包含。已證實(shí)，在植物細(xì)胞中人工誘導(dǎo)的位點(diǎn)特異性基因組雙鏈斷裂通過使用兩個(gè)不同的途徑用外源供應(yīng)的DNA進(jìn)行同源重組而得到修復(fù)。(Puchta等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：5055-5060；2005年8月4日公布的美國專利申請(qǐng)公布2005/0172365A1；2006年12月14日公布的美國專利申請(qǐng)公布2006/0282914；2005年6月2日公布的WO2005/028942)。由于DNA區(qū)段(包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi))的分離、克隆、轉(zhuǎn)移和重組用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行最便利。許多研究集中在研究和設(shè)計(jì)內(nèi)切核酸酶，諸如2004年8月12日公布的WO2004/067736；1998年8月11日授予Dujon等人的美國專利5,792,632；2003年8月26日授予Dujon等人的美國專利6,610,545B2；Chevalier等人，(2002)MolCell10：895-905；Chevalier等人，(2001)NucleicAcidsRes29：3757-3774；Seligman等人，(2002)NucleicAcidsRes30：3870-3879。雖然已開發(fā)了若干種方法來靶向特異性位點(diǎn)以用于細(xì)胞基因組中的修飾，但仍然需要用于制備具有改變基因組的生物體的更高效和有效的方法，所述生物體諸如但不限于酵母和能育植物，所述改變的基因組在細(xì)胞基因組的限定區(qū)域中包含特異性修飾。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：提供了使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的組合物和方法，用于對(duì)細(xì)胞或生物體的基因組中的靶序列進(jìn)行基因組修飾，用于基因編輯，以及用于將感興趣的多核苷酸插入到細(xì)胞或生物體的基因組中。所述方法和組合物采用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)來提供用于修飾或改變靶位點(diǎn)以及編輯細(xì)胞基因組內(nèi)感興趣的核苷酸序列的有效系統(tǒng)，其中引導(dǎo)多核苷酸由DNA、RNA或DNA-RNA組合序列構(gòu)成。細(xì)胞包括但不限于非人類、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細(xì)胞。一旦鑒定了基因組靶位點(diǎn)，便可采用多種方法來進(jìn)一步修飾靶位點(diǎn)，使得它們包含多種感興趣的多核苷酸。公開了使用引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的育種方法和選擇植物的方法。還提供了具有引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸構(gòu)建體、細(xì)胞、酵母、植物、植物細(xì)胞、外植體、種子和谷粒。還提供了用于編輯細(xì)胞基因組中的核苷酸序列的組合物和方法。待編輯的核苷酸序列(感興趣的核苷酸序列)可位于由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別的靶位點(diǎn)之內(nèi)或之外。因此在本公開的第一實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，該引導(dǎo)多核苷酸包含：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域；以及(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構(gòu)成，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(可變靶向結(jié)構(gòu)域)和靶序列之間的互補(bǔ)性％可為至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)包含12至30個(gè)核苷酸的連續(xù)片段。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域位于單個(gè)分子上。在另一個(gè)實(shí)施例中，第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域)包含能夠沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA序列，并且第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和/或第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含至少一種修飾，該修飾任選地提供另外的有益特征，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。另外的益處可為改變的或調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞靶向、跟蹤、熒光標(biāo)記、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)、改變的互補(bǔ)靶序列結(jié)合親和力、改變的細(xì)胞降解抗性、或提高的細(xì)胞滲透性。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中引導(dǎo)多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域；以及(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中所述引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和/或第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含至少一種修飾，該修飾任選地提供另外的有益特征，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含本公開的引導(dǎo)多核苷酸或引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的植物或種子。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸引入到具有Cas內(nèi)切核酸酶的細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)向細(xì)胞提供引導(dǎo)多核苷酸、供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)向細(xì)胞提供cr核苷酸、能夠表達(dá)tracrRNA的第一重組DNA構(gòu)建體、能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)向細(xì)胞提供tracr核苷酸、能夠表達(dá)crRNA的第一重組DNA構(gòu)建體、能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA，其中所述tracr核苷酸選自脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)將能夠表達(dá)引導(dǎo)多核苷酸的第一重組DNA構(gòu)建體、以及能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA構(gòu)建體引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于編輯細(xì)胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中Cas內(nèi)切核酸酶在所述細(xì)胞的基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述Cas內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含重組DNA構(gòu)建體和引導(dǎo)多核苷酸的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。在另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于選擇植物的方法，所述植物在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導(dǎo)多核苷酸的第二植物，所述引導(dǎo)多核苷酸能夠與(a)的Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物，其中該引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評(píng)價(jià)(c)的子代的靶位點(diǎn)改變；以及e)選擇具有所述靶位點(diǎn)的所需改變的子代植物。本公開的方法和組合物的另外實(shí)施例在下文公開。附圖和序列表簡(jiǎn)述由以下的“具體實(shí)施方式”及構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的附圖和序列表可以更完全地理解本公開。本申請(qǐng)隨附的序列說明和序列表符合美國聯(lián)邦法規(guī)37C.F.R.§§1.821-1.825中關(guān)于專利申請(qǐng)中的核苷酸和氨基酸序列公開的指導(dǎo)規(guī)則。序列說明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定義的氨基酸三字母代碼，將其以引用方式并入本文。附圖圖1A示出含有雙分子的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸，該雙鏈引導(dǎo)多核苷酸包含與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為可變靶向結(jié)構(gòu)域或VT結(jié)構(gòu)域)以及與Cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或CER結(jié)構(gòu)域)。雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的CER結(jié)構(gòu)域包含沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子。這兩個(gè)單獨(dú)分子可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。包含連接到CER結(jié)構(gòu)域的VT結(jié)構(gòu)域的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的第一分子(示為cr核苷酸)被稱為“crDNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“crRNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))，或“crDNA-RNA”(當(dāng)由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。包含CER結(jié)構(gòu)域的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的第二分子(示為tracr核苷酸)被稱為“tracrRNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“tracrDNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))，或“tracrDNA-RNA”(當(dāng)由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。圖1B示出單鏈引導(dǎo)多核苷酸，該單鏈引導(dǎo)多核苷酸包含與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為可變靶向結(jié)構(gòu)域或VT結(jié)構(gòu)域)以及與Cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸結(jié)構(gòu)域(稱為Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或CER結(jié)構(gòu)域)。所謂“結(jié)構(gòu)域”，意指核苷酸的連續(xù)片段，該連續(xù)片段可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。單鏈引導(dǎo)多核苷酸包含通過連接子核苷酸序列(示為環(huán))連接到tracr核苷酸(包含CER結(jié)構(gòu)域)的cr核苷酸(包含連接到CER結(jié)構(gòu)域的VT結(jié)構(gòu)域)。由來自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列構(gòu)成的單鏈引導(dǎo)多核苷酸可被稱為“單鏈引導(dǎo)RNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“單鏈引導(dǎo)DNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“單鏈引導(dǎo)RNA-DNA”(當(dāng)由RNA核苷酸和DNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。圖2A至圖2C示出用于Cas9、crRNA和tracrRNA表達(dá)的表達(dá)盒。圖2A示出含有馬鈴薯ST-LS1內(nèi)含子、SV40氨基末端核定位序列(SV40NLS)和VirD2羧基末端NLS(VirD2NLS)的玉米密碼子優(yōu)化的Cas9基因(編碼Cas9內(nèi)切核酸酶)，其可操作地連接至植物泛素啟動(dòng)子(UBIPro)(SEQIDNO：5)。玉米優(yōu)化的Cas9基因(僅為Cas9編碼序列，沒有NLS)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：5的第2037-2411位和第2601-6329位核苷酸，其中馬鈴薯內(nèi)含子存在于SEQIDNO：5的第2412-2600位處。SV40NLS存在于SEQIDNO：5的第2010-2036位處。VirD2NLS位于SEQIDNO：5的第6330-6386位處。圖2B示出可操作地連接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III啟動(dòng)子，該核苷酸序列編碼可操作地連接至玉米U6終止子的crRNA分子。所得玉米優(yōu)化的crRNA表達(dá)盒以SEQIDNO：8列出。圖2C示出可操作地連接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III啟動(dòng)子，該核苷酸序列編碼可操作地連接至玉米U6PolIII終止子的tracrRNA分子。所得玉米優(yōu)化的tracrRNA表達(dá)盒以SEQIDNO：9列出。圖3A示出相對(duì)于在玉米LIGCas-3靶序列處適當(dāng)取向的PAM序列(AGG)(SEQIDNO：14，表1)的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas9內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)和靶DNA復(fù)合物。雙鏈引導(dǎo)RNA(淺灰色背景)包含含有與LIGCas-3靶序列的互補(bǔ)鏈堿基配對(duì)的可變靶向結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)的crRNA分子(SEQIDNO：10)，以及含有CER結(jié)構(gòu)域的一部分的tracrRNA分子(SEQIDNO：11)。Cas9內(nèi)切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預(yù)期DNA裂解位點(diǎn)。圖3B示出相對(duì)于在玉米基因組LIGCas-3靶位點(diǎn)處適當(dāng)取向的PAM序列(AGG)(SEQIDNO：14，表1)與基因組LIGCas-3靶位點(diǎn)相互作用的單鏈引導(dǎo)RNA/Cas9內(nèi)切核酸酶復(fù)合物。該單鏈引導(dǎo)RNA(淺灰色背景，SEQIDNO：96)是crRNA和tracrRNA之間的融合體并且包含與雙鏈DNA基因組靶位點(diǎn)的一條DNA鏈互補(bǔ)的可變靶向結(jié)構(gòu)域。Cas9內(nèi)切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預(yù)期DNA裂解位點(diǎn)。圖4A至圖4C示出由本文所述在玉米基因組無葉舌1基因座處的玉米優(yōu)化的引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)誘導(dǎo)的前10個(gè)最常見NHEJ突變的比對(duì)和計(jì)數(shù)。所述突變通過深度測(cè)序進(jìn)行鑒定。還指示了PAM序列和預(yù)期的裂解位點(diǎn)。由NHEJ不完整導(dǎo)致的缺失或插入分別以“-”或標(biāo)有下劃線且為斜體的核苷酸示出。在圖4A中，參考序列(SEQIDNO：23)表示靶位點(diǎn)標(biāo)有下劃線的未修飾LIGCas-1基因座。包含LIGCas-1靶位點(diǎn)的第1-10個(gè)突變的序列分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：24-33。在圖4B中，參考序列(SEQIDNO：23)表示靶位點(diǎn)標(biāo)有下劃線的未修飾LIGCas-2基因座。包含LIGCas-2靶位點(diǎn)的第1-10個(gè)突變的序列分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：34-43。在圖4C中，參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點(diǎn)標(biāo)有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點(diǎn)的第1-10個(gè)突變的序列分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：45-54。圖5示出相對(duì)于在玉米LIGCas-3靶序列處適當(dāng)取向的PAM序列(SEQIDNO：14，表1)的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas9內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)和靶DNA復(fù)合物。雙鏈引導(dǎo)RNA(淺灰色背景)包含含有與LIGCas-3靶序列的互補(bǔ)鏈堿基配對(duì)的可變靶向結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)的crDNA分子(SEQIDNO：55)，以及含有CER結(jié)構(gòu)域的一部分的tracrRNA分子(SEQIDNO：11)。Cas9內(nèi)切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有義DNA鏈和反義DNA鏈兩者上的預(yù)期DNA裂解位點(diǎn)。圖6A至圖6B示出由本文所述在玉米基因組無葉舌1基因座處的玉米優(yōu)化的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)(圖6A)或玉米優(yōu)化的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)(圖6B)誘導(dǎo)的前3個(gè)最常見NHEJ突變的比對(duì)和計(jì)數(shù)。所述突變通過深度測(cè)序進(jìn)行鑒定。還指示了PAM序列和預(yù)期的裂解位點(diǎn)。由NHEJ不完整導(dǎo)致的缺失或插入分別以“-”或標(biāo)有下劃線且為斜體的核苷酸示出。在圖6A中，NHEJ突變?cè)醋院铣蒫rRNA加tracrRNA和Cas9表達(dá)盒。參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點(diǎn)標(biāo)有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點(diǎn)的第1-3個(gè)突變的序列分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：56-58。在圖6B中，NHEJ突變?cè)醋院铣蒫rDNA加tracrRNA和Cas9表達(dá)盒。參考序列(SEQIDNO：44)表示靶位點(diǎn)標(biāo)有下劃線的未修飾LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位點(diǎn)的第1-3個(gè)突變的序列分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：59-61。圖7示出通過URA3編碼序列和305bp的重復(fù)ADE2基因序列破壞15號(hào)染色體上的酵母ADE2基因，產(chǎn)生ADE：URA3：DE2酵母篩選菌株。圖8示出可用于在酵母ADE：URA3：DE2篩選菌株中監(jiān)測(cè)裂解活性的方案。如果URA3靶位點(diǎn)被切斷，則URA3編碼序列旁側(cè)的ADE2序列重復(fù)可用作DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)的模板。如從ADE：URA3：DE2構(gòu)型中的ADE2序列重復(fù)區(qū)域引向ADE2構(gòu)型的虛線所示，雙鏈斷裂的同源重組介導(dǎo)的修復(fù)將去掉URA3基因編碼序列并獲得功能性ADE2基因。圖9示出用于定量裂解活性的酵母菌落的數(shù)值刻度和相應(yīng)的紅色/白色扇形菌落。由于扇形菌落表型是裂解活性的定性度量，因此實(shí)施0-4數(shù)值評(píng)分系統(tǒng)。0分表示未觀察到白色扇形菌落(無切割)；4分表示完全白色菌落(識(shí)別位點(diǎn)的完全切割)；1-3分表示中間白色扇形菌落表型(以及中等程度的識(shí)別位點(diǎn)切割)。序列SEQIDNO：1為來自釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)M1GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。SEQIDNO：2為馬鈴薯ST-LS1內(nèi)含子的核苷酸序列。SEQIDNO：3為SV40氨基N末端的氨基酸序列。SEQIDNO：4為根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)雙分體VirD2T-DNA邊界內(nèi)切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。SEQIDNO：5為表達(dá)玉米優(yōu)化的Cas9的表達(dá)盒的核苷酸序列。SEQIDNO：6為玉米U6聚合酶III啟動(dòng)子的核苷酸序列。SEQIDNO：7為SV40核定位信號(hào)的氨基酸序列。SEQIDNO：8為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結(jié)構(gòu)域的玉米優(yōu)化crRNA表達(dá)盒的核苷酸序列。SEQIDNO：9為玉米優(yōu)化的tracrRNA表達(dá)盒的核苷酸序列。SEQIDNO：10為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結(jié)構(gòu)域的crRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：11為來自釀膿鏈球菌MIGAS(SF370)＞的tracrRNA的核苷酸序列。SEQIDNO：12為玉米基因組靶位點(diǎn)LIGCas-1的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：13為玉米基因組靶位點(diǎn)LIGCas-2的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：14為玉米基因組靶位點(diǎn)LIGCas-3的核苷酸序列加PAM序列。SEQIDNO：15-22為PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO：23為L(zhǎng)IGCas-1和LIGCas-2基因座的未修飾參考序列的核苷酸序列(圖4A至圖4B)。SEQIDNO：24-33為L(zhǎng)IGCas-1基因座的第1-10個(gè)突變的核苷酸序列(圖4A)。SEQIDNO：34-43為L(zhǎng)IGCas-2基因座的第1-10個(gè)突變的核苷酸序列(圖4B)。SEQIDNO：44為L(zhǎng)IGCas-3的未修飾參考序列的核苷酸序列(圖4C)。SEQIDNO：45-54為L(zhǎng)IGCas-3基因座的第1-10個(gè)突變的核苷酸序列(圖4C)。SEQIDNO：55為包含靶向LIGCas-3靶序列的可變靶向結(jié)構(gòu)域的crDNA(由脫氧核糖核酸構(gòu)成)的核苷酸序列。SEQIDNO：56-58為L(zhǎng)IGCas-3基因座(源自合成crRNA加tracrRNA和Cas9表達(dá)盒)的第1-3個(gè)突變的核苷酸序列。SEQIDNO：59-61為L(zhǎng)IGCas-3基因座(源自合成crDNA加tracrRNA和Cas9表達(dá)盒)的第1-3個(gè)突變的核苷酸序列。SEQIDNO：62為不包含對(duì)其核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。SEQIDNO：63為不包含對(duì)其核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crRNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。SEQIDNO：64為在其核苷酸序列的5’端包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的G核糖核苷酸，第二個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的C核糖核苷酸，并且第三個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的G核糖核苷酸。SEQIDNO：65為在其核苷酸序列的3’端附近包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crRNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(U*U*U*)。在序列表中，在第十九、第二十和第二十一位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的U核糖核苷酸。SEQIDNO：66為在其5’端處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(mGmCmG)。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，第二個(gè)N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：67為在其核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(mUmUmG)。在序列表中，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2’-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：68為對(duì)于每個(gè)核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：69為對(duì)于每個(gè)核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十八位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十九位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：70為不包含對(duì)其脫氧核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。SEQIDNO：71為不包含對(duì)其脫氧核糖核苷酸序列的任何修飾的cr核苷酸(crDNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。SEQIDNO：72為在其核苷酸序列中包含一個(gè)鎖核酸核苷酸(+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：73為在其核苷酸序列中包含三個(gè)鎖核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：74為在其核苷酸序列中包含六個(gè)鎖核酸核苷酸(+C、+C、+T、+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位處的N代表C鎖核酸堿基，在第八位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十位處的N代表T鎖核酸堿基，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：75為在其核苷酸序列以及其核苷酸序列的5’端附近的硫代磷酸酯鍵中包含三個(gè)鎖核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，在第二位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的C脫氧核糖核苷酸，在第三位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C鎖核酸堿基，在第十四位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第十六位處的N代表T鎖核酸堿基。SEQIDNO：76為在核苷酸序列的3’端附近包含三個(gè)鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(T*T*T)。在序列表中，在第十九位、第二十位和第二十一位處的N代表具有硫代磷酸酯鍵的T脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：77為在其核苷酸序列中包含一個(gè)5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位處的N代表5-甲基dC脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：78為在其核苷酸序列中包含三個(gè)5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位、第八位和第十二位處的N代表5-甲基dC脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：79為在其核苷酸序列中包含一個(gè)2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第十一位處的N代表2，6-二氨基嘌呤脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：80為在其核苷酸序列中包含兩個(gè)2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第五位和第十一位處的N代表2，6-二氨基嘌呤脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：81為在其核苷酸序列的5’端附近包含鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G鎖核酸堿基，第二個(gè)N代表C鎖核酸堿基，并且第三個(gè)N代表G鎖核酸堿基。SEQIDNO：82為在核苷酸序列的3’端附近包含鎖核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位處的N代表T鎖核酸堿基，在第二十一位處的N代表T鎖核酸堿基，并且在第二十二位處的N代表G鎖核酸堿基。SEQIDNO：83為在其核苷酸序列的5’端附近包含硫代磷酸酯鍵的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸，第二個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的C脫氧核糖核苷酸，并且第三個(gè)N代表具有硫代磷酸酯鍵的G脫氧核糖核苷酸。SEQIDNO：84為在其核苷酸序列的5’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，第二個(gè)N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：85為在核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位處的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位處的N代表G2’-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：86為在其核苷酸序列的除T之外的每個(gè)核苷酸處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可變靶向結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：87為在核苷酸序列的除T之外的每個(gè)核苷酸處包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端處的第一個(gè)N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位處的N代表A2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位處的N代表C2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在二十二位處的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸。SEQIDNO：88為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)密碼子優(yōu)化的Cas9的核苷酸序列。SEQIDNO：89為來自噬菌體T7的T7啟動(dòng)子的核苷酸序列。SEQIDNO：90為ADE：URA3：DE2靶序列的核苷酸序列(不包括PAM序列)。SEQIDNO：91-95為Cas9內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列。SEQIDNO：96為靶向LIGCas-3靶序列的單鏈引導(dǎo)RNA的核苷酸序列(圖3B)。具體實(shí)施方式本公開包括用于細(xì)胞基因組中的靶序列的基因組修飾的組合物和方法。該方法和組合物采用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)來提供用于修飾細(xì)胞基因組內(nèi)的靶位點(diǎn)的有效系統(tǒng)。細(xì)胞包括但不限于動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細(xì)胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。一旦鑒定了基因組靶位點(diǎn)，便可采用多種方法來進(jìn)一步修飾靶位點(diǎn)，使得它們包含多種感興趣的多核苷酸。還公開了使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的育種方法。還提供了用于編輯細(xì)胞基因組中的核苷酸序列的組合物和方法。待編輯的核苷酸序列(感興趣的核苷酸序列)可位于由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別的靶位點(diǎn)之內(nèi)或之外。CRISPR基因座(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)(也稱為SPIDRs--SPacerInterspersedDirectRepeats，間隔區(qū)散在同向重復(fù)序列))構(gòu)成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重復(fù)序列(通常24至40bp，重復(fù)1至140次，也稱CRISPR重復(fù)序列)組成，所述DNA重復(fù)序列是部分回文的。重復(fù)的序列(通常是物種特異性的)被恒定長(zhǎng)度的可變序列(通常20至58bp，取決于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))間隔。CRISPR基因座首先在大腸桿菌(E.coli)中確認(rèn)(Ishino等人(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。在地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)、釀膿鏈球菌、魚腥藻屬(Anabaena)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中已鑒定出類似的散在短序列重復(fù)序列(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座與其他SSR不同之處在于重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，所述重復(fù)序列也被命名為短規(guī)則間隔重復(fù)序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICSJ.Integ.Biol.6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。所述重復(fù)序列是成簇出現(xiàn)的短元件，其通常被恒定長(zhǎng)度的可變序列規(guī)則地間隔(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。“Cas基因”包括這樣的基因，該基因通常與旁側(cè)CRISPR基因座偶聯(lián)、相關(guān)或接近或在旁側(cè)CRISPR基因座的附近。術(shù)語“Cas基因”、“CRISPR相關(guān)(Cas)基因”在本文中可互換使用。Cas蛋白質(zhì)家族的全面綜述在Haft等人(2005)ComputationalBiology，PLoSComputBiol1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。如該文獻(xiàn)中所描述，除了四個(gè)之前已知的基因家族外，還描述了41個(gè)CRISPR相關(guān)(Cas)基因家族。該文獻(xiàn)表明，CRISPR系統(tǒng)屬于不同的類別，具有不同的重復(fù)序列模式、不同組的基因以及不同物種范圍。給定的CRISPR基因座中的Cas基因的數(shù)目可隨物種而不同。Cas內(nèi)切核酸酶與由Cas基因編碼的Cas蛋白質(zhì)相關(guān)，其中所述Cas蛋白質(zhì)能夠?qū)㈦p鏈斷裂引入到DNA靶序列中。Cas內(nèi)切核酸酶接近基因組靶位點(diǎn)解旋DNA雙鏈并且在識(shí)別靶序列時(shí)通過引導(dǎo)多核苷酸裂解兩條DNA鏈，但唯一條件是正確的原間隔序列相鄰基元(PAM)大致在靶序列的3′端處取向(圖3A，圖3B)。在一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶為能夠在DNA靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的Cas9內(nèi)切核酸酶，其中在特定位置處的DNA裂解通過以下方式實(shí)現(xiàn)：a)在DNA靶位點(diǎn)和引導(dǎo)多核苷酸的可變靶向結(jié)構(gòu)域之間堿基配對(duì)互補(bǔ)，以及b)存在緊鄰DNA靶位點(diǎn)的短原間隔序列相鄰基元(PAM)。在一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶基因?yàn)镃as9內(nèi)切核酸酶，諸如但不限于2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097的SEQIDNO：462、474、489、494、499、505和518中列出的Cas9基因。在另一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶基因?yàn)橹参锶缬衩谆虼蠖箖?yōu)化的Cas9內(nèi)切核酸酶(圖1A)。在另一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶基因可操作地連接至Cas密碼子區(qū)域上游的SV40核靶向信號(hào)以及Cas密碼子區(qū)域下游的雙分體VirD2核定位信號(hào)(Tinland等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7442-6)。在一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶基因?yàn)镾EQIDNO：1、91、92、93、94、95的Cas9內(nèi)切核酸酶基因或SEQIDNO：5的第2037-6329位核苷酸、或它們的任意功能片段或變體。術(shù)語“功能片段”、“功能上等同的片段”和“功能等同片段”在本文中可互換使用。這些術(shù)語是指其中產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力得以保持的Cas內(nèi)切核酸酶序列的一部分或亞序列。術(shù)語“功能變體”、“功能上等同的變體”和“功能等同變體”在本文中可互換使用。這些術(shù)語是指其中產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力得以保持的Cas內(nèi)切核酸酶的變體。片段和變體可通過諸如定點(diǎn)誘變和合成構(gòu)建之類的方法來獲得。在一個(gè)實(shí)施例中，Cas內(nèi)切核酸酶基因?yàn)橹参锩艽a子優(yōu)化的釀膿鏈球菌Cas9基因，其可識(shí)別原則上N(12-30)NGG可被靶向的形式的任何基因組序列。內(nèi)切核酸酶是裂解多核苷酸鏈內(nèi)的磷酸二酯鍵的酶，包括裂解DNA成特異性位點(diǎn)而不損傷堿基的限制性內(nèi)切核酸酶。限制性內(nèi)切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型內(nèi)切核酸酶，它們進(jìn)一步包括亞型。在I型和III型系統(tǒng)中，甲基化酶活性和限制酶活性兩者都包含在單一復(fù)合物中。內(nèi)切核酸酶還包括大范圍核酸酶，也稱為歸巢內(nèi)切核酸酶(HEases)，其如同限制性內(nèi)切核酸酶，在特定識(shí)別位點(diǎn)處結(jié)合和切割，然而大范圍核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)通常較長(zhǎng)，約18bp或更長(zhǎng)。(2012年3月22日提交的專利申請(qǐng)WO-PCTPCT/US12/30061)大范圍核酸酶已基于保守序列基元分為四個(gè)家族(BelfortM，和PerlmanPSJ.Biol.Chem.1995(270)：30237-30240)。這些基元參與金屬離子的配位和磷酸二酯鍵的水解。HE酶的顯著之處在于它們的識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)，并且能容忍它們的DNA底物中有一定的序列多態(tài)性。大范圍核酸酶的命名規(guī)范與其他限制性內(nèi)切核酸酶的規(guī)范相似。對(duì)于分別由獨(dú)立式ORF、內(nèi)含子和內(nèi)含肽編碼的大范圍核酸酶，它們也通過前綴F-、I-或PI-進(jìn)行表征。重組過程中的一個(gè)步驟涉及在識(shí)別位點(diǎn)之處或附近進(jìn)行多核苷酸裂解。這個(gè)裂解活性可用來產(chǎn)生雙鏈斷裂。有關(guān)位點(diǎn)特異性重組酶及其識(shí)別位點(diǎn)的綜述，參見Sauer(1994)CurrOpBiotechnol5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB7：760-7。在一些例子中，重組酶來自整合酶或解離酶家族。TAL效應(yīng)物核酸酶是新一類序列特異性核酸酶，可用來在植物或其他生物體的基因組中的特定靶序列處產(chǎn)生雙鏈斷裂。(Miller等人(2011)NatureBiotechnology29：143-148)。鋅指核酸酶(ZFN)包括工程改造的雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑，由鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。識(shí)別位點(diǎn)特異性由鋅指結(jié)構(gòu)域賦予，鋅指結(jié)構(gòu)域通常包含兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)例如具有C2H2結(jié)構(gòu)的鋅指，但是其他鋅指結(jié)構(gòu)也是已知的并被工程構(gòu)建。鋅指結(jié)構(gòu)域易于設(shè)計(jì)特異性結(jié)合選定的多核苷酸識(shí)別序列的多肽。ZFN由工程改造的DNA結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)域與非特異性內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域連接組成，所述非特異性內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域例如來自II型內(nèi)切核酸酶(如FokI)的核酸酶結(jié)構(gòu)域?？蓪⒘硗獾墓δ苄匀诤系戒\指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白結(jié)構(gòu)域和甲基化酶。在一些例子中，核酸酶結(jié)構(gòu)域的二聚化為裂解活性所需。每個(gè)鋅指能識(shí)別靶DNA中的三個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。例如，一個(gè)3鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別9個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，由于該核酸酶要求二聚化，使用兩組鋅指三聯(lián)體來結(jié)合一條18個(gè)核苷酸的識(shí)別序列。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含引導(dǎo)多核苷酸和Cas9內(nèi)切核酸酶的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述Cas9內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。細(xì)菌和古細(xì)菌已進(jìn)化出適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，又稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR相關(guān)聯(lián)的(Cas)系統(tǒng)，其使用短RNA來指導(dǎo)外源核酸的降解(2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097)。來自細(xì)菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)采用crRNA和tracrRNA來將Cas內(nèi)切核酸酶引導(dǎo)至其DNA靶標(biāo)。crRNA(CRISPRRNA)包含與雙鏈DNA靶標(biāo)中的一條鏈互補(bǔ)的區(qū)域并且與tracrRNA(反式激活CRISPRRNA)堿基配對(duì)，從而形成指導(dǎo)Cas內(nèi)切核酸酶裂解DNA靶標(biāo)的RNA雙鏈體。如本文所用，術(shù)語“引導(dǎo)多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，該多核苷酸序列可與Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物并且使Cas內(nèi)切核酸酶能夠識(shí)別并且任選地裂解DNA靶位點(diǎn)。引導(dǎo)多核苷酸可為單分子或雙分子。引導(dǎo)多核苷酸序列可為RNA序列、DNA序列、或它們的組合(RNA-DNA組合序列)。任選地，引導(dǎo)多核苷酸可包含至少一個(gè)核苷酸、磷酸二酯鍵或鍵修飾，諸如但不限于鎖核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18(六乙二醇鏈)分子)、或?qū)е颅h(huán)化的5’至3’共價(jià)鍵。在本公開的一些實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸(RNA)。單獨(dú)包含核糖核酸的引導(dǎo)多核苷酸也稱為“引導(dǎo)DNA”。引導(dǎo)多核苷酸可為雙分子(也稱為雙鏈引導(dǎo)多核苷酸)，其包含與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為可變靶向結(jié)構(gòu)域或VT結(jié)構(gòu)域)以及與Cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或CER結(jié)構(gòu)域)(圖1A)。雙分子引導(dǎo)多核苷酸的CER結(jié)構(gòu)域包含沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子(圖1A)。這兩個(gè)單獨(dú)分子可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，雙鏈引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸(RNA)，如例如但不限于圖3A所示。在一些實(shí)施例中，包含連接到CER結(jié)構(gòu)域的VT結(jié)構(gòu)域的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的第一分子(在圖1A中示為“cr核苷酸”)被稱為“crDNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“crRNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))，或“crDNA-RNA”(當(dāng)由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。在一些實(shí)施例中，包含CER結(jié)構(gòu)域的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的第二分子(在圖1A中示為tracr核苷酸)被稱為“tracrRNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“tracrDNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))，或“tracrDNA-RNA”(當(dāng)由DNA核苷酸和RNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。引導(dǎo)多核苷酸也可為單分子，其包含與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(稱為可變靶向結(jié)構(gòu)域或VT結(jié)構(gòu)域)以及與Cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸結(jié)構(gòu)域(稱為Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域或CER結(jié)構(gòu)域)(圖1B)。所謂“結(jié)構(gòu)域”，意指核苷酸的連續(xù)片段，該連續(xù)片段可為RNA、DNA和/或RNA-DNA組合序列。單鏈引導(dǎo)多核苷酸的VT結(jié)構(gòu)域和/或CER結(jié)構(gòu)域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列。在一些實(shí)施例中，單鏈引導(dǎo)多核苷酸包括連接到tracr核苷酸(包含CER結(jié)構(gòu)域)的cr核苷酸(包含連接到CER結(jié)構(gòu)域的VT結(jié)構(gòu)域)，其中所述鍵為包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列的核苷酸序列(圖1B)。由來自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列構(gòu)成的單鏈引導(dǎo)多核苷酸可被稱為“單鏈引導(dǎo)RNA”(當(dāng)由RNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“單鏈引導(dǎo)DNA”(當(dāng)由DNA核苷酸的連續(xù)片段構(gòu)成時(shí))或“單鏈引導(dǎo)RNA-DNA”(當(dāng)由RNA核苷酸和DNA核苷酸的組合構(gòu)成時(shí))。使用單鏈引導(dǎo)多核苷酸與雙鏈引導(dǎo)多核苷酸相比的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是僅需要形成一個(gè)表達(dá)盒即可表達(dá)單鏈引導(dǎo)多核苷酸。術(shù)語“可變靶向結(jié)構(gòu)域”或“VT結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用并且指與雙鏈DNA靶位點(diǎn)的一條鏈(核苷酸序列)互補(bǔ)的核苷酸序列。第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)和靶序列之間的互補(bǔ)性％可為至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％?？勺儼薪Y(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可為至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，可變靶向結(jié)構(gòu)域包含12至30個(gè)核苷酸的連續(xù)片段?？勺儼邢蚪Y(jié)構(gòu)域可由DNA序列、RNA序列、修飾的DNA序列、修飾的RNA序列(參見例如本文所述的修飾)、或它們的任何組合構(gòu)成。術(shù)語引導(dǎo)多核苷酸的“Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域”或“CER結(jié)構(gòu)域”在本文中可互換使用并且涉及與Cas內(nèi)切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(諸如引導(dǎo)多核苷酸的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域)。CER結(jié)構(gòu)域可由DNA序列、RNA序列、修飾的DNA序列、修飾的RNA序列(參見例如本文所述的修飾)、或它們的任何組合構(gòu)成。連接單鏈引導(dǎo)多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA組合序列。在一個(gè)實(shí)施例中，連接單鏈引導(dǎo)多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的長(zhǎng)度可為至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，連接單鏈引導(dǎo)多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四環(huán)序列，諸如但不限于GAAA四環(huán)序列。引導(dǎo)多核苷酸、VT結(jié)構(gòu)域和/或CER結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列修飾可選自但不限于5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。這些修飾可產(chǎn)生至少一種另外的有益特征，其中所述另外的有益特征選自改變的或調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞靶向、跟蹤、熒光標(biāo)記、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)、改變的互補(bǔ)靶序列結(jié)合親和力、改變的細(xì)胞降解抗性、和提高的細(xì)胞滲透性。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，該引導(dǎo)多核苷酸包括：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)；以及(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(CER結(jié)構(gòu)域)，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構(gòu)成，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(可變靶向結(jié)構(gòu)域)和靶序列之間的互補(bǔ)性％可為至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(CER結(jié)構(gòu)域)位于單個(gè)分子上。在另一個(gè)實(shí)施例中，第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域)包含能夠沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA序列，并且第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)為DNA序列，并且第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(CER結(jié)構(gòu)域)選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成稱為“引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物”的復(fù)合物，該復(fù)合物使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在DNA靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中引導(dǎo)多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域；以及(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包含引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(VT結(jié)構(gòu)域)和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域(CER結(jié)構(gòu)域)由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構(gòu)成，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸可使用粒子轟擊直接引入到植物細(xì)胞中。當(dāng)引導(dǎo)多核苷酸僅由RNA序列(也稱為“引導(dǎo)RNA”)組成時(shí)，其可通過引入包含有效連接到植物特異性啟動(dòng)子的相應(yīng)引導(dǎo)DNA序列的重組DNA分子而間接引入，該植物特異性啟動(dòng)子能夠轉(zhuǎn)錄所述植物細(xì)胞中的引導(dǎo)多核苷酸。術(shù)語“相應(yīng)引導(dǎo)DNA”是指如下DNA分子，該DNA分子與RNA分子相同但是RNA分子的每個(gè)“U”替換為“T”。在一些實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸通過粒子轟擊或包含可操作地連接至植物U6聚合酶III啟動(dòng)子的相應(yīng)引導(dǎo)DNA的重組DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化來引入。術(shù)語“靶位點(diǎn)”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因組靶位點(diǎn)”、“基因組靶序列”和“基因組靶基因座”在本文中可互換使用并且指細(xì)胞的基因組(包括葉綠體和線粒體DNA)中的多核苷酸序列，在細(xì)胞基因組中在該多核苷酸序列處通過Cas內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)雙鏈斷裂。靶位點(diǎn)可為細(xì)胞或生物體的基因組中的內(nèi)源位點(diǎn)，或者另選地，靶位點(diǎn)可與細(xì)胞或生物體是異源的，從而不天然存在于基因組中，或靶位點(diǎn)與其天然出現(xiàn)的位置相比可存在于異源基因組位置中。如本文所用，術(shù)語“內(nèi)源靶序列”和“天然靶序列”可在本文中互換使用并且是指這樣的靶序列，該靶序列對(duì)細(xì)胞或生物體的基因組為內(nèi)源或天然的并且位于該靶序列在細(xì)胞或生物體的基因組中的內(nèi)源或天然位置處。細(xì)胞包括但不限于動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細(xì)胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。在一個(gè)實(shí)施例中，靶位點(diǎn)可類似于DNA識(shí)別位點(diǎn)或由雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑特異性識(shí)別和/或結(jié)合的靶位點(diǎn)，所述雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑諸如LIG3-4內(nèi)切核酸酶(2009年5月21日公布的美國專利公布2009-0133152A1)或MS26++大范圍核酸酶(2012年6月19日提交的美國專利申請(qǐng)13/526912)?！叭斯ぐ形稽c(diǎn)”或“人工靶序列”在本文中可互換使用并且指已被引入到細(xì)胞或生物體(諸如但不限于植物或酵母)的基因組中的靶序列。這種人工靶序列可在序列上與細(xì)胞基因組中的內(nèi)源或天然靶序列相同，但可位于細(xì)胞或生物體的基因組中的另一不同位置(即，非內(nèi)源或非天然位置)。“改變的靶位點(diǎn)”、“改變的靶序列”、“修飾的靶位點(diǎn)”、“修飾的靶序列”在本文中可互換使用，并且指如本文所公開的當(dāng)與未改變的靶序列相比時(shí)包含至少一種改變的靶序列。此類“改變”包括例如：(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何組合。本文中公開了用于修飾生物體(諸如但不限于植物或酵母)的基因組靶位點(diǎn)的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，用于修飾植物細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法包括將引導(dǎo)多核苷酸引入到具有Cas內(nèi)切核酸酶的細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。該方法可進(jìn)一步包括鑒定至少一個(gè)在所述靶標(biāo)處具有修飾的細(xì)胞，其中在所述靶位點(diǎn)處的修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。該方法還可進(jìn)一步包括將供體DNA引入到所述細(xì)胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。還提供了用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。該方法可進(jìn)一步包括鑒定至少一個(gè)在所述靶標(biāo)處具有修飾的細(xì)胞，其中在所述靶位點(diǎn)處的修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。該方法還可進(jìn)一步包括將供體DNA引入到所述細(xì)胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。還提供了用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)將cr核苷酸、能夠表達(dá)tracrRNA的第一重組DNA構(gòu)建體、能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA引入到細(xì)胞中，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。還提供了用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)將tracr核苷酸、能夠表達(dá)crRNA的第一重組DNA構(gòu)建體、以及能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA引入到細(xì)胞中，其中所述tracr核苷酸選自脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意組合。靶位點(diǎn)的長(zhǎng)度可改變，并且包括例如長(zhǎng)度為至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個(gè)核苷酸的靶位點(diǎn)。靶位點(diǎn)還有可能是回文的，即一條鏈上的序列在互補(bǔ)鏈上從相反方向讀起來是一樣的。切口/裂解位點(diǎn)可在靶序列內(nèi)，或切口/裂解位點(diǎn)可在靶序列之外。在另一個(gè)變型形式中，裂解可發(fā)生在互相正對(duì)著的核苷酸位置處以產(chǎn)生平端切口，或在其他情況中，切口可交錯(cuò)以產(chǎn)生單鏈突出端，也稱“粘性末端”，可以為5′突出端或3′突出端。還可使用基因組靶位點(diǎn)的活性變體。此類活性變體可與給定靶位點(diǎn)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性變體保留生物活性并且因此能夠由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解。通過內(nèi)切核酸酶測(cè)量靶位點(diǎn)的雙鏈斷裂的測(cè)定法是本領(lǐng)域中已知的，并且通常測(cè)量該試劑對(duì)含有識(shí)別位點(diǎn)的DNA底物的總體活性和特異性。各種方法和組合物均可用于獲得具有插入到Cas內(nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)中的感興趣的多核苷酸的細(xì)胞或生物體。此類方法可采用同源重組來提供感興趣的多核苷酸在靶位點(diǎn)處的整合。在提供的一種方法中，向供體DNA構(gòu)建體中的細(xì)胞提供感興趣的多核苷酸。如本文所用，“供體DNA”是包含待插入到cas內(nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)中的感興趣的多核苷酸的DNA構(gòu)建體。任選地，供體DNA構(gòu)建體還可包含感興趣的多核苷酸旁側(cè)的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域。供體DNA的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域分別與存在于植物基因組的靶位點(diǎn)中或旁側(cè)的第一基因組區(qū)域和第二基因組區(qū)域共享同源性。所謂“同源性”是指類似的DNA序列。例如，存在于供體DNA上的“基因組區(qū)域的同源性區(qū)域”是與植物基因組中的給定“基因組區(qū)域”具有類似序列的DNA區(qū)域。同源性區(qū)域可具有任何長(zhǎng)度，該長(zhǎng)度足以促進(jìn)裂解靶位點(diǎn)處的同源重組。例如，同源性區(qū)域的長(zhǎng)度可為至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多個(gè)堿基，使得同源性區(qū)域具有充分的同源性與相應(yīng)的基因組區(qū)域發(fā)生同源重組?！俺浞值耐葱浴北砻鲀蓚€(gè)多核苷酸序列具有充分的結(jié)構(gòu)相似性以充當(dāng)同源重組反應(yīng)的底物。結(jié)構(gòu)相似性包括每個(gè)多核苷酸片段的總體長(zhǎng)度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通過序列的總長(zhǎng)度上的序列同一性百分?jǐn)?shù)，和/或通過包含局部化相似性的保守區(qū)域(如具有100％序列同一性的連續(xù)核苷酸)以及序列長(zhǎng)度的一部分上的序列同一性百分?jǐn)?shù)來描述。靶標(biāo)和供體多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可變，包括總長(zhǎng)度和/或具有在以下范圍內(nèi)的單位整數(shù)值的區(qū)域：約1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或直到并包括該靶位點(diǎn)的總長(zhǎng)度。這些范圍包括該范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)，例如1-20bp的范圍包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通過兩個(gè)多核苷酸的完全比對(duì)長(zhǎng)度上的序列同一性百分?jǐn)?shù)來描述，所述序列同一性百分?jǐn)?shù)包括約至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性百分?jǐn)?shù)。充分的同源性包括多核苷酸長(zhǎng)度、全局序列同一性百分?jǐn)?shù)和連續(xù)核苷酸的任選保守區(qū)域或局部序列同一性百分?jǐn)?shù)的任何組合，例如充分的同源性可描述為75-150bp的與靶基因座區(qū)域具有至少80％序列同一性的區(qū)域。充分的同源性還可通過所預(yù)測(cè)的兩個(gè)多核苷酸在高嚴(yán)格條件下特異性雜交的能力來描述，參見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)；CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等人編輯(1994)CurrentProtocols，(GreenePublishingAssociates，Inc.和JohnWiley&Sons，Inc)；以及Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，(Elsevier，NewYork)。如本文所用，“基因組區(qū)域”是植物細(xì)胞基因組中的染色體的區(qū)段，該區(qū)段存在于靶位點(diǎn)的任一側(cè)上，或者另選地，還包含靶位點(diǎn)的一部分。基因組區(qū)域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多個(gè)堿基，使得基因組區(qū)域具有充分的同源性與相應(yīng)的同源性區(qū)域發(fā)生同源重組。供體DNA上的同源性區(qū)域可與靶位點(diǎn)旁側(cè)的任何序列具有同源性。雖然在一些實(shí)施例中，同源性區(qū)域與緊鄰靶位點(diǎn)旁側(cè)的基因組序列共享顯著的序列同源性，但應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，同源性區(qū)域可被設(shè)計(jì)為與如下區(qū)域具有充分的同源性，該區(qū)域可進(jìn)一步位于靶位點(diǎn)的5′或3′處。在另外的實(shí)施例中，同源性區(qū)域還可與靶位點(diǎn)的片段連同下游基因組區(qū)域具有同源性。在一個(gè)實(shí)施例中，第一同源性區(qū)域還包含靶位點(diǎn)的第一片段并且第二同源性區(qū)域包含靶位點(diǎn)的第二片段，其中第一片段和第二片段不相似。如本文所用，“同源重組”是指兩個(gè)DNA分子之間在同源性位點(diǎn)處的DNA片段交換。同源重組的頻率受多個(gè)因素影響。不同的生物體在同源重組的量和同源與非同源重組的相對(duì)比例方面不同。一般地講，同源性區(qū)域的長(zhǎng)度影響同源重組事件的頻率，同源性區(qū)域越長(zhǎng)，頻率越高。為觀察到同源重組而需要的同源性區(qū)域的長(zhǎng)度也是隨物種而異的。在許多情況下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情況下就已觀察到同源重組。參見例如Singer等人，(1982)Cell31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)MolCellBiol12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)MolCellBiol4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics115：161-7。植物細(xì)胞基因組的改變，例如通過同源重組(HR)改變，是遺傳工程的強(qiáng)大工具。盡管高等植物中的同源重組頻率低，但還是有植物內(nèi)源基因同源重組的少數(shù)成功例子。植物中同源重組的參數(shù)已主要通過拯救(rescue)所引入的截短的選擇性標(biāo)記基因進(jìn)行了研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之間。觀察到的同源重組頻率大約為10-4至10-5。參見例如Halfter等人，(1992)MolGenGenet231：186-93；Offringa等人，(1990)EMBOJ9：3077-84；Offringa等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)EMBOJ7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)MolGenGenet243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)PlantJ7：109-19。同源重組在昆蟲中已得到證明。Dray和Gloor在果蠅中發(fā)現(xiàn)，少至3kb的總模板：靶標(biāo)同源性就足夠以適當(dāng)?shù)男蕦⒋蟮姆峭碊NA區(qū)段復(fù)制到靶標(biāo)中(Dray和Gloor，(1997)，Genetics，147：689-99)。Golic等人采用在果蠅中的靶標(biāo)FRT處進(jìn)行FLP介導(dǎo)的DNA整合，證實(shí)了當(dāng)供體和靶標(biāo)共享4.1kb的同源性時(shí)，與1.1kb的同源性時(shí)相比，整合效率大約高10倍(Golic等人，(1997)，NucleicAcidsRes，25：3665)。來自果蠅的數(shù)據(jù)表明，2-4kb的同源性對(duì)于有效靶向是充足的，但是有一些證據(jù)證明低得多的同源性-約30bp至約100bp范圍內(nèi)-可能就足夠(Nassif和Engels，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)MolCellBiol17：627-34)。也在其他生物體中實(shí)現(xiàn)了同源重組。例如，在寄生性原生動(dòng)物利什曼蟲中進(jìn)行同源重組需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)NucleicAcidsRes25：4278-86)。在絲狀真菌構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，用少至50bp旁側(cè)同源性實(shí)現(xiàn)了基因替換(Chaveroche等人，(2000)NucleicAcidsRes28：e97)。在纖毛蟲嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)中也證明了所靶向基因替換(Gaertig等人，(1994)NucleicAcidsRes22：5391-8)。在哺乳動(dòng)物中，使用可培養(yǎng)生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化、選擇和引入到小鼠胚胎中的多能胚胎干細(xì)胞系(ES)，同源重組在小鼠中已經(jīng)是最成功的。帶有插入的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的胚胎發(fā)育成遺傳后代。通過將同胞小鼠進(jìn)行雜種繁殖，可獲得攜帶選定的基因的純合小鼠。該方法的概述在以下文獻(xiàn)中提供：Watson等人，(1992)RecombinantDNA，第2版，(ScientificAmericanBooks，WHFreeman&Co.出版)；Capecchi，(1989)TrendsGenet5：70-6；以及Bronson，(1994)JBiolChem269：27155-8。由于缺乏能夠移植到卵母細(xì)胞或發(fā)育的胚胎中的干細(xì)胞，在小鼠以外的哺乳動(dòng)物中的同源重組曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature405：1066-9(2000)報(bào)道了通過在原代胚胎成纖維細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和選擇在綿羊中成功進(jìn)行了同源重組。一旦在DNA中誘導(dǎo)產(chǎn)生雙鏈斷裂，細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制就被激活以修復(fù)斷裂。易錯(cuò)DNA修復(fù)機(jī)制可在雙鏈斷裂位點(diǎn)產(chǎn)生突變。將斷裂端連到一起的最常用修復(fù)機(jī)制是非同源末端連接(NHEJ)途徑(Bleuyard等人，(2006)DNARepair5：1-12)。染色體的結(jié)構(gòu)完整性通常通過修復(fù)來保持，但缺失、插入或其他重排都是可能發(fā)生的(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。一個(gè)雙鏈斷裂的兩個(gè)末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBOJ19：5562-6)，但是，如果出現(xiàn)兩個(gè)不同的雙鏈斷裂，則來自不同斷裂的游離末端可連接并導(dǎo)致染色體缺失(Siebert和Puchta，(2002)PlantCell14：1121-31)，或不同染色體之間的染色體易位(Pacher等人，(2007)Genetics175：21-9)。也可將附加型DNA分子連接到雙鏈斷裂中，例如將T-DNA整合到染色體雙鏈斷裂中(Chilton和Que，(2003)PlantPhysiol133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)EMBOJ17：6086-95)。一旦雙鏈斷裂周圍的序列被改變，例如被參與雙鏈斷裂成熟的外切核酸酶活性改變，則基因轉(zhuǎn)換途徑可恢復(fù)原始結(jié)構(gòu)，如果有同源序列的話，如非分裂的體細(xì)胞中的同源染色體，或DNA復(fù)制后的姊妹染色單體(Molinier等人，(2004)PlantCell16：342-52)。異位的和/或表成的DNA序列也可充當(dāng)DNA修復(fù)模板用于同源重組(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。另選地，雙鏈斷裂可通過同源DNA序列之間的同源重組來修復(fù)。一旦雙鏈斷裂周圍的序列被改變，例如被參與雙鏈斷裂成熟的外切核酸酶活性改變，如果有同源序列的話，如非分裂的體細(xì)胞中的同源染色體，或DNA復(fù)制后的姊妹染色單體(Molinier等人，(2004)PlantCell16：342-52)，則基因轉(zhuǎn)換途徑可恢復(fù)原始結(jié)構(gòu)。異位的和/或表成的DNA序列也可充當(dāng)DNA修復(fù)模板用于同源重組(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。DNA雙鏈斷裂似乎是刺激同源重組途徑的有效因子(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol28：281-92；Tzfira和White，(2005)TrendsBiotechnol23：567-9；Puchta，(2005)JExpBot56：1-14)。使用DNA斷裂劑，在植物中人工構(gòu)建的同源DNA重復(fù)序列之間觀察到同源重組提高兩倍至九倍(Puchta等人，(1995)PlantMolBiol28：281-92)。在玉米原生質(zhì)體中，用線狀DNA分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證明了質(zhì)粒之間的同源重組增強(qiáng)(Lyznik等人，(1991)MolGenGenet230：209-18)。在一些實(shí)施例中，本文中提供的方法包括使細(xì)胞與供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶接觸。一旦通過Cas內(nèi)切核酸酶將雙鏈斷裂引入靶位點(diǎn)中，則供體DNA的第一同源性區(qū)域和第二同源性區(qū)域可經(jīng)歷與其相應(yīng)的同源性基因組區(qū)域的同源重組，從而在供體和基因組之間進(jìn)行DNA交換。因此，所提供的方法使供體DNA的感興趣的多核苷酸整合到細(xì)胞或生物體基因組的靶位點(diǎn)處的雙鏈斷裂中，從而改變?cè)及形稽c(diǎn)并產(chǎn)生改變的基因組靶位點(diǎn)。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)將引導(dǎo)多核苷酸、供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方式引入引導(dǎo)多核苷酸、Cas內(nèi)切核酸酶和供體DNA。這些方式包括但不限于通過粒子轟擊直接遞送每種組分，通過一個(gè)或多個(gè)重組DNA表達(dá)盒遞送，或它們的任意組合。在本公開的一些實(shí)施例中，該方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，其中使用能夠表達(dá)供體DNA和/或Cas內(nèi)切核酸酶的至少一個(gè)重組DNA構(gòu)建體將供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶引入到所述細(xì)胞中；并且/或其中引導(dǎo)多核苷酸通過粒子轟擊直接引入。在本公開的另一個(gè)實(shí)施例中，方法包括用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)將能夠表達(dá)引導(dǎo)多核苷酸的第一重組DNA構(gòu)建體、以及能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA構(gòu)建體引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸。可通過本領(lǐng)域已知的任何方式引入供體DNA。例如，提供了細(xì)胞或生物體，諸如但不限于具有靶位點(diǎn)的植物或酵母。供體DNA可通過本領(lǐng)域中已知的任何轉(zhuǎn)化方法來提供，所述轉(zhuǎn)化方法包括例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍粒子轟擊。供體DNA可瞬時(shí)地存在于細(xì)胞中或其可通過病毒復(fù)制子引入。在Cas內(nèi)切核酸酶和靶位點(diǎn)的存在下，供體DNA被插入到轉(zhuǎn)化的基因組中。另一個(gè)方法采用對(duì)現(xiàn)有的歸巢內(nèi)切核酸酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造以改變它們的靶標(biāo)特異性。歸巢內(nèi)切核酸酶，如I-SceI或I-CreI，能結(jié)合和裂解相對(duì)較長(zhǎng)的DNA識(shí)別序列(分別為18bp和22bp)。這些序列據(jù)預(yù)測(cè)在基因組中很少天然發(fā)生，通常僅1或2個(gè)位點(diǎn)/基因組。歸巢內(nèi)切核酸酶的裂解特異性可通過合理設(shè)計(jì)在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域處的氨基酸替換和/或突變單體的組合裝配和選擇來改變(參見例如Arnould等人，(2006)JMolBiol355：443-58；Ashworth等人，(2006)Nature441：656-9；Doyon等人，(2006)JAmChemSoc128：2477-84；Rosen等人，(2006)NucleicAcidsRes34：4791-800；以及Smith等人，(2006)NucleicAcidsRes34：e149；Lyznik等人(2009)美國專利申請(qǐng)公布20090133152A1；Smith等人(2007)美國專利申請(qǐng)公布20070117128A1)。已證明了經(jīng)工程改造的大范圍核酸酶能裂解同族突變位點(diǎn)而不擴(kuò)大它們的特異性。將對(duì)野生型酵母I-SceI歸巢核酸酶具有特異性的人工識(shí)別位點(diǎn)引入到玉米基因組中，檢測(cè)到當(dāng)轉(zhuǎn)基因I-SceI通過雜交引入并且通過基因切除激活時(shí)，在1％的被分析的F1植物中存在識(shí)別序列的突變(Yang等人，(2009)PlantMolBiol70：669-79)。更實(shí)際的是，使用基于I-CreI大范圍核酸酶序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的工程改造的單鏈內(nèi)切核酸酶靶向玉米無舌葉基因座(ligulelesslocus)。當(dāng)設(shè)計(jì)的歸巢核酸酶通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化不成熟胚來引入時(shí)，在3％的TO轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)到選定的無舌葉基因座識(shí)別序列的突變(Gao等人，(2010)PlantJ61：176-87)。感興趣的多核苷酸在本文中進(jìn)一步描述并且反映出作物開發(fā)參與者的商業(yè)市場(chǎng)和利益。感興趣的作物和市場(chǎng)在變化，隨著發(fā)展中國家開放了世界市場(chǎng)，也將出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。另外，隨著我們對(duì)農(nóng)學(xué)性狀和特性諸如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢(shì)的理解逐漸深入，基因工程的選擇將相應(yīng)地變化。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)進(jìn)行的基因組編輯。如本文所述，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板結(jié)合使用，允許編輯感興趣的基因組核苷酸序列。雖然存在許多雙鏈斷裂制造系統(tǒng)，但其實(shí)際應(yīng)用于基因編輯可能由于所誘導(dǎo)的雙鏈斷裂(DSB)的頻率相對(duì)較低而受限。迄今為止，許多基因組修飾方法依賴于同源重組系統(tǒng)。同源重組(HR)可提供用于找到感興趣的基因組DNA序列并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)范修飾它們的分子方法。同源重組以低頻率在植物體細(xì)胞中發(fā)生。該過程可通過在所選擇的內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂(DSB)而增強(qiáng)到用于基因組工程的實(shí)際水平。所面臨的挑戰(zhàn)是有效地在感興趣的基因組位點(diǎn)處形成DSB，因?yàn)閮蓚€(gè)相互作用的DNA分子之間的信息傳遞的方向性存在偏差(斷裂的分子充當(dāng)遺傳學(xué)信息的受體)。本文描述了引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)的用途，即，提供靈活的基因組裂解特異性并且在DNA靶位點(diǎn)處產(chǎn)生高頻率的雙鏈斷裂，從而實(shí)現(xiàn)在感興趣的核苷酸序列中的高效基因編輯，其中待編輯的感興趣的核苷酸序列可位于由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解的靶位點(diǎn)之內(nèi)或之外?！靶揎椀暮塑账帷被颉熬庉嫷暮塑账帷笔侵冈谂c未修飾的核苷酸序列相比時(shí)包含至少一種改變的感興趣的核苷酸序列。此類“改變”包括例如：(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何組合。術(shù)語“多核苷酸修飾模板”是指當(dāng)與待編輯的核苷酸序列相比時(shí)包含至少一種核苷酸修飾的多核苷酸。核苷酸修飾可為至少一個(gè)核苷酸的替換、添加或缺失。任選地，多核苷酸修飾模板還可包含至少一種核苷酸修飾旁側(cè)的同源核苷酸序列，其中旁側(cè)同源核苷酸序列向待編輯的所需核苷酸序列提供充分的同源性。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開描述了用于編輯細(xì)胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中Cas內(nèi)切核酸酶在所述細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。細(xì)胞包括但不限于動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細(xì)胞以及通過本文所述的方法制備的植物和種子。待編輯的核苷酸可位于由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解的靶位點(diǎn)之內(nèi)或之外。在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一種核苷酸修飾不是在由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解的靶位點(diǎn)處的修飾。在另一個(gè)實(shí)施例中，待編輯的至少一個(gè)核苷酸與基因組靶位點(diǎn)之間存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000個(gè)核苷酸。待編輯的核苷酸序列可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的序列。例如，細(xì)胞基因組中的核苷酸序列可為穩(wěn)定地?fù)饺氲郊?xì)胞基因組中的轉(zhuǎn)基因。編輯這樣的轉(zhuǎn)基因可得到另外的所需表型或基因型。細(xì)胞基因組中的核苷酸序列還可為突變的或預(yù)先存在的序列，其為從諸如感興趣的內(nèi)源基因或突變基因之類的起源內(nèi)生或人造的。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為啟動(dòng)子，其中編輯啟動(dòng)子導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動(dòng)子活性、提高的啟動(dòng)子組織特異性、降低的啟動(dòng)子活性、降低的啟動(dòng)子組織特異性、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的缺失或添加。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為細(xì)胞基因組中的調(diào)控序列。調(diào)控序列為能夠提高或降低生物體內(nèi)特定基因的表達(dá)的核酸分子的區(qū)段。調(diào)控序列的例子包括但不限于轉(zhuǎn)錄激活因子、轉(zhuǎn)錄阻遏子和翻譯阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、CAAT盒、CCAAT盒、普里布諾盒、TATA盒、SECIS元件和聚腺苷酸化信號(hào)。在一些實(shí)施例中，編輯調(diào)控元件導(dǎo)致改變的蛋白質(zhì)翻譯、RNA裂解、RNA剪接或轉(zhuǎn)錄終止。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的調(diào)控序列修飾在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的核苷酸序列可為調(diào)控序列，諸如啟動(dòng)子，其中編輯啟動(dòng)子包括將啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段替換(也稱為“啟動(dòng)子交換”或“啟動(dòng)子替換”)為不同的啟動(dòng)子(也稱為替換啟動(dòng)子)或啟動(dòng)子片段(也稱為替換啟動(dòng)子片段)，其中啟動(dòng)子替換導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動(dòng)子活性、提高的啟動(dòng)子組織特異性、降低的啟動(dòng)子活性、降低的啟動(dòng)子組織特異性、新的啟動(dòng)子活性、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性、延長(zhǎng)的基因表達(dá)窗、同一細(xì)胞層或其他細(xì)胞層中基因表達(dá)的時(shí)機(jī)或發(fā)育進(jìn)度的修飾(諸如但不限于延長(zhǎng)玉米花藥的絨氈層中基因表達(dá)的時(shí)機(jī)(1998年11月17日公布的US5,837,850))、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的缺失或添加。待修飾的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)。替換啟動(dòng)子(或替換啟動(dòng)子片段)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子片段)。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為啟動(dòng)子，其中編輯啟動(dòng)子包括將ARGOS8啟動(dòng)子替換為玉蜀黍(Zeamays)GOS2PRO：GOS2-內(nèi)含子啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為啟動(dòng)子，其中編輯啟動(dòng)子包括將天然EPSPS1啟動(dòng)子替換為植物泛素啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為啟動(dòng)子，其中編輯啟動(dòng)子包括將內(nèi)源玉米NPK1啟動(dòng)子替換為脅迫誘導(dǎo)型玉米R(shí)AB17啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，核苷酸序列可為啟動(dòng)子，其中待編輯的啟動(dòng)子選自玉蜀黍-PEPCI啟動(dòng)子(Kausch等人，PlantMolecularBiology，45：1-15，2001)、玉蜀黍泛素啟動(dòng)子(UBI1ZMPRO，Christensen等人，plantMolecularBiology18：675-689，1992)、玉蜀黍-Rootmet2啟動(dòng)子(US7,214,855)、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(OS-ACTINPRO，US5641876；McElroy等人，ThePlantCell，第2卷，163-171，1990年2月)、高粱RCC3啟動(dòng)子(2012年2月13日提交的US2012/0210463)、玉蜀黍-GOS2啟動(dòng)子(US6,504,083)、玉蜀黍-ACO2啟動(dòng)子(2014年3月14日提交的美國申請(qǐng)14/210,711)或玉蜀黍-油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(US8466341B2)。在另一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板或供體DNA序列結(jié)合使用以允許將啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件插入到感興趣的基因組核苷酸序列中，其中啟動(dòng)子插入(或啟動(dòng)子元件插入)導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的啟動(dòng)子活性(提高的啟動(dòng)子強(qiáng)度)、提高的啟動(dòng)子組織特異性、降低的啟動(dòng)子活性、降低的啟動(dòng)子組織特異性、新的啟動(dòng)子活性、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性、延長(zhǎng)的基因表達(dá)窗、基因表達(dá)的時(shí)機(jī)或發(fā)育進(jìn)度的修飾、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的添加。待插入的啟動(dòng)子元件可為但不限于啟動(dòng)子核心元件(諸如但不限于CAAT盒、CCAAT盒、普里布諾盒和/或TATA盒)、用于誘導(dǎo)型表達(dá)的翻譯調(diào)控序列和/或阻遏子系統(tǒng)(諸如TET操縱子阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物元件、或磺酰脲類(Su)阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物元件)。脫水響應(yīng)元件(DRE)首先經(jīng)鑒定為干旱響應(yīng)基因rd29A的啟動(dòng)子中的順式作用啟動(dòng)子元件，其包含9bp保守核心序列TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)PlantCell6，251-264)。將DRE插入到內(nèi)源啟動(dòng)子中可賦予下游基因干旱誘導(dǎo)型表達(dá)。另一個(gè)例子是ABA響應(yīng)元件(ABRE)，其包含據(jù)發(fā)現(xiàn)存在于許多ABA和/或脅迫調(diào)節(jié)的基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(BuskP.K.，PagesM.(1998)PlantMol.Biol.37：425-435)。將35S增強(qiáng)子或MMV增強(qiáng)子插入到內(nèi)源啟動(dòng)子區(qū)中將提高基因表達(dá)(美國專利5196525)。待插入的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子元件)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子(或啟動(dòng)子元件)。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于在內(nèi)源FMT1啟動(dòng)子前面插入增強(qiáng)子元件(諸如但不限于花椰菜花葉病毒35S增強(qiáng)子)以增強(qiáng)FTM1的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于將TET操縱子阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物系統(tǒng)的組分、或磺酰脲類(Su)阻遏子/操縱子/誘導(dǎo)物系統(tǒng)的組分插入到植物基因組中，以生成或控制誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于允許啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件的缺失，其中啟動(dòng)子缺失(或啟動(dòng)子元件缺失)導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：永久失活的基因座、提高的啟動(dòng)子活性(提高的啟動(dòng)子強(qiáng)度)、提高的啟動(dòng)子組織特異性、降低的啟動(dòng)子活性、降低的啟動(dòng)子組織特異性、新的啟動(dòng)子活性、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子活性、延長(zhǎng)的基因表達(dá)窗、基因表達(dá)的時(shí)機(jī)或發(fā)育進(jìn)度的修飾、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的添加。待缺失的啟動(dòng)子元件可為但不限于啟動(dòng)子核心元件、啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件或35S增強(qiáng)子元件(如實(shí)例32中所述)。待缺失的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子片段對(duì)于正在編輯的細(xì)胞可為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于缺失存在于玉米基因組中的ARGOS8啟動(dòng)子，如本文所述。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于缺失存在于植物基因組中的35S增強(qiáng)子元件，如本文所述。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的終止子修飾在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的核苷酸序列可為終止子，其中編輯終止子包括將終止子或終止子片段替換(也稱為“終止子交換”或“終止子替換”)為不同的終止子(也稱為替換終止子)或終止子片段(也稱為替換終止子片段)，其中終止子替換導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的缺失或添加。待修飾的終止子(或終止子片段)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的終止子(或終止子片段)。替換終止子(或替換終止子片段)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的終止子(或終止子片段)。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的核苷酸序列可為終止子，其中待編輯的終止子選自：來自玉米Argos8或SRTF18基因的終止子，或其他終止子，諸如馬鈴薯PinII終止子、高粱肌動(dòng)蛋白終止子(SB-ACTINTERM，2013年12月公布的WO2013/184537A1)、高粱SB-GKAFTERM(WO2013019461)、稻T28終止子(OS-T28TERM，WO2013/012729A2)、AT-T9TERM(WO2013/012729A2)或GZ-W64ATERM(US7053282)。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板或供體DNA序列結(jié)合使用以允許將終止子或終止子元件插入到感興趣的基因組核苷酸序列中，其中終止子插入(或終止子元件插入)導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性(提高的終止子強(qiáng)度)、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的添加。待插入的終止子(或終止子元件)可為對(duì)于正在編輯的細(xì)胞為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的終止子(或終止子元件)。在另一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于允許終止子或終止子元件的缺失，其中終止子缺失(或終止子元件缺失)導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的終止子活性(提高的終止子強(qiáng)度)、提高的終止子組織特異性、降低的終止子活性、降低的終止子組織特異性、DNA結(jié)合元件的突變和/或DNA結(jié)合元件的添加。待缺失的終止子或終止子片段對(duì)于正在編輯的細(xì)胞可為內(nèi)源、人工、預(yù)先存在、或轉(zhuǎn)基因的。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的另外的調(diào)控序列修飾在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于修飾或替換細(xì)胞基因組中的調(diào)控序列。調(diào)控序列為能夠提高或降低生物體內(nèi)特定基因的表達(dá)并且/或能夠改變生物體內(nèi)基因的組織特異性表達(dá)的核酸分子的區(qū)段。調(diào)控序列的例子包括但不限于3’UTR(非翻譯區(qū))區(qū)、5’UTR區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活因子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄阻遏子、翻譯阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、啟動(dòng)子元件、CAMV35S增強(qiáng)子、MMV增強(qiáng)子元件(2013年3月11日提交的PCT/US14/23451)、SECIS元件、聚腺苷酸化信號(hào)，以及聚泛素化位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，編輯(修飾)或替換調(diào)控元件導(dǎo)致改變的蛋白質(zhì)翻譯、RNA裂解、RNA剪接、轉(zhuǎn)錄終止或翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，可鑒定啟動(dòng)子內(nèi)的調(diào)控元件并且可編輯或修飾這些調(diào)控元件，從而優(yōu)化這些調(diào)控元件對(duì)啟動(dòng)子的上調(diào)或下調(diào)。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的基因組序列是聚泛素化位點(diǎn)，其中聚泛素化位點(diǎn)的修飾改變了蛋白質(zhì)降解速度。泛素標(biāo)簽使蛋白質(zhì)通過蛋白酶體或自體吞噬降解。已知蛋白酶體抑制劑導(dǎo)致蛋白質(zhì)生產(chǎn)過剩。對(duì)編碼感興趣的蛋白質(zhì)的DNA序列的修飾可產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的至少一種氨基酸修飾，其中所述修飾允許蛋白質(zhì)的聚泛素化(翻譯后修飾)，從而導(dǎo)致對(duì)蛋白質(zhì)降解的修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為玉米EPSPS基因上的聚泛素化位點(diǎn)，其中聚泛素化位點(diǎn)經(jīng)修飾后，由于EPSPS蛋白質(zhì)降解速度減慢，所以蛋白質(zhì)含量提高。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內(nèi)含子位點(diǎn)，其中該修飾包括將內(nèi)含子增強(qiáng)基元插入到內(nèi)含子中，這引起對(duì)包含所述內(nèi)含子的基因的轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內(nèi)含子位點(diǎn)，其中該修飾包括將大豆EPSP1內(nèi)含子替換為大豆泛素內(nèi)含子1，如本文所述(實(shí)例25)。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的基因組序列為內(nèi)含子或UTR位點(diǎn)，其中該修飾包括將至少一個(gè)微RNA插入到所述內(nèi)含子或UTR位點(diǎn)，其中包含內(nèi)含子或UTR位點(diǎn)的基因的表達(dá)還引起所述微RNA的表達(dá)，這繼而可沉默由微RNA靶向的任何基因而不破壞包含所述內(nèi)含子的天然/轉(zhuǎn)基因的基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于允許鋅指轉(zhuǎn)錄因子的缺失或突變，其中鋅指轉(zhuǎn)錄因子的缺失或突變導(dǎo)致或允許形成顯性負(fù)性鋅指轉(zhuǎn)錄因子突變體(Li等人2013RicezincfingerproteinDSTenhancesgrainproductionthroughcontrollingGnla/OsCKX2expressionPNAS110：3167-3172)。在鋅指結(jié)構(gòu)域下游插入單個(gè)堿基對(duì)將導(dǎo)致移碼并且產(chǎn)生新蛋白質(zhì)，該新蛋白質(zhì)可在沒有轉(zhuǎn)錄活性的情況下仍結(jié)合到DNA。突變型蛋白將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到細(xì)胞分裂素氧化酶基因啟動(dòng)子并且阻斷細(xì)胞分裂素氧化酶基因的表達(dá)。細(xì)胞分裂素氧化酶基因表達(dá)的減少將提高細(xì)胞分裂素水平并且促進(jìn)稻中的稻穗生長(zhǎng)和玉米中的穗生長(zhǎng)，并且提高在正常和脅迫條件下的產(chǎn)量。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)修飾剪接位點(diǎn)和/或引入替代剪接位點(diǎn)蛋白質(zhì)合成使用由前mRNA分子經(jīng)受成熟過程產(chǎn)生的mRNA分子。通過添加多A尾對(duì)前mRNA分子進(jìn)行加帽、剪接和穩(wěn)定化。真核細(xì)胞進(jìn)化出復(fù)雜的剪接過程，該過程產(chǎn)生原始前mRNA分子的備選變體。真核細(xì)胞中的一些可能不產(chǎn)生用于蛋白質(zhì)合成的功能模板。在玉米細(xì)胞中，剪接過程受外顯子-內(nèi)含子連接位點(diǎn)處的剪接位點(diǎn)影響。典型的剪接位點(diǎn)的例子是AGGT?；蚓幋a序列可包含多個(gè)替代剪接位點(diǎn)，其可影響前mRNA成熟過程的總體效率，因而可限制細(xì)胞中的蛋白質(zhì)積累。引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸修飾模板結(jié)合使用來編輯感興趣的基因，從而在剪接位點(diǎn)的所述連接點(diǎn)或任何變體處引入典型的剪接位點(diǎn)，所述剪接位點(diǎn)改變前mRNA分子的剪接模式。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的核苷酸序列為玉米EPSPS基因，其中基因的修飾包括修飾可選的剪接位點(diǎn)，從而提高功能基因轉(zhuǎn)錄物和基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的產(chǎn)量。在一個(gè)實(shí)施例中，待修飾的感興趣的核苷酸序列為基因，其中基因的修飾包括編輯可選地剪接的基因的內(nèi)含子邊界以改變剪接變體的積累。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)進(jìn)行的編碼感興趣的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的修飾在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于修飾或替換細(xì)胞基因組中的編碼序列，其中修飾或替換導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的蛋白質(zhì)(酶)活性、提高的蛋白質(zhì)功能性、降低的蛋白質(zhì)活性、降低的蛋白質(zhì)功能性、位點(diǎn)特異性突變、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域交換、蛋白質(zhì)敲除、新的蛋白質(zhì)功能性、修飾的蛋白質(zhì)功能性。在一個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)敲除是由于將終止密碼子引入到感興趣的編碼序列中造成的。在一個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)敲除是由于感興趣的編碼序列中的起始密碼子的缺失造成的。使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的氨基酸和/或蛋白質(zhì)融合在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼第一蛋白質(zhì)的第一編碼序列融合到編碼細(xì)胞基因組中的第二蛋白質(zhì)的第二編碼序列，其中蛋白質(zhì)融合導(dǎo)致以下情況中的任一種或以下情況的任一組合：提高的蛋白質(zhì)(酶)活性、提高的蛋白質(zhì)功能性、降低的蛋白質(zhì)活性、降低的蛋白質(zhì)功能性、新的蛋白質(zhì)功能性、修飾的蛋白質(zhì)功能性、新的蛋白質(zhì)定位、新的蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)機(jī)、修飾的蛋白質(zhì)表達(dá)模式、嵌合蛋白質(zhì)，或具有顯性表型功能性的修飾蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號(hào)的第一編碼序列融合到編碼感興趣的蛋白質(zhì)的第二編碼序列，其中蛋白質(zhì)融合將感興趣的蛋白質(zhì)靶向到葉綠體。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號(hào)的第一編碼序列融合到編碼感興趣的蛋白質(zhì)的第二編碼序列，其中蛋白質(zhì)融合將感興趣的蛋白質(zhì)靶向到葉綠體。在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以將編碼葉綠體定位信號(hào)(例如，葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)的第一編碼序列融合到第二編碼序列，其中蛋白質(zhì)融合產(chǎn)生具有顯性表型功能性的修飾蛋白質(zhì)。通過使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)在感興趣的基因中表達(dá)反向重復(fù)進(jìn)行的基因沉默在一個(gè)實(shí)施例中，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可與共同遞送的多核苷酸序列結(jié)合使用以將反向基因片段插入到生物體基因組的感興趣的基因中，其中插入反向基因片段可允許在體內(nèi)創(chuàng)建反向重復(fù)(發(fā)夾)并且導(dǎo)致所述內(nèi)源基因的沉默。在一個(gè)實(shí)施例中，插入反向基因片段可導(dǎo)致在基因的天然(或修飾的)啟動(dòng)子和/或天然基因的天然5’端中形成體內(nèi)創(chuàng)建的反向重復(fù)(發(fā)夾)。反向基因片段還可包含內(nèi)含子，其可導(dǎo)致所靶向基因的增強(qiáng)沉默。用于性狀基因座表征的基因組缺失植物育種中的性狀定位通常會(huì)檢測(cè)其中含有控制感興趣的性狀表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)基因的染色體區(qū)域。對(duì)于質(zhì)量性狀，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于消除所鑒定的染色體區(qū)域中的候選基因，以確定所述基因的缺失是否影響性狀的表達(dá)。對(duì)于數(shù)量性狀，感興趣的性狀的表達(dá)取決于在一個(gè)或多個(gè)染色體上效應(yīng)量、復(fù)雜性和統(tǒng)計(jì)顯著性不同的多個(gè)數(shù)量性狀基因座(QTL)。在負(fù)面效應(yīng)或有害QTL區(qū)域影響復(fù)雜性狀的情況下，引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)可用于消除由標(biāo)記輔助的精細(xì)定位界定的整個(gè)區(qū)域，以及用于靶向特定區(qū)域來進(jìn)行其選擇性消除或重排。類似地，存在/不存在變異(PAV)或拷貝數(shù)變異(CNV)可使用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)通過選擇性基因組缺失操縱。在一個(gè)實(shí)施例中，感興趣的區(qū)域可在旁側(cè)帶有兩個(gè)獨(dú)立的引導(dǎo)多核苷酸/CAS內(nèi)切核酸酶靶序列。裂解將同時(shí)進(jìn)行。缺失事件將為不具有感興趣的區(qū)域的兩個(gè)染色體末端的修復(fù)?？蛇x結(jié)果將包括感興趣的區(qū)域的倒位，在切割位點(diǎn)處的突變以及感興趣的區(qū)域的重復(fù)。用于鑒定在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸的至少一個(gè)植物細(xì)胞的方法。還提供了用于鑒定在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸的至少一個(gè)植物細(xì)胞的方法。有多種方法可用于鑒定在靶位點(diǎn)處或附近具有對(duì)基因組的插入的那些植物細(xì)胞，而無須使用可篩選的標(biāo)記表型。這種方法可認(rèn)為是直接分析靶序列以檢測(cè)靶序列中的任何變化，包括但不限于PCR方法、測(cè)序方法、核酸酶消化、DNA印跡法以及它們的任何組合。參見例如，美國專利申請(qǐng)12/147,834以本文所述方法所需的程度并入本文中。該方法還包括由包含整合到其基因組中的感興趣的多核苷酸的植物細(xì)胞再生植物。該植物可為不育的或能育的。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到任何感興趣的多核苷酸均可在靶位點(diǎn)處提供、整合到植物基因組中，并且在植物中表達(dá)。感興趣的多核苷酸/多肽包括但不限于除草劑耐受性編碼序列、殺昆蟲編碼序列、殺線蟲編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物和生物脅迫耐受性編碼序列、或修飾植物性狀例如產(chǎn)量、谷粒質(zhì)量、營(yíng)養(yǎng)成分、淀粉質(zhì)量和數(shù)量、固氮和/或氮利用、脂肪酸以及含油量和/或油組成的序列。更具體的感興趣的多核苷酸包括但不限于改善作物產(chǎn)量的基因，改善作物合意性的多肽，編碼賦予對(duì)非生物壓力例如干旱、氮、溫度、鹽度、有毒金屬或微量元素的抗性的蛋白或賦予對(duì)毒素例如殺蟲劑和除草劑的抗性的那些蛋白或賦予對(duì)生物壓力例如真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲和線蟲入侵的抗性及對(duì)與這些生物體相關(guān)疾病的發(fā)展的抗性的那些蛋白的基因。感興趣的基因的大體類別包括例如涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及管家的那些基因(如熱休克蛋白)。轉(zhuǎn)基因的更具體類別例如包括編碼對(duì)農(nóng)藝學(xué)、昆蟲抗性、病害抗性、除草劑抗性、能育性或不育性、谷粒特性和商業(yè)產(chǎn)品重要的性狀的基因。一般而言，感興趣的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的那些以及影響籽粒大小、蔗糖載量等的那些，所述性狀可與其他性狀堆疊或組合使用，所述其他性狀諸如但不限于本文所述的除草劑抗性。除了使用傳統(tǒng)的育種方法外，還可通過遺傳方式改變農(nóng)藝上重要的性狀，比如油脂含量、淀粉含量和蛋白質(zhì)含量。修飾包括提高油酸、飽和油脂與不飽和油脂的含量，提升賴氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修飾淀粉。美國專利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389描述了大麥硫堇(Hordothionin)蛋白質(zhì)修飾法，這些專利都以引用方式并入本文。另一個(gè)例子是美國專利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或富含硫的種子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的來自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，這些文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都以引用方式并入本文。還可在感興趣的多核苷酸上編碼可提高例如用于乙醇生產(chǎn)的淀粉，或提供蛋白質(zhì)的表達(dá)的商業(yè)性狀。經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的另一個(gè)重要商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料，如美國專利5,602,321中所述。諸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA還原酶的基因(參見Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達(dá)。可通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生編碼序列的衍生物，由此提高預(yù)選氨基酸在所編碼的多肽中的水平。舉例來說，編碼大麥高賴氨酸多肽(BHL)的基因源自大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑(1996年11月1日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)08/740,682，以及WO98/20133，這些專利的公開內(nèi)容以引用方式并入本文)。其他蛋白質(zhì)包括富含甲硫氨酸的植物蛋白質(zhì)，諸如來自葵花籽的蛋白質(zhì)(Lilley等人(1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs，Applewhite編輯(AmericanOilChemistsSociety，Champaign，Illinois)，第497-502頁；該文獻(xiàn)以引用方式并入本文)；來自玉米的蛋白質(zhì)(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359，這兩篇文獻(xiàn)均以引用方式并入本文)和來自稻的蛋白質(zhì)(Musumura等人(1989)PlantMol.Biol.12：123，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文)。其他農(nóng)藝上重要的基因編碼膠乳、Floury2、生長(zhǎng)因子、種子貯藏因子和轉(zhuǎn)錄因子。改善作物產(chǎn)量的多核苷酸包括矮化基因，如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature400：256-261)以及提高植物生長(zhǎng)的那些，如銨誘導(dǎo)型谷氨酸脫氫酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允許植物具有減少的飽和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的那些多核苷酸、以及提高籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善鹽耐受性的多核苷酸是提高或允許植物在與已引入耐鹽基因的該植物的天然環(huán)境相比更高鹽度的環(huán)境中生長(zhǎng)的那些多核苷酸。影響氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如鄰氨基苯甲酸合酶(AS；EC4.1.3.27)，該酶催化植物、真菌和細(xì)菌中從芳族氨基酸途徑分支到色氨酸生物合成的第一反應(yīng)。在植物中，色氨酸生物合成的化學(xué)過程處于葉綠體區(qū)室中。參見例如美國公布20080050506，這篇文獻(xiàn)以引用方式并入本文。另外的感興趣的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指編碼催化分支酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已從大腸桿菌中分離并具有GenBank登錄號(hào)M96268。參見美國專利7,361,811，將其以引用的方式并入本文。這些感興趣的多核苷酸序列可編碼涉及提供病害或害蟲抗性的蛋白。所謂“病害抗性”或“害蟲抗性”意指植物避開作為植物-病原體相互作用的后果的有害癥狀。害蟲抗性基因可編碼對(duì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量的害蟲如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和昆蟲抗性基因，如用于抗細(xì)菌保護(hù)的溶菌酶或天蠶抗菌肽(cecropin)，或用于抗真菌保護(hù)的蛋白質(zhì)如防御素、葡聚糖酶或幾丁質(zhì)酶，或用于防治線蟲或昆蟲的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)內(nèi)毒素、蛋白酶抑制劑、膠原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因產(chǎn)物的例子。編碼病害抗性性狀的基因包括解毒基因，如抗伏馬毒素(美國專利5,792,931)；無毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science266：789；Martin等人(1993)Science262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell78：1089)等等。昆蟲抗性基因可編碼針對(duì)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量大跌的害蟲(諸如根蟲、切根蟲、歐洲玉米螟等)的抗性。這種基因包括例如蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因(美國專利5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene48：109)等等?！俺輨┛剐缘鞍住被蛴伞俺輨┛剐跃幋a核酸分子”表達(dá)生成的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)，其賦予細(xì)胞與未表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞相比耐受更高濃度除草劑的能力，或賦予細(xì)胞與未表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞相比對(duì)某種濃度除草劑耐受更長(zhǎng)時(shí)間的能力。除草劑抗性性狀可通過如下基因引入到植物中：編碼對(duì)乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草劑(特別是磺酰脲類除草劑)的抗性的基因、編碼對(duì)谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草劑例如膦絲菌素或basta的抗性的基因(如，bar基因)、對(duì)草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、對(duì)HPPD抑制劑的抗性的基因(如，HPPD基因)或本領(lǐng)域已知的其他這類基因。參見例如美國專利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美國臨時(shí)申請(qǐng)61/401,456，將所述專利每一者以引用的方式并入本文。bar基因編碼對(duì)除草劑basta的抗性，nptII基因編碼對(duì)抗生素卡那霉素和遺傳霉素的抗性，ALS基因突變體編碼對(duì)除草劑氯磺隆的抗性。不育基因也可編碼在表達(dá)盒中，為物理去雄提供備選方案。以此類方式使用的基因的例子包括雄性育性基因，諸如MS26(參見例如美國專利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(參見例如美國專利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(參見例如美國專利7,919,676)。玉米植物(玉蜀黍(ZeamaysL.))可通過自花授粉和異花授粉兩種技術(shù)來進(jìn)行育種。在同一植株上，玉米具有位于雄穗上的雄花，以及位于雌穗上的雌花。其可自花授粉(“自交”)或異花授粉。當(dāng)風(fēng)將花粉從雄穗吹至從初始雌穗頂部突出的穗絲時(shí)在玉米中發(fā)生天然的授粉。授粉可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)容易地控制。玉米雜交體的開發(fā)需要純合近交系的開發(fā)、這些近交系的雜交和雜交的評(píng)估。譜系選擇和輪回選擇是用于從群體開發(fā)近交系的兩種育種方法。育種程序?qū)碜詢煞N或更多種近交系或各種廣泛來源的所需性狀結(jié)合到育種庫中，從育種庫中通過自交并選擇所需表型來開發(fā)新的近交系。雜交玉米品種是兩個(gè)此類近交系的雜交，所述近交系中的每個(gè)可能具有一種或多種在另一近交系中缺乏的所需特性，或補(bǔ)充另一近交系的所需特性。使新的近交株與其他近交系雜交，并且對(duì)來自這些雜交的雜交體進(jìn)行評(píng)價(jià)以確定哪些具有商業(yè)潛力。第一代雜交子代稱為F1。F1雜交體比其自交親本更有活力。該雜交體活力(或雜種優(yōu)勢(shì))可以多種方式體現(xiàn)，包括提高的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和提高的產(chǎn)量。雜交玉米種子可通過結(jié)合了人工去雄的雄性不育系統(tǒng)產(chǎn)生。為了產(chǎn)生雜交種子，將雄穗從生長(zhǎng)的雌性近交親本移除，其可以與雄性近交親本成交替行的多種模式種植。因此，在與外來玉米花粉的來源充分隔離的前提條件下，磁性近交株的雌穗將僅通過來自雄性近交株的花粉受精。因此所得種子是雜交體(F1)并且將形成雜交植物。影響植物發(fā)育的田地變化可導(dǎo)致植物在雌性親本的人工去雄完成之后抽穗?；蛘撸菩越恢参镄鬯肟赡軣o法在去雄過程期間被完全移除。在任何情況下，結(jié)果是雌性植物將成功地散出花粉并且一些雌性植物將自花授粉。這將導(dǎo)致雌性近交株的種子連同正常產(chǎn)生的雜交種子一起收獲。雌性近交株種子不表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)并且因此不如F1種子高產(chǎn)。此外，雌性近交株種子的存在對(duì)于生產(chǎn)雜交體的公司可能意味著種質(zhì)安全風(fēng)險(xiǎn)。另選地，雌性近交株可通過機(jī)器機(jī)械地去雄。機(jī)械去雄大致如手工去雄一樣可靠，但是更快并且成本更低。然而，大多數(shù)去雄機(jī)器比手工去雄對(duì)植物產(chǎn)生更多損害。因此，目前沒有一種去雄形式是完全令人滿意的，并且仍然需要進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本的替代品以及消除雜交種子生產(chǎn)中雌性親本的自花授粉。造成植物中雄性不育的突變有潛力可用于作物植物(諸如玉米)的雜交種子生產(chǎn)的方法中，并且可通過以下方式來降低生產(chǎn)成本：消除耗費(fèi)勞力地從用作雜交親本的母本植物移除雄花(也稱為去雄)的需要。已有多種方法可產(chǎn)生造成玉米中雄性不育的突變，諸如X射線或紫外線照射、化學(xué)處理或轉(zhuǎn)座元件插入(ms23、ms25、ms26、ms32)(Chaubal等人(2000)AmJBot87：1193-1201)。通過育性/不育性“分子開關(guān)”對(duì)育性基因進(jìn)行條件調(diào)控可增強(qiáng)設(shè)計(jì)用于作物改良的新雄性不育性系統(tǒng)的選擇性(Unger等人(2002)TransgenicRes11：455-465)。除了鑒定影響雄性育性的新型基因之外，還需要提供產(chǎn)生遺傳雄性不育性的可靠系統(tǒng)。在美國專利5,478,369中，描述了一種方法，通過該方法將Ms45雄性育性基因加標(biāo)簽并克隆在玉米9號(hào)染色體上。此前，已描述了9號(hào)染色體上的從未被克隆和測(cè)序的雄性育性基因ms2。該基因不是‘369專利中提到的基因的等位基因。參見Albertsen，M.和Phillips，R.L.，“DevelopmentalCytologyof13GeneticMaleSterileLociinMaize”CanadianJournalofGenetics&Cytology23：195-208(1981年1月)。在此之前克隆的僅有的育性基因是Aarts等人(出處同上)描述的擬南芥(Arabidopsis)基因。隨后發(fā)現(xiàn)的對(duì)于雄性育性重要的基因的例子有很多并且包括擬南芥敗育小孢子(AMS)基因(Sorensen等人，ThePlantJournal(2003)33(2)：413-423)；擬南芥MS1基因(Wilson等人，ThePlantJournal(2001)39(2)：170-181)；NEF1基因(Ariizumi等人，ThePlantJournal(2004)39(2)：170-181)；擬南芥AtGPAT1基因(Zheng等人，ThePlantCell(2003)15：1872-1887)；擬南芥dde2-2突變被示為缺乏丙二烯氧合酶基因(Malek等人，Planta(2002)216：187-192)；擬南芥匿名(faceless)花粉-1基因(flp1)(Ariizumi等人，PlantMol.Biol.(2003)53：107-116)；擬南芥雄性性母細(xì)胞死亡1基因(Yang等人，ThePlantCell(2003)15：1281-1295)；絨氈層特異性鋅指基因TAZ1(Kapoor等人，ThePlantCell(2002)14：2353-2367)；以及絨氈層決定子1基因(Lan等人，ThePlantCell(2003)15：2792-2804)。其他已知的來自玉蜀黍的雄性育性突變體或基因在美國專利7,919,676中列出，該專利以引用方式并入本文。其他基因包括激酶和編碼對(duì)雄性或雌性配子體發(fā)育有毒的化合物的那些基因。此外，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到感興趣的多核苷酸可還包含與所靶向的感興趣的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補(bǔ)的反義序列。構(gòu)建反義核苷酸以與對(duì)應(yīng)的mRNA雜交。可對(duì)反義序列作出修飾，只要該序列能雜交對(duì)應(yīng)的mRNA并干擾其表達(dá)。以此方式，可使用與對(duì)應(yīng)的反義序列具有70％、80％或85％序列同一性的反義構(gòu)建體。此外，反義核苷酸的部分可用來破壞靶基因的表達(dá)。一般而言，可使用至少50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的序列。另外，感興趣的多核苷酸還可以以有義取向使用來抑制植物中的內(nèi)源基因的表達(dá)。用有義取向的多核苷酸抑制植物中的基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。該方法通常涉及用包含這樣的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該啟動(dòng)子可操作地連接至對(duì)應(yīng)于該內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列的至少一部分，能驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)。通常，這種核苷酸序列與內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物的序列具有實(shí)質(zhì)的序列同一性，通常高于約65％的序列同一性、約85％的序列同一性或高于約95％的序列同一性。參見美國專利5,283,184和5,034,323；將這些專利以引用方式并入本文。感興趣的多核苷酸還可以是表型標(biāo)記。表型標(biāo)記是可篩選或可選擇的標(biāo)記，其包括可視標(biāo)記和選擇標(biāo)記，無論它是陽性還是陰性選擇標(biāo)記?？墒褂萌魏伪硇蜆?biāo)記。具體地，可選擇的或可篩選的標(biāo)記包含這樣的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段使得可以常常在特定條件下鑒別或選取或不選取含有它的分子或細(xì)胞。這些標(biāo)記可編碼活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或可為RNA、肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)和有機(jī)化合物或組合物等提供結(jié)合位點(diǎn)。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于包含限制性酶位點(diǎn)的DNA區(qū)段；編碼提供對(duì)于有毒化合物的抗性的產(chǎn)物的DNA區(qū)段，所述有毒化合物包括抗生素，諸如壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Basta、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)；編碼另外缺乏受體細(xì)胞的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(例如，tRNA基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記)；編碼可易于鑒定的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(例如，表型標(biāo)記，諸如β-半乳糖苷酶、GUS；熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)，青色熒光蛋白(CFP)，黃色熒光蛋白(YFP)，紅色熒光蛋白(RFP)，以及細(xì)胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位點(diǎn)(例如，之前尚未并置的兩個(gè)DNA序列的并置)的DNA區(qū)段；包含未受限制性內(nèi)切核酸酶或其他DNA修飾酶、化學(xué)品等作用或受其作用的DNA序列的DNA區(qū)段；以及包含特異性修飾(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA區(qū)段，該特異性修飾使得可以鑒別該DNA序列。另外的選擇性標(biāo)記包括能賦予對(duì)除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。參見例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell71：63-72；Reznikoff，(1992)MolMicrobiol6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell49：603-12；Figge等人，(1988)Cell52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol10：143-62；Degenkolb等人，(1991)AntimicrobAgentsChemother35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgentsChemother36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature334：721-4。也可以在一種或多種基因上編碼商業(yè)性狀，所述基因可提高例如用于乙醇生產(chǎn)的淀粉，或提供蛋白質(zhì)表達(dá)。經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的另一個(gè)重要商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料，如美國專利5,602,321中所述。諸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羥基丁酸合酶)和乙酰乙?；?CoA還原酶的基因(參見Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達(dá)。外源產(chǎn)物包括植物酶和植物產(chǎn)物，以及來自包括原核生物和其他真核生物在內(nèi)的其他來源的那些產(chǎn)物。這類產(chǎn)物包括酶、輔因子、激素等?？商岣叩鞍踪|(zhì)，特別是具有能夠提高植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改善氨基酸分布的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)的水平。這可通過表達(dá)具有提高的氨基酸含量的這類蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。感興趣的轉(zhuǎn)基因、重組DNA分子、DNA序列以及感興趣的多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表達(dá)DNA序列的基因沉默方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于共抑制、反義抑制、雙鏈RNA(dsRNA)干擾、發(fā)夾RNA(hpRNA)干擾、含內(nèi)含子的發(fā)夾RNA(ihpRNA)干擾、轉(zhuǎn)錄基因沉默以及微RNA(miRNA)干擾。本文所用的“核酸”是指多核苷酸，包括脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。核酸也可包括片段和修飾的核苷酸。因此，術(shù)語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互換使用，表示單鏈或雙鏈的RNA和/或DNA聚合物，其任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。核苷酸(通常以它們的5′-單磷酸形式存在)通過它們的單字母命名指代如下：“A”指代腺苷或脫氧腺苷(分別對(duì)于RNA或DNA)，“C”指代胞嘧啶或脫氧胞嘧啶，“G”指代鳥苷或脫氧鳥苷，“U”指代尿苷，“T”指代脫氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或T)，“K”指代G或T，“H”指代A或C或T，“I”指代肌苷，“N”指代任何核苷酸。“開放閱讀框”縮寫為ORF。術(shù)語“功能上等同的亞片段”和“功能等同亞片段”在本文中可互換使用。這些術(shù)語指代分離核酸片段的這樣的部分或亞序列，其中改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力得到保持，無論該片段或亞序列是否編碼活性酶。例如，該片段或亞片段可用于設(shè)計(jì)基因以在轉(zhuǎn)化的植物中產(chǎn)生所需的表型?？赏ㄟ^將核酸片段或其亞片段——無論其是否編碼活性酶——相對(duì)于植物啟動(dòng)子序列以有義或反義方向進(jìn)行連接，來設(shè)計(jì)基因用于抑制。術(shù)語“保守結(jié)構(gòu)域”或“基元”是指在進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)的經(jīng)比對(duì)的序列上特定位置處保守的一組氨基酸。雖然其他位置處的氨基酸在同源蛋白質(zhì)之間可變，但在特定位置處高度保守的氨基酸表示對(duì)于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性而言必需的氨基酸。由于它們因其在蛋白質(zhì)同源物家族的經(jīng)比對(duì)的序列中的高保守度而被鑒定，它們可用作鑒定物或“識(shí)別標(biāo)志(signature)”，以鑒定具有新確定的序列的蛋白質(zhì)是否屬于之前鑒定的蛋白質(zhì)家族。多核苷酸和多肽序列、其變體以及這些序列的結(jié)構(gòu)關(guān)系，可用術(shù)語“同源性”、“同源的”、“實(shí)質(zhì)上相同的”、“實(shí)質(zhì)上相似的”和“實(shí)質(zhì)上對(duì)應(yīng)”描述，這些術(shù)語在本文中可互換使用。這些是指多肽或核酸片段，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸堿基的變化不影響分子的功能，如介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語還指核酸片段的這樣的修飾，相對(duì)于初始的未修飾的片段，所述修飾不實(shí)質(zhì)上改變所得的核酸片段的功能性質(zhì)。這些修飾包括在核酸片段中缺失、替換和/或插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸。所涵蓋的實(shí)質(zhì)上相似的核酸序列，可通過其與本文所例示的序列雜交，或與本文所公開的且與任何本文所公開的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分雜交(在中等嚴(yán)格條件下，例如0.5XSSC，0.1％SDS，60℃)的能力來定義。可調(diào)整嚴(yán)格性條件以篩選中等相似片段，如來自遠(yuǎn)緣關(guān)系生物的同源序列，以及高度相似片段，如來自近緣關(guān)系生物的復(fù)制功能酶的基因。雜交后的洗滌決定了嚴(yán)格性條件。術(shù)語“選擇性雜交”包括指涉在嚴(yán)格雜交條件下核酸序列與指定的核酸靶序列雜交的程度比其與非靶序列雜交的程度可檢測(cè)地更高(例如，至少2倍于背景)，并且實(shí)質(zhì)上排除非靶核酸。選擇性雜交的序列通常相互具有約至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互補(bǔ)性)。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括指代在體外雜交測(cè)定中探針將與其靶序列選擇性雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的情況中將會(huì)不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))。另選地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。一般地講，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，任選地長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其他鹽)，pH為7.0至8.3，對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少30℃，對(duì)長(zhǎng)探針(例如超過50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約60℃的那些條件。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括用30％-35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37℃下雜交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中在50-55℃下洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在40％-45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中在37℃下雜交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS中在37℃下雜交并在0.1倍SSC中在60-65℃下洗滌。在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比較窗范圍為獲得最大對(duì)應(yīng)而比對(duì)時(shí)兩條序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。術(shù)語“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過在比較窗上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸或多肽序列在比較窗中的部分與參考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。通過以下方式計(jì)算這種百分?jǐn)?shù)：確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。序列同一性百分?jǐn)?shù)的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％的任何整數(shù)百分?jǐn)?shù)。這些同一性可用本文描述的任何程序確定。序列比對(duì)和百分比同一性或相似性計(jì)算可用多種被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)同源序列的比較方法來確定，包括但不限于LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包的MegAlignTM程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。在本申請(qǐng)的上下文中，應(yīng)理解，在使用序列分析軟件進(jìn)行分析的情況中，除非另有指明，否則分析的結(jié)果將基于所提到的程序的“默認(rèn)值”。本文所用的“默認(rèn)值”將意指軟件第一次初始化時(shí)原始裝載在該軟件中的任何數(shù)值或參數(shù)組?！癈lustalV比對(duì)方法”對(duì)應(yīng)于標(biāo)記為ClustalV的比對(duì)方法(通過以下文獻(xiàn)描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci8：189-191)并且可見于LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包的MegAlignTM程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。對(duì)于多序列比對(duì)，默認(rèn)值對(duì)應(yīng)于GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝10。使用Clustal方法進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的雙序列比對(duì)和同一性百分?jǐn)?shù)計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5，以及DIAGONALSSAVED＝5。對(duì)于核酸，這些參數(shù)是KTUPLE＝2、GAPPENALTY＝5，WINDOW＝4，以及DIAGONALSSAVED＝4。在用ClustalV程序進(jìn)行序列比對(duì)后，可以通過觀察同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”?！癈lustalW比對(duì)方法”對(duì)應(yīng)于標(biāo)記為ClustalW的比對(duì)方法(通過以下文獻(xiàn)描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Higgins等人，(1992)ComputApplBiosci8：189-191)并且可見于LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包的MegAlignTMv6.1程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。用于多序列比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)(GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝0.2，DelayDivergenSeqs(％)＝30，DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重＝0.5，蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣＝Gonnet系列，DNA權(quán)重矩陣＝IUB)。在用ClustalW程序進(jìn)行序列比對(duì)后，可以通過觀察同一程序中的“序列距離”表來獲得“百分比同一性”。除非另有規(guī)定，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，SanDiego，CA)用以下參數(shù)獲得的值：使用空位產(chǎn)生罰分權(quán)重50和空位長(zhǎng)度延伸罰分權(quán)重3以及nwsgapdna.cmp打分矩陣獲得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用空位產(chǎn)生罰分權(quán)重8和空位長(zhǎng)度延伸罰分2以及BLOSUM62打分矩陣獲得的氨基酸序列的同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)。GAP利用Needleman和Wunsch，(1970)JMolBiol48：443-53的算法來尋找兩個(gè)完整序列的比對(duì)，該比對(duì)使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并使用以匹配堿基為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分產(chǎn)生出具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)?！癇LAST”是美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的用于尋找生物序列之間的相似性區(qū)域的搜索算法。該程序?qū)⒑塑账峄虻鞍踪|(zhì)序列與序列數(shù)據(jù)庫比較，并計(jì)算各匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性以鑒定出與查詢序列具有足夠的相似性的序列，使得相似性不會(huì)被預(yù)測(cè)為隨機(jī)發(fā)生。BLAST報(bào)告所鑒定的序列以及它們與查詢序列的局部比對(duì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知，許多序列同一性水平可用于鑒定來自其它物種的或經(jīng)天然修飾或合成法修飾的多肽，其中這種多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分?jǐn)?shù)的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％之間的任何整數(shù)百分?jǐn)?shù)。實(shí)際上，50％至100％之間的任何整數(shù)氨基酸同一性可用于描述本公開，如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％?！盎颉卑ū磉_(dá)功能性分子(諸如但不限于特定蛋白質(zhì))的核酸片段，包括位于編碼序列之前(5′非編碼序列)和之后(3′非編碼序列)的調(diào)控序列?！疤烊换颉敝溉缱匀唤缰姓业侥菢泳哂衅渥陨碚{(diào)節(jié)序列的基因?！巴蛔兓颉笔且淹ㄟ^人為干預(yù)被改變的天然基因。這種“突變基因”的序列與相應(yīng)的非突變基因的序列不同之處在于至少一個(gè)核苷酸的添加、缺失或替換。在本公開的某些實(shí)施例中，突變基因包含由本文所公開的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)引起的改變。突變植物是包含突變基因的植物。本文所用的“靶向突變”是天然基因中的通過如下方式產(chǎn)生的突變：使用涉及本文所公開的或本領(lǐng)域已知的能夠在靶序列的DNA中引起雙鏈斷裂的雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑的方法，對(duì)天然基因內(nèi)的靶序列進(jìn)行改變。在一個(gè)實(shí)施例中，靶向突變是引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)的基因編輯的結(jié)果，如本文所述。引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)的靶向突變可發(fā)生于位于基因組靶位點(diǎn)之內(nèi)或之外的核苷酸序列中，該基因組靶位點(diǎn)由Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解。術(shù)語“基因組”應(yīng)用于植物細(xì)胞時(shí)，不僅涵蓋細(xì)胞核內(nèi)存在的染色體DNA，也涵蓋細(xì)胞的亞細(xì)胞組分(例如線粒體或質(zhì)體)中存在的細(xì)胞器DNA?！懊艽a子修飾的基因”或“密碼子偏好的基因”或“密碼子優(yōu)化的基因”是這樣的基因，其密碼子用法的頻率被設(shè)計(jì)成模擬宿主細(xì)胞的偏好密碼子用法的頻率?！暗任换颉笔腔虻恼紦?jù)染色體上特定基因座的幾種另選形式之一。當(dāng)染色體上特定基因座處存在的所有等位基因都相同時(shí)，該植物在該基因座處是純合的。如果染色體上特定基因座處存在的等位基因不同，則該植物在該基因座處是雜合的?！熬幋a序列”指編碼特定氨基酸序列的多核苷酸序列?！罢{(diào)控序列”指位于編碼序列上游(5′非編碼序列)、內(nèi)部、或下游(3′非編碼序列)并且影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯的核苷酸序列。調(diào)控序列可包括但不限于：?jiǎn)?dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、5′非翻譯序列、3′非翻譯序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)?！爸参飪?yōu)化核苷酸序列”是已經(jīng)過優(yōu)化以提高在植物中的表達(dá)、特別是提高在植物中或一種或多種感興趣的植物中的表達(dá)的核苷酸序列。例如，可通過使用一個(gè)或多個(gè)用于改進(jìn)表達(dá)的植物偏好密碼子，對(duì)本文所公開的編碼蛋白質(zhì)例如雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑(例如內(nèi)切核酸酶)的核苷酸序列進(jìn)行修飾，來合成植物優(yōu)化核苷酸序列。有關(guān)宿主偏好的密碼子使用的討論，參見例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11。合成植物偏好基因的方法是本領(lǐng)域現(xiàn)成的。參見例如美國專利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，這些專利和文獻(xiàn)以引用方式并入本文。已知有另外的序列修飾可增強(qiáng)在植物宿主中的基因表達(dá)。這些修飾包括例如消除以下序列：一個(gè)或多個(gè)編碼假聚腺苷酸化信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)的序列，一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)序列，以及其他這種得到很好表征的可能對(duì)基因表達(dá)有害的序列?？蓪⑿蛄械腉-C含量調(diào)整到給定的植物宿主的平均水平，這通過參考在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算得到。當(dāng)可能時(shí)，修飾序列以避免一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。因此，本公開的“植物優(yōu)化核苷酸序列”包含一個(gè)或多個(gè)這種序列修飾?！皢?dòng)子”指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。啟動(dòng)子序列由近端上游元件和更遠(yuǎn)端的上游元件組成，后一類元件經(jīng)常稱作增強(qiáng)子。因此，“增強(qiáng)子”是這樣的DNA序列，其可以刺激啟動(dòng)子活性，并且可以是啟動(dòng)子的固有元件或經(jīng)插入以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或組織特異性的異源元件。啟動(dòng)子可以整體源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可以引導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中或在不同的發(fā)育階段或應(yīng)答于不同的環(huán)境條件時(shí)表達(dá)。還認(rèn)識(shí)到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切界限仍未完全確定，因此存在一定變異的各DNA片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性。造成基因在大多數(shù)時(shí)間在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。已經(jīng)證實(shí)，某些啟動(dòng)子能夠以高于其他啟動(dòng)子的速率指導(dǎo)RNA合成。這些被稱為“強(qiáng)啟動(dòng)子”。已經(jīng)證實(shí)，某些其他啟動(dòng)子僅在特定類型的細(xì)胞或組織中以較高水平指導(dǎo)RNA合成，并且如果啟動(dòng)子優(yōu)選地在某些組織中指導(dǎo)RNA合成，但在其他組織中以降低的水平指導(dǎo)RNA合成，則其通常被稱為“組織特異性啟動(dòng)子”或“組織偏好啟動(dòng)子”。由于引入到植物中的一個(gè)或多個(gè)嵌合基因的表達(dá)模式使用啟動(dòng)子來控制，因此人們對(duì)下述新型啟動(dòng)子的分離一直有興趣，該新型啟動(dòng)子能夠在特定組織類型中或在特定植物發(fā)育階段以一定水平控制一個(gè)或多個(gè)嵌合基因的表達(dá)。不斷發(fā)現(xiàn)可用于植物細(xì)胞中的各種類型的新啟動(dòng)子，在以下匯編物中可以找到許多例子：Okamuro和Goldberg，(1989)TheBiochemistryofPlants，第115卷，Stumpf和Conn編輯(NewYork，NY：AcademicPress)，第1-82頁?！胺g前導(dǎo)序列”指位于基因啟動(dòng)子序列和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物加工成mRNA、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的例子已有描述(例如Turner和Foster，(1995)MolBiotechnol3：225-236)?！?′非編碼序列”、“轉(zhuǎn)錄終止子”或“終止序列”指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化識(shí)別序列和其他編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的序列。多腺苷酸化信號(hào)通常以影響添加多腺苷酸串至mRNA前體3′末端為特征。不同的3′非編碼序列的用途由Ingelbrecht等人，(1989)PlantCell1：671-680例舉。“RNA轉(zhuǎn)錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完美互補(bǔ)拷貝時(shí)，它被稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是由初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工衍生的RNA序列時(shí)，它被稱為成熟RNA?！靶攀筊NA”或“mRNA”指沒有內(nèi)含子且可被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA模板互補(bǔ)且用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。cDNA可為單鏈的或通過使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式?！坝辛x”RNA是指包含mRNA并且可被翻譯成細(xì)胞內(nèi)或體外的蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”指與靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，并且能阻斷靶基因的表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(參見例如美國專利5,107,065)。反義RNA的互補(bǔ)性可存在于特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即在5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列?！肮δ躌NA”指反義RNA、核酶RNA或其他可能不被翻譯但仍對(duì)細(xì)胞過程具有作用的RNA。術(shù)語“互補(bǔ)序列”或“反向互補(bǔ)序列”在本文中可互換地用來指涉mRNA轉(zhuǎn)錄物，并且意在定義該信息(message)的反義RNA。術(shù)語“有效連接”指各核酸序列結(jié)合在單一核酸片段上，使得一個(gè)核酸序列的功能被另一個(gè)核酸序列調(diào)節(jié)。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)時(shí)(即，該編碼序列處于該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列有效連接。編碼序列可以以有義或反義方向與調(diào)節(jié)序列有效連接。在另一個(gè)例子中，互補(bǔ)的RNA區(qū)域可以直接或間接地與靶mRNA的上游(5′)有效連接，或與靶mRNA的下游(3′)有效連接，或在靶mRNA內(nèi)部有效連接，或第一互補(bǔ)區(qū)域在靶mRNA的上游(5′)，并且其互補(bǔ)序列在靶mRNA的下游(3′)。本文所用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，在以下文獻(xiàn)中有更完全的描述：Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory：ColdSpringHarbor，NY(1989)。轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并在下文中描述?！癙CR”或“聚合酶鏈反應(yīng)”是一項(xiàng)用于合成特定DNA區(qū)段的技術(shù)，由一系列的重復(fù)的變性、退火和延伸循環(huán)組成。通常，將雙鏈DNA進(jìn)行熱變性，并將兩條與靶區(qū)段的3′邊界互補(bǔ)的引物與該DNA在低溫下退火，然后在中等溫度下延伸。一組這三個(gè)連續(xù)步驟稱為一個(gè)“循環(huán)”。術(shù)語“重組的”指序列的兩個(gè)本來分開的區(qū)段例如通過化學(xué)合成人工組合在一起，或通過遺傳工程技術(shù)對(duì)核酸的分離的區(qū)段進(jìn)行操縱。術(shù)語“質(zhì)?！薄ⅰ拜d體”和“盒”指這樣的染色體外元件，其通常攜帶不是細(xì)胞的中心代謝的一部分的基因，并且通常為雙鏈DNA的形式。這種元件可以是衍生自任何來源的、單鏈或雙鏈DNA或RNA的、線狀或環(huán)狀形式的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中多個(gè)核苷酸序列已連接或重組成能夠?qū)⒏信d趣的多核苷酸引入到細(xì)胞中的獨(dú)特構(gòu)建體。“轉(zhuǎn)化盒”指含有外來基因并且除該外來基因之外還具有能促進(jìn)特定宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。“表達(dá)盒”指含有外來基因并且除該外來基因之外還具有使該基因可以在外來宿主中表達(dá)的元件的特定載體。術(shù)語“重組DNA分子”、“重組構(gòu)建體”、“表達(dá)構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”和“重組DNA構(gòu)建體”在本文中可互換使用。重組構(gòu)建體包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如調(diào)節(jié)序列和編碼序列)的人工組合。例如，構(gòu)建體可以包含源自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源自相同來源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。這種構(gòu)建體可單獨(dú)使用或可與載體結(jié)合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于將被用來轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員熟知為了成功地轉(zhuǎn)化、選擇和擴(kuò)增宿主細(xì)胞而必須在載體上存在的遺傳元件。技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件可導(dǎo)致不同的表達(dá)水平和表達(dá)模式(Jones等人，(1985)EMBOJ4：2411-2418；DeAlmeida等人，(1989)MolGenGenetics218：78-86)，因此通常對(duì)多個(gè)事件進(jìn)行篩選以獲得顯示所需表達(dá)水平和表達(dá)模式的細(xì)胞系。這種篩選可通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)測(cè)定法、生物化學(xué)測(cè)定法和其他測(cè)定法完成，所述測(cè)定法包括DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、PCR、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡分析、酶或活性測(cè)定和/或表型分析。本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指產(chǎn)生前體形式或成熟形式的功能性最終產(chǎn)物(例如mRNA、引導(dǎo)多核苷酸或蛋白質(zhì))。術(shù)語“引入”意指向細(xì)胞提供核酸(例如表達(dá)構(gòu)建體)或蛋白質(zhì)。引入包括指代核酸摻入到真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸可摻入到該細(xì)胞的基因組中，并且包括指代核酸或蛋白質(zhì)短暫提供到細(xì)胞。引入包括指代穩(wěn)定的或短暫的轉(zhuǎn)化方法，以及有性雜交。因此，在將核酸片段(例如，重組DNA構(gòu)建體/表達(dá)構(gòu)建體)插入細(xì)胞中的語境中，“引入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指代將核酸片段摻入到真核或原核細(xì)胞中，其中該核酸片段可摻入到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。“成熟”蛋白質(zhì)指翻譯后加工的多肽(即，已從初級(jí)翻譯產(chǎn)物移除了任何存在的原肽或前肽所得的多肽)。“前體”蛋白質(zhì)指mRNA的翻譯的初級(jí)產(chǎn)物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于胞內(nèi)定位信號(hào)。“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物體的基因組中，包括核基因組和細(xì)胞器基因組在內(nèi)，從而導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。相反，“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物體的細(xì)胞核或其他含DNA的細(xì)胞器中，導(dǎo)致基因表達(dá)，但不存在整合或穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱作“轉(zhuǎn)基因”生物體。遺傳改良種質(zhì)的商業(yè)開發(fā)也已進(jìn)展到將多種性狀引入作物植物的階段，通常稱為基因堆疊方法。在該方法中，可以將賦予不同感興趣的特性的多個(gè)基因引入植物?；蚨询B可通過許多方法實(shí)現(xiàn)，包括但不限于共轉(zhuǎn)化、再轉(zhuǎn)化以及使具有不同感興趣的基因的株系的雜交。術(shù)語“植物”指整株植物、植物器官、植物組織、種子、植物細(xì)胞、及其種子和子代。植物細(xì)胞包括但不限于來自種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子的細(xì)胞。植物部分包括分化的和未分化的組織，包括但不限于根、莖、苗、葉、花粉、種子、瘤組織和各種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(例如，單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。植物組織可以在植物中或在植物器官、組織或培養(yǎng)物中。術(shù)語“植物器官”指構(gòu)成植物的形態(tài)上和功能上不同的部分的植物組織或一組植物組織。術(shù)語“基因組”指生物體每個(gè)細(xì)胞或病毒或細(xì)胞器中存在的全部互補(bǔ)遺傳材料(基因和非編碼序列)；以及/或者作為(單倍體)單位從一個(gè)親本繼承的完整組的染色體?！白哟卑参锏娜魏魏罄m(xù)各代。轉(zhuǎn)基因植物包括例如這樣的植物，該植物在其基因組內(nèi)包含通過轉(zhuǎn)化步驟引入的異源多核苷酸。異源多核苷酸可穩(wěn)定地整合在基因組內(nèi)，使得該多核苷酸得以傳遞到連續(xù)世代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合到基因組中。轉(zhuǎn)基因植物還可在其基因組內(nèi)包含不止一個(gè)異源多核苷酸。每個(gè)異源多核苷酸可賦予轉(zhuǎn)基因植物不同性狀。異源多核苷酸可包括源自外來物種的序列，或者，如果源自相同物種，則可為對(duì)其天然形式進(jìn)行了實(shí)質(zhì)性修飾的序列。“轉(zhuǎn)基因”可包括其基因型已因異源核酸的存在而改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初經(jīng)如此改變的轉(zhuǎn)基因植物以及通過有性雜交或無性繁殖從最初的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的那些。通過常規(guī)植物育種方法，通過本文所述的不導(dǎo)致外來多核苷酸插入的基因組編輯程序，或通過諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變不旨在被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因的。在本公開的一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含重組DNA構(gòu)建體和引導(dǎo)多核苷酸的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。在本公開的另一個(gè)實(shí)施例中，組合物還包含整合到所述植物的基因組靶位點(diǎn)中的感興趣的多核苷酸。在本公開的另一個(gè)實(shí)施例中，組合物還包含在基因組靶位點(diǎn)處的修飾，其中該修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。在本公開的另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含至少一個(gè)改變的靶序列的植物或種子，其中所述至少一個(gè)改變的靶序列源自由引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物識(shí)別和裂解的相應(yīng)靶序列，其中Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。在本公開的另一個(gè)實(shí)施例中，組合物包括包含修飾的核苷酸序列的植物或種子，其中修飾的核苷酸序列通過向細(xì)胞提供引導(dǎo)多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內(nèi)切核酸酶而產(chǎn)生，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。在本公開的某些實(shí)施例中，能育植物是能產(chǎn)生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。這種自身能育植物可在沒有任何其他植物貢獻(xiàn)配子及其中所含的遺傳材料的情況下產(chǎn)生子代植物。本公開的其他實(shí)施例可涉及使用不是自身能育的植物，因?yàn)樵撝参锊划a(chǎn)生活的或能夠授/受精的雄配子或雌配子，或兩者。本文所用的“雄性不育植物”是不產(chǎn)生活的或能夠授精的雄配子的植物。本文所用的“雌性不育植物”是不產(chǎn)生活的或能夠受精的雌配子的植物。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，雄性不育和雌性不育植物可以分別是雌性能育和雄性能育的。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到，雄性能育(但雌性不育)植物當(dāng)與雌性能育植物雜交時(shí)可產(chǎn)生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物當(dāng)與雄性能育植物雜交時(shí)可產(chǎn)生活的子代。“厘摩”(cM)或“圖距單位(mapunit)”是兩個(gè)連接的基因、標(biāo)記、靶位點(diǎn)、基因座或它們的任何配對(duì)之間的距離，其中1％的減數(shù)分裂產(chǎn)物是重組的。因此，一厘摩與等于兩個(gè)連接的基因、標(biāo)記、靶位點(diǎn)、基因座或它們的任何配對(duì)之間的1％平均重組頻率的距離相當(dāng)。使用雙組分引導(dǎo)RNA和Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的育種方法和選擇植物的方法。本公開可用于培育包含一種或多種轉(zhuǎn)基因性狀的植物。最通常地，轉(zhuǎn)基因性狀是作為基于農(nóng)桿菌法、基因槍法或其他常用程序的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的結(jié)果而隨機(jī)插入在植物基因組當(dāng)中。最近，已開發(fā)出了能夠定向插入轉(zhuǎn)基因的基因打靶方案。一種重要的技術(shù)即位點(diǎn)特異性整合(SSI)能使轉(zhuǎn)基因靶向與之前插入的轉(zhuǎn)基因相同的染色體位置。定制的大范圍核酸酶和定制的鋅指大范圍核酸酶使研究者可以設(shè)計(jì)核酸酶以靶向特定的染色體位置，并且這些試劑使得可以將轉(zhuǎn)基因靶向于被這些核酸酶裂解的染色體位點(diǎn)。真核基因組(例如，植物基因組)的精確遺傳工程目前所使用的系統(tǒng)依賴于歸巢內(nèi)切核酸酶、大范圍核酸酶、鋅指核酸酶、以及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)，這需要對(duì)每個(gè)新靶基因座進(jìn)行從頭蛋白質(zhì)工程改造。本文所述的高度特異性引導(dǎo)多核苷酸/Cas9內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)更易于定制，并且因此在以許多不同靶序列的修飾為目標(biāo)時(shí)更有用。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開進(jìn)一步利用引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)的多組分性質(zhì)，其中其恒定蛋白質(zhì)組分為Cas內(nèi)切核酸酶，并且其可變和易于重復(fù)編程的靶向組分為引導(dǎo)多核苷酸。如本文所述，引導(dǎo)多核苷酸可包含DNA、RNA或DNA-RNA組合序列，從而使其完全可定制并且因此在以一個(gè)或許多不同靶序列的修飾為目標(biāo)時(shí)更有用。在其中核酸酶脫靶切割對(duì)于靶細(xì)胞可能有毒的情況下，本文所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)對(duì)于基因組工程(尤其是植物基因組工程)特別有用。在本文所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施例中，將表達(dá)優(yōu)化的Cas9基因形式的恒定組分穩(wěn)定地整合到靶基因組(諸如植物基因組)中。Cas9基因的表達(dá)處于啟動(dòng)子(例如，植物啟動(dòng)子)的控制下，該啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如溫度誘導(dǎo)型、脅迫誘導(dǎo)型、發(fā)育階段誘導(dǎo)型、或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在不存在引導(dǎo)多核苷酸的可變靶向結(jié)構(gòu)域的情況下，Cas蛋白質(zhì)不能夠識(shí)別和切割DNA，并且因此其在植物細(xì)胞中的存在應(yīng)具有很小影響或沒有影響。因此，本文所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是形成和維護(hù)細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因生物體的能力，所述細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因生物體能夠有效地表達(dá)對(duì)于細(xì)胞活力具有很小影響或沒有影響的Cas蛋白質(zhì)。為了誘導(dǎo)在所需基因組位點(diǎn)處的切割實(shí)現(xiàn)靶向遺傳修飾，可通過多種方法將引導(dǎo)多核苷酸引入到包含穩(wěn)定整合和表達(dá)的Cas基因的細(xì)胞中。例如，引導(dǎo)多核苷酸可通過化學(xué)或酶促合成，并且通過直接遞送方法(諸如粒子轟擊或電穿孔)引入到Cas表達(dá)細(xì)胞中。另選地，能夠在靶細(xì)胞中有效地表達(dá)引導(dǎo)多核苷酸的基因可通過化學(xué)合成、酶促合成或在生物系統(tǒng)中合成，并且這些基因可通過直接遞送方法(諸如粒子轟擊、電穿孔)或生物遞送方法(諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA遞送)引入到Cas表達(dá)細(xì)胞中。本公開的一個(gè)實(shí)施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導(dǎo)多核苷酸的第二植物，該引導(dǎo)多核苷酸能夠與(a)的Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物，其中該引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評(píng)價(jià)(c)的子代的靶位點(diǎn)改變；以及e)選擇具有所述靶位點(diǎn)的所需改變的子代植物。本公開的另一個(gè)實(shí)施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物；b)獲得包含引導(dǎo)多核苷酸和供體DNA的第二植物，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸能夠與(a)的Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評(píng)價(jià)(c)的子代的靶位點(diǎn)改變；以及e)選擇包含在所述靶位點(diǎn)處插入的感興趣的多核苷酸的子代植物。本公開的另一個(gè)實(shí)施例是用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)的植物的方法，該方法包括選擇至少一種在其植物基因組中的靶位點(diǎn)處包含改變的子代植物，其中所述子代植物通過使表達(dá)至少一種Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物與包含引導(dǎo)多核苷酸和供體DNA的第二植物雜交而獲得，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。如本文所公開，引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因靶向可在用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因插入和/或用于制備包含多個(gè)轉(zhuǎn)基因的復(fù)合轉(zhuǎn)基因性狀基因座的方法中以類似于WO2013/0198888(2013年8月1日公布)中公開的方式使用，其中使用如本文所公開的引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)代替使用雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑來引入感興趣的基因。在一個(gè)實(shí)施例中，復(fù)合轉(zhuǎn)基因性狀基因座是具有多個(gè)彼此遺傳連鎖的轉(zhuǎn)基因的基因座。通過在彼此0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或甚至5厘摩(cM)的距離內(nèi)插入獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因，轉(zhuǎn)基因可作為單個(gè)遺傳基因座培育(參見例如，美國專利申請(qǐng)13/427,138或PCT申請(qǐng)PCT/US2012/030061)。在選擇包含轉(zhuǎn)基因的植物之后，包含(至少)一個(gè)轉(zhuǎn)基因的植物可雜交以形成包含兩個(gè)轉(zhuǎn)基因的F1。在來自這些F1的子代(F2或BC1)中，1/500的子代會(huì)具有被重組到同一染色體上的兩個(gè)不同轉(zhuǎn)基因。該復(fù)合基因座然后可被培育成為具有兩種轉(zhuǎn)基因性狀的單個(gè)遺傳基因座?？芍貜?fù)這個(gè)過程以按需堆積盡可能多的性狀。蛋白質(zhì)可以各種方式進(jìn)行改變，包括氨基酸替換、缺失、截短和插入。用于這類操作的方法是公知的。例如，可通過在DNA中作出突變來制備蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法包括例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92；Kunkel等人，(1987)MethEnzymol154：367-82；美國專利4,873,192；Walker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany，NewYork)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。有關(guān)不太可能影響蛋白質(zhì)的生物活性的氨基酸替換的指導(dǎo)，見于例如Dayhoff等人，(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(NatlBiomedResFound，Washington，D.C.)的模型。保守替換，如將一個(gè)氨基酸用另一具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換，可以是優(yōu)選的。保守缺失、插入和氨基酸替換預(yù)期不會(huì)造成蛋白質(zhì)特征的根本性變化，并且任何替換、缺失、插入或它們的組合的效應(yīng)可通過常規(guī)篩選測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。測(cè)定雙鏈斷裂誘導(dǎo)活性的測(cè)定法是已知的，一般是測(cè)量該試劑對(duì)含有靶位點(diǎn)的DNA底物的總體活性和特異性。已知有多種方法可用來將核苷酸序列和多肽引入到生物體中，包括例如轉(zhuǎn)化、有性雜交在內(nèi)，以及將多肽、DNA或mRNA引入細(xì)胞中。用于接觸、提供和/或引入組合物到各種生物體中的方法是已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法、病毒介導(dǎo)的方法和有性育種。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化表示所引入的多核苷酸整合到生物體的基因組中并能夠被其子代遺傳。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化表示所引入的組合物僅僅在生物體中暫時(shí)表達(dá)或存在。用于將多核苷酸或多肽引入得到植物中的方案可根據(jù)作為轉(zhuǎn)化目標(biāo)的植物或植物細(xì)胞的類型(如單子葉植物或雙子葉植物)而異。將多核苷酸和多肽引入到植物細(xì)胞中并隨后插入到植物基因組中的合適方法包括顯微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-34，以及美國專利6,300,543)、分生組織轉(zhuǎn)化(美國專利5,736,369)、電穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：5602-6)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利5,563,055和5,981,840)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，(1984)EMBOJ3：2717-22)，以及彈道粒子加速法(美國專利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782；Tomes等人，(1995)“DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment”，PlantCell，Tissue，andOrganCulture：FundamentalMethods，Gamborg和Phillips編輯(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology6：923-6；Weissinger等人，(1988)AnnRevGenet22：421-77；Sanford等人，(1987)ParticulateScienceandTechnology5：27-37(洋蔥)；Christou等人，(1988)PlantPhysiol87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)InVitroCellDevBiol27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)TheorApplGenet96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology8：736-40(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-9(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology6：559-63(玉米)；美國專利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)PlantPhysiol91：440-4(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology8：833-9(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature311：763-4；美國專利5,736,369(谷類)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-9(百合科(Liliaceae))；DeWet等人，(1985)，TheExperimentalManipulationofOvuleTissues，Chapman等人編輯，(Longman，NewYork)，第197-209頁(花粉)；Kaeppler等人，(1990)PlantCellRep9：415-8和Kaeppler等人，(1992)TheorApplGenet84：560-6(觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D′Halluin等人，(1992)PlantCell4：1495-505(電穿孔)；Li等人，(1993)PlantCellRep12：250-5；Christou和Ford(1995)AnnalsBotany75：407-13(稻)以及Osjoda等人，(1996)NatBiotechnol14：745-50(通過根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的玉米)。另選地，可通過使植物與病毒或病毒核酸接觸來將多核苷酸引入到植物中。一般地講，這種方法涉及將多核苷酸摻入在病毒DNA或RNA分子內(nèi)。在一些例子中，可最初將感興趣的多肽作為病毒聚蛋白的一部分合成，后者然后在體內(nèi)或體外通過蛋白水解加工而產(chǎn)生所需的重組蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于將多核苷酸引入到植物中并表達(dá)其中所編碼的蛋白質(zhì)的方法是已知的，參見例如美國專利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接引入多肽如雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑到生物體中、引入多核苷酸如DNA和/或RNA多核苷酸、引入RNA轉(zhuǎn)錄物如編碼雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑的mRNA到生物體中。這類方法包括(例如)顯微注射法或粒子轟擊法。參見例如Crossway等人，(1986)MolGenGenet202：179-85；Nomura等人，(1986)PlantSci44：53-8；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：2176-80；以及Hush等人，(1994)JCellSci107：775-84。術(shù)語“雙子葉植物”是指也稱為“雙子葉植物綱”的被子植物的亞類并且包括提及整株植物、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞及其子代。本文所用的植物細(xì)胞包括但不限于種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、苗、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本公開的上下文中的術(shù)語“雜交的”或“雜交”或“正在雜交”意指配子通過授粉而融合以產(chǎn)生子代(即，細(xì)胞、種子或植物)。該術(shù)語既涵蓋有性雜交(一株植物由另一株植物授粉)，也涵蓋自交(自花授粉，即，當(dāng)花粉和胚珠來自相同植物或遺傳上相同的植物時(shí))。術(shù)語“基因滲入”是指遺傳基因座的所需等位基因從一種遺傳背景傳遞到另一種遺傳背景的現(xiàn)象。例如，所需等位基因在指定基因座處的基因滲入可通過兩個(gè)親本植物之間有性雜交傳遞到至少一個(gè)子代植物，其中親本植物中的至少一個(gè)在其基因組內(nèi)具有所需等位基因。另選地，例如，等位基因的傳遞可通過例如在融合原生質(zhì)體中的兩個(gè)供體基因組之間的重組而發(fā)生，其中供體原生質(zhì)體中的至少一個(gè)在其基因組中具有所需等位基因。所需等位基因可為例如轉(zhuǎn)基因或所選的標(biāo)記或QTL的等位基因。標(biāo)準(zhǔn)的DNA分離、純化、分子克隆、載體構(gòu)建和驗(yàn)證/表征方法是確立的，參見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY)。載體和構(gòu)建體包括包含感興趣的多核苷酸和任選其他組分的環(huán)狀質(zhì)粒和線狀多核苷酸，所述其他組分包括連接子、銜接子、調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子、限制位點(diǎn)、增強(qiáng)子、隔離子、選擇性標(biāo)記、感興趣的核苷酸序列、啟動(dòng)子和/或其他有助于載體構(gòu)建或分析的位點(diǎn)。在一些例子中，識(shí)別位點(diǎn)和/或靶位點(diǎn)可包含在內(nèi)含子、編碼序列、5′UTR、3′UTR和/或調(diào)控區(qū)內(nèi)。本公開還提供了表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體用于在酵母或植物、植物細(xì)胞或植物部分中表達(dá)能夠結(jié)合到靶位點(diǎn)并在靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂的引導(dǎo)多核苷酸/Cas系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施例中，本公開的表達(dá)構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼Cas基因的核苷酸序列的啟動(dòng)子以及可操作地連接至本公開的引導(dǎo)多核苷酸的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)有效連接的核苷酸序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)。啟動(dòng)子是參與RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。植物啟動(dòng)子是能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，有關(guān)植物啟動(dòng)子的綜述參見Potenza等人，(2004)InVitroCellDevBiol40：1-22。組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子以及WO99/43838和美國專利6,072,050中公開的其他組成型啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等人，(1985)Nature313：810-2)；稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等人，(1990)PlantCell2：163-71)；泛素(Christensen等人，(1989)PlantMolBiol12：619-32；Christensen等人，(1992)PlantMolBiol18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)TheorApplGenet81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBOJ3：2723-30)；ALS啟動(dòng)子(美國專利5,659,026)等。其他組成型啟動(dòng)子在例如美國專利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中有所描述。在一些例子中，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。病原體感染后被誘導(dǎo)的病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于那些調(diào)節(jié)PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等的表達(dá)的啟動(dòng)子?？蓪⒒瘜W(xué)調(diào)控啟動(dòng)子用于通過施用外源化學(xué)調(diào)控劑來調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。該啟動(dòng)子可以是化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子，其中化學(xué)劑的施加可誘導(dǎo)基因表達(dá)，或是化學(xué)阻遏啟動(dòng)子，其中化學(xué)劑的施加可阻遏基因表達(dá)。化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括但不限于玉米In2-2啟動(dòng)子，其由苯磺酰胺除草劑安全劑激活(DeVeylder等人，(1997)PlantCellPhysiol38：568-77)；玉米GST啟動(dòng)子(GST-II-27，WO93/01294)，其由用作萌前除草劑的疏水親電子化合物激活；以及煙草PR-1a啟動(dòng)子(Ono等人，(2004)BiosciBiotechnolBiochem68：803-7)，其由水楊酸激活。其他化學(xué)調(diào)控啟動(dòng)子包括類固醇響應(yīng)性啟動(dòng)子(參見例如糖皮質(zhì)類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-5；McNellis等人，(1998)PlantJ14：247-257)；四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動(dòng)子(Gatz等人，(1991)MolGenGenet227：229-37；美國專利5,814,618和5,789,156)。組織偏好的啟動(dòng)子可用來靶向特定植物組織內(nèi)的增強(qiáng)的表達(dá)。組織偏好性啟動(dòng)子包括(例如)下列文獻(xiàn)中提出的那些：Kawamaa等人，(1997)PlantCellPhysiol38：792-803；Hansen等人，(1997)MolGenGenet254：337-43；Russell等人，(1997)TransgenicRes6：157-68；Rinehart等人，(1996)PlantPhysiol112：1331-41；VanCamp等人，(1996)PlantPhysiol112：525-35；Canevascini等人，(1996)PlantPhysiol112：513-524；Lam，(1994)ResultsProblCellDiffer20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)PlantJ4：495-505。葉偏好的啟動(dòng)子包括(例如)下列文獻(xiàn)中提出的那些：Yamamoto等人，(1997)PlantJ12：255-65；Kwon等人，(1994)PlantPhysiol105：357-67；Yamamoto等人，(1994)PlantCellPhysiol35：773-8；Gotor等人，(1993)PlantJ3：509-18；Orozco等人，(1993)PlantMolBiol23：1129-38；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：9586-90；Simpson等人，(1958)EMBOJ4：2723-9；Timko等人，(1988)Nature318：57-8。根偏好的啟動(dòng)子包括(例如)下列文獻(xiàn)中提出的那些：Hire等人，(1992)PlantMolBiol20：207-18(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Miao等人，(1991)PlantCell3：11-22(胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)PlantCell3：1051-61(法國菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件)；Sanger等人，(1990)PlantMolBiol14：433-43(根瘤農(nóng)桿菌甘露氨酸合酶(MAS)的根特異性啟動(dòng)子)；BoguSz等人，(1990)PlantCell2：633-41(從榆科山黃麻(Parasponiaandersonii)和雞屎藤山麻黃(Trematomentosa)分離的根特異性啟動(dòng)子)；Leach和Aoyagi，(1991)PlantSci79：69-76(毛根農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)rolC和rolD根誘導(dǎo)基因)；Teeri等人，(1989)EMBOJ8：343-50(農(nóng)桿菌創(chuàng)傷誘導(dǎo)的TR1′和TR2’基因)；VfENOD-GRP3基因啟動(dòng)子(Kuster等人，(1995)PlantMolBiol29：759-72)；以及rolB啟動(dòng)子(Capana等人，(1994)PlantMolBiol25：681-91)；菜豆素基因(Murai等人，(1983)Science23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3320-4)。還可參見美國專利5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。種子偏好的啟動(dòng)子包括種子發(fā)育過程中活躍的種子特異性啟動(dòng)子和在種子萌發(fā)過程中活躍的種子萌發(fā)啟動(dòng)子。參見Thompson等人，(1989)BioEssays10：108。種子偏好的啟動(dòng)子包括但不限于Cim1(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合酶)；(WO00/11177和美國專利6,225,529)。對(duì)于雙子葉植物，種子偏好的啟動(dòng)子包括但不限于豆類β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對(duì)于單子葉植物，種子偏好啟動(dòng)子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、22kDa玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、27kDaγ玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、waxy基因啟動(dòng)子、shrunken1基因啟動(dòng)子、shrunken2基因啟動(dòng)子、球蛋白1基因啟動(dòng)子，油質(zhì)蛋白基因啟動(dòng)子以及nuc1基因啟動(dòng)子。另參見WO00/12733，其中公開了來自END1和END2基因的種子偏好啟動(dòng)子。表型標(biāo)記是可篩選或可選擇的標(biāo)記，其包括可視標(biāo)記和選擇性標(biāo)記，無論它是陽性還是陰性選擇性標(biāo)記?？墒褂萌魏伪硇蜆?biāo)記。具體地，可選擇的或可篩選的標(biāo)記包含這樣的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段使得可以常常在特定條件下鑒別或選取或不選取含有它的分子或細(xì)胞。這些標(biāo)記可編碼活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或可為RNA、肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)和有機(jī)化合物或組合物等提供結(jié)合位點(diǎn)。選擇性標(biāo)記的例子包括但不限于包含限制性酶位點(diǎn)的DNA區(qū)段；編碼提供對(duì)于有毒化合物的抗性的產(chǎn)物的DNA區(qū)段，所述有毒化合物包括抗生素，諸如壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Basta、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)；編碼另外缺乏受體細(xì)胞的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(例如，tRNA基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記)；編碼可易于鑒定的產(chǎn)物的DNA區(qū)段(例如，表型標(biāo)記，諸如β-半乳糖苷酶、GUS；熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(GFP)，青色熒光蛋白(CFP)，黃色熒光蛋白(YFP)，紅色熒光蛋白(RFP)，以及細(xì)胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位點(diǎn)(例如，之前尚未并置的兩個(gè)DNA序列的并置)的DNA區(qū)段；包含未受限制性內(nèi)切核酸酶或其他DNA修飾酶、化學(xué)品等作用或受其作用的DNA序列的DNA區(qū)段；以及包含特異性修飾(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA區(qū)段，該特異性修飾使得可以鑒別該DNA序列。另外的選擇性標(biāo)記包括能賦予對(duì)除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。參見例如Yarranton，(1992)CurrOpinBiotech3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell71：63-72；Reznikoff,(1992)MolMicrobiol6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell49：603-12；Figge等人，(1988)Cell52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1917-21；Labow等人，(1990)MolCellBiol10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072-6；Wyborski等人，(1991)NucleicAcidsRes19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)TopicsMolStrucBiol10：143-62；Degenkolb等人，(1991)AntimicrobAgentsChemother35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，UniversityofHeidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgentsChemother36：913-9；Hlavka等人，(1985)HandbookofExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature334：721-4?？刹捎贸Ｒ?guī)條件將具有所引入的序列的細(xì)胞生長(zhǎng)或再生成植物，參見例如McCormick等人，(1986)PlantCellRep5：81-4。然后可使這些植物生長(zhǎng)，并用相同轉(zhuǎn)化株或用不同轉(zhuǎn)化株或未轉(zhuǎn)化株進(jìn)行授粉，并鑒定出具有所需特性和/或包含所引入的多核苷酸或多肽的所得子代?？缮L(zhǎng)兩代或更多代以確保多核苷酸得到穩(wěn)定保持和遺傳，并收獲種子?？墒褂萌魏沃参?，包括單子葉植物和雙子葉植物。可使用的單子葉植物的例子包括但不限于玉米(Zeamays)、稻(Oryzasativa)、黑麥(Secalecereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、小麥(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumspp.)、燕麥(Avena)、大麥(Hordeum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、菠蘿(Ananascomosus)、香蕉(Musaspp.)、棕櫚、觀賞植物、草坪草和其他草類?？墒褂玫碾p子葉植物的例子包括但不限于大豆(Glycinemax)、卡諾拉(Brassicanapus和B.campestris)、苜蓿(Medicagosativa)、煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)、棉花(Gossypiumarboreum)和花生(Arachishypogaea)、西紅柿(Solanumlycopersicum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等。感興趣的轉(zhuǎn)基因、重組DNA分子、DNA序列以及感興趣的多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因。這種感興趣的基因可編碼例如為植物提供農(nóng)藝優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)。植物的標(biāo)記輔助選擇和育種開發(fā)作物物種中的分子標(biāo)記的主要?jiǎng)訖C(jī)是有可能通過標(biāo)記輔助選擇(MAS)提高植物育種效率。遺傳標(biāo)記等位基因，或者另選地，數(shù)量性狀基因座(QTL)等位基因用于鑒定如下植物，該植物包含一個(gè)或多個(gè)基因座處的所需基因型，并且預(yù)期將所需基因型連同所需表型傳遞到其子代。遺傳標(biāo)記等位基因(或QTL等位基因)可用于鑒定如下植物，該植物包含一個(gè)基因座或若干非連鎖或連鎖的基因座處的所需基因型(例如，單倍型)，并且預(yù)期將所需基因型連同所需表型傳遞到其子代。應(yīng)當(dāng)理解，出于MAS的目的，術(shù)語標(biāo)記可涵蓋標(biāo)記和QTL基因座兩者。在確定所需表型和多態(tài)性染色體基因座(例如，標(biāo)記基因座或QTL)同時(shí)分離之后，可以使用那些多態(tài)性基因座來選擇對(duì)應(yīng)于所需表型的等位基因一稱為標(biāo)記輔助選擇(MAS)的過程。簡(jiǎn)而言之，在來自待選擇的植物的生物樣品中檢測(cè)對(duì)應(yīng)于標(biāo)記核酸的核酸。該檢測(cè)可采取探針核酸與標(biāo)記雜交的形式，例如使用等位基因特異性雜交、DNA印跡分析、RNA印跡分析、原位雜交、引物的雜交然后是PCR擴(kuò)增標(biāo)記區(qū)域等。用于檢測(cè)標(biāo)記的各種程序是本領(lǐng)域中已知的。在生物樣品中的特定標(biāo)記的存在(或不存在)被驗(yàn)證之后，選擇植物，即，用于通過選擇性育種形成子代植物。植物育種需要結(jié)合感興趣的性狀與高產(chǎn)基因并結(jié)合其他所需性狀以開發(fā)改良的植物品種。篩選大量樣品可能是昂貴、耗時(shí)且不可靠的。使用標(biāo)記和/或遺傳連鎖的核酸是用于在育種程序中選擇具有所需性狀的植物的有效方法。例如，經(jīng)過田地評(píng)價(jià)的標(biāo)記輔助選擇的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，MAS可無論生長(zhǎng)季節(jié)如何而在一年中的任何時(shí)候進(jìn)行。此外，環(huán)境效應(yīng)與標(biāo)記輔助選擇無關(guān)。當(dāng)群體根據(jù)影響一種或多種性狀的多個(gè)基因座而分離時(shí)，MAS的效率與表型篩選相比變得甚至更高，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室中可對(duì)來自單個(gè)DNA樣品的所有基因座一起加工。細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制是引入外源DNA或在內(nèi)源基因中誘導(dǎo)突變的基礎(chǔ)。DNA同源重組是細(xì)胞使用同源序列修復(fù)DNA損傷的專門DNA修復(fù)方式。在植物中，DNA同源重組發(fā)生頻率過低而不能按常規(guī)用于基因靶向或基因編輯，后來發(fā)現(xiàn)該過程可通過DNA雙鏈斷裂刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.CellBiol.21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)Science300：763；Wright等人，(2005)PlantJ.44：693-705)?？s寫含義如下：“sec”指秒，“min”指分鐘，“h”指小時(shí)，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升、“L”指升、“μM”指微摩爾濃度、“mM”指毫摩爾濃度、“M”指摩爾濃度、“mmol”指毫摩爾、“μmole”指微摩爾、“g”指克、“μg”指微克、“ng”指納克、“U”指單位、“bp”指堿基對(duì)，并且“kb”指千堿基。本文所公開的組合物和方法的非限制性例子如下：1.一種引導(dǎo)多核苷酸，所述引導(dǎo)多核苷酸包含：(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域；和(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構(gòu)成，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。2.根據(jù)實(shí)施例1所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域位于單個(gè)分子上。3.根據(jù)實(shí)施例1所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含能夠沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)分子。4.根據(jù)實(shí)施例1-3中任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA序列，并且第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域選自DNA序列、RNA序列、以及它們的組合。5.根據(jù)實(shí)施例1所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA序列。6.根據(jù)實(shí)施例1所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和/或第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。7.根據(jù)實(shí)施例1所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和/或第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含至少一種提供另外的有益特征的修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟i核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。8.根據(jù)實(shí)施例7所述的引導(dǎo)多核苷酸，其中所述另外的有益特征選自改變的或調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性、亞細(xì)胞靶向、跟蹤、熒光標(biāo)記、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)、改變的互補(bǔ)靶序列結(jié)合親和力、改變的細(xì)胞降解抗性、和提高的細(xì)胞滲透性。9.一種包含實(shí)施例1-8中任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)多核苷酸的植物或種子。10.一種引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中引導(dǎo)多核苷酸包括(i)與靶DNA中的核苷酸序列互補(bǔ)的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域；和(ii)與Cas內(nèi)切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。11.根據(jù)實(shí)施例10所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域由脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它們的組合構(gòu)成，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。12.根據(jù)實(shí)施例10所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中所述引導(dǎo)多核苷酸的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和/或第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域包含至少一種提供另外的有益特征的修飾，其中所述至少一種修飾選自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖開關(guān)序列、穩(wěn)定性控制序列、形成dsRNA雙鏈體的序列、使引導(dǎo)多核苷酸靶向到亞細(xì)胞位置的修飾或序列、提供跟蹤的修飾或序列、提供蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的修飾或序列、鎖核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯鍵(鍵合到膽固醇分子、鍵合到聚乙二醇分子、鍵合到間隔區(qū)18分子)、5’至3’共價(jià)鍵、或它們的任何組合。13.根據(jù)實(shí)施例10-12中任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物，其中Cas內(nèi)切核酸酶為Cas9內(nèi)切核酸酶。14.一種包含實(shí)施例10-13中任一項(xiàng)所述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的植物或種子。15.一種用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸引入到具有Cas內(nèi)切核酸酶的細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。16.一種用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物。17.根據(jù)實(shí)施例15-16中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括將供體DNA引入到所述細(xì)胞中，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸。18.根據(jù)實(shí)施例15-17中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括鑒定至少一個(gè)在所述靶標(biāo)處具有修飾的細(xì)胞，其中在所述靶位點(diǎn)處的修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。19.一種用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)將引導(dǎo)多核苷酸、供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸。20.根據(jù)實(shí)施例19所述的方法，其中供體DNA和Cas內(nèi)切核酸酶使用至少一個(gè)能夠表達(dá)供體DNA和/或Cas內(nèi)切核酸酶的重組DNA構(gòu)建體引入到所述細(xì)胞中。21.根據(jù)實(shí)施例15-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中引導(dǎo)多核苷酸通過粒子轟擊直接引入。22.根據(jù)實(shí)施例15-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中引導(dǎo)多核苷酸通過粒子轟擊或包含U6聚合酶III的重組DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化來引入。23.根據(jù)實(shí)施例15-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中引導(dǎo)多核苷酸為包含可變靶向結(jié)構(gòu)域和cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別結(jié)構(gòu)域的單鏈引導(dǎo)多核苷酸。24.根據(jù)實(shí)施例15-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中引導(dǎo)多核苷酸為包含cr核苷酸分子和tracr核苷酸分子的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸。25.一種用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)將cr核苷酸、能夠表達(dá)tracrRNA的第一重組DNA構(gòu)建體、和能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA引入到細(xì)胞中，其中所述cr核苷酸為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的組合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。26.一種用于修飾細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)的方法，該方法包括：a)將tracr核苷酸、能夠表達(dá)crRNA的第一重組DNA構(gòu)建體和能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA引入到細(xì)胞中，其中所述tracr核苷酸被選為脫氧核糖核苷酸序列或脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的組合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；以及b)鑒定至少一個(gè)在所述靶位點(diǎn)處具有修飾的細(xì)胞，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。27.一種用于將感興趣的多核苷酸引入到細(xì)胞基因組的靶位點(diǎn)中的方法，該方法包括：a)將能夠表達(dá)引導(dǎo)多核苷酸的第一重組DNA構(gòu)建體、和能夠表達(dá)Cas內(nèi)切核酸酶的第二重組DNA構(gòu)建體引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸和Cas內(nèi)切核酸酶能夠形成使Cas內(nèi)切核酸酶能夠在所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的復(fù)合物；b)使(a)的細(xì)胞與包含感興趣的多核苷酸的供體DNA接觸；以及c)鑒定至少一個(gè)來自(b)的細(xì)胞，該細(xì)胞在其基因組中包含在所述靶位點(diǎn)處整合的感興趣的多核苷酸。28.一種用于編輯細(xì)胞基因組中的核苷酸序列的方法，該方法包括將引導(dǎo)多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內(nèi)切核酸酶引入到細(xì)胞中，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中Cas內(nèi)切核酸酶在所述細(xì)胞基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。29.根據(jù)實(shí)施例15-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞選自非人類動(dòng)物、細(xì)菌、真菌、昆蟲、酵母和植物細(xì)胞。30.根據(jù)實(shí)施例29所述的方法，其中植物細(xì)胞選自單子葉植物和雙子葉植物細(xì)胞。31.根據(jù)實(shí)施例29所述的方法，其中植物細(xì)胞選自玉米、稻、高粱、黑麥、大麥、小麥、粟、燕麥、甘蔗、草坪草、或柳枝稷、大豆、卡諾拉、苜蓿、向日葵、棉花、煙草、花生、馬鈴薯、煙草、擬南芥、和紅花細(xì)胞。32.一種包含引導(dǎo)多核苷酸和Cas9內(nèi)切核酸酶的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述Cas9內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。33.一種包含重組DNA構(gòu)建體和引導(dǎo)多核苷酸的植物或種子，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述重組DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶的核苷酸序列的啟動(dòng)子，其中所述植物優(yōu)化Cas內(nèi)切核酸酶和引導(dǎo)多核苷酸能夠形成復(fù)合物并且在所述植物的基因組靶位點(diǎn)中產(chǎn)生雙鏈斷裂。34.根據(jù)實(shí)施例32-33中任一項(xiàng)所述的植物，所述植物還包含整合到所述植物的所述基因組靶位點(diǎn)中的感興趣的多核苷酸。35.根據(jù)實(shí)施例32-33中任一項(xiàng)所述的植物或種子，所述植物或種子還包含在所述基因組靶位點(diǎn)處的修飾，其中所述修飾選自(i)至少一個(gè)核苷酸的替換，(ii)至少一個(gè)核苷酸的缺失，(iii)至少一個(gè)核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何組合。36.一種包含至少一個(gè)改變的靶序列的植物或種子，其中所述至少一個(gè)改變的靶序列源自由引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物識(shí)別和裂解的相應(yīng)靶序列，其中Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的所述靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸。37.一種包含修飾的核苷酸序列的植物或種子，其中修飾的核苷酸序列通過向細(xì)胞提供引導(dǎo)多核苷酸、多核苷酸修飾模板和至少一種Cas內(nèi)切核酸酶而產(chǎn)生，其中所述引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂，其中所述多核苷酸修飾模板包含所述核苷酸序列的至少一種核苷酸修飾。38.根據(jù)實(shí)施例29所述的植物或植物細(xì)胞，其中所述至少一種核苷酸修飾不是在所述靶位點(diǎn)處的修飾。39.根據(jù)實(shí)施例32-38中任一項(xiàng)所述的植物，其中所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。40.根據(jù)實(shí)施例39所述的植物，其中所述單子葉植物選自玉米、稻、高粱、黑麥、大麥、小麥、粟、燕麥、甘蔗、草坪草、或柳枝稷。41.根據(jù)實(shí)施例39所述的植物，其中所述雙子葉植物選自大豆、卡諾拉、苜蓿、向日葵、棉花、煙草、花生、馬鈴薯、煙草、擬南芥、或紅花。42.一種用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含至少一種Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物，所述至少一種Cas內(nèi)切核酸酶能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂；b)獲得包含引導(dǎo)多核苷酸的第二植物，該引導(dǎo)多核苷酸能夠與(a)的Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物，其中該引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評(píng)價(jià)(c)的子代的靶位點(diǎn)改變；以及e)選擇具有所述靶位點(diǎn)的所需改變的子代植物。一種用于選擇在其植物基因組中包含改變的靶位點(diǎn)的植物的方法，該方法包括：a)獲得包含能夠在植物基因組中的靶位點(diǎn)處引入雙鏈斷裂的至少一種Cas內(nèi)切核酸酶的第一植物；b)獲得包含引導(dǎo)多核苷酸和供體DNA的第二植物，其中引導(dǎo)多核苷酸不單獨(dú)包含核糖核酸，其中所述引導(dǎo)多核苷酸能夠與(a)的Cas內(nèi)切核酸酶形成復(fù)合物，其中所述供體DNA包含感興趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物與(b)的第二植物雜交；d)評(píng)價(jià)(c)的子代的靶位點(diǎn)改變；以及e)選擇包含在所述靶位點(diǎn)處插入的感興趣的多核苷酸的子代植物。實(shí)例以下實(shí)例進(jìn)一步說明本公開，其中份和百分?jǐn)?shù)是以重量計(jì)，度是指攝氏度，除非另有規(guī)定。應(yīng)理解，這些實(shí)例雖然說明本公開的各實(shí)施例，但僅以舉例說明的方式給出。根據(jù)以上討論和這些實(shí)例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本公開的必要特征，并且在不脫離本公開的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，可對(duì)本公開作出各種變化和修改以使其適合于各種應(yīng)用和條件。此類修改形式也旨在落入所附實(shí)施例的范圍內(nèi)。實(shí)例1用于對(duì)玉米植物基因組修飾的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的玉米優(yōu)化表達(dá)盒在該實(shí)例中，將Cas9內(nèi)切核酸酶和成熟的經(jīng)完全加工的天然CRISPR-RNA(crRNA)以及如以下文獻(xiàn)所述屬于II型適應(yīng)性病毒免疫系統(tǒng)的來自釀膿鏈球菌的反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的表達(dá)盒進(jìn)行玉米優(yōu)化以檢測(cè)其在玉米中作為基因組工程工具的用途：Deltcheva等人(2011)Nature471：602-7和Jinek等人(2012)Science337：816-21。如圖1A所示，在該實(shí)例中完全由RNA核苷酸構(gòu)成的cr核苷酸和tracr核苷酸分子形成由稱為“可變靶向”(VT)結(jié)構(gòu)域的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域和稱為“Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別”(CER)結(jié)構(gòu)域的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的雙鏈體。crRNA和tracrRNA多核苷酸雙鏈體的CER結(jié)構(gòu)域包含沿著互補(bǔ)區(qū)域雜交的兩個(gè)單獨(dú)的分子(位于cr核苷酸和tracr核苷酸上的VT結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列3’)(圖1A)。VT結(jié)構(gòu)域有助于促進(jìn)DNA靶位點(diǎn)識(shí)別，而CER結(jié)構(gòu)域通過Cas9蛋白質(zhì)促進(jìn)識(shí)別。連同所需的原間隔序列相鄰基元(PAM)序列，crRNA/tracrRNA多核苷酸雙鏈體的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域用于引導(dǎo)Cas內(nèi)切核酸酶DNA靶位點(diǎn)裂解并且將在本文中稱為“雙鏈引導(dǎo)多核苷酸”、“雙鏈引導(dǎo)RNA”或“crRNA/tracrRNA雙鏈體”，如2013年8月22日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/868706的實(shí)例1所述。為了測(cè)試玉米中的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)，將來自釀膿鏈球菌M1GAS(SF370)的Cas9基因(SEQIDNO：1)按本領(lǐng)域所知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行玉米密碼子優(yōu)化，并且引入馬鈴薯ST-LS1內(nèi)含子(SEQIDNO：2)以便消除其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中的表達(dá)(圖2A)。為了有利于Cas9蛋白質(zhì)在玉米細(xì)胞中的核定位，將猿猴病毒40(SV40)單分體(MAPKKKRKV，SEQIDNO：3)和根瘤農(nóng)桿菌雙分體VirD2T-DNA邊界內(nèi)切核酸酶(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQIDNO：4)核定位信號(hào)分別摻入到Cas9開放閱讀框的氨基末端和羧基末端處(圖2A)。將玉米優(yōu)化Cas9基因通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可操作地連接至玉米組成型啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子。玉米優(yōu)化的Cas9表達(dá)盒(SEQIDNO：5)的例子示于圖2A中，該表達(dá)盒包含玉米優(yōu)化的Cas9基因、以及ST-LS1內(nèi)含子、SV40氨基末端核定位信號(hào)(NLS)和VirD2羧基末端NLS，該表達(dá)盒由植物泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。為了賦予玉米細(xì)胞高效的crRNA和tracrRNA表達(dá)以使得crRNA/tracrRNA多核苷酸雙鏈體可引導(dǎo)Cas9蛋白質(zhì)裂解體內(nèi)DNA靶位點(diǎn)，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將位于8號(hào)染色體上的玉米U6聚合酶III啟動(dòng)子(SEQIDNO：6)和玉米U6聚合酶III終止子(TTTTTTTT)分離并且將二者分別作為5’端融合體和3’端融合體有效融合到crRNA和tracrRNADNA編碼序列兩者，從而生成如圖2B和圖2C所示的表達(dá)盒。所得玉米優(yōu)化的crRNA和tracrRNA表達(dá)盒的序列可見于SEQIDNO：8(crRNA表達(dá)盒，其中VT結(jié)構(gòu)域靶向LIGCas-3靶位點(diǎn)(表1))和SEQIDNO：9(tracrRNA表達(dá)盒)。如圖3A所示，crRNA分子需要與DNA靶標(biāo)互補(bǔ)的區(qū)域(VT結(jié)構(gòu)域)，其長(zhǎng)度為大約12-30個(gè)核苷酸并且在用于靶位點(diǎn)識(shí)別和裂解的PAM序列的上游(Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science337：816-21，Mali等人(2013)Science339：823-26，以及Cong等人(2013)Science339：819-23)。為了有利于將玉米基因組DNA靶序列快速引入到crRNA表達(dá)構(gòu)建體中，將兩個(gè)IIS型BbsI限制性內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)以反向串聯(lián)取向引入，其中裂解以向外方向取向，如Cong等人(2013)Science339：819-23所述。在裂解時(shí)，IIS型限制性內(nèi)切核酸酶將其靶位點(diǎn)從crRNA表達(dá)質(zhì)粒切除，生成突出端，以便允許將包含所需玉米基因組DNA靶位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸框內(nèi)定向克隆到VT結(jié)構(gòu)域中。在示出的實(shí)例中，僅將開始于G核苷酸的靶序列用于促進(jìn)crRNA的聚合酶III的有利表達(dá)。然后Cas內(nèi)切核酸酶基因以及crRNA和tracrRNA分子兩者的表達(dá)允許示于圖3A中的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)(也稱為crRNA/tracrRNA/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物)的形成(SEQIDNO：10-11)。實(shí)例2雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米中的染色體DNA并且通過不完整非同源末端連接引入突變?yōu)榱藴y(cè)試實(shí)例1中描述的玉米優(yōu)化的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)是否可識(shí)別、裂解以及通過不精確的非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)途徑突變玉米染色體DNA，對(duì)三個(gè)不同的基因組靶序列進(jìn)行裂解(參見表1)并且通過深度測(cè)序來檢測(cè)NHEJ突變的存在。表1.引入到crRNA表達(dá)盒中的玉米基因組靶序列。LIG＝在無葉舌1基因起始密碼子上游的大約600bp處將玉米優(yōu)化的Cas9內(nèi)切核酸酶表達(dá)盒、包含與表1中列出的玉米基因組靶序列的反義鏈互補(bǔ)的特定玉米VT結(jié)構(gòu)域的crRNA表達(dá)盒、以及tracrRNA表達(dá)盒在BBM和WUS2基因的存在下通過粒子介導(dǎo)的遞送(參見實(shí)例7)共同遞送到60-90Hi-II未成熟玉米胚(參見實(shí)例8)。用靶向LIGCas-3基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行裂解的Cas9和長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA表達(dá)盒(如2013年8月22日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)61/868706中所述)轉(zhuǎn)化的Hi-II玉米胚用作陽性對(duì)照，而僅用Cas9表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的胚用作陰性對(duì)照。在7天之后，合并來自每個(gè)處理的20-30個(gè)最均勻轉(zhuǎn)化的胚并且提取總基因組DNA。用高保真PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑(NewEnglandBiolabs，M0531L)對(duì)預(yù)期靶位點(diǎn)周圍的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而添加上擴(kuò)增子特異性條形碼所必需的序列，由此使用“加尾”引物通過兩輪PCR進(jìn)行Illumnia測(cè)序。用于一級(jí)PCR反應(yīng)中的引物示于表2中，用于二級(jí)PCR反應(yīng)中的引物為AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(正向，SEQIDNO：21)和CAAGCAGAAGACGGCATA(反向，SEQIDNO：22)。表2.PCR引物序列所得PCR擴(kuò)增用QiagenPCR純化離心柱進(jìn)行純化，采用基于Hoechst染料的熒光測(cè)定法，以等摩爾比結(jié)合測(cè)量濃度，并且在Illumina的MiSeq個(gè)人測(cè)序儀上用PhiX對(duì)照v3(Illumina，F(xiàn)C-110-3001)的30-40％(v/v)加標(biāo)(用于抵消序列偏差)來進(jìn)行100核苷酸長(zhǎng)度的深度單端(singleread)測(cè)序。只有在以預(yù)期的裂解位點(diǎn)為中心的10核苷酸窗內(nèi)出現(xiàn)的核苷酸插入與缺失(indel)≥1，并且不以類似的水平存在于陰性對(duì)照中的那些讀段(read)才被歸類為NHEJ突變。對(duì)具有相同突變的NHEJ突變讀段計(jì)數(shù)并將其折合成單個(gè)讀段，并且前10個(gè)最普遍的突變經(jīng)目視確認(rèn)為出現(xiàn)在預(yù)期的裂解位點(diǎn)內(nèi)。然后使用經(jīng)目視確認(rèn)的NHEJ突變的總數(shù)，基于包含與條形碼和正向引物的完全匹配的適當(dāng)長(zhǎng)度讀段的總數(shù)來計(jì)算突變讀段的百分比(％)。將靶向三個(gè)LIGCas靶標(biāo)(SEQIDNO：12-14)的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)與靶向相同基因座的單個(gè)長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)相比，通過深度測(cè)序恢復(fù)的NHEJ突變的頻率示于表3中。基于雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)恢復(fù)的前十個(gè)最普遍類型的NHEJ突變示于圖4A(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：24-33，其中SEQIDNO：23為包含LIGCas-1靶位點(diǎn)的參考玉米序列)、圖4B(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：34-43，其中SEQIDNO：23為包含LIGCas-2靶位點(diǎn)的參考玉米序列)和圖4C(對(duì)應(yīng)于SEQIDNO：45-54，其中SEQIDNO：44為包含LIGCas-3靶位點(diǎn)的參考玉米序列)中。綜合上述內(nèi)容的數(shù)據(jù)表明，本文所述的玉米優(yōu)化的雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米染色體DNA并且生成不完整NHEJ突變。表3.與長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)相比在由雙鏈引導(dǎo)RNA/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)在玉米無葉舌1靶基因座處產(chǎn)生的突變讀段的百分比(％)實(shí)例3脫氧核糖核酸(DNA)可用于引導(dǎo)Cas9蛋白質(zhì)裂解玉米染色體DNA并且通過不完整非同源末端連接引入突變?nèi)缰霸谝韵挛墨I(xiàn)中所述：Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science337：816-21，Mali等人(2013)Science339：823-26，以及Cong等人(2013)Science339：819-23，核糖核酸或RNA已成為被描述為引導(dǎo)Cas9內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解特定DNA靶位點(diǎn)的僅有分子。在該實(shí)例中，我們提供了以下證據(jù)：一類新的分子即脫氧核糖核酸(DNA)也可用于引導(dǎo)Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別和裂解染色體DNA靶位點(diǎn)，從而可恢復(fù)不完整NHEJ突變。在該實(shí)例中，我們使用包含稱為“可變靶向”(VT)結(jié)構(gòu)域的第一核苷酸序列結(jié)構(gòu)域以及稱為“Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別”(CER)結(jié)構(gòu)域的第二核苷酸序列結(jié)構(gòu)域的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸，其中可變靶向結(jié)構(gòu)域?yàn)槊撗鹾颂呛怂?DNA)的連續(xù)片段。雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的CER結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)單獨(dú)的分子、一個(gè)DNA分子，該DNA分子連接到cr核苷酸分子的VT結(jié)構(gòu)域(圖1B)并且沿著互補(bǔ)區(qū)域與由核糖核酸(RNA)核苷酸(稱為tracrRNA)的連續(xù)片段組成的第二分子(tracr核苷酸，圖1A)雜交。在該實(shí)例中，雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的cr核苷酸(圖1A)單獨(dú)地由DNA核苷酸組成并且在本文中稱為crDNA。將包含靶向LIGCas-3靶位點(diǎn)的VT結(jié)構(gòu)域的crDNA序列(表1)(SEQIDNo：55)在IntegratedDNATechnologies，Inc.用5’磷酸基團(tuán)合成并且通過PAGE純化，然后用于測(cè)試如圖5所示的雙鏈引導(dǎo)crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物是否可識(shí)別和裂解玉米染色體DNA靶位點(diǎn)，從而恢復(fù)NHEJ突變。為了確定用于合成crDNA分子的最佳遞送濃度，將crDNA以不同濃度(20ng、50ng、100ng、1μg和5μg)連同玉米優(yōu)化的tracrRNA和Cas9表達(dá)盒共同遞送到60-90Hi-II未成熟玉米胚，然后測(cè)定NHEJ突變的存在，如實(shí)例2所述。僅用Cas9和tracrRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的胚用作陰性對(duì)照。如表4所示，用接近50ng的最佳crDNA遞送濃度檢測(cè)NHEJ突變。為了比較雙鏈引導(dǎo)crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物(圖5)與雙鏈引導(dǎo)RNA(crRNA-tracrRNA)/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物(圖3A)的NHEJ突變活性，將包含靶向LIGCas-3靶位點(diǎn)的VT結(jié)構(gòu)域的crRNA(表1)在Bio-Synthesis，Inc.用5’磷酸基團(tuán)合成并且通過PAGE純化(SEQIDNO：10)。然后將50ng的合成crDNA和crRNA二者獨(dú)立地連同玉米優(yōu)化的tracrRNA和Cas9DNA表達(dá)盒共同遞送，并且測(cè)定NHEJ突變，如前所述。進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)以證實(shí)重現(xiàn)性。陰性對(duì)照由用50ng的crDNA、Cas9表達(dá)盒或50ng的crDNA加tracrRNA表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的Hi-II玉米胚組成。如表4和表5所示，與僅使用Cas9的對(duì)照、僅使用crDNA的對(duì)照、僅使用crDNA加tracrRNA的對(duì)照和僅使用tracrRNA加Cas9的對(duì)照中不存在NHEJ突變相比，當(dāng)與tracrRNA和Cas9DNA表達(dá)盒一起遞送crDNA時(shí)，鑒定出由雙鏈引導(dǎo)crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)產(chǎn)生的NHEJ突變。前3個(gè)最豐富的crRNANHEJ突變示于圖6A(SEQIDNO：56、57、58，其中SEQIDNO：44為L(zhǎng)IGCas-3基因座的未修飾參考序列)中，并且前3個(gè)最豐富的crDNANHEJ突變示于圖6B(SEQIDNO：59、60、61，其中SEQIDNO：44為L(zhǎng)IGCas-3基因座的未修飾參考序列)中，比較鑒定出的這些NHEJ突變并且示于圖6(SEQIDNO：44、56-61)中。綜合上述內(nèi)容的數(shù)據(jù)表明，脫氧核糖核酸(DNA)也可用于引導(dǎo)雙鏈引導(dǎo)crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物中的Cas內(nèi)切核酸酶(圖4)裂解玉米染色體DNA，產(chǎn)生不精確的NHEJ突變。表4.在由與tracrRNA和Cas9DNA表達(dá)盒共同遞送的瞬時(shí)遞送的crDNA分子以不同濃度在玉米無葉舌1靶基因座處產(chǎn)生的突變讀段的百分比(％)遞送的crDNA的量遞送的DNA表達(dá)盒讀段的總數(shù)突變讀段的數(shù)目0Cas9，tracrRNA1,046,553020ngCas9，tracrRNA926,915050ngCas9，tracrRNA1,032,08018100ngCas9，tracrRNA860,56581μgCas9，tracrRNA398,99605μgCas9，tracrRNA394,9590表5.在由與tracrRNA和Cas9DNA表達(dá)盒共同遞送的瞬時(shí)遞送的crDNA或crRNA分子在玉米無葉舌1靶基因座處產(chǎn)生的突變讀段的百分比(％)的比較實(shí)例4修飾引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分以提高裂解活性和特異性。在該實(shí)例中，描述了通過修飾引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的引導(dǎo)核酸組分的核苷酸堿基、磷酸二酯鍵鍵合或分子形貌來提高裂解活性和特異性。如圖1A和圖1B所示，引導(dǎo)多核苷酸的核酸組分包含可變靶向(VT)結(jié)構(gòu)域和Cas內(nèi)切核酸酶識(shí)別(CER)結(jié)構(gòu)域。VT結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)通過核苷酸-核苷酸直接堿基配對(duì)與DNA靶位點(diǎn)相互作用，而CER結(jié)構(gòu)域是正確識(shí)別Cas內(nèi)切核酸酶所需的(圖3A和圖3B)。引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域連同所需PAM序列用于將DNA靶位點(diǎn)識(shí)別與Cas內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)裂解相關(guān)聯(lián)(圖3A和圖3B)。鑒于VT結(jié)構(gòu)域與DNA靶位點(diǎn)的直接相互作用，VT結(jié)構(gòu)域內(nèi)的核苷酸堿基修飾可用于改變核苷酸-核苷酸堿基配對(duì)關(guān)系，從而有利于Cas內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)識(shí)別。此類修飾可用于加強(qiáng)與互補(bǔ)DNA靶序列的結(jié)合親和力，從而增強(qiáng)引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)識(shí)別和/或特異性。當(dāng)引入到引導(dǎo)多核苷酸的VT結(jié)構(gòu)域中時(shí)可增強(qiáng)靶位點(diǎn)結(jié)合親和力和/或特異性的核苷酸堿基修飾的非限制性例子列于表6中。這些修飾可單獨(dú)使用或在VT結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)合使用。表6.用于增強(qiáng)與互補(bǔ)DNA靶序列的核苷酸堿基配對(duì)的核苷酸堿基修飾類似于表6中示出的那些的核苷酸修飾也可在單鏈或雙鏈引導(dǎo)多核苷酸的CER結(jié)構(gòu)域中形成(圖1A和圖1B)。這些修飾可用于加強(qiáng)或穩(wěn)定雙鏈cr核苷酸分子(例如，但不限于crRNA、crDNA、或它們的組合)和tracr核苷酸分子(例如，tracrRNA、tracrDNA、或它們的組合)的CER結(jié)構(gòu)域中分子間的相互作用(圖3A)。這些修飾還可幫助重現(xiàn)在由單個(gè)分子構(gòu)成的引導(dǎo)多核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)中正確識(shí)別Cas內(nèi)切核酸酶所需的cr核苷酸和tracr核苷酸(諸如但不限于crRNA/tracrRNA、crDNA/tracrRNA、crRNA/tracrDNA、crDNA/tracrDNA)結(jié)構(gòu)(圖3A和圖3B)。表達(dá)或瞬時(shí)遞送到細(xì)胞的核酸經(jīng)受周轉(zhuǎn)或降解。為了提高體內(nèi)引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的有效壽命或穩(wěn)定性，可引入核苷酸和/或磷酸二酯鍵修飾以減少不希望的降解?？购怂崦负塑账岷土姿岫ユI修飾的例子示于表7中并且可引入到引導(dǎo)多核苷酸的VT和/或CER結(jié)構(gòu)域中的任一者中。可在包含VT或CER結(jié)構(gòu)域的任一個(gè)核酸殘基的5’端和3’端處引入修飾以抑制外切核酸酶裂解活性，可在包含VT或CER結(jié)構(gòu)域的核酸序列中間引入修飾以降低內(nèi)切核酸酶裂解活性，或可在包含VT或CER結(jié)構(gòu)域的整個(gè)核酸序列中引入修飾以提供對(duì)外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的保護(hù)。表7.用于減少不希望的核酸酶降解的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾。為了提供對(duì)細(xì)胞中周轉(zhuǎn)和降解的抗性，引導(dǎo)多核苷酸的核酸組分還可被環(huán)化，其中5’端和3’端共價(jià)連接在一起。環(huán)狀RNA可具有比線性RNA更強(qiáng)的對(duì)核酸酶降解的抗性并且可在相應(yīng)線性轉(zhuǎn)錄之后在細(xì)胞中存留很長(zhǎng)時(shí)間(Jeck等人(2013)RNA19：141-157)。還可引入對(duì)引導(dǎo)多核苷酸核酸組分中任一者的修飾以提高其細(xì)胞滲透性或遞送到細(xì)胞中的能力。此類修飾將包括但不限于鍵合到膽固醇、聚乙二醇和間隔區(qū)18(六乙二醇鏈)。許多上述經(jīng)修飾的引導(dǎo)多核苷酸可被合成并且通過基因槍粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或電穿孔瞬時(shí)遞送。形成能夠結(jié)合和/或裂解染色體DNA靶位點(diǎn)的功能性復(fù)合物所需的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的剩余組分可作為DNA表達(dá)盒、RNA、mRNA(5′加帽和聚腺苷酸化)或蛋白質(zhì)的任意組合共同遞送。還可建立如下細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化體，所述細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定表達(dá)形成功能性引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物所需的全部組分(其中的一種或兩種組分除外)，使得在瞬時(shí)遞送上述經(jīng)修飾的引導(dǎo)核酸時(shí)，可形成功能性引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物。上述經(jīng)修飾的引導(dǎo)多核苷酸還可多路同時(shí)遞送，以靶向用于裂解或產(chǎn)生切口的多個(gè)染色體DNA序列。上述經(jīng)修飾的引導(dǎo)多核苷酸可用于植物、動(dòng)物、酵母和細(xì)菌中或用于接受利用引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)進(jìn)行的基因組修飾的任何生物體中，以及用于將不精確NHEJ突變引入到染色體DNA中，切除由轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源DNA中任一者構(gòu)成的染色體DNA片段，通過用供體DNA修復(fù)模板的同源重組修復(fù)來編輯天然或轉(zhuǎn)基因的基因的密碼子構(gòu)成，通過用供體DNA修復(fù)模板的同源重組修復(fù)來位點(diǎn)特異性插入轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源DNA序列。實(shí)例5檢測(cè)玉米中引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的引導(dǎo)多核苷酸組分的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾的效應(yīng)在該實(shí)例中，將實(shí)例4中所述的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾中的一些引入到cr核苷酸的VT結(jié)構(gòu)域和/或CER結(jié)構(gòu)域中，并且將討論用于評(píng)價(jià)這些修飾對(duì)雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)裂解玉米染色體DNA的能力的影響。如表8中所示，將核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾單獨(dú)地或以組合形式引入到靶向LIGCas-3位點(diǎn)(參見表1)進(jìn)行裂解的雙鏈引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的cr核苷酸(crRNA或crDNA)組分的VT結(jié)構(gòu)域和CER結(jié)構(gòu)域中。雖然在此處檢測(cè)了多個(gè)不同組合形式的核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾，但可預(yù)期還有其他可能的組合。引入形成于VT結(jié)構(gòu)域中的鎖核酸(+)、5-甲基dC(iMe-dC)和2，6-二氨基嘌呤(i6diPr)核苷酸堿基修飾以提高與互補(bǔ)DNA靶序列的結(jié)合親和力，并且就鎖核酸修飾而言還提高對(duì)體內(nèi)核酸酶的抗性。在crRNA或crDNA序列的5’端和3’端處或在整個(gè)crRNA或crDNA序列中引入在VT和CER結(jié)構(gòu)域二者中設(shè)計(jì)的所有其他修飾，以降低體內(nèi)核酸酶的效應(yīng)，并且延長(zhǎng)crRNA或crDNA組分的有效壽命。為了檢測(cè)表8中所述的經(jīng)修飾crRNA或crDNA組分對(duì)其相關(guān)聯(lián)的經(jīng)修飾引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶復(fù)合物識(shí)別和裂解LIGCas-3位點(diǎn)(參見表1)的能力的效應(yīng)，將經(jīng)修飾的crRNA和crDNA分子與tracrRNA和Cas9表達(dá)盒共同遞送到HiII未成熟玉米胚，如實(shí)例3中所述。與tracrRNA和Cas9表達(dá)盒共同遞送的未修飾crRNA或crDNA分子用作比較物。陰性對(duì)照由僅用相應(yīng)經(jīng)修飾的crRNA或crDNA或Cas9表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的未成熟玉米胚組成。如實(shí)例2中所述測(cè)定的不完整NHEJ突變的頻率用于評(píng)價(jià)相對(duì)于進(jìn)行比較的未修飾crRNA或crDNA實(shí)驗(yàn)，每個(gè)crRNA或crDNA修飾對(duì)Cas內(nèi)切核酸酶裂解活性的效應(yīng)。表8.crRNA和crDNA核苷酸堿基和磷酸二酯鍵修飾。1：核苷酸之前的“+”表示鎖核酸堿基修飾，核苷酸之后的“*”表示硫代磷酸酯鍵主鏈修飾，核苷酸之前的“m”表示2’-0-甲基RNA堿基修飾，“iMe-dC”表示5-甲基dC堿基修飾，并且“i6diPr”表示2，6-二氨基嘌呤堿基修飾實(shí)例6用于檢測(cè)酵母中引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)核酸組分的修飾的效應(yīng)的方法在該實(shí)例中，酵母篩選方法被設(shè)計(jì)為鑒定對(duì)引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的導(dǎo)致裂解活性增強(qiáng)的最佳修飾。A.ADE：URA3：DE2酵母篩選菌株為了鑒定對(duì)實(shí)例4中概述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的最佳修飾或其組合，培育出用于仔細(xì)監(jiān)測(cè)引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的裂解活性的釀酒酵母菌株。這通過將酵母菌株BY4247的15號(hào)染色體上的天然ADE2基因替換為由酵母URA3基因破壞的非功能性的部分重復(fù)ADE2基因(ADE：URA3：DE2)而實(shí)現(xiàn)，如圖7所示。然后針對(duì)插入的URA3基因設(shè)計(jì)與適當(dāng)PAM序列相鄰的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶靶位點(diǎn)，使得在裂解時(shí)，包含305bp重疊序列的被破壞的ADE2基因可通過分子內(nèi)同源重組途徑而被修復(fù)，從而去掉URA3基因并獲得功能性ADE2基因，如圖8所示。然后可將包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培養(yǎng)基或缺乏腺嘌呤的培養(yǎng)基用于選擇其中已發(fā)生裂解的細(xì)胞。然后可將選擇之后酵母細(xì)胞的恢復(fù)頻率用于在檢測(cè)對(duì)引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分的不同修飾時(shí)定量引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的裂解效率。還可對(duì)包含由于裂解和修復(fù)ADE：URA3：DE2基因座而產(chǎn)生的功能性ADE2基因的酵母細(xì)胞進(jìn)行有關(guān)裂解活性的目測(cè)表型篩選。在不存在5-FOA或缺乏腺嘌呤的選擇的情況下，功能性ADE2基因產(chǎn)物產(chǎn)生白色表型，而非功能性產(chǎn)物產(chǎn)生紅色表型(Ugolini等人(1996)Curr.Genet.30：485-492)。為了能夠觀察到白色或紅色表型，可將單獨(dú)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化體接種在固體培養(yǎng)基上并且使其生長(zhǎng)成足夠大以供目視檢查的菌落。白色到紅色扇形菌落的量提供了關(guān)于裂解活性的量的指示。由于扇形菌落表型是定性度量，因此可實(shí)施0-4數(shù)值評(píng)分系統(tǒng)。如圖9所示，0分表示未觀察到白色扇形菌落(無靶位點(diǎn)裂解)；4分表示完全白色菌落(識(shí)別位點(diǎn)的完全切割)；1-3分表示中間白色扇形菌落表型(以及中等程度的靶位點(diǎn)裂解)。B.引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的Cas9組分為了穩(wěn)定地表達(dá)用于與實(shí)例4中所述的瞬時(shí)遞送的經(jīng)修飾核酸組分配對(duì)的Cas內(nèi)切核酸酶，可將來自釀膿鏈球菌M1GAS(SF370)的Cas9基因按本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行釀酒酵母密碼子優(yōu)化(SEQIDNO：88)，并且可將SV40(猿猴病毒40)核定位信號(hào)(SRADPKKKRKV，SEQIDNO：7)摻入到羧基末端處以有利于核定位。然后將所得Cas9開放閱讀框有效融合到酵母誘導(dǎo)型GAL1啟動(dòng)子和CYC1終止子。然后將所得Cas9表達(dá)盒置于包含LEU2選擇性標(biāo)記的CEN6自主復(fù)制酵母載體中。為了能夠測(cè)試實(shí)例4中所述的Cas9組分和經(jīng)修飾核酸組分的瞬時(shí)遞送，還可將Cas9基因作為mRNA遞送。為了生成釀酒酵母優(yōu)化的Cas9mRNA，可使用PCR擴(kuò)增釀酒酵母優(yōu)化的Cas9開放閱讀框以及在所需T7啟動(dòng)子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQIDNO：89)上加尾(剛好在翻譯ATG起始位點(diǎn)的5’端)的相關(guān)聯(lián)核定位信號(hào)。然后可將包含T7啟動(dòng)子的所得線性模板用于在進(jìn)行或未進(jìn)行體外多腺苷酸化的情況下轉(zhuǎn)錄未加帽或加帽的Cas9mRNA。Cas9組分還可作為蛋白質(zhì)瞬時(shí)遞送并且與經(jīng)修飾的核酸組分配對(duì)。具有相關(guān)聯(lián)的羧基末端核定位信號(hào)的Cas9蛋白質(zhì)可按照類似于以下文獻(xiàn)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或通過其他方法表達(dá)和純化：Fonfara等人(2013)Nucl.AcidsRes.doi：10.1093/nar/gkt1074。C.引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的核酸組分將瞬時(shí)遞送的經(jīng)修飾crRNA或tracrRNA組分與相應(yīng)穩(wěn)定表達(dá)的未修飾crRNA或tracrRNA配對(duì)可為有利的。為了促進(jìn)酵母中crRNA和tracrRNA的穩(wěn)定表達(dá)，可生成釀酒酵母優(yōu)化的crRNA和tracrRNA表達(dá)盒。酵母RNA聚合酶IIISNR52啟動(dòng)子和SUP4終止子可以有效融合到DNA片段的端部，所述DNA片段編碼通過釀膿鏈球菌Cas9蛋白質(zhì)進(jìn)行的識(shí)別所需的適當(dāng)crRNA和tracrRNA序列。所有crRNA表達(dá)盒將包含VT結(jié)構(gòu)域中的ADE：URA3：DE2靶序列(GCAGACATTACGAATGCACA，SEQIDNO：90)并且靶向ADE：URA3：DE2基因座進(jìn)行裂解。然后將所得表達(dá)盒置于包含HIS3選擇性標(biāo)記的CEN6自主復(fù)制酵母載體中。為了遞送未修飾的crRNA、tracrRNA或引導(dǎo)RNA，可使用PCR擴(kuò)增在所需T7啟動(dòng)子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQIDNO：89)上加尾(剛好在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的5′端)的相應(yīng)crRNA、tracrRNA或引導(dǎo)RNA序列。然后可將包含T7啟動(dòng)子的所得線性模板用于轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的crRNA、tracrRNA或長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA。還將瞬時(shí)遞送如實(shí)例4中概述的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的經(jīng)修飾核酸組分?？蓪㈩愃朴趯?shí)例5表8中示出的那些的核苷酸堿基和/或磷酸二酯鍵修飾單獨(dú)地或以組合形式引入到引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的crRNA、crDNA、tracrRNA、tracrDNA、長(zhǎng)鏈引導(dǎo)RNA或長(zhǎng)鏈引導(dǎo)DNA核酸組分并且按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成。另外在實(shí)例4中討論的包含能夠與Cas內(nèi)切核酸酶形成功能性復(fù)合物的必要VT和CER結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀RNA可在體外生成，如Diegleman等人(1998)Nucl.AcidsRes.26：3235-3241所述，并且瞬時(shí)遞送到酵母細(xì)胞。D.將引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶組分轉(zhuǎn)化到ADE：URA3：DE2酵母菌株中可使用標(biāo)準(zhǔn)乙酸鋰、聚乙二醇(PEG)、電穿孔或基因槍轉(zhuǎn)化方法將引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)的組分遞送到ADE：URA3：DE2酵母細(xì)胞并且監(jiān)測(cè)其裂解ADE：URA3：DE2靶標(biāo)的能力。實(shí)例6的B節(jié)和C節(jié)中討論的酵母優(yōu)化的引導(dǎo)多核苷酸/Cas內(nèi)切核酸酶組分可作為低拷貝自主復(fù)制質(zhì)粒DNA載體上的表達(dá)盒、作為非復(fù)制瞬時(shí)分子(諸如mRNA、蛋白質(zhì)、RNA或經(jīng)修飾的引導(dǎo)核酸)或以質(zhì)粒DNA載體表達(dá)盒和瞬時(shí)分子的任意組合遞送。實(shí)例7玉米不成熟胚的轉(zhuǎn)化可通過各種已知在植物中有效的方法來完成轉(zhuǎn)化，包括粒子介導(dǎo)的遞送、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、PEG介導(dǎo)的遞送和電穿孔。a.粒子介導(dǎo)的遞送如下使用粒子遞送進(jìn)行玉米不成熟胚的轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方見下文。將穗去殼并在30％Clorox漂白劑加0.5％Micro洗滌劑中表面滅菌20分鐘，然后用無菌水漂洗兩次。將不成熟胚分離，并以胚軸一側(cè)朝下(盾片一側(cè)朝上)放置，每板25個(gè)胚，在560Y培養(yǎng)基上放置4小時(shí)，然后在2.5cm靶區(qū)內(nèi)排成一行準(zhǔn)備進(jìn)行轟擊。另選地，將分離的胚放在560L(起始培養(yǎng)基)上，并在暗處在26℃至37℃溫度下放置8-24小時(shí)，然后在560Y上26℃下放置4小時(shí)后如上所述進(jìn)行轟擊。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建包含雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑和供體DNA的質(zhì)粒并且與包含發(fā)育基因ODP2(AP2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ODP2(胚珠發(fā)育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel(US2011/0167516)的質(zhì)粒共轟擊。使用水溶性陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑按如下方式將感興趣的質(zhì)粒和DNA沉淀到0.6μm(平均直徑)金丸上。使用1μg的質(zhì)粒DNA以及任選地使用用于共轟擊的其他構(gòu)建體在冰上制備DNA溶液，所述其他構(gòu)建體諸如50ng(0.5μl)的包含發(fā)育基因ODP2(AP2結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ODP2(胚珠發(fā)育蛋白2)；US20090328252A1)和Wushel的每個(gè)質(zhì)粒。為了得到預(yù)混的DNA，將20μl的制備的金粒子(15mg/ml)和5μl的水溶性陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑添加在水中并且仔細(xì)混合。將金粒子在微量離心機(jī)中以10,000rpm離心1分鐘并且移除上清液。用100ml的100％EtOH在不使小丸重懸的情況下仔細(xì)清洗所得小丸，然后小心移除EtOH洗液。添加105μl的100％EtOH并且通過短暫超聲處理使粒子重懸。然后，將10μl點(diǎn)滴到每個(gè)巨載體的中央上，讓其干燥約2分鐘后進(jìn)行轟擊。另選地，使用氯化鈣(CaCl2)沉淀程序，通過混合100μl在水中制備的鎢粒子、10μl(1μg)DNA/TrisEDTA緩沖液(1μg總DNA)、100μl2.5MCaCl2、10μl0.1M亞精胺，將感興趣的質(zhì)粒和DNA沉淀到1.1μm(平均直徑)鎢丸上。每種試劑依序加到鎢粒子懸浮液，同時(shí)進(jìn)行混合。將最終的混合物進(jìn)行短暫超聲處理，并且讓其在恒定漩渦混合下溫育10分鐘。在沉淀期間，將管短暫離心，移除液體，將粒子用500ml100％乙醇洗滌，然后進(jìn)行30秒離心。再次移除液體，將105μL100％乙醇加至最終的鎢粒子小丸。對(duì)于粒子槍轟擊，將鎢/DNA粒子進(jìn)行短暫超聲處理。將10μl的鎢/DNA粒子點(diǎn)滴到每個(gè)巨載體(macrocarrier)的中央上，然后讓點(diǎn)滴的粒子干燥約2分鐘再進(jìn)行轟擊。用Biorad氦槍以水平#4對(duì)樣品板進(jìn)行轟擊。所有樣品接受450PSI的單次射擊，每管的制備粒子/DNA共取十個(gè)等分試樣。在轟擊后，將胚在560P(維持培養(yǎng)基)上在26℃至37℃的溫度下溫育12-48小時(shí)，然后置于26℃下。在5-7天后，將胚轉(zhuǎn)移到含有3mg/L雙丙氨膦的560R選擇培養(yǎng)基，每隔2個(gè)星期在26℃下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在進(jìn)行大約10個(gè)星期的選擇后，將抗選擇的愈傷組織克隆轉(zhuǎn)移到288J培養(yǎng)基以引發(fā)植物再生。在體細(xì)胞胚成熟后(2-4個(gè)星期)，將發(fā)育良好的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)芽并轉(zhuǎn)移到有光照的培養(yǎng)室。大約7-10天后，將發(fā)育的小植株轉(zhuǎn)移到管中的272V無激素培養(yǎng)基7-10天，直到小植株完全長(zhǎng)好。然后將植物轉(zhuǎn)移到含有盆栽土的淺箱嵌塊(insertsinflats)(相當(dāng)于2.5英寸盆)，在生長(zhǎng)室中生長(zhǎng)1個(gè)星期，隨后在溫室中另外生長(zhǎng)1-2個(gè)星期，然后轉(zhuǎn)移到Classic600盆(1.6加侖)并生長(zhǎng)至成熟。對(duì)植物進(jìn)行監(jiān)測(cè)并進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率的打分和/或進(jìn)行再生能力的修飾的打分。起始培養(yǎng)基(560L)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調(diào)至pH5.8后用去離子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。維持培養(yǎng)基(560P)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l2，4-D和0.69g/lL-脯氨酸(用KOH調(diào)至pH5.8后用去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l2，4-D和2.88g/lL-脯氨酸(用KOH調(diào)至pH5.8后用去離子水定容)；2.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸銀(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SIGMAC-1416)、1.0ml/lEriksson維生素混合物(1000XSIGMA-1511)、0.5mg/l鹽酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l2，4-D(用KOH調(diào)至pH5.8后用去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸銀和3.0mg/l雙丙氨膦(兩者均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到室溫后加入)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素母液(0.100g煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺、0.10g/l鹽酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去離子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脫落酸(在調(diào)至pH5.6后用精制去離子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去離子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l雙丙氨膦(在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻到60℃后加入)。無激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/lMS鹽(GIBCO11117-074)、5.0ml/lMS維生素母液(0.100g/l煙酸、0.02g/l鹽酸硫胺素、0.10g/l鹽酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去離子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在調(diào)至pH5.6后用精制去離子水定容)和6g/l細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(在用精制去離子水定容后加入)，滅菌并冷卻至60℃。b.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化基本上如Djukanovic等人(2006)PlantBiotechJ4：345-57中所述進(jìn)行。簡(jiǎn)單地講，從經(jīng)滅菌的種仁切下10-12日齡的不成熟胚(尺寸0.8-2.5mm)并放入液體培養(yǎng)基(4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson維生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/l鹽酸硫胺、1.5mg/l2，4-D、0.690g/lL-脯氨酸、68.5g/l蔗糖、36.0g/l葡萄糖、pH5.2)中。在收集胚后，用1ml濃度為0.35-0.45OD550的農(nóng)桿菌更換培養(yǎng)基。將玉米胚與農(nóng)桿菌在室溫下溫育5分鐘，然后將該混合物倒到培養(yǎng)基板上，該培養(yǎng)基板含有4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson維生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/l鹽酸硫胺、1.5mg/l2，4-D、0.690g/lL-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.85mg/l硝酸銀、0.1nM乙酰丁香酮和3.0g/lGelrite，pH5.8。將胚以胚軸朝下在暗處20℃下溫育3天，然后在暗處28℃下溫育4天，然后轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基板上，該培養(yǎng)基板含有4.0g/lN6基礎(chǔ)鹽(SigmaC-1416)、1.0ml/LEriksson復(fù)合維生素(SigmaE-1511)、1.0mg/L鹽酸硫胺、1.5mg/L2，4-D、0.69g/LL-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.5g/LMES緩沖液、0.85mg/L硝酸銀、3.0mg/L雙丙氨膦、100mg/L羧芐西林和6.0g/L瓊脂，pH5.8。將胚每隔三個(gè)星期進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直到鑒定到轉(zhuǎn)基因事件。通過將小量的組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(4.3g/LMS鹽(Gibco11117)、5.0ml/LMS維生素母液、100mg/L肌醇、0.1μMABA、1mg/LIAA、0.5mg/L玉米素、60.0g/L蔗糖、1.5mg/L雙丙氨膦、100mg/L羧芐西林、3.0g/LGelrite、pH5.6)并且在暗處在28℃下溫育兩個(gè)星期來誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生。將具有可見苗和根的所有材料轉(zhuǎn)移到含有4.3g/LMS鹽(Gibco11117)、5.0ml/LMS維生素母液、100mg/L肌醇、40.0g/L蔗糖、1.5g/LGelrite，pH為5.6的培養(yǎng)基上，并且在人造光下28℃溫育。一星期之后，將小植株移到含有相同培養(yǎng)基的玻璃管中并且生長(zhǎng)直到將其取樣以及/或者移植到土壤中。實(shí)例8BBM的瞬時(shí)表達(dá)能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化可對(duì)轉(zhuǎn)化方案的參數(shù)進(jìn)行修改以確保BBM活性是瞬時(shí)的。一個(gè)這種方法涉及例如使用化學(xué)品PEL將含BBM的質(zhì)粒進(jìn)行沉淀，使得可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，但又排除隨后DNA釋放。在一個(gè)例子中，將BBM質(zhì)粒用PEI沉淀到金粒子上，同時(shí)將待整合的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT為玉米優(yōu)化的PAT基因)使用標(biāo)準(zhǔn)氯化鈣方法沉淀到金粒子上。簡(jiǎn)單地講，如下用PEI包覆金粒子。首先，洗滌金粒子。稱取35mg平均直徑為1.0的金粒子(A.S.I.#162-0010)到微量離心管中，加入1.2ml無水乙醇并漩渦混合一分鐘。將管在室溫下溫育15分鐘，然后使用微量離心機(jī)在4℃下高速離心15分鐘。棄去上清液，加入新鮮的1.2ml乙醇等分試樣，漩渦混合一分鐘，離心一分鐘，再次棄去上清液(重復(fù)這一操作兩次)。加入新鮮的1.2ml乙醇等分試樣，將此懸浮液(金粒子在乙醇中)在-20℃下保存數(shù)星期。為了用聚乙基亞胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆粒子，將250μl的經(jīng)洗滌的金粒子/乙醇混合物離心，然后棄去乙醇。將粒子在100μl雙蒸水中洗滌一次以除去殘余乙醇，加入250μl的0.25mMPEI，接著進(jìn)行脈沖超聲處理以使粒子懸浮，然后將管投入干冰/乙醇浴中以將懸浮液快速冷凍，然后將懸浮液冷凍干燥過夜。此時(shí)，干燥的涂覆粒子可在-80℃下保存至少3個(gè)星期。在使用前，將粒子用2.5mMHEPES緩沖液(pH7.1)的250μl等分試樣漂洗3次，進(jìn)行1次脈沖超聲處理，然后每次離心前進(jìn)行快速漩渦混合。然后將粒子懸浮于最終體積250μlHEPES緩沖液中。將25μl粒子等分試樣加到新鮮管中，以便隨后連接DNA。為連接未包覆的DNA，將粒子進(jìn)行脈沖超聲處理，然后加入1μg的DNA(在5μl水中)，接著用Pipetteman上下吹吸幾次進(jìn)行混合，然后溫育10分鐘。將粒子短暫離心(即，10秒)，移除上清液，并且添加60μl乙醇。將具有PEI沉淀的DNA-1的粒子在60μl乙醇中洗滌兩次。將粒子離心，棄去上清液，然后將粒子重新懸浮于45μl水中。為連接第二DNA(DNA-2)，利用水溶性陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行沉淀。將45μl的粒子/DNA-1懸浮液稍作超聲處理，然后加入5μl的100ng/μlDNA-2和2.5μl的水溶性陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑。將溶液置于旋轉(zhuǎn)搖蕩器上10分鐘，在10,000g下離心1分鐘。去除上清液，將粒子重新懸浮于60μl的乙醇中。將溶液點(diǎn)滴到巨載體上，使用用于PDS-1000的標(biāo)準(zhǔn)方案將其上依序連接了DNA-1和DNA-2的金粒子遞送到10DAPHi-II不成熟胚的小盾片細(xì)胞中。對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，DNA-1質(zhì)粒含有UBI：：RFP：：pinII表達(dá)盒，DNA-2含有UBI：：CFP：：pinII表達(dá)盒。轟擊后兩天，觀察到CFP和RFP熒光標(biāo)記都有瞬時(shí)表達(dá)，因?yàn)樵谖闯墒炫弑砻嫔嫌性S多紅色和藍(lán)色細(xì)胞。然后將胚放在非選擇性培養(yǎng)基上，讓其生長(zhǎng)3個(gè)星期后對(duì)穩(wěn)定集落進(jìn)行打分。在這個(gè)3星期期間后，觀察到10個(gè)多細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)的藍(lán)色集落，相比之下只有一個(gè)紅色集落。這證明PEI沉淀可用來有效引入DNA進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，同時(shí)大大減少PEI引入的DNA的整合，從而減少表達(dá)RFP的轉(zhuǎn)基因事件的恢復(fù)。這樣，PEI沉淀可用來遞送BBM和/或WUS2的瞬時(shí)表達(dá)。例如，首先使用PEI使粒子包覆上UBI：：BBM：：pinII，接著使用水溶性陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑包覆上UBI：：moPAT～YFP，然后轟擊到不成熟胚的表面上的小盾片細(xì)胞中。PEI介導(dǎo)的沉淀導(dǎo)致在未成熟胚表面上瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞的高頻率以及恢復(fù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的極低頻率。因此，預(yù)期PEI沉淀的BBM盒瞬時(shí)表達(dá)并且刺激組織的轟擊表面(即，小盾片表面)上的胚發(fā)生生長(zhǎng)的突發(fā)，但該質(zhì)粒將不會(huì)整合。從Ca++/金粒子釋放的PAT～GFP質(zhì)粒預(yù)期會(huì)發(fā)生整合并以會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因事件的實(shí)質(zhì)上改進(jìn)的恢復(fù)的頻率表達(dá)選擇性標(biāo)記。作為對(duì)照處理，將含有UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI沉淀的粒子與PAT～GFP/Ca++粒子混合。將來自兩個(gè)處理的不成熟胚移到含有3mg/l雙丙氨膦的培養(yǎng)基上。6-8個(gè)星期后，預(yù)期在PEI/BBM處理中觀察到的GFP+、雙丙氨膦抗性愈傷組織的頻率要比對(duì)照處理(PEI/GUS)高得多。作為一個(gè)可供選擇的方法，用PEI將BBM質(zhì)粒沉淀到金粒子上，然后引入到不成熟胚的表面上的小盾片細(xì)胞中，隨后BBM基因的瞬時(shí)表達(dá)引發(fā)胚發(fā)生生長(zhǎng)的快速增殖。在這個(gè)誘導(dǎo)的生長(zhǎng)期間，使用用于玉米的標(biāo)準(zhǔn)方法(參見實(shí)例1)，用農(nóng)桿菌處理外植體，T-DNA遞送到細(xì)胞中，引入轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在進(jìn)行了共培養(yǎng)后，讓外植體在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基上恢復(fù)，然后移到含有3mg/l雙丙氨膦的培養(yǎng)基上。6-8個(gè)星期后，預(yù)期在PEI/BBM處理中觀察到的GFP+、雙丙氨膦抗性愈傷組織的頻率要比對(duì)照處理(PEI/GUS)高得多。通過瞬時(shí)表達(dá)BBM和/或WUS2多核苷酸產(chǎn)物來“啟動(dòng)”愈傷組織生長(zhǎng)可能是合宜的。這可通過遞送BBM和WUS25′加帽的聚腺苷酸化RNA、含有BBM和WUS2DNA的表達(dá)盒或BBM和/或WUS2蛋白來完成。所有這些分子可用生物射彈粒子槍來遞送。例如，5′加帽的聚腺苷酸化BBM和/或WUS2RNA可容易地使用Ambion公司的mMessagemMachine試劑盒在體外制備。將RNA與含有感興趣的多核苷酸和用于選擇/篩選的標(biāo)記如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII的DNA一起進(jìn)行共遞送。預(yù)期接受了RNA的細(xì)胞將立即開始更快速地分裂，并且這些細(xì)胞中有很大一部分將整合了該農(nóng)藝基因。這些事件可進(jìn)一步被確認(rèn)為轉(zhuǎn)基因克隆集落，因?yàn)樗鼈円矊⒈磉_(dá)PAT～GFP融合蛋白(從而將在適當(dāng)?shù)恼彰飨嘛@示綠色熒光)。然后可對(duì)從這些胚再生的植物篩選感興趣的多核苷酸的存在。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3