本發(fā)明涉及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，特別是一種降低小麥花藥白苗率的培養(yǎng)基及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是目前植物基因工程的常用方法，與基因槍轉(zhuǎn)化等方法比較，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有簡單易行，不需要昂貴的儀器設(shè)備，轉(zhuǎn)基因多以單低拷貝整合進受體染色體，轉(zhuǎn)基因植物后代的遺傳較為穩(wěn)定等特點，該方法在植物轉(zhuǎn)基因研究方面一直受到普遍的重視和應(yīng)用。迄今為止，媒介農(nóng)桿菌法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因植物總數(shù)的85％左右。同時，將一些有利用價值的外源基因?qū)胫参?，并逐漸將轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花、油菜等作物新品種在生產(chǎn)上的產(chǎn)業(yè)化面積逐年增加。

在糧食作物中，小麥屬于遺傳轉(zhuǎn)化最為困難的作物，加上轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，基因工程育種進程明顯落后于其他作物。自1992年Vasil等將GUS/Bar基因?qū)胄←湯@得首例轉(zhuǎn)基因小麥以來，轉(zhuǎn)基因小麥研究有了長足進展，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法一直被認為是小麥遺傳轉(zhuǎn)化的一道難關(guān)，然而Cheng等于1997年首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了正常的轉(zhuǎn)基因小麥，隨后國內(nèi)外其它幾個實驗室例如Xia等、葉興國等、王永勤等、Khanna等、夏光敏等也相繼報告了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化。

目前為止，雖然對農(nóng)桿菌法介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的研究有很多，大多以小麥幼胚、成熟胚為受體材料，以幼胚、成熟胚為受體材料獲得的轉(zhuǎn)基因株是一個外源基因雜合體，須經(jīng)再自交2代選擇才能獲得外源基因純合的個體，育種程序復(fù)雜。而以花藥為受體材料進行遺傳轉(zhuǎn)化，不僅愈傷組織再生特型好，而且再生苗直接加倍后就可成為基因型純合的穩(wěn)定雙倍體。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥花藥遺傳轉(zhuǎn)化具有其獨特的優(yōu)點，但是再生植株的白化現(xiàn)象極為普遍，白苗率一般約為40％，高的達80-90％，甚至全部為白苗，使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥花藥不能獲得足夠數(shù)量的再生植株，遠遠不能滿足依靠該遺傳轉(zhuǎn)化方法改良小麥的實際要求，限制了轉(zhuǎn)基因小麥的規(guī)?；a(chǎn)和小麥功能基因組研究的發(fā)展。因此，優(yōu)化小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，降低白苗率和初步建立的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法，將對小麥轉(zhuǎn)基因研究將有巨大的推動作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于上述領(lǐng)域的空白和需求，本發(fā)明的目的是提供一種降低小麥花藥白苗率的培養(yǎng)基及 小麥遺傳轉(zhuǎn)化方法。技術(shù)方案如下：

一種降低小麥花藥白苗率的培養(yǎng)基，其特征在于配方如下：無水氯化鈣150mg/L、硝酸鉀1400mg/L、七水硫酸鎂150mg/L、硝酸銨300mg/L、磷酸二氫鉀400mg/L；硫酸錳8.5mg/L、硫酸鋅8.6mg/L、硼酸6.2mg/L、碘化鉀0.83mg/L、五水硫酸銅0.025mg/L、六水氯化鈷0.025mg/L；硫酸亞鐵27.85mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.25mg/L；甘氨酸1mg/L、VB1 0.5mg/L、VB6 0.25mg/L、煙酸0.25mg/L、生物素1mg/L、亮氨酸1mg/L、2，4-D 2mg/L、KT 0.5mg/L、水解乳蛋白500mg/L、PAA 0.5-10mg/L、秋水仙堿0.005-0.1mg/L、麥芽糖30-100g/L，瓊脂3.7g/L。

上述培養(yǎng)基中，PAA的濃度優(yōu)選為1mg/L、秋水仙堿的濃度優(yōu)選為0.01mg/L、麥芽糖的濃度優(yōu)選為90g/L。

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥花藥遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括下述步驟：

(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)：獲得小麥花藥愈傷組織，

(2)侵染：采用攜帶目標基因的農(nóng)桿菌侵染步驟(1)獲得的小麥花藥愈傷組織，

其特征在于：所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基。

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為27～30℃，黑暗條件下培養(yǎng)40-60天。

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用的小麥花藥采自發(fā)育至單核中-晚期的小麥幼穗,用10％的次氯酸鈣消毒15min,然后用無菌蒸餾水沖洗。

所述浸染采用的侵染培養(yǎng)液配方為：硝酸鉀190mg/L、硝酸銨165mg/L、磷酸二氫鉀17mg/L、無水氯化鈣44mg/L、七水硫酸鎂37mg/L；碘化鉀0.083mg/L、四水硫酸錳2.23mg/L、硼酸0.62mg/L、七水硫酸鋅0.86mg/L、六水氯化鈷0.0025mg/L、五水硫酸銅0.0025mg/L、二水鉬酸鈉0.025mg/L；硫酸亞鐵2.785mg/L、乙二胺四乙酸鈉3.725mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、煙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；麥芽糖40g/L、乙磺酸(MES)1.95g/L、谷氨酰胺0.1g/L、水解酪蛋白0.1g/L、葡萄糖10g/L、維生素C 100mg/L、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg/L、乙酰丁香酮(AS)39mg/L、pluronic F68 1ml/L。

所述侵染之后，還包括共培養(yǎng)、抗性愈傷組織恢復(fù)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)步驟；抗性愈傷組織恢復(fù)采用的培養(yǎng)基如下：硝酸鉀1900mg/L、硝酸銨1650mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L、無水氯化鈣440mg/L、七水硫酸鎂370mg/L；碘化鉀0.83mg/L、四水硫酸錳22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸鋅8.6mg/L、六水氯化鈷0.025mg/L、五水硫酸銅0.025mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L；硫酸亞鐵27.85mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、煙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；蔗糖30g/L,Phytagel 2.7g/L,Dicamba 2mg/L、羧芐青霉素250mg/L、PPT 3mg/L；

培養(yǎng)條件為：25℃黑暗條件下培養(yǎng)15-20天。

所述分化培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基配方為：硝酸鉀1900/L mg、硝酸銨1650mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L、無水氯化鈣440mg/L、七水硫酸鎂370mg/L；碘化鉀0.83mg/L、四水硫酸錳22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸鋅8.6mg/L、六水氯化鈷0.025mg/L、五水硫酸銅0.025mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L；硫酸亞鐵27.85mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、煙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；維生素C 100mg/L、2，4-D 0.5mg/L、蔗糖30g/L、Phytagel 2.7g/L、羧芐青霉素250mg/L、PPT 3mg/L；

培養(yǎng)條件為：25℃條件下，每天光照12-14小時進行分化培養(yǎng)。

所述生根培養(yǎng)采用的生根培養(yǎng)基配方為：硝酸鉀950/L mg、硝酸銨825mg/L、磷酸二氫鉀85mg/L、無水氯化鈣220mg/L、七水硫酸鎂185mg/L；碘化鉀0.83mg/L、四水硫酸錳22.3mg/L、硼酸6.2mg/L、七水硫酸鋅8.6mg/L、六水氯化鈷0.025mg/L、五水硫酸銅0.025mg/L、二水鉬酸鈉0.25mg/L；硫酸亞鐵27.85mg/L、乙二胺四乙酸鈉37.25mg/L；甘氨酸2mg/L、VB1 0.4mg/L、VB6 0.5mg/L、煙酸0.5mg/L、肌醇100mg/L；萘乙酸(NAA)1mg/L、多效唑3mg/L、蔗糖80g/L、Phytagel 2.7g/L、羧芐青霉素250mg/L；

培養(yǎng)條件為：愈傷組織分化出的抗性再生芽長至2-3cm左右時,將其轉(zhuǎn)入所述生根培養(yǎng)基上進行壯根培養(yǎng)，當(dāng)不定根長到3-4cm時，將試管苗轉(zhuǎn)移至2-4℃冰箱中進行春化處理。

本發(fā)明通過對用于小麥花藥的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行改進，從而使得愈傷組織誘導(dǎo)率和抗性植株的獲得率得到提高，白苗率降低。試驗數(shù)據(jù)表明，在其它培養(yǎng)條件完全一樣的情況下，采用本發(fā)明的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，小麥石4185的愈傷組織誘導(dǎo)率為83.4％，小麥冀5265的愈傷組織誘導(dǎo)率為78.2％；小麥石4185抗性植株的平均獲得率為39.0％，小麥冀5265抗性植株的平均獲得率為36.3％；小麥石4185的白苗率為25.4％，小麥冀5265的白苗率為23.5％。而采用現(xiàn)有技術(shù)中采用的C17為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的，小麥冀5265的愈傷組織誘導(dǎo)率為49.7％，抗性植株獲得率為20.3％，白苗率為46.5％。實驗數(shù)據(jù)說明，本發(fā)明中，改良的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基在提高愈傷組織誘導(dǎo)率和抗性植株的獲得率及降低白苗率方面起著決定性作用，因此，本發(fā)明請求保護改良的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

基于上述改良的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，本發(fā)明進一步請求保護農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥花藥遺傳轉(zhuǎn)化方法。該方法除采用的培養(yǎng)基為上述改良愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之外，其它步驟和產(chǎn)生可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員采用的現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥花藥遺傳轉(zhuǎn)化方法的步驟和參數(shù)。本發(fā)明實施例中所列的這些步驟和參數(shù)只是一種優(yōu)選實施方式，對本發(fā)明的不具有限定作用。

本發(fā)明中，愈傷組織誘導(dǎo)率是指愈傷組織數(shù)占接種花藥數(shù)的百分率，抗性植株的平均獲得率是指抗性苗占愈傷組織數(shù)的百分率，白苗率是指白苗占愈傷組織數(shù)的百分率。

附圖說明

圖1為采用現(xiàn)有文獻中的小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對小麥冀5265的花藥進行誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果。

圖2為采用本發(fā)明的小麥花藥愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基對小麥冀5265的花藥進行誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果。

圖3為本發(fā)明培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化方法對小麥冀5265的花藥愈傷組織進行農(nóng)桿菌侵染后的誘導(dǎo)抗性愈傷組織的培養(yǎng)效果。

圖4為本發(fā)明培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥冀5265后的抗性愈傷組織的分化情況。

圖5為本發(fā)明培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化小麥冀5265后生根培養(yǎng)情況。

具體實施方式

下述實施例中所涉及的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。

實施例1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥花藥

一、培養(yǎng)基的配制和滅菌

1.MC17培養(yǎng)基，配方為每1000ml含：無水氯化鈣150mg、硝酸鉀1400mg、七水硫酸鎂150mg、硝酸銨300mg、磷酸二氫鉀400mg；硫酸錳8.5mg、硫酸鋅8.6mg、硼酸6.2mg、碘化鉀0.83mg、五水硫酸銅0.025mg、六水氯化鈷0.025mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、煙酸0.25mg、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、KT 0.5mg、PAA 1mg、秋水仙堿0.01mg、水解乳蛋白500mg、麥芽糖90g，瓊脂3.7g。

配制方法如下：無水氯化鈣150mg、硝酸鉀1400mg、七水硫酸鎂150mg、硝酸銨300mg、磷酸二氫鉀400mg；硫酸錳8.5mg、硫酸鋅8.6mg、硼酸6.2mg、碘化鉀0.83mg、五水硫酸銅0.025mg、六水氯化鈷0.025mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸1mg、VB1 0.5mg、VB6 0.25mg、煙酸0.25mg、、生物素1mg、亮氨酸1mg、2，4-D 2mg、KT 0.5mg、水解乳蛋白500mg、麥芽糖90g，定容1000ml，調(diào)節(jié)PH至5.8，再加入瓊脂3.7g，以上成分采用121℃高壓滅菌20分鐘，待滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至65℃左右時加入過濾滅菌后的PAA 1mg、秋水仙堿0.01mg。

MC17培養(yǎng)基的特點是添加了PAA和秋水仙堿，用麥芽糖取代了蔗糖。

2.侵染培養(yǎng)基，配方為每1000ml含：硝酸鉀190mg、硝酸銨165mg、磷酸二氫鉀17mg、無水氯化鈣44mg、七水硫酸鎂37mg；碘化鉀0.083mg、四水硫酸錳2.23mg、硼酸0.62mg、七水硫酸鋅0.86mg、六水氯化鈷0.0025mg、五水硫酸銅0.0025mg、二水鉬酸鈉0.025mg；硫酸亞鐵2.785mg、乙二胺四乙酸鈉3.725mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg；麥芽糖40g、乙磺酸(MES)1.95g、谷氨酰胺0.1g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、維生素C 100mg、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg、乙酰丁香酮(AS)39mg、pluronic F68 1ml。

配制方法如下：硝酸鉀190mg、硝酸銨165mg、磷酸二氫鉀17mg、無水氯化鈣44mg、七水硫酸鎂37mg；碘化鉀0.083mg、四水硫酸錳2.23mg、硼酸0.62mg、七水硫酸鋅0.86mg、六水氯化鈷0.0025mg、五水硫酸銅0.0025mg、二水鉬酸鈉0.025mg；硫酸亞鐵2.785mg、乙二胺四乙酸鈉3.725mg；麥芽糖40g、乙磺酸(MES)1.95g，定容950ml,調(diào)節(jié)PH至5.4，以上成分采用121℃高壓滅菌20分鐘；均勻混合下面的幾種成分：100×MS維生素 10ml(含VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg)、谷氨酰胺0.1g、水解酪蛋白0.1g、葡萄糖10g、維生素C 100mg、4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸(Picloram)1mg、乙酰丁香酮(AS)39mg、pluronic F68 1ml，定容50ml，過濾滅菌后加入上述高壓滅菌后的培養(yǎng)基中。

3.抗性愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)基，配方為每1000ml含：硝酸鉀1900mg、硝酸銨1650mg、磷酸二氫鉀170mg、無水氯化鈣440mg、七水硫酸鎂370mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg；蔗糖30g,Phytagel 2.7g,Dicamba 2mg、羧芐青霉素250mg、PPT 3mg。

配制方法如下：硝酸鉀1900mg、硝酸銨1650mg、磷酸二氫鉀170mg、無水氯化鈣440mg、七水硫酸鎂370mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg、蔗糖30g,定容1000ml,調(diào)節(jié)PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高壓滅菌20分鐘，待滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至65℃左右時加入過濾滅菌后的Dicamba 2mg、羧芐青霉素250mg、PPT 3mg。

4.愈傷組織分化培養(yǎng)基，配方為每1000ml含：硝酸鉀1900mg、硝酸銨1650mg、磷酸二氫鉀170mg、無水氯化鈣440mg、七水硫酸鎂370mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、 硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg；維生素C 100mg、2，4-D 0.5mg、蔗糖30g、Phytagel 2.7g、羧芐青霉素250mg、PPT 3mg。

配制方法如下：硝酸鉀1900mg、硝酸銨1650mg、磷酸二氫鉀170mg、無水氯化鈣440mg、七水硫酸鎂370mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg、維生素C 100mg、2，4-D 0.5mg、蔗糖30g,定容1000ml,調(diào)節(jié)PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高壓滅菌20分鐘，待滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至65℃左右時加入過濾滅菌后的羧芐青霉素250mg、PPT 3mg。

5.生根培養(yǎng)基，配方為每1000ml含：硝酸鉀950mg、硝酸銨825mg、磷酸二氫鉀85mg、無水氯化鈣220mg、七水硫酸鎂185mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg；萘乙酸(NAA)1mg、多效唑3mg、蔗糖80g、Phytagel 2.7g、羧芐青霉素250mg。

配制方法如下：硝酸鉀950mg、硝酸銨825mg、磷酸二氫鉀85mg、無水氯化鈣220mg、七水硫酸鎂185mg；碘化鉀0.83mg、四水硫酸錳22.3mg、硼酸6.2mg、七水硫酸鋅8.6mg、六水氯化鈷0.025mg、五水硫酸銅0.025mg、二水鉬酸鈉0.25mg；硫酸亞鐵27.85mg、乙二胺四乙酸鈉37.25mg；甘氨酸2mg、VB1 0.4mg、VB6 0.5mg、煙酸0.5mg、肌醇100mg；、萘乙酸(NAA)1mg、多效唑3mg、蔗糖80g，定容1000ml,調(diào)節(jié)PH至5.8，再加入Phytagel 2.7g,以上成分采用121℃高壓滅菌20分鐘，待滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至65℃左右時加入過濾滅菌后的羧芐青霉素250mg。

二、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥花藥

1、誘導(dǎo)培養(yǎng)

4月下旬小麥抽穗以前取材鏡檢。選取小麥花粉細胞發(fā)育至單核中—晚期的小麥幼穗,用10％的次氯酸鈣消毒15min,然后用無菌蒸餾水沖洗3次,每次3min。在超凈臺上接種花藥于MC17培養(yǎng)基上，28℃條件下暗培養(yǎng)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織。

小麥冀5265的花藥進行誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果如圖2所示。小麥石4185的愈傷組織誘導(dǎo)率為 83.4％(愈傷組織誘導(dǎo)率是指愈傷組織數(shù)占接種花藥數(shù)的百分率)，小麥冀5265的愈傷組織誘導(dǎo)率為78.2％。

2、侵染

將目的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EP培養(yǎng)液中，28℃黑暗條件下250rpm震蕩培養(yǎng)至OD值在0.6-1.0之間。然后將OD值在0.6-1.0之間的農(nóng)桿菌于室溫條件下4500rpm離心10min，收集沉淀重懸于侵染培養(yǎng)液中。將小麥花藥的愈傷組織放入到重懸菌液中浸泡30min.期間輕輕晃動。

3、共培養(yǎng)

取出目的農(nóng)桿菌侵染后的花藥愈傷組織，置于無菌濾紙(少許侵染液)上，25℃黑暗條件下共培養(yǎng)2天。

4、誘導(dǎo)抗性愈傷組織

將共培養(yǎng)后的小麥花藥愈傷組織置于抗性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下培養(yǎng)15-20天誘導(dǎo)抗性愈傷組織。

小麥冀5265的花藥愈傷組織進行農(nóng)桿菌侵染后的誘導(dǎo)抗性愈傷組織的培養(yǎng)效果如圖3所示。

5、愈傷組織分化

將小麥花藥的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，25℃條件下，每天光照12-14小時進行分化培養(yǎng)。小麥冀5265后的抗性愈傷組織的分化情況如圖4所示。

6、生根培養(yǎng)

從小麥花藥抗性愈傷組織分化出的抗性再生芽長至2-3cm左右時,將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上,進行壯根培養(yǎng)，當(dāng)不定根長到3-4cm時，將試管苗轉(zhuǎn)移至2-4℃冰箱中進行春化處理。小麥冀5265后生根培養(yǎng)情況如圖5所示。

7、染色體加倍

將春化好的植株取出，徹底清除根部培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至土壤中培養(yǎng)，將小麥花粉植株移栽成活生長到分孽盛期時，在顯微鏡下通過保衛(wèi)細胞長度來鑒別小麥花粉植株倍性，保衛(wèi)細胞在65u以上的認為是雙倍體無需加倍，65u以下的植株用0.75-1％的秋水仙堿與1.5％二甲基亞砜混合液在25℃條件下浸泡分蘗節(jié)4-5小時，花粉植株經(jīng)染色體加倍后得到加倍純合個體。

8、分子檢測

用常規(guī)的分子檢測技術(shù)對加倍純合個體進行分子檢測，篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因純合株。

試驗結(jié)果：小麥石4185抗性植株的平均獲得率為39.0％，小麥冀5265抗性植株的平均 獲得率為36.3％；小麥石4185的白苗率為25.4％，小麥冀5265的白苗率為23.5％。

實施例2

本實施例與實施例1的步驟相同，區(qū)別在于本實施例的步驟1)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織的黑暗培養(yǎng)溫度為30℃。

小麥冀5265的愈傷組織誘導(dǎo)率為87.4％，抗性植株獲得率為25.1％，白苗率為35.2％。

實施例3

本實施例與實施例1的步驟相同，區(qū)別在于本實施例的步驟1)誘導(dǎo)小麥花藥愈傷組織的培養(yǎng)基為已發(fā)文獻中的常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基C17(王培，陳玉蓉，提高冬小麥花粉植株誘導(dǎo)率的研究，華北農(nóng)學(xué)報，1986，1(1)：20-25)。小麥冀5265的愈傷組織誘導(dǎo)率為49.7％，抗性植株獲得率為20.3％，白苗率為46.5％。

本發(fā)明采用PAA取0.5-2mg/L、秋水仙堿0.005-0.05mg/L、麥芽糖30-100g/L的MC17作為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行了類似實施例1，2，3的試驗，得出基本相同的結(jié)果，即本發(fā)明請求保護范圍內(nèi)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相對于常規(guī)誘導(dǎo)培養(yǎng)基C17，具有提高愈傷組織誘導(dǎo)率，抗性植株獲得率，以及降低白苗率的效果。