本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，尤其是農業(yè)生物技術研究中的轉基因農作物育種領域，特別是涉及具有耐旱功能的棉花轉化事件。
背景技術：
：全球人口在迅速增長，據估計到2025年全球人口將由2014年的70億增加到85億，全球糧食安全面臨巨大挑戰(zhàn)。進入21世紀后，全球干旱缺水態(tài)勢加劇，引起國際社會關注。隨著生產的發(fā)展，人類生活需求的增加、耕地復種指數的提高、農作物品種的調整和產量的提高，使農業(yè)用水量大幅度增加，水資源供需矛盾日趨緊張，干旱問題更趨嚴重。2020年我國糧食總產量需達到6.0億萬噸，可供農業(yè)用水總量不會增加，按目前全國平均作物水分利用效率0.8kg/m3計算，農業(yè)缺水將達1200億m3。農業(yè)是我國節(jié)水潛力最大的行業(yè)，據專家預測，一旦實現生物節(jié)水技術的突破，在我國僅種植玉米、小麥、水稻和秋雜糧就可節(jié)水421億m3。因此，發(fā)掘并利用作物抗旱節(jié)水優(yōu)異基因資源，培育抗旱節(jié)水作物新品種提高作物的抗旱性和水分利用效率，是解決當前日益嚴重的干旱問題的主要手段之一，對于緩解水資源危機、保障國家的糧食安全、生態(tài)安全和社會可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前我國人均水資源占有量約2500立方米，約為世界人均的1/4，是世界上人均水資源貧乏的幾個國家之一。干旱是我國最常見、對農業(yè)生產影響最大的氣候災害。進入21世紀后，全球干旱缺水態(tài)勢加劇，我國干旱從發(fā)生頻率和危害范圍兩個方面呈明顯增大趨勢，對我國農業(yè)生產和糧食安全帶來了更為嚴峻的威脅。因此，發(fā)掘并利用作物抗旱節(jié)水優(yōu)異基因資源，培育抗旱節(jié)水作物新品種，提高作物的抗旱性和水分利用效率，是解決當前日益嚴重干旱問題的主要手段之一，對于緩解水資源危機、保障國家糧食安全、生態(tài)安全和社會可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。技術實現要素：本發(fā)明人通過轉基因方法獲得了一種轉化事件，發(fā)明人將其命名為R9-1。該轉化事件具有穩(wěn)定的耐旱性狀。其代表性陸地棉(Gossypiumhirsutum)種子已于2015年08月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所郵政編碼：100101)，保藏編號為：CGMCCNo.11093。本發(fā)明第一方面提供了一種棉花轉化事件R9-1，其特征在于其是位于A1染色體上的一段序列如SEQIDNo：16所示，其由第505-5208bp的T-DNA插入序列、第1-504bp的上游側翼棉花基因組序列和第5209-6046bp的下游側翼棉花基因組序列構成。本發(fā)明第二方面提供了一個DNA序列，所述DNA序列包含發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列(即SEQIDNo：16第505-5208bp)和所述側翼棉花基因組序列(即SEQIDNo：16第1-504bp的上游側翼棉花基因組序列和第5209-6046bp的下游側翼棉花基因組序列)。本發(fā)明第三方面提供一種重組載體，所述重組載體含有本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列(即SEQIDNo：16第505-5208bp)。在一個實施方案中，所述載體為圖2中的pBI121-GhDh1載體。本發(fā)明第四方面提供了一種重組細胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的重組載體。在一個實施方案中，所述重組細胞為含有本發(fā)明第三方面所述的重組載體的重組農桿菌細胞。本發(fā)明第五方面提供了用于檢測本發(fā)明第一方面所述的棉花轉化事件的引物對，其由特異性識別本發(fā)明第一方面所述的任一側的側翼序列的第一引物和特異性識別本發(fā)明第一方面所述的T-DNA插入序列的第二引物組成。在一些實施方案中，所述第一引物的序列為SEQIDNO：17，所述第二引物的序列為SEQIDNO：18。在另一些實施方案中，所述第一引物的序列為SEQIDNO：19，所述第二引物的序列為SEQIDNO：20。本發(fā)明第六方面提供了一種鑒定棉花生物樣品中轉化事件R9-1的方法，其包括：(a)從待鑒定的棉花生物樣品提取DNA樣品；(b)以提取的DNA樣品為模板，使用本發(fā)明第五方面所述的引物對進行PCR擴增；(c)檢測PCR擴增產物，如果擴增產物長度與SEQIDNO：16上所述PCR引物對的序列之間的理論長度一致，則表明所述棉花生物樣品中R9-1轉化事件的存在。本發(fā)明第七方面提供了本發(fā)明第一方面所述棉花轉化事件向不同棉花育種材料中轉移的方法，所述方法包括：將含有本發(fā)明第一方面所述的轉化事件的棉花材料與其他棉花育種材料進行雜交后，進一步進行回交，獲得含有本發(fā)明第一方面所述的轉化事件的新材料；在雜交及回交過程中，利用本發(fā)明第六方面所述的方法在后代群體中進行篩選鑒定，確認本發(fā)明第一方面所述的轉化事件的存在。本發(fā)明第八方面提供了本發(fā)明第一方面所述的轉化事件、本發(fā)明第二方面所述的DNA分子、本發(fā)明第三方面所述的重組載體或本發(fā)明第四方面所述的重組細胞、本發(fā)明第六和第七方面所述的方法用于提高棉花耐旱性狀、進行植物育種以及用作分子標記的用途。附圖說明圖1示出了植物表達載體pBI121-GhDh1的構建流程。圖2示出了植物表達載體pBI121-GhDh1。圖3GhDh1轉基因棉花T1代株系葉片鮮重失水速率對比。圖4GhDh1轉基因棉花苗期對干旱脅迫的反應。A，耐旱表現明顯的單株葉片夾角大于45度；B，耐旱表現較差植株葉片夾角小于15度。圖5R9-1轉化事件Southern雜交分析-nptII探針。其中：1：pBI121-GhDh1-EcoRI消化；2：野生型棉花J14-EcoRI消化；3：野生型棉花J14-HindIII消化；4：R9-1-3轉基因棉花-EcoRI消化；5：R9-1-3轉基因棉花-HindIII消化；6：R9-1--2轉基因棉花-EcoRI消化；7：R9-1-2轉基因棉花-HindIII消化；8：MarkerλDNA/HindIII+EcoRI。圖6是R9-1轉化事件插入位點處的核苷酸片段缺失分析，示出了以受體材料冀棉14DNA為模板，使用序列分別為SEQIDNo：14和SEQIDNo：15的引物對，擴增得到大小為780bp左右的擴增產物，測序后與R9-1的旁側序列比對的結果。圖7示出了利用引物對R9-1-RB5’(SEQIDNO：17)/R9-1-RB3’(SEQIDNO：18)、R9-1LB5’(SEQIDNO：19)/R9-1LB3’(SEQIDNO：20)分別擴增R9-1T1(1-9)、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花樣品的結果。在圖中：M：marker/DL2000；1-9：R9-1-RB5’/R9-1-RB3’擴增R9-1T1(1-9)；10：冀棉14-1；11：冀棉14-2；12：陰性對照，陽性擴增條帶879bp；13-24：R9-1-RB5’/R9-1-RB3’擴增R9-1T1(13-9)；22：冀棉14-1；23：冀棉14-2；24：陰性對照，陽性擴增條帶1025bp。更具體如下：M：Marker/DL2000；1：R9-1-1；2：R9-1-2；3：R9-1-3；4：R9-1-4；5：R9-1-5；6：R9-1-6；7：R9-1-7；8：R9-1-8；9：R9-1-9；10：J14；11：J14；12：ddH2O；13：R9-1-1；14：R9-1-2；15：R9-1-3；16：R9-1-4；17：R9-1-5；18：R9-1-6；19：R9-1-7；20：R9-1-8；21：R9-1-9；22：J14；23：J14；24：ddH2O。具體實施方式在本發(fā)明中，“轉化事件”是指將外源序列通過農桿菌介導遺傳轉化方法(本領域技術人員公知)轉化到棉花細胞中，并進一步獲得的轉基因棉花植株中外源序列在棉花基因組中的目標位置插入并整合的事件；“轉化事件”并不是一種植物細胞或植株，植物細胞或植株僅僅是轉化事件存在的載體；“轉化事件”的核心特征是外源序列在植物基因組中目標位置的插入所形成的外源插入序列和棉花基因組序列連接的一段特征DNA序列。實施例下面結合非限制性實施例對本發(fā)明進行進一步說明。實施例1.植物表達載體構建利用基礎植物表達載體pBI121(購自北京華夏遠洋科技有限公司)，構建了GhDh1基因植物表達載體，利用35S啟動子驅動目的基因在植物細胞中超量表達脫水素蛋白。具體構建過程為：以GhDh1基因為模板(序列如SEQIDNo：1所示)，用帶有酶切位點的引物擴增(序列分別如SEQIDNo：2和SEQIDNo：3所示)，用T4DNA連接酶連接至pGEM-Teasy(購自Promega公司)上得到質粒pGEM-GhDh1，用BamH1和SacI同時雙酶切pGEM-GhDh1和pBI121，分別獲得GhDh1片段和線性pBI121載體，用T4DNA連接酶將GhDh1片段和線性pBI121載體連接，得到GhDh1基因植物表達載體pBI121-GhDh1，構建流程如圖1所示，構建的植物表達載體pBI121-GhDh1見圖2。實施例2.陸地棉(Gossypiumhirsutum)的遺傳轉化采用農桿菌介導的遺傳轉化方法進行棉花遺傳轉化。棉花轉化受體材料冀棉14(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統一編號：ZM-30270)，轉化外植體是棉花下胚軸，轉化所用農桿菌菌株是含植物表達載體pBI121-GhDh1農桿菌LBA4404。具體轉化過程為：將實施例1所構建的pBI121-GhDh1質粒電激轉化到農桿菌菌株LBA4404(購自BiovectorScienceLab，Inc)中，農桿菌單菌落接種于含卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L的LB液體培養(yǎng)基(酵母提取物(Yeastextract)5g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、氯化鈉(NaCl)10g/L)中。28℃振蕩暗培養(yǎng)過夜到細菌生長對數期。用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，再振蕩培養(yǎng)4-6h，將菌液稀釋至OD600值0.3-0.35。棉花無菌苗制備：棉花種子用硫酸(H2SO4)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾干后用70％乙醇對種子進行表面消毒1min，再用10％-15％過氧化氫(H2O2)處理2-4h，用無菌水沖洗2-3次。然后在無菌水中浸泡18-24h，待種子露白，再在無菌條件下剝去種皮，種入種苗培養(yǎng)基(1/2MS+瓊脂6g/L，pH6.8)中，25℃-28℃光培養(yǎng)3-5d時備用。棉花外植體與農桿菌的共培養(yǎng)：取無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0.5-0.6cm小段，浸入稀釋好的菌液中5-10min，然后取出胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS(MurashigeandSkoog鹽培養(yǎng)基)+2.4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L+KT(激動素)0.1mg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+瓊脂6g/L，pH5.0，表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。22℃-25℃共培養(yǎng)2天。誘導愈傷組織及抗性愈傷組織的篩選：經共培養(yǎng)后的下胚軸段放入愈傷組織誘導培養(yǎng)基中(MS+2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.1mg/L+KT0.1mg/L+MgCl20.91g/L+植物凝膠2.0g/L+卡那霉素50-100mg/L+頭孢霉素500mg/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)，在常規(guī)條件下(25℃)培養(yǎng)2個月(一個月換一次相同的培養(yǎng)基)。無菌條件下挑取愈傷組織少許進行選擇標記基因nptII的檢測，檢測結果為陽性的愈傷組織繼續(xù)繼代，非陽性的愈傷組織淘汰，獲得棉花抗性愈傷組織的頻率為50％-76％。愈傷組織的增殖繼代：誘導出的抗性愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+MgCl20.91g/L+植物凝膠2.0g/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)中，常規(guī)條件下(25℃)培養(yǎng)，每隔一個月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉入增殖培養(yǎng)基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。愈傷組織的分化及壯苗培養(yǎng)：愈傷組織經繼代幾次后，有的愈傷組織轉成米粒狀顆粒，將其轉入分化培養(yǎng)基中(無NH4+、且KNO3加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天門冬酰胺0.5g/L+MgCl20.91-1.35g/L+植物凝膠2.0-3.0g/L+葡萄糖20-30g/L，pH5.8)，進一步分化成胚狀體，當培養(yǎng)的體胚長至1.5-2cm時，轉至棉花壯苗培養(yǎng)基(本領域所熟知的SchenkandHildebrandtMedium)上進行生根壯苗培養(yǎng)，30d左右繼代一次相同的培養(yǎng)基，直至正常苗長至3-5片真葉。再生植株的嫁接：在裝有營養(yǎng)土的土盆中，種上普通棉花種子(抗病、植株生長旺盛)，待棉苗長至1-3片真葉時待用(砧木苗)。用劈接法將轉基因再生棉株嫁接到砧木苗上。全株或嫁接苗部位保濕7d左右，確認成活后移栽至大田。共嫁接移栽11個系25株，成活8個系17株，畸形不育拔除6株，收到T1代自交轉基因棉花種子10份，分別為：R1-1、R1-2、R3-1、R3-2、R8-1、R8-2、R8-4、R9-1、R9-2和R9-4。實施例3.轉基因材料的耐旱篩選鑒定試驗材料與方法：10個GhDh1耐旱轉基因棉花T1代株系，分別為R1-1、R1-2、R3-1、R3-2、R8-1、R8-2、R8-4、R9-1、R9-2和R9-4，對照為冀棉14。試驗在溫室內進行，正常出苗后，卡那霉素篩選鑒定T1代轉基因株系分離情況；取試驗棉花植株葉片，進行室內葉片失水速率對比分析；出苗后暫不澆水，在80％植株出現萎蔫后限制性恢復給水，保持干旱脅迫狀態(tài)，并記錄給水情況。記錄對照及各轉基因株系的生長情況及結鈴性，評估各GhDh1耐旱轉基因棉花耐旱性。試驗概況：對照材料(冀棉14)正常澆水情況：出苗后，6月18日第一次給水，澆水量40方/畝，以后每10天澆一次水，每次澆水量30方/畝，全生育期累計給水10次，折算總澆水量為310方/畝。試驗材料(各編號為R的轉基因株系及控水對照冀棉14)控水情況：出苗后，在7月26日當80％棉株出現萎焉，50％以上植株開始脫落葉子時，第一給水，每畝澆水10方；8月2日澆水15方/畝，8月10日澆水30方/畝，8月17日澆水30方/畝，8月26日澆水30方/畝。全生育期累計給水5次，折算總澆水量為115方/畝。通過卡那霉素鑒定進行T1代分離情況篩查：根據轉基因棉花攜帶nptII標記基因，可提供卡那霉素抗性的特性，5月27日-6月1日葉片人工涂抹2000ppm卡那霉素，6月5日-8日對變色株和不變色株分別做標記，進行外源基因分離情況鑒定，結果表明：除R3-1和R3-2株行外，其他8個轉化體株系分離比存在較大3∶1可能，可推測為外源基因單拷貝插入，數據見表1。表1.GhDh1轉基因棉花T1代株系卡那霉素鑒定分離情況轉化體株系出苗數抗性株數分離比例拷貝數推測*R1-1372424∶131R1-21399∶41R3-1877∶1NAR3-2221919∶3＞1R8-1171111∶61R8-225153∶21R8-41499∶51R9-1191451R9-2141111∶31R9-4211515∶61J14-1(對照)350//*分離比例低于或接近3∶1，顯著偏離15∶1或更高推測為單拷貝，NA表無法推測轉基因植株葉片離體失水速率初步測定：6月15日，在出苗后植株尚未受到干旱脅迫，第一次澆水之前，分別取大小基本一致的轉基因棉花葉片進行葉片保水能力測定，采用鮮重失水速率測定方法，每個株系選卡那霉素抗性單株測三個重復。葉片稱重后，在實驗室室內條件下放置6小時并再次稱重，失水速度用每小時重量減少的百分率表示(％/h)，即葉片鮮重失水速率＝(鮮重-處理后重量)/鮮重*處理時間*100％。試驗表明，不同處理時間不同測試葉片的失水趨勢一致，下圖表是6小時測量數據結果。通過轉基因植株葉片失水速度比對照減緩的百分率，可參考衡量植物細胞保水能力的變化。結果表明，在離體情況下，轉GhDh1基因棉花的葉片在6個小時內平均失水速率比對照顯著降低。其中R9-1表現最為明顯，比對照失水速率減緩34.8％，如下表2、圖3所示。表2.GhDh1轉基因棉花T1代株系葉片鮮重失水速率情況轉化體株系編號6小時平均鮮重失水速度(％/h)較CK減緩(％)R1-12.2730.6R1-22.6219.7R3-12.4325.6R3-22.3228.9R8-12.5920.8R8-22.6120.0R8-42.7914.6R9-12.1334.8R9-22.3627.8R9-43.017.89J14-1(對照)3.27/[0051]不同轉基因株系耐旱性能力比較分析：在7月底溫室內試驗區(qū)觀察時發(fā)現：凡是變色株，絕大部分和對照表現一致，極少部分表現較好(可能是卡那檢測和目的基因檢測的不相關性造成)，而不變色株，基本表現為具有較好的抗旱能力，葉片夾角顯著高于對照，葉片萎蔫程度較低(不變色株和變色株情況分別如圖4A、4B所示)。9月底對試驗材料進行了結鈴性調查，獲得不同株系在受到干旱脅迫后的結鈴情況。對照非轉基因冀棉14在正常灌溉情況下，平均單株結鈴16.8個，而在本試驗干旱脅迫狀態(tài)下，對照平均結鈴2.4個，在本試驗干旱脅迫條件下結鈴降低85.7％。而同樣干旱脅迫情況下部分轉基因株系結鈴性顯著高于對照。因試驗規(guī)模較小，未進行產量數據調查，根據結鈴性調查數據對不同轉基因株系的耐旱性進行評估，并在表現好的株行中進一步選單株，收獲自交種子，用于進一步中間試驗研究(具體數據見表3)。從10個轉化體中選擇了6個耐旱表現較突出的株行，累計選了25個結鈴性表現較好的單株。其中R9-1轉化事件表現最優(yōu)，試驗干旱脅迫條件下平均單株結鈴12.6個，比正常給水對照只降低25.0％，比脅迫對照提高425.0％。表3GhDh1T1代轉基因植株干旱脅迫情況下結鈴性調查及單株選擇轉化體株系調查株數單株平均結鈴數選擇單株數入選單株平均結鈴數R1-1248.6512.2R1-294.50/R3-177.8311.4R3-2198.1511.8R8-1114.10/R8-2156.3410.6R8-495.10/R9-11412.6514.3R9-2117.6310.1R9-4153.60/J14-1(脅迫)202.4//J14-1(正常)2016.8//實施例4.優(yōu)選轉化事件拷貝數分析根據T1代溫室耐旱鑒定結果，對耐旱表現突出的R9-1轉化事件進行Southern拷貝數檢測。參考Paterson等[1](Paterson，A.H，Brubaker，C.L.，Wendel，J.F.Arapidforextractionofcotton(Gossypiumspp)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis[J].PlantMolecularBiologyReporter，1993，11(3)：122-127.)和孫志棟等[2](孫志棟，王學德，倪西源等.棉花DNA提取方法的探討浙江農業(yè)學報)的方法，稍加改動采用SDS-CTAB法提取棉花基因組DNA。利用兩組不同的限制性內切酶(EcoRI、HindIII)對R9-1轉化事件的兩個棉花基因組DNA進行酶切消化。為避免棉花內源GhDh1基因的干擾，以地高辛標記nptII為探針與酶切消化的基因組DNA進行雜交。兩個不同限制性內切酶、兩個重復的Southern雜交圖譜表明，R9-1轉化事件為單拷貝轉化事件。Southern雜交結果見圖5。實施例5.旁側序列分析樣品制備：用本領域常用的植物DNA提取方法提取含有R9-1轉化事件的棉花材料的基因組DNA，取2.5μgDNA，SspI消化6-8小時，酒精沉淀純化后加適量水溶解。連接接頭：根據載體酶切位點分析，分別設計合成兩對接頭：GenomeWalkerAdaptor+和GenomeWalkerAdaptor-(序列分別如SEQIDNo：4和SEQIDNo：5所示)，其中SEQIDNo：5的5’端進行了磷酸化，3’端加氨基。等量混合GenomeWalkerAdaptor+和GenomeWalkerAdaptor-，70℃保溫10分鐘，后緩慢降到室溫。取4μl消化純化的DNA加到含1.9μlGenomeWalkerAdaptor(25μM)，1.6μl10X連接緩沖液，0.5μlT4DNA連接酶(6單位/μl)，在16℃下過夜培養(yǎng)，停止反應，在70℃下水浴5min，在每個管中，加入72μlTE(10/1，pH7.5)，在低速下振蕩5-10sec。使用ClontechGenomeWalkerTMUniversal試劑盒，利用引物AP1和GSP1(序列分別如SEQIDNo：6和SEQIDNo：7所示)，以連接產物為模板，進行第一輪擴增：7個循環(huán)：94℃25sec，72℃6min；32個循環(huán)：94℃25sec，67℃6min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫7分鐘。PCR產物稀釋50倍后，用AP2和GSP2(序列分別如SEQIDNo：8和SEQIDNo：9，所示)進行第二輪PCR擴增，PCR程序如下：5循環(huán)：94℃25sec，72℃5min；20循環(huán)：94℃25sec，67℃5min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫10分鐘。產物回收測序。對R9-1事件的左邊界(LB)端序列分析，共獲得1846bp的核苷酸序列(序列如SEQIDNo：10所示)，包括1bp-258bp為GhDh1的部分序列，第259bp-535bp為Tnos序列，第536bp-1007bp為Tnos表達盒到LB內側的載體序列，第1008bp-1846bp為棉花DNA序列。序列說明：RB端序列分析，根據所獲得的棉花側翼序列，利用公布的二倍體棉花(Gossypiumarboreum)A染色體組基因組序列(http：//cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)進行對比分析，設計下游引物RBflank51’(SEQIDNO：11)。以R9-1基因組DNA為模板，用RBflank51’和GSP2-NPTII31’(SEQIDNo：12所示)進行PCR擴增，PCR程序如下：35循環(huán)：94℃25sec，67℃5min；最后一個循環(huán)后再于67℃保溫10分鐘。產物回收測序。對R9-1事件的RB端序列分析，共獲得1834bp核苷酸序列(序列如SEQIDNo：13)，包括，第1bp-504bp為棉花DNA序列，第505bp-550bp為RB內側的載體序列，第551bp-857bp為Pnos啟動子序列，第858bp-869bp是Pnos與NPTII之間的連接序列，870bp-1655bp是NPTII序列，1656bp-1834bp是NPTII與Tnos之間的連接序列。序列說明：以受體材料冀棉14DNA為模板，分別在插入序列的RB和LB端側翼棉花基因組序列設計引物(序列分別如SEQIDNo：14和SEQIDNo：15所示)，得到大小為780bp左右的擴增產物，與R9-1的旁側序列比對發(fā)現，該事件通過插入序列替換原基因組序列上27bp堿基獲得的。比對結果見圖6。根據以上結果，本領域技術人員可容易得出R9-1事件的特征DNA序列(SEQIDNO：16)，如下所示，加下劃線部分示出的是T-DNA插入序列，未加下劃線部分示出的是插入序列的側翼棉花基因組DNA序列。實施例6.轉化事件檢測使用DNA引物對進行PCR擴增以檢測R9-1事件，所述引物對由特異性識別本發(fā)明T-DNA插入序列的第一引物和特異性識別所述插入序列任一側翼序列的第二引物組成。例如，當第一引物為R9-1-RB5’(SEQIDNO：17)時，第二引物為R9-1-RB3’(SEQIDNO：18)；當第一引物為R9-1LB5’(SEQIDNO：19)時，第二引物為R9-1LB3’(SEQIDNO：20)。利用上述引物對進行PCR鑒定使用本領域常用的方法。利用引物對R9-1-RB5’(SEQIDNO：17)/R9-1-RB3’(SEQIDNO：18)、R9-1LB5’(SEQIDNO：19)/R9-1LB3’(SEQIDNO：20)分別擴增R9-1T1(1-9)、冀棉14-1、冀棉14-2的棉花樣品的結果如圖7所示。實施例7.染色體定位根據所獲得的棉花側翼序列，利用公布的二倍體棉花(Gossypiumarboreum)A染色體組基因組序列(http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)進行對比分析，可知R9-1事件中，與插入序列接合的棉花側翼DNA序列與A1染色體上的序列高度同源，因此可知，R9-1事件中外源DNA插入序列的整合位點位于受體四倍體棉花的A基因組第1組染色體上。其代表性陸地棉(Gossypiumhirsutum)種子已于2015年08月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學院微生物研究所郵政編碼：100101)，保藏編號為：CGMCCNo.11093。其他序列如下：SEQIDNo：1：當前第1頁1 2 3