本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列，還有由其通過重組質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)得到的金錢魚LH重組蛋白的純化及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：金錢魚(Scatophagusargus)又名金鼓魚，隸屬鱸形目(Perciformes)，金錢魚科(Scatophagidae)，分布于我國東海和南海海域，為一種兼具觀賞性的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚類。金錢魚為廣鹽性魚類，在鹽度極高的海區(qū)中有分布，在純淡水中也能很好的生長與存活，可以直接從35‰的海水轉(zhuǎn)移到淡水生活，無需進(jìn)行淡化馴養(yǎng)，其罕有的對鹽度超強(qiáng)的適應(yīng)性使其非常適合作為研究硬骨魚類生殖與生長的材料。研究金錢魚的金錢魚精子發(fā)生機(jī)制對于海水經(jīng)濟(jì)魚類的淡化養(yǎng)殖非常有意義。了解海水魚類繁育過程中的機(jī)體變化與環(huán)境適應(yīng)，對于提高海水魚類繁殖和生長性能，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展具有重要意義。黃體生成素又稱促黃體素(luteinizinghormone，LH)。垂體前葉嗜堿性細(xì)胞所分泌的激素。為糖蛋白。分子量約30000?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)：為糖蛋白，由α和β兩個亞基肽鏈以共價鍵結(jié)合而成。在有卵泡刺激素存在下，與其協(xié)同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟與排卵，使破裂卵泡形成黃體并分泌雌激素和孕激素。刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育并促進(jìn)其分泌睪酮。故又稱間質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)素。LH、FSH和人絨毛膜促性腺激素(HCG)都屬于糖蛋白家族，LH的結(jié)構(gòu)和功能與HCG相似，兩種激素通過相同的受體發(fā)揮作用，但其半衰期很短，約30分鐘，在血液中波動范圍較大；而HCG有較長的半衰期，并且與受體結(jié)合更加穩(wěn)固，容易被放免法所測定，所以經(jīng)常用于臨床和實驗室研究。雖然促黃體生成素(LH)對人類的不孕不育治療有了廣泛的應(yīng)用，但是對魚類的研究與應(yīng)用還比較少。黃體生成素的功能：(1)促進(jìn)雌激素和孕酮的合成。(2)觸發(fā)排卵：在切除腺垂體的病人，當(dāng)用各種方法使卵泡發(fā)育到一定階段后，人工給予LH即可導(dǎo)致排卵。LH引起排卵的機(jī)制可能是由于溶蛋白酶，淀粉酶，透明質(zhì)酸酶的活性增加，導(dǎo)致卵泡壁的結(jié)締組織分解而造成的。動物實驗表明：在LH作用下產(chǎn)生的孕酮可以觸發(fā)排卵酶的形成及釋放。在LH作用下，成熟的卵泡分泌前列腺素。(3)促進(jìn)黃體的產(chǎn)生：成熟的卵泡中的粘膜細(xì)胞在沒有LH存在時，也會自然地黃體化，但未成熟的粒膜細(xì)胞，只有加入LH，才能黃體化。(4)LH對卵巢的其他作用：增加卵巢的血流量，增加鳥氨酸脫羚酶的活性，降低卵巢組織內(nèi)膽固醇濃度。LH能促進(jìn)Leydig細(xì)胞增殖和分化促進(jìn)攀酮的生成，同時，精囊和前列腺也增生。LH在促使家畜性成熟提前、誘導(dǎo)泌乳乏情期的母畜發(fā)情、提高公畜精液品質(zhì)、治療母畜卵巢疾病和胚胎移植中的供體超數(shù)排卵等領(lǐng)域的應(yīng)用中已經(jīng)得到了深入的分析和總結(jié)，近年來又對胚胎移植與超數(shù)排卵(MOET)、卵母細(xì)胞的體外成熟(IVM)和體外受精(IVF)進(jìn)行了深入研究和探索。使我們進(jìn)一步了解了LH在動物繁殖育種中的應(yīng)用：(1)促使家畜性成熟提前：某些家畜的繁殖具有季節(jié)性，如果出生較晚，性成熟時有可能錯過繁殖季節(jié)，接近性成熟的家畜孕酮處理，配合使用LH，可使它們提早發(fā)情配種；(2)誘導(dǎo)泌乳乏情期的母畜發(fā)情：LH處理，可誘導(dǎo)泌乳乏情期的母畜發(fā)情和配種，縮短胎間距，提高母畜的繁殖效率；(3)提高公畜精液品質(zhì)：公畜精子密度不足或精子活力差可致母畜不孕，應(yīng)用LH和FSH治療，可提高精子密度，改善精液品質(zhì)；(4)治療母畜卵巢疾?。篖H對卵巢機(jī)能不全，發(fā)育停滯或交替發(fā)育均有較好療效；(5)超排處理：在胚胎移植工作中，為了獲得大量的卵子和胚胎，常用LH對供體動物進(jìn)行處理，使其卵泡大量發(fā)育成熟和排卵；(6)卵母細(xì)胞的體外成熟和體外受精。家畜卵母細(xì)胞體外成熟和促性腺激素有著密切的聯(lián)系?？傊?，黃體生成素因其廣泛而奇特的生物學(xué)功能，在水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)甚至人類疾病治療等領(lǐng)域有著廣泛和誘人的前景?，F(xiàn)有技術(shù)存在的問題：隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷地擴(kuò)大，為了穩(wěn)定的保證數(shù)量的生產(chǎn)模式，確保繁殖、生長的效率，很多藥物投入到生產(chǎn)行業(yè)中，這無疑會對環(huán)境以及人體造成一定傷害。近年來隨著生物學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)展，使得對魚類精子發(fā)生相關(guān)基因的認(rèn)識取得了長足的進(jìn)步。RT-PCR技術(shù)、原位雜交技術(shù)、減除雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、EST微陣列技術(shù)的應(yīng)用獲得了許多與精子發(fā)生及成熟相關(guān)的基因，促進(jìn)了對精子發(fā)生分子機(jī)理的認(rèn)識。但是，精子發(fā)生有大量基因表達(dá)，并且這些基因表達(dá)是呈階段特異性的，具有嚴(yán)格的時、空調(diào)控關(guān)系，用睪丸和精子mRNA探測一塊克隆EST微陣列已經(jīng)說明了精子發(fā)生的復(fù)雜性，在精子發(fā)生相關(guān)基因的研究中尚存在許多未知領(lǐng)域?；虻陌l(fā)現(xiàn)及其功能與關(guān)系的闡明是將來研究精子發(fā)生分子機(jī)理的核心任務(wù)，目前魚類對于調(diào)控精子發(fā)生的特異基因研究尚處于起步和探索階段。進(jìn)一步篩選、鑒定和克隆精子發(fā)生過程特異表達(dá)基因，對于了解精子發(fā)生、減數(shù)分裂和分化變態(tài)的分子及其調(diào)控機(jī)制十分重要。由于生精細(xì)胞的發(fā)育需要嚴(yán)格的特殊環(huán)境，缺少體外培養(yǎng)模型，長期制約著精子發(fā)生分子機(jī)理的研究。但近年來隨著生物學(xué)技術(shù)的快速進(jìn)展，使得對精子發(fā)生相關(guān)基因的認(rèn)識取得了長足的進(jìn)步。減除雜交、差異顯示技術(shù)的應(yīng)用獲得了許多與精子發(fā)生及成熟相關(guān)的基因。鑒定調(diào)節(jié)精子發(fā)生的關(guān)鍵基因以及闡明其功能是將來研究精子發(fā)生分子機(jī)理的核心任務(wù)，完善對金錢魚精子發(fā)生機(jī)制的研究，為研究魚類精子發(fā)生的分子機(jī)制等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，從而更好的指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種金錢魚黃體生成素LH基因、金錢魚LH重組蛋白及應(yīng)用；具體而言，是由金錢魚黃體生成素LH基因通過原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)得到的金錢魚LH重組蛋白及其應(yīng)用，不僅獲得了金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列全長，還通過原核表達(dá)獲得了金錢魚LH重組蛋白，通過親和柱純化，獲得純的LH重組蛋白，以應(yīng)用于魚類體外注射來促進(jìn)魚類性腺發(fā)育，進(jìn)而使魚類性腺發(fā)育表現(xiàn)同步性。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明涉及一種金錢魚黃體生成素LH基因，其cDNA序列包括如SEQIDNO：1所示的堿基序列。第二方面，本發(fā)明涉及一種金錢魚LH重組蛋白，所述重組蛋白包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。編碼該重組蛋白的基因序列如SEQIDNO：1所示。第三方面，本發(fā)明還涉及一種前述的金錢魚LH重組蛋白的制備方法，獲取前述的金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列全長，通過原核表達(dá)獲得金錢魚LH重組蛋白。優(yōu)選的，所述獲取包括如下步驟：S1、利用Trizol提取法，利用金錢魚性腺進(jìn)行RNA提取，再通過反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行cDNA的合成；S2、根據(jù)步驟S1合成得到的cDNA保守區(qū)設(shè)計引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得金錢魚LH基因序列全長。優(yōu)選的，所述克隆引物對為3′LH1、3′LH2和5′LH1、5′LH2。其堿基序列分別依次如SEQIDNO：3-6所示。優(yōu)選的，所述原核表達(dá)包括如下步驟：A1、金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列與pGEM-TEasy載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)；離心收集，抽提含有目的基因(LH基因)和pGEM-TEasy載體的質(zhì)粒；A2、根據(jù)pET-28a+載體選擇酶切位點(diǎn)XhoI(158)，NdeI(238)，分別對步驟A1抽提得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切；回收有效片段；A3、純化；將目的基因和質(zhì)粒的回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入BL-21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；離心分離；挑菌，菌落PCR驗證后選取有效菌液；A4、將所述有效菌液以體積比1∶10轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，獲取重組粗提蛋白。優(yōu)選的，步驟A2中，酶切引物對為pET(LH)-F、pET(LH)-R；其對應(yīng)的序列分別如SEQIDNO：7、8所示。優(yōu)選的，原核表達(dá)后還包括通過親和柱純化，獲得純的金錢魚LH重組蛋白的步驟。優(yōu)選的，所述親和柱純化包括如下步驟：B1、取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后10ml重組粗提蛋白樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集；B2、用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的重組粗提蛋白樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集；B3、用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的重組粗提蛋白樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。第四方面，本發(fā)明還涉及一種前述的金錢魚LH重組蛋白在用作促進(jìn)魚類性腺發(fā)育藥劑中的用途。優(yōu)選的，所述促進(jìn)魚類性腺發(fā)育藥劑為體外注射液。第五方面，本發(fā)明還涉及一種前述的制備方法制得的金錢魚LH重組蛋白在用作促進(jìn)魚類性腺發(fā)育藥劑中的用途。優(yōu)選的，所述促進(jìn)魚類性腺發(fā)育藥劑為體外注射液。第六方面，本發(fā)明還涉及一種魚用重組蛋白體外注射液，所述體外注射液包括獲取前述的金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列全長，通過原核表達(dá)獲得的金錢魚LH重組蛋白。第七方面，本發(fā)明還涉及一種魚用重組蛋白體外注射液的制備方法，所述方法包括如下步驟：C1、利用Trizol提取法，利用金錢魚性腺進(jìn)行RNA提取，再通過反轉(zhuǎn)試劑盒進(jìn)行cDNA的合成；C2、根據(jù)步驟S1合成得到的cDNA保守區(qū)設(shè)計引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得金錢魚LH基因序列全長；C3、金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列與pGEM-TEasy載體連接后，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)；離心收集，抽提含有目的基因(LH基因)和pGEM-TEasy載體的質(zhì)粒；C4、根據(jù)pET-28a+載體選擇酶切位點(diǎn)XhoI(158)，NdeI(238)，分別對步驟A1抽提得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切；回收有效片段；C5、純化；將目的基因和質(zhì)粒的回收產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物導(dǎo)入BL-21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞；離心分離；挑菌，菌落PCR驗證后選取有效菌液；C6、將所述有效菌液以體積比1∶10轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，獲取重組粗提蛋白；C7、重組粗提蛋白通過親和柱純化，獲得純的金錢魚LH重組蛋白，即所述魚用重組蛋白體外注射液。優(yōu)選的，所述親和柱純化包括如下步驟：B1、取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后10ml重組粗提蛋白樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集；B2、用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的重組粗提蛋白樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集；B3、用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的重組粗提蛋白樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1)本發(fā)明是利用RT-PCR和RACE等分子生物操作技術(shù)，克隆得到黃體生成素的cDNA序列全長，通過酶切等技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)，然后在IPTG作用下誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，然后進(jìn)行提取、純化。本發(fā)明著力于獲得一種較為安全、健康、有效的體外注射夜，其過程中所提及的重組質(zhì)粒的構(gòu)建、分離和純化，是之前水產(chǎn)養(yǎng)殖中體外注射所沒有涉及到的。2)本發(fā)明填補(bǔ)了國內(nèi)外利用金錢魚黃體生成素(LH)重組質(zhì)粒的構(gòu)建制備蛋白體外注射液，解決了金錢魚性腺發(fā)育不同步的問題。3)由于飼料中添加投喂重組蛋白存在因飼料投喂而產(chǎn)生的重組蛋白浪費(fèi)、蛋白利用率不高等問題；且魚類促性腺激素是糖蛋白類物質(zhì)，容易被有胃魚體內(nèi)的蛋白酶所降解，從而降低其生理功能。因此，本發(fā)明采用注射誘導(dǎo)方式可更為直接地使體外重組LH作用于魚體，利用直觀地研究LH對魚類配子的生成的調(diào)控作用。4)本發(fā)明利用注射誘導(dǎo)方法，認(rèn)識了金錢魚黃體生成素LH重組蛋白對成熟期金錢魚配子發(fā)育參數(shù)的影響?？蓮幕虮磉_(dá)水平、血清相關(guān)激素水平和掃描隧道顯微鏡角度分析，推測其可能的機(jī)制，為深入認(rèn)識金錢魚生殖軸(BPG-axis)的調(diào)控機(jī)制和建立實用的金錢魚養(yǎng)殖技術(shù)提供基礎(chǔ)。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：圖1為pET-28a(+)載體質(zhì)粒圖譜；圖2為pET-28a載體多克隆位點(diǎn)示意圖；圖3為酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定激素水平示意圖，其中，A為11-KT(睪酮)雌性♀水平示意圖，B為Estrogen(雌二醇)雌性♀水平示意圖，C為11-KT(睪酮)雄性♂水平示意圖，D為Estrogen(雌二醇)雄性♂水平示意圖；圖4為掃描電鏡觀察、拍攝性腺結(jié)構(gòu)示意圖；其中，A、B、E、F為對照組；C、D、G、H為試驗組；圖5為LH克隆PCR示意圖；圖6為LH膠回電泳、PCR送測陽性克隆產(chǎn)物電泳驗證示意圖；其中，a為LH膠回電泳示意圖，b為陽性克隆產(chǎn)物電泳示意圖；圖7為雙酶切pET-LH電泳圖；其中，a為pET-LH，b中，左上pET-28a，左下LH，右pET-LH；圖8為pET-LH重組蛋白Western檢測圖譜；其中a為顯色拍攝圖，且1-5道是考馬斯亮藍(lán)染色拍攝圖，6、7道是Westernblot轉(zhuǎn)膜ECL顯色拍攝圖，b為重組蛋白純化結(jié)果示意圖；具體實施方式本發(fā)明首先利用RT-PCR和RACE等分子生物操作技術(shù)，獲得金錢魚黃體生成素LH基因的cDNA序列全長，通過原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)得到金錢魚粗提LH重組蛋白，通過親和柱純化，獲得純的LH重組蛋白，應(yīng)用于魚類體外注射，促進(jìn)魚類性腺發(fā)育，使魚類性腺發(fā)育表現(xiàn)同步性。具體步驟如下：1)利用Trizol提取法，利用金錢魚性腺進(jìn)行RNA提取，再通過反轉(zhuǎn)試劑盒(羅氏)進(jìn)行cDNA的合成，合成的cDNA保存于-20℃，待用。LH基因的cDNA全長608bp(圖5為LH克隆PCR示意圖；由圖5可知，LH片斷大小608bp(所用Marker為2000bp，Takara))，其序列如SEQIDNO：1所示，其中開放閱讀框為438bp(第106-543個堿基)，編碼145個氨基酸，第1-22個氨基酸為信號肽，存在著一個硬骨魚類特異性的Cys-Ser-Gly-His(CSGH)區(qū)域。此外，在LH氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了一個N-糖基化位點(diǎn)(NHT)，在3’端非編碼區(qū)內(nèi)含有一個加尾信號AAATAA。NCBI，ORFfinderLHcDNA序列檢測結(jié)果如下：ORF編碼氨基酸：第1-22個氨基酸為信號肽，具體序列如SEQIDNO：2所示：MMAAQVSRATFPLILFLEFTAAFQLPPCQLVNHTVSLEKEGCPKCHPVETTICSGHCLTKDPVIKIPFSNVYQHVCTYRDLYYKTFELPDCPPGVDPTVTYPVALSCHCGRCAMDTSDCTFESLHPDFCMNDIPFYYPSEGMSLY。2)通過生物軟件BioEdit，Primer5.0等生物軟件，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得金錢魚LH(黃體生成素)基因序列全長?？寺∫铮?′LH1GTCTCTGGAGAAGGAGGGCTGT(SEQIDNO：3)3′LH2TACAAGACATTTGAGCTTCCCGA(SEQIDNO：4)5′LH1CAGGCTCTCGAAGGTGCAGTC(SEQIDNO：5)5′LH2TCGGGAAGCTCAAATGTCTTGTA(SEQIDNO：6)再通過與pGEM-TEasy載體(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)16℃連接過夜，然后再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技(北京)有限公司)中，然后搖菌3-6h后，進(jìn)行菌落PCR驗證，將有效菌液接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，使用足夠的LB液體培養(yǎng)基讓大腸桿菌大量擴(kuò)增培養(yǎng)。3)提取質(zhì)粒：2)中所搖菌包括轉(zhuǎn)入目的基因和表達(dá)載體的感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)之后，先將擴(kuò)增培養(yǎng)的大腸桿菌離心收集，然后利用Takara質(zhì)粒抽提試劑盒(上海皓嘉科技發(fā)展有限公司)大量提取目的基因和載體的質(zhì)粒。4)雙酶切：根據(jù)pET-28a+載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)選擇酶切位點(diǎn)XhoI(158)，NdeI(238)(載體pET-28a(+)圖譜如圖1所示，載體大小5369bp；載體pET-28a(+)上選擇的酶切位點(diǎn)如圖2所示)，分別對提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切，將目的片段和表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后，2％瓊脂糖膠跑膠，用Promega膠回試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)回收有效片段。酶切引物：pET(LH)-FCATATGTTCCAGCTGCCGCCATGC(SEQIDNO：7)pET(LH)-RCTCGAGTTAGTACAGAGACATCCCTTCAGACGG(SEQIDNO：8)圖7為雙酶切pET-LH電泳圖；由圖7-a可知，pET-LH大小約為6000bp，酶切正確，回收產(chǎn)物為目的片段(所用Marker為5000bp)；由圖7-b可知，因為購買pET-28a載體片段大小為5369bp，圖中pET-LH大小約為6000bp，符合酶切意圖(所用Marker為5000bp，Takara)。5)純化：通過瓊脂糖進(jìn)行膠回，目的基因回收的是較小的片段，質(zhì)粒則是較大的片段。圖6為LH膠回電泳示意圖；由圖6-a，b可知，LH片斷大小608bp(所用Marker為2000bp，Takara)。6)連接：將目的基因和質(zhì)粒的回收產(chǎn)物連接，以10∶1的比例，16℃連接過夜。瓊脂糖電泳鑒定正確后，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入BL-21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞(BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞天根生化科技(北京)有限公司)中，加入裝有新鮮1mlLB液體培養(yǎng)基的1.5ml的EP管中，搖菌。7)酶切檢測：對連接產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切和單酶切(都是2個)檢測。將攜帶有目的基因和載體的質(zhì)粒的菌液，接種于50mlLB液體培養(yǎng)基(Amp+工作液濃度50ug/ml)，37℃，200rpm，搖菌6-8h，雙酶切組與單酶切組互相做對照。8)將所搖得的菌液進(jìn)行離心收集，然后涂于Kana+的LB平板，每組10樣進(jìn)行挑菌，置于裝有1mlKana+的LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管中搖菌3-6h，進(jìn)行菌落PCR驗證，選取上述步驟中的有效菌液進(jìn)行接下來的接種工作。9)保存菌種：將50％⑧有效菌液與50％甘油混合，搖勻，-80℃保存(甘油濃度在30-70％即可。)10)將上述8)菌液以1∶100轉(zhuǎn)接到新的LB中，37℃，200rpm，進(jìn)行大量培養(yǎng)2-3h；當(dāng)細(xì)菌長到OD＝0.4-0.6后，加入IPTG工作液至其終濃度為1mM，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6-8h，收集菌液(做對照組，無IPTG)。11)蛋白檢測：4℃，12,000g離心5min，收集細(xì)菌沉淀，1×PBS漂洗(注意不要溶解)，然后溶解沉淀，加2×LoadingBuffer，100℃煮沸5min，冷卻至室溫，然后10,000g離心10min，取5ul上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳?？既净騑esternBlot分析，出現(xiàn)目的條帶，蛋白豐度較高，進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白擴(kuò)增培養(yǎng)。圖8為pET-LH重組蛋白Western檢測圖譜；由圖8-a，b可知，蛋白表達(dá)豐度較高，且大小約為16kDa。12)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：取上述9)中-80℃保存的pET-LH/BL和pET-28a/BL凍存菌液100ul接于1ml含卡那霉素(Kana+)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)1h。隨后吸取適量菌液涂于含卡那霉素(Kana+)的LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10-14h。13)挑取單克隆接于lml含卡那霉素(Kana+)LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管中，37℃，振蕩培養(yǎng)8-10h以讓大腸桿菌大量擴(kuò)增(生長至大腸桿菌對數(shù)生長期)。菌液PCR驗證后，將含有目的基因插入片段的菌液以1∶100(v/v)的比例接種于400ml新鮮(Kana+終濃度50ug/ml)LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)。14)重組粗提蛋白獲取：將收集的菌液于4000-5500rpm離心10min，去除培養(yǎng)基，用pH＝7.4的PBS緩沖液重懸菌體。冰浴超聲破碎菌體。參數(shù)設(shè)置為電壓200V，2s破碎，2s間隔，如此反復(fù)至菌液清亮。4000-5500rpm離心10min，沉淀為細(xì)胞碎片，上清液為菌體粗蛋白。吸取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?5)溶液試劑：(純化所用試劑購于生工生物工程上海股份有限公司)平衡緩沖液，pH＝7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含20mM咪唑。洗脫緩沖液，pH＝7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含500mM咪唑。16)重組蛋白分離純化：取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20％乙醇，封閉，以備下次使用。收集的部分用考瑪斯亮藍(lán)法、SDS-Page電泳、Western-Blot檢測。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例1、重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)：取上述-80℃保存的pET-LH/BL和pET-28a/BL凍存菌液100ul接于1ml含卡那霉素(Kana+)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)1-3h。隨后吸取適量菌液涂于含卡那霉素(Kana+)的LB固體平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10-14h。挑取單克隆接于1ml含卡那霉素(Kana+)LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管中，37℃，振蕩培養(yǎng)8-10h以讓大腸桿菌大量擴(kuò)增(生長至大腸桿菌對數(shù)生長期)。2、菌液PCR驗證后，將含有目的基因插入片段的菌液以1∶100(v/v)的比例接種于400ml新鮮(Kana+終濃度50ug/m1)LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)增培養(yǎng)。3、重組粗提蛋白獲?。簩⑹占木河?000-5500rpm離心10min，去除培養(yǎng)基，用pH＝7.4的PBS緩沖液重懸菌體。冰浴超聲破碎菌體。參數(shù)設(shè)置為電壓200V，2s破碎，2s間隔，如此反復(fù)至菌液清亮。4000-5500rpm離心10min，沉淀為細(xì)胞碎片，上清液為菌體粗蛋白。吸取上清液，-20℃保存?zhèn)溆茫?、溶液試劑：(純化所用試劑購于生工生物工程上海股份有限公司)平衡緩沖液：pH＝7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含20mM咪唑。洗脫緩沖液：pH＝7.4的50mM磷酸緩沖液含0.5MNaCl，含500mM咪唑。5、重組蛋白分離純化：首先取1ml鎳瓊脂糖凝膠FF或鎳NTA瓊脂糖凝膠FF預(yù)裝柱，用10ml平衡緩沖液平衡，然后取破碎上清10ml樣品以0.5ml/min上樣，然后2ml/管分管收集。用15ml平衡緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。用5ml洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品，流速1-2ml/min，2ml/管收集。再用5ml平衡緩沖液平衡柱子，灌滿20％乙醇，封閉，以備下次使用。收集的部分用考瑪斯亮藍(lán)法、SDS-Page電泳、Western-Blot檢測。6、體外注射：使用生理鹽水進(jìn)行稀釋，配置濃度為5-10ng/ml的重組蛋白注射液，分別對三組(空白組：不注射任何藥物及藥品，對照組：注射與實驗組相同劑量的生理鹽水，實驗組：注射濃度為5-10ng/ml的重組蛋白，注射量為1.5-2ml/100g)金錢魚進(jìn)行肌肉注射(背鰭)，設(shè)采樣時間點(diǎn)設(shè)為0d，7d，14d，采取性腺、血清。7、結(jié)果檢測：對所采得的樣品進(jìn)行分子水平的檢測，經(jīng)由酶聯(lián)免疫法(ELISA試劑盒德國Cayman公司)對血清中的睪酮，雌二醇進(jìn)行濃度檢測。另將所采得的性腺經(jīng)過處理，掃描電鏡下進(jìn)行觀察并拍攝。酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定激素水平如圖3所示，可見在0d，7d，14d，金錢魚空白組，對照組，實驗組血清中的睪酮，雌二醇濃度差異。實驗組的雌性金錢魚血清中雌二醇在0天時含量391pg/ml，7天時含量為578pg/ml，有顯著上升，14天時含量降為305pg/ml，又有所降低。而血清中睪酮含量從0天至14天含量在11-17pg/ml之間，處理前后無明顯變化(*p＜0.05)。實驗組的雄性金錢魚血清中睪酮在0天和7天時含量50pg/ml左右，14天時含量為132pg/ml，有顯著上升。而血清中雌二醇含量從0天至14天含量在6.5-7.5pg/ml之間，處理前后無明顯變化(*p＜0.05)。掃描電鏡觀察、拍攝性腺結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示，掃描隧道顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，處理前后卵巢組織實驗組和對照組無明顯變化。對照組精巢出現(xiàn)精子發(fā)育不同步，實驗組精子發(fā)育較一致。說明體外注射LH重組蛋白可促進(jìn)金錢魚配子生成及發(fā)育。以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。SEQUENCELISTING<110>上海海洋大學(xué)<120>金錢魚黃體生成素LH基因、金錢魚LH重組蛋白及應(yīng)用<130>2016<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>608<212>DNA<213>Scatophagusargus<400>1ggaaactgcctgcaggctgcagacgggactgttcaaaacacgcccactagctggcacacc60tgacaatcaacagaacaactaagtaaattattgactgacttcaggatgatggctgcacag120gtcagcagagcgacgttccccttgatactgtttctggaattcacagcggccttccagctg180ccgccatgccagctcgtcaaccacacggtgtctctggagaaggagggctgtcccaagtgt240cacccggtggaaacaaccatctgcagtgggcactgcctcaccaaggatcctgtcattaag300ataccgttcagcaacgtttaccagcacgtctgcacgtaccgggacttgtactacaagaca360tttgagcttcccgactgtccacccggcgtggacccgacggtcacctaccccgtggctctg420agctgccactgcggccgctgcgccatggacacatccgactgcaccttcgagagcctgcac480ccagacttctgcatgaacgacatacctttctactacccgtctgaagggatgtctctgtac540taaagcacacgacacgtacaaaaactgtgctgacttcaaatattgtaaataaagattgtt600gcatttac608<210>2<211>145<212>PRT<213>Scatophagusargus<400>2MetMetAlaAlaGlnValSerArgAlaThrPheProLeuIleLeuPhe151015LeuGluPheThrAlaAlaPheGlnLeuProProCysGlnLeuValAsn202530HisThrValSerLeuGluLysGluGlyCysProLysCysHisProVal354045GluThrThrIleCysSerGlyHisCysLeuThrLysAspProValIle505560LysIleProPheSerAsnValTyrGlnHisValCysThrTyrArgAsp65707580LeuTyrTyrLysThrPheGluLeuProAspCysProProGlyValAsp859095ProThrValThrTyrProValAlaLeuSerCysHisCysGlyArgCys100105110AlaMetAspThrSerAspCysThrPheGluSerLeuHisProAspPhe115120125CysMetAsnAspIleProPheTyrTyrProSerGluGlyMetSerLeu130135140Tyr145<210>3<211>22<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>3gtctctggagaaggagggctgt22<210>4<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>4tacaagacatttgagcttcccga23<210>5<211>21<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>5caggctctcgaaggtgcagtc21<210>6<211>23<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>6tcgggaagctcaaatgtcttgta23<210>7<211>24<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>7catatgttccagctgccgccatgc24<210>8<211>33<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>ArtificialSequence<400>8ctcgagttagtacagagacatcccttcagacgg33當(dāng)前第1頁1 2 3