本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：。具體涉及一種GhJAZ1基因在增強(qiáng)植物抗低溫脅迫中的應(yīng)用。從棉花中克隆的JAZ(JASMONATE-ZIMDOMAIN)家族蛋白基因GhJAZ1，功能驗(yàn)證表明超表達(dá)GhJAZ1基因能提高棉花對(duì)低溫脅迫的耐受性。利用本發(fā)明克隆的GhJAZ1基因，通過遺傳轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。
背景技術(shù)：
：：低溫脅迫包括冷脅迫(0-20℃)和冰凍脅迫(<0℃)，會(huì)對(duì)植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致植株的死亡，同時(shí)，低溫還是限制植物空間分布的重要應(yīng)影響因子。當(dāng)植物處在冷脅迫環(huán)境下時(shí)，植物體正常的新陳代謝受阻，除此之外，冷脅迫還會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生滲透脅迫，活性氧增加等其它脅迫反應(yīng)(Chinnusamyetal.2007)。一些喜溫作物如玉米、西紅柿、大豆、棉花、香蕉等，如果在低于10-15攝氏度的環(huán)境下生長就會(huì)造成嚴(yán)重的損害，表現(xiàn)為葉片萎蔫、枯黃和壞死等癥狀。低溫也會(huì)對(duì)植物的生殖生長造成嚴(yán)重影響，例如，在水稻在開花期如果遭遇低溫脅迫將會(huì)導(dǎo)致花的敗育(Wenetal.2002)。棉花原產(chǎn)于熱帶和亞熱帶，屬于喜溫作物，各生育時(shí)期對(duì)溫度都有一定的要求，棉花在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中所能承受的最低溫度分別是12℃和15.5℃；現(xiàn)蕾要求最低溫度為19-20℃；花鈴期如果環(huán)境溫度低于21℃會(huì)影響還原糖不能轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維素，嚴(yán)重影響纖維發(fā)育。棉花花粉管伸長的適宜溫度為28～32℃，一旦溫度低于19℃或者是高于45℃花粉管完全不能伸長(Kakanietal.2005)。棉花全生育期生長的最適宜溫度為20～30℃，如果低于該溫度范圍，棉花則不能正常生長發(fā)育。然而隨著我國棉花種植方式的改變，越來越多的植棉省區(qū)均采用直播植棉方式，在這種植棉方式下，棉花苗期遭遇低溫的幾率加大，對(duì)我國棉花的種植造成了嚴(yán)重影響。例如我國最大的棉花種植省區(qū)和優(yōu)質(zhì)商品棉基地新疆，在播種至幼苗生長期間，經(jīng)常遭遇寒潮等低溫氣象災(zāi)害，地表溫度遠(yuǎn)低于棉花幼苗最低生長溫度，甚至達(dá)0℃以下，嚴(yán)重影響植株生長發(fā)育和產(chǎn)量形成(辛慧慧etal.2014)。因此，培育高產(chǎn)、多抗的棉花品種，有效應(yīng)對(duì)棉花生長發(fā)育進(jìn)程中的各種逆境，是當(dāng)前棉花育種的重要任務(wù)。茉莉酸及其衍生物(JAs)是植物體內(nèi)的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，它在維持植物體發(fā)育、生長、抗逆等生物進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。在模式植物擬南芥中，JAs影響雄蕊和絨毛發(fā)育、營養(yǎng)生長、細(xì)胞周期調(diào)控、衰老，除此之外還影響植物體對(duì)外界生物及非生物脅迫的響應(yīng)。JAZs(JASMONATEZIM-DOMAINProtein)是茉莉酸信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控茉莉酸信號(hào)通路。在正常情況下，植物體內(nèi)茉莉酸含量很低，JAZs與轉(zhuǎn)錄因子(如MYC2)結(jié)合，從而抑制茉莉酸信號(hào)通路；當(dāng)植物受到生物逆境和非生物逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)茉莉酸含量大量增加，在JA-Ile存在的情況下，JAZ蛋白與COI1結(jié)合，接著SCFCOI1被E3泛素連接酶識(shí)別并使JAZ蛋白泛素化，最終使其進(jìn)入26s蛋白酶降解途徑降解，被JAZs抑制的轉(zhuǎn)錄因子 被釋放，從而啟動(dòng)茉莉酸應(yīng)答基因響應(yīng)(PauwelsandGoossens2011)。JAZs還可以結(jié)合其它代謝通路中的調(diào)節(jié)因子，從而使茉莉酸代謝通路與其它代謝通路相互協(xié)同，互相調(diào)節(jié)，從而在植物體的發(fā)育、生長、抗逆等生物進(jìn)程中起到至關(guān)重要的作用(孫程2013)。擬南芥JAZ蛋白(JAZ1，JAZ8和JAZ11)可以與MYB21和MYB24互作，抑制MYB21和MYB24的轉(zhuǎn)錄功能，從而抑制茉莉酸調(diào)控的花藥發(fā)育過程，影響植物育性(Songetal.2011)。DELLAs蛋白(RGA、GAI、RGL、RGL1、RGL2)是赤霉素信號(hào)通路的抑制調(diào)節(jié)因子，JAZ1在體內(nèi)可以與DELLA蛋白R(shí)GA互作，干擾DELLAs與PIF3轉(zhuǎn)錄因子的互作從而調(diào)控赤霉素信號(hào)通路，同樣，DELLA蛋白R(shí)GA可以與MYC2競爭性結(jié)合JAZ來調(diào)控茉莉酸信號(hào)通路(Houetal.2010)。大豆JAZ家族蛋白GsJAZ2是一種核定位蛋白，受鹽、堿、低溫和干旱誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中超表達(dá)GsJAZ2可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)鹽，堿的耐受性，對(duì)一些脅迫響應(yīng)的標(biāo)記基因檢測發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)量在超表達(dá)材料中顯著增強(qiáng)(Zhuetal.2012)。茉莉酸可以通過調(diào)節(jié)ICE-CBFs信號(hào)通路增強(qiáng)擬南芥對(duì)低溫的耐受性，JAZ1和JAZ4可以與ICE1蛋白互作從而抑制ICE1的轉(zhuǎn)錄功能，超表達(dá)JAZ1或JAZ4抑制擬南芥對(duì)凍害的耐受性(Huetal.2013)。對(duì)擬南芥TIFY10s(AtTIFY10a和AtTIFY10b)突變體研究發(fā)現(xiàn)，在堿性環(huán)境脅迫下，突變體較野生型表現(xiàn)出較低的萌發(fā)率。在紫花苜蓿中超表達(dá)大豆基因GsTIFY10a可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)堿脅迫的耐受性，主要表現(xiàn)為促進(jìn)植株生長，增加蘋果酸脫氫酶活性、檸檬酸含量和脯氨酸含量，降低丙二醛含量。對(duì)一些脅迫響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測發(fā)現(xiàn)，蘋果酸脫氫酶(NADP-ME)、焦磷酸酶(H+-PPase)、羧酸合成酶(P5CS)合成基因在GsTIFY10a轉(zhuǎn)基因植株中上調(diào)表達(dá)。除此之外，在苜蓿中超表達(dá)GsTIFY10a還可以增加內(nèi)源茉莉酸含量(DanZhuetal.2014)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明基于擬南芥同源序列比對(duì)及棉花中逆境表達(dá)差異篩選，分離、克隆到一個(gè)參與茉莉酸信號(hào)路徑調(diào)節(jié)的棉花JAZ家族基因，我們將這個(gè)基因命名為GhJAZ1基因，通過轉(zhuǎn)化陸地棉YZ1，獲得轉(zhuǎn)基因陸地棉，以驗(yàn)證其在棉花抗非生物逆境中的功能，為茉莉酸信號(hào)如何參與植物抗非生物逆境提供理論依據(jù)，并為棉花在逆境中提高產(chǎn)量提供參考。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：(1)通過STIFDB(StressResponsiveTranscriptionFactorDatabase)數(shù)據(jù)庫和Genevestigator技術(shù)篩選出可能參與非生物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)的擬南芥調(diào)節(jié)因子，用初步篩選出的擬南芥基因Blast棉花EST數(shù)據(jù)庫，獲得與其同源的棉花EST序列。對(duì)陸地棉YZ1幼苗進(jìn)行鹽、冷、ABA等逆境處理，提取根、葉的RNA，利用Real-timePCR技術(shù)對(duì)該篩選到的棉花基因進(jìn)行表達(dá)分析，根據(jù)基因誘導(dǎo)表達(dá)情況，最終確定研究的目的基因。本發(fā)明從陸地棉中克隆一個(gè)與棉花抗逆相關(guān)的功能基因GhJAZ1，它的cDNA序列是序列表SEQNO:1中第1-792位堿基所示的序列，其中該序列1-792位堿基所示的序列是該基因的編碼區(qū)，其編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQNO:2所示。對(duì)該基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，GhJAZ1含有4個(gè)內(nèi)含子，其ORF長792bp，編碼一個(gè)263個(gè)氨基酸的JAZ家族蛋白。對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，GhJAZ1具有經(jīng)典的ZIMdomain和Jasdomain， 與擬南芥的JAZ1(TIFY10a)最同源，同源度為46％。用ClustalX1.83和MEGA5.2軟件將GhJAZ1基因蛋白序列與12個(gè)AtJAZ蛋白序列進(jìn)行相似性分析，GhJAZ1與AtJAZ1和AtJAZ2聚類在一起(見圖1)。本發(fā)明分離的基因GhJAZ1來源于棉花，該基因在對(duì)逆境脅迫，激素以及棉花生長發(fā)育的影響上尚未有任何報(bào)道。通過不同的脅迫處理及激素處理野生型棉花YZ1(即豫早1號(hào)陸地棉)，檢測該基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)該基因受PEG模擬的干旱、鹽(NaCl)，低溫(4℃)，脫落酸(ABA)，茉莉酸(JA)和活性氧(H2O2)等處理的誘導(dǎo)表達(dá)(見圖2)。本發(fā)明分別構(gòu)建了該基因的超量表達(dá)載體pK2GW7.0和干涉表達(dá)載體pHELLSGATE4(見圖3中的圖3D，該質(zhì)粒載體又稱為pHellsgate4-JAZ1，其構(gòu)建流程見圖3)，我們將這兩個(gè)載體分別轉(zhuǎn)化到豫早1號(hào)陸地棉(YZ1)中，得到該基因的超表達(dá)和干涉轉(zhuǎn)基因陽性株系，檢測其表達(dá)量并選取具有合適表達(dá)量的2個(gè)超表達(dá)純系(編號(hào)為J39，J92)和2個(gè)干涉純系(編號(hào)為JR3，JR3)并進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。通過GhJAZ1在低溫處理下表達(dá)分析，我們認(rèn)為GhJAZ1基因可能在棉花響應(yīng)低溫脅迫方面發(fā)揮一定的作用。首先，我們采用水培的方法進(jìn)行低溫脅迫下的表型鑒定，當(dāng)幼苗生長至兩葉一心期用4℃進(jìn)行低溫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在處理3小時(shí)不同材料間植株表型已經(jīng)發(fā)生很大變化，主要表現(xiàn)在兩個(gè)干涉株系植株葉片已嚴(yán)重萎蔫，對(duì)照野生型YZ1葉片也開始出現(xiàn)萎蔫，然而兩個(gè)超表達(dá)株系植株則沒有出現(xiàn)明顯的表型。處理15小時(shí)，超表達(dá)植株葉片也開始出現(xiàn)萎蔫，同期的干涉植株和對(duì)照野生型YZ1已完全萎蔫。處理25小時(shí)后對(duì)處理材料進(jìn)行常溫恢復(fù)，在恢復(fù)50小時(shí)后發(fā)現(xiàn)干涉和對(duì)照出現(xiàn)較嚴(yán)重程度的葉片枯死，然而超表達(dá)植株葉片枯死面積則較少(見圖5A)。為了更為真實(shí)地模擬棉花在自然情況低溫對(duì)棉花植株造成的影響，我們采用人工氣候箱模擬冷脅迫(8℃)，同時(shí)將棉花幼苗種植于裝滿營養(yǎng)土(育苗基質(zhì)：蛭石＝3:1)的營養(yǎng)缽內(nèi)，棉花幼苗生長至兩葉一心時(shí)進(jìn)行冷脅迫處理。處理兩天后我們發(fā)現(xiàn)干涉株系和對(duì)照野生型YZ1絕大部分植株表現(xiàn)出葉片萎蔫的表型，超表達(dá)材料只有個(gè)別單株表現(xiàn)出葉片的輕微萎蔫。然后我們對(duì)處理材料進(jìn)行室溫恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，恢復(fù)一天后我們發(fā)現(xiàn)干涉株系和對(duì)照野生型YZ1絕大部分植株表現(xiàn)出葉片嚴(yán)重枯死，這與前面水培處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相同的(見圖5B)。對(duì)處理后葉片相對(duì)電導(dǎo)率和葉綠素含量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)材料葉片較干涉和對(duì)照株系離子滲出率較小且具有較高的葉綠素含量，這表明超表達(dá)GhJAZ1材料葉片受損程度較小，表現(xiàn)出對(duì)低溫更強(qiáng)的耐受性(見圖5C)。本發(fā)明具體操作步驟如下：1)以野生型棉花YZ1葉片cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增GhJAZ1基因全長，獲得目的DNA片段，其核苷酸序列和CDS序列全長如SEQIDNO:1(1-792bp)所示，擴(kuò)增該基因的引物序列如下所示：GhJAZ1-F：5'-GAGCAAATAGTTGGGATTCTGG-3'GhJAZ1-R：5'-AACTCGGCTGGGACTACTAC-3'2)根據(jù)得到的基因序列，設(shè)計(jì)帶BP-LR反應(yīng)的接頭的引物用于構(gòu)建表達(dá)載體，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到兩端帶有BP-LR反應(yīng)的接頭堿基的包含完整CDS的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP反應(yīng)連接至pDONRTM221載體上(BP酶購自Invitrogen公司，美國，室溫反應(yīng)4小時(shí)，見圖3C，pDONRTM221載體來源于CSIROPlantIndustry，澳大利亞)，再用LR反應(yīng)將GhJAZ1基因連接至植物表達(dá)載體pK2GW7.0(LR酶購自Invitrogen公司，美國，室溫反應(yīng)4小時(shí)，圖3A，載體pK2GW7.0來自根特大學(xué)，比利時(shí))(pK2GW7.0-GhJAZ1，圖3B，由申請(qǐng)人自行 制備，武漢)。同時(shí)設(shè)計(jì)引物用于非保守區(qū)干涉，通過BP反應(yīng)，將該選取干涉片段連接到干涉載體pHELLSGATE4(由CSIROPlantIndustry惠贈(zèng)，澳大利亞)上，再通過熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，對(duì)陽性單克隆提取質(zhì)粒分別用XhoI和XbaI分別進(jìn)行單酶切檢測，從而獲得正確連接方向的GhJAZ1干涉表達(dá)載體(pHELLSGATE4-GhJAZ1,由申請(qǐng)人自行制備)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，將所述的載體pHELLSGATE4-GhJAZ1轉(zhuǎn)化陸地棉YZ1(來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南.安陽)下胚軸，通過組織培養(yǎng)，獲得超量表達(dá)和干涉表達(dá)GhJAZ1轉(zhuǎn)基因植株。所用引物序列如下：OE-GhJAZ1-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGAGCAAATAGTTGGGATTCTGG-3’OE-GhJAZ1-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAACTCGGCTGGGACTACTAC-3’RNAi-GhJAZ1-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGGTTCTTCAGTGGAGCCT-3’RNAi-GhJAZ1-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATGCTGTGGAGTTACTTATCTGGT-3’M13-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’35S-F：5’-CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3’進(jìn)一步的具體步驟如下所述：1)借助卡那霉素篩選，拷貝數(shù)鑒定和分離比統(tǒng)計(jì)的方法獲得轉(zhuǎn)基因陽性純合植株，通過RT-PCR的方法，檢測轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量。2)用PEG模擬的干旱、鹽(NaCl)，低溫(4℃)，脫落酸(ABA)，茉莉酸(JA)和活性氧(H2O2)處理兩葉一心期的野生型棉花品種YZ1幼苗，檢測GhJAZ1對(duì)不同逆境脅迫處理的應(yīng)答響應(yīng)。3)GhJAZ1超表達(dá)和干涉植株在苗期分別進(jìn)行水培和營養(yǎng)缽栽培進(jìn)行低溫表型鑒定，觀察其表型，并測定低溫脅迫處理下相關(guān)指標(biāo)及基因的表達(dá)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在其生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受各種不良環(huán)境的脅迫,如干旱、高鹽、低溫等，在這些因素中，低溫是影響棉花正常生長發(fā)育的重要影響因子之一，棉花全生育期生長的最適宜溫度為20～30℃，如果低于該范圍，棉花則不能正常生長發(fā)育。隨著我國棉花種植方式的改變，越來越多的植棉省區(qū)均采用直播植棉方式，在這種植棉方式下，棉花苗期遭遇低溫的幾率加大，對(duì)我國棉花的種植造成了嚴(yán)重影響。目前，尚無棉花響應(yīng)低溫脅迫分子機(jī)理研究的研究報(bào)道，我們期望通過本研究以構(gòu)建植物響應(yīng)低溫的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為目標(biāo)，進(jìn)一步豐富調(diào)控棉花抗冷的分子機(jī)理。利用STIFDB(StressResponsiveTranscriptionFactorDatabase)數(shù)據(jù)庫和Genevestigator技術(shù)篩選擬南芥中受非生物脅迫響應(yīng)基因，然后Blast棉花EST數(shù)據(jù)庫尋找目標(biāo)基因，這種研究策略的可行性與科學(xué)性已被證實(shí)(Zhuetal.,2010)。本發(fā)明克隆的GhJAZ1基因是利用STIFDB(StressResponsiveTranscriptionFactorDatabase)數(shù)據(jù)庫和Genevestigator技術(shù)篩選擬南芥中受非生物脅迫響應(yīng)基因，然后Blast棉花EST數(shù)據(jù)庫尋找到的目標(biāo)基因，這種篩選目標(biāo)基因的研究策略的可行性與科學(xué)性已被證實(shí)。茉莉酸(JA)作為植物中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)廣泛參與逆境脅迫等抗逆反應(yīng)。擬南芥、水稻、香蕉、小麥等作物均報(bào)道了茉莉酸參與植物對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，棉 花中有關(guān)茉莉酸在非生物逆境方面的研究較少。擬南芥JAZ1是茉莉酸信號(hào)路徑上的負(fù)調(diào)控因子，抑制茉莉酸信號(hào)的傳遞。棉花GhJAZ1是與擬南芥JAZ1最為同源的基因，很可能參與茉莉酸信號(hào)通路。在棉花中超量表達(dá)GhJAZ1基因，能夠有效提高苗期轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫脅迫的耐受性，因此能夠利用基因工程技術(shù)提高作物耐低溫脅迫的能力。附圖說明序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明分離克隆GhJAZ1基因的核苷酸序列(序列長度為792bp)，也是該基因的編碼區(qū)(CDS，1--792位堿基所示的序列)，編碼263個(gè)氨基酸。序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明分離克隆GhJAZ1基因編碼的蛋白質(zhì)序列。圖1：是利用ClustalX軟件和MEGA5.2軟件(公開使用軟件)對(duì)GhJAZ1編碼氨基酸序列與Tair數(shù)據(jù)庫中擬南芥JAZ家族成員聚類分析的結(jié)果。通過聚類分析表明，GhJAZ1編碼氨基酸序列與擬南芥中的AtJAZ1和AtJAZ2編碼氨基酸同源性最高。圖2：使用Real-timePCR的方法檢測GhJAZ1基因?qū)δ婢程幚淼谋磉_(dá)模式分析。附圖標(biāo)記說明：圖2A為15％PEG處理下葉片和根中GhJAZ1的表達(dá)分析(其中：圖2A中的左圖是GhJAZ1在葉片中的表達(dá)情況，圖2A中的右圖是GhJAZ1在根中的表達(dá)情況)；圖2B為200mMNaCl處理下葉片和根中GhJAZ1的表達(dá)分析(其中：圖2B中的左圖是GhJAZ1在葉片中的表達(dá)情況，圖2B中的右圖是GhJAZ1在根中的表達(dá)情況)；圖2C為4℃冷處理下葉片和根中GhJAZ1的表達(dá)分析(其中：圖2C中的左圖是GhJAZ1在葉片中的表達(dá)情況，圖2C中的右圖是GhJAZ1在根中的表達(dá)情況)；圖2D為脫落酸(ABA)處理下葉片和根中GhJAZ1的表達(dá)分析(其中：圖2D中的左圖是GhJAZ1在葉片中的表達(dá)情況，圖2D中的右圖是GhJAZ1在根中的表達(dá)情況)；圖2E為100uM過氧化氫(H2O2)和茉莉酸(MeJA)處理下葉片中GhJAZ1的表達(dá)分析(其中：圖2E中的左圖是GhJAZ1在100uM過氧化氫(H2O2)處理棉花幼苗葉片中的表達(dá)情況，圖2E中的右圖是GhJAZ1在茉莉酸(MeJA)處理棉花幼苗葉片中的表達(dá)情況)。表達(dá)分析結(jié)果表明，GhJAZ1基因受PEG、NaCl、ABA、H2O2和MeJA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，受4℃低溫處理先下調(diào)和后上調(diào)表達(dá)。圖3：構(gòu)建超表達(dá)載體和干涉表達(dá)載體所用的相關(guān)載體圖。附圖標(biāo)記說明：圖3A為本發(fā)明構(gòu)建的超量表達(dá)載體所用的pK2GW7.0載體示意圖。圖3B為構(gòu)建的目標(biāo)基因超量表達(dá)載體pK2GW7.0-GhJAZ1的示意圖。圖3C為BP反應(yīng)的中間載體pDONRTM221示意圖。圖3D為本發(fā)明構(gòu)建的干涉表達(dá)載體所用的pHELLSGATE4(或稱pHellsgate4-JAZ1)載體示意圖。圖4：利用RT-PCR方法檢測超表達(dá)和干涉表達(dá)GhJAZ1轉(zhuǎn)基因株系葉片中GhJAZ1表達(dá)分析。附圖標(biāo)記說明：圖4的上圖泳道為GhJAZ1基因表達(dá)量檢測，圖4的下圖泳道為棉花內(nèi)參基因UB7表達(dá)量檢測；J39和J92是GhJAZ1超表達(dá)材料，YZ1為對(duì)照材料，JR3和JR13為GhJAZ1干涉株系。圖5：超表達(dá)GhJAZ1基因能夠提高苗期陸地棉對(duì)低溫脅迫的耐受性。附圖標(biāo)記說明：圖5A為苗期轉(zhuǎn)基因株系4℃低溫處理的表型鑒定，幼苗生長環(huán)境為常用的霍格蘭營養(yǎng)液，其中圖5A的上中下三幅圖分別為處理前、低溫處理25小時(shí)和處理后恢復(fù)5天拍照?qǐng)D片，左起前兩個(gè)為超量表達(dá)系J39和J92，第三個(gè)為轉(zhuǎn)基因受體YZ1(即對(duì)照，CK)，后兩個(gè)為干涉表達(dá)系JR3和JR13。圖5B為8℃低溫處理25天大轉(zhuǎn)基因棉花幼苗表型，幼苗生長環(huán)境為常規(guī)營養(yǎng)土栽培，圖5B的上下兩幅圖分別為8℃低溫處理兩天后的表型和處理后進(jìn)行 一天恢復(fù)的表型，左起前兩個(gè)為超量表達(dá)系J39和J92，第三個(gè)為轉(zhuǎn)基因受體YZ1(即對(duì)照，CK)，后兩個(gè)為干涉表達(dá)系JR3和JR13。圖5C為8℃低溫處理兩天恢復(fù)一天后，相對(duì)離子滲出率和總?cè)~綠素含量測定結(jié)果。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明克隆包含有GhJAZ1基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗(yàn)證GhJAZ1基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實(shí)施例1GhJAZ1基因的分離克隆及表達(dá)模式分析A.RNA的提取及cDNA的獲得GhJAZ1基因ORF、蛋白序列及保守結(jié)構(gòu)域均在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查詢得到。從豫早1號(hào)陸地棉(YZ1)植株葉片中提取總RNA，提取總RNA的方法參照Zhuetal(2005)報(bào)道的方法，取2ugRNA樣品，利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅢ(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：65℃5min，50℃60min，70℃10min。B.GhJAZ1基因全長序列的獲得根據(jù)查詢得到的GhJAZ1基因ORF序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增該基因引物GhJAZ1-F(5'-GAGCAAATAGTTGGGATTCTGG-3')和GhJAZ1-R(5'-AACTCGGCTGGGACTACTAC-3')，以棉花YZ1葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司，美國)，篩選陽性克隆并測序，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。其CDS序列為SEQIDNO:1中1-792bp所示的序列，其表達(dá)的蛋白的氨基酸見SEQIDNO:1中1-792位堿基對(duì)應(yīng)的序列，其蛋白質(zhì)序列見SEQIDNO:2所示的序列。C.GhJAZ1的基因的組織表達(dá)分析及逆境/激素誘導(dǎo)表達(dá)分析以豫早1號(hào)陸地棉(YZ1)為材料，提取PEG、NaCl、ABA和冷處理不同時(shí)間點(diǎn)根和葉片各樣品的RNA(提取方法參考本發(fā)明的上述方法)，選取的PEG、NaCl和4℃冷處理的時(shí)間點(diǎn)分別是0h，1h，4h，8h，ABA處理的時(shí)間點(diǎn)分別是1h，2h和4h，H2O2處理時(shí)間點(diǎn)為0h，1h，3h和5h，MeJA處理時(shí)間點(diǎn)為0h，3h和12h，以正常生長的YZ1選取相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)作平行對(duì)照。利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptⅢ(購自Invitrogen公司，美國)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：65℃5min，50℃60min，70℃10min。以上述反轉(zhuǎn)合成的cDNA為模板，采用Real-timePCR檢測GhJAZ1的表達(dá)水平，所用引物為：GhJAZ1-QRT-F：(5'-ATCTGCTCAGCGACCCATTCC-3')和GhJAZ1-QRT-R：5'-(GAGATTGAGCAGCCAAACCGA-3')。同時(shí)用引物GhUbiquitin7-F：(5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3')和GhUbiquitin7-R：(5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3')對(duì)棉花基因做特異擴(kuò)增，作為內(nèi)參對(duì)照進(jìn)行相對(duì)定量分析。定量PCR儀型號(hào)為ABI7500，定量PCR試劑購自Bio-Rad公司。PCR反應(yīng)體系(總體積為20μl)包括：10μl稀釋后的cDNA(等于20ng起始總RNA)，10μl2×PCRMasterMix，200nM的引物。反應(yīng)條件為：95℃30 sec；95℃5sec，58℃35sec，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果表明：該基因受PEG模擬的干旱、鹽(NaCl)，低溫(4℃)，脫落酸(ABA)，茉莉酸(JA)和活性氧(H2O2)等處理的誘導(dǎo)表達(dá)(見圖2)。實(shí)施例2：GhJAZ1基因植物超量表達(dá)載體和干涉表達(dá)載體的構(gòu)建A.超量表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)得到的基因序列，設(shè)計(jì)帶BP-LR反應(yīng)的接頭的引物用于構(gòu)建表達(dá)載體，引物序列分別為OE-GhJAZ1-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGAGCAAATAGTTGGGATTCTGG-3’)和OE-GhJAZ1-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAACTCGGCTGGGACTACTAC-3’)，以T-GhJAZ1質(zhì)粒(購自Promega公司，美國)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到兩端帶有BP-LR反應(yīng)的接頭堿基的包含完整ORF的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP反應(yīng)連接至pDONRTM221載體上(BP酶購自Invitrogen公司，美國，室溫反應(yīng)4小時(shí)，pDONRTM221載體圖見圖3C，pDONRTM221載體來源于CSIROPlantIndustry，澳大利亞)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10，10-12小時(shí)后挑取單克隆進(jìn)行PCR陽性檢測，引物選用M13-F通用引物(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCAAAAATGATGATCGGAGA-3’)和OE-GhJAZ1-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAACTCGGCTGGGACTACTAC-3’)，陽性單克隆活化提取質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。再用LR反應(yīng)(Invitrogen)將GhJAZ1基因連接至植物表達(dá)載體pK2GW7.0(其中：LR酶購自Invitrogen公司，美國；室溫反應(yīng)4小時(shí)，pK2GW7.0載體圖譜見圖3A；中間載體pK2GW7.0來自根特大學(xué)，比利時(shí))，用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10。10-12小時(shí)后挑取單克隆進(jìn)行PCR陽性檢測，引物選用35S-F(5’-CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3’)和OE-GhJAZ1-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAACTCGGCTGGGACTACTAC-3’)，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。陽性單克隆活化提取質(zhì)粒，即為獲得用于轉(zhuǎn)化的超表達(dá)質(zhì)粒pK2GW7.0-GhJAZ1。B.干涉表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)得到的SEQIDNO:1序列設(shè)計(jì)引物用于構(gòu)建非保守區(qū)干涉表達(dá)載體，在引物兩端分別加上BP-LR反應(yīng)的接頭堿基，引物序列分別為RNAi-GhJAZ1-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGGTTCTTCAGTGGAGCCT-3’)和RNAi-GhJAZ1-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATGCTGTGGAGTTACTTATCTGGT-3’)，以T-GhJAZ1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到兩端帶attB接頭的的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP反應(yīng)將GhJAZ1干涉片段連接至植物表達(dá)載體pHELLSGATE4(其中：BP酶購自Invitrogen公司，美國；室溫反應(yīng)4小時(shí)，載體圖譜見圖3D；中間載體pHELLSGATE4由CSIROPlantIndustry惠贈(zèng)，澳大利亞)，用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10。以35S-F(5’-CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3’)和RNAi-GhJAZ1-R(5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATGCTGTGGAGTTACTTATCTGGT-3’)對(duì)挑取的單克隆進(jìn)行PCR檢測，陽性單克隆活化提取質(zhì)粒。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。陽性質(zhì)粒分別用xbaI和xhoI進(jìn)行單酶切檢測(xbaI和xhoI均購自NewEnglandBiolabs公司，美國，37℃酶切5小時(shí))，酶切產(chǎn)物跑膠檢測，帶型正確的質(zhì)粒確定為構(gòu)建正確的干涉表達(dá)載體質(zhì)粒pHELLSGATE4-GhJAZ1(即圖3D所示的pHellsgate4-JAZ1載體質(zhì)粒)。C.載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將構(gòu)建的pK2GW7.0-GhJAZ1載體和干涉表達(dá)載體pHELLSGATE4-GhJAZ1轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，挑取單克隆菌落接于含100mg/L壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中于150rpm，28℃搖24h，分別用特異引物對(duì)菌液進(jìn)行陽性檢測(pK2GW7.0-GhJAZ1載體檢測引物為OE-GhJAZ1-F和OE-GhJAZ1-R(所述的引物序列見實(shí)施例2)，pHELLSGATE4-GhJAZ1載體檢測引物為RNAi-GhJAZ1-F和RNAi-GhJAZ1-R，所述的引物序列見實(shí)施例2)，陽性菌液按菌液：新鮮LB：40％甘油體積比為3:3:2加入2mL離心管中混勻，-70℃保存。再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化棉花下胚軸。以上及以下所述的LB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L；用5mMNaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH＝7.2；用蒸餾水定容至1L；在121-125℃高壓蒸汽下滅菌15-20min。LB固體培養(yǎng)基需每升另外加入8g瓊脂。實(shí)施例3GhJAZ1基因的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定A.棉花下胚軸的準(zhǔn)備供試材料為豫早1號(hào)陸地棉(YZ1),選擇飽滿一致YZ1種子，剝?nèi)シN皮，用0.1％升汞溶液殺菌10-12min，期間不斷搖動(dòng)，再用無菌水沖洗種子3次，將種子置于MS培養(yǎng)基表面。30℃暗培養(yǎng)1天后扶苗，繼續(xù)暗培養(yǎng)4-5天。B.農(nóng)桿菌的活化從超低溫冰箱內(nèi)取出保存的含有目標(biāo)基因(即本發(fā)明克隆的GhJAZ1基因)的EHA105菌株的甘油管在冰上融化，接10μl于2ml含100mg/L壯觀霉素的LB液體中，28℃震蕩培養(yǎng)1天，活化好的菌液接20ul與15-20ml含100mg/L壯觀霉素的新鮮LB液體中，28℃震蕩培養(yǎng)過夜，吸取1ml渾濁菌液于2ml無菌離心管8000-10000rpm離心30s集菌，用20ml含50mg/L乙酰丁香酮(AS)的MGL培養(yǎng)基(具體成分見后描述)重新懸浮菌體，28℃振蕩培養(yǎng)30-40min，用于侵染下胚軸。YZ1下胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的再生農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花下胚軸的轉(zhuǎn)化方法和程序參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室金雙俠(金雙俠2006，http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10504-2006190162.htm)報(bào)道的方法。具體步驟如下：(1)每次取15-20株無菌苗下胚軸切成0.5-0.8cm小段接入50ml無菌錐形瓶，加入活化好的含有目標(biāo)載體pK2GW7.0-GhJAZ1和pHELLSGATE4-GhJAZ1的EHA105農(nóng)桿菌菌液侵染10min，期間搖動(dòng)數(shù)次；(2)倒去菌液，將下胚軸置于無菌濾紙上吸干表面菌液，置于超凈工作臺(tái)吹10-15min后接入不含抗生素2，4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具體成分見后面描述)上，在19℃黑暗條件下共培養(yǎng)48-60h；(3)共培養(yǎng)結(jié)束后將下胚軸切段接入含卡那霉素(100mg/L)和頭孢霉素(100mg/L)2，4D誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具體成分見后面描述)，在28℃弱光下培養(yǎng)；(4)3周后轉(zhuǎn)入含抗生素吲哚丁酸(IBA)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(具體成分見后面描述)連續(xù)繼代至出現(xiàn)胚性愈傷；(5)將胚性愈傷陸續(xù)接入胚分化培養(yǎng)基(具體成分見后面描述)繼代至體細(xì)胞胚成熟，將成熟的子葉胚接入生根培養(yǎng)基(具體成分見后面描述)上萌發(fā)、直至獲得完整植株。本實(shí)施例中所用的MGL培養(yǎng)基：胰蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O0.1g/L，KH2PO40.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1g/L，用蒸餾水補(bǔ)充至1L。2，4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2,4-D0.1mg/L，細(xì)胞激動(dòng)素(KT)0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel2.5g/L，用蒸餾水補(bǔ)充至1L。調(diào)pH至5.9。IBA誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加IBA0.5mg/L，KT0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Phytagel2.5g/L，用蒸餾水補(bǔ)充至1L。調(diào)pH至5.9。胚分化培養(yǎng)基：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1.9g/LKNO3，KT0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gln1.0g/L，Asn0.5g/L，Phytagel2.5g/L，用蒸餾水補(bǔ)充至1L。調(diào)pH至5.9。生根培養(yǎng)基：以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加葡萄糖15g/L，Phytagel2.5g/L，用蒸餾水補(bǔ)充至1L。調(diào)pH為5.9。上述培養(yǎng)基配方中所述的基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基配方為:大量元素(KNO31.9g/L，NH4NO31.65g/L，KH2PO40.17g/L，MgSO4·7H2O0.37g/L，CaCl2·2H2O0.44g/L)，微量元素(KI0.83mg/L，H3BO36.2mg/LMnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，CoCl20.025mg/L)，鐵鹽(Na2·EDTA37.3mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2027.8mg/L)，有機(jī)成分(肌醇100mg/L，Gly2mg/L，VB10.1mg/L，VB60.5mg/L，VB50.5mg/L)。C.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定(1)轉(zhuǎn)基因植株陽性檢測及純系檢測提取轉(zhuǎn)基因植株幼嫩葉片的基因組DNA，DNA抽提采用天根生化(北京)科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取(具體操作步驟見該試劑盒的說明書)，以35s啟動(dòng)子正向引物35s-S(5’-CCACTATCCTTCGCAAGACCCT-3’)和目的基因GhJAZ1反向引物RNAi-GhJAZ1-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGATGCTGTGGAGTTACTTATCTGGT-3’)進(jìn)行PCR檢測是否有相應(yīng)T-DNA插入。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。將收取的T1代的種子剝?nèi)シN皮，用0.1％升汞溶液殺菌10-12min，期間不斷搖動(dòng)，用無菌水沖洗3次，將種子置于棉花無菌苗培養(yǎng)基(含100mg/L卡那霉素)表面。30℃暗培養(yǎng)1天后扶苗，轉(zhuǎn)移至光照室(3000Lux，15h光照/9h黑暗)培養(yǎng)，5-6天觀察是否有抗性分離(長側(cè)根植株鑒定為陽性轉(zhuǎn)基因植株)。之后每一代單株留自交種進(jìn)行篩選直至不發(fā)生抗性分離的即為轉(zhuǎn)基因純系，用作下一步表型分析和功能鑒定。(2)轉(zhuǎn)基因RNA水平檢測取T3代轉(zhuǎn)基因棉花植株主莖倒一葉提取RNA，RNA的抽提用本實(shí)驗(yàn)室改良的異硫氰酸胍法(朱龍付et al.2005)。cDNA的合成是以2μg總RNA為模版，與1μl500μg/mloligo-dT(15)引物(購自Promega公司)，DEPC-water混合，總體積為14μl；然后70℃變性5min冰上驟冷；再加入10μl含有5μlRTbuffer，1.25μl10mMdNTP，1.75μlDEPC-water，1μlRibonucleaseInhibitor(購自Promega公司，美國)，和1μlSuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶(購自Invitrogen公司，美國)的混合液；42℃溫浴1h合成第一鏈；反應(yīng)結(jié)束后70℃處理15min使SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶失活。每份cDNA稀釋到200μl后于-20℃保存待用。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物GhJAZ1-QRT-S(5’-AGCTAATGAGACTCCCGAGATGC-3’)和GhJAZ1-QRT-AS(5’-GAGGCTCCACTGAAGAACCCA-3’)進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長203bp)。同時(shí)用GhUbiquitin7-QRT-S(5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’)和GhUbiquitin7-QRT-AS(5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’)對(duì)棉花GhUbiquitin7(GenBank登陸號(hào)：DQ116441)基因做特異擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長198bp)，作為內(nèi)參對(duì)照進(jìn)行相對(duì)定量分析。PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，cDNA模板1ul、10×Taq酶反應(yīng)緩沖液2μl、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物0.2ul、0.3單位Taq酶0.2μl，加ddH2O至20μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min，94℃30s、53℃30s、72℃30s34個(gè)循環(huán)(GhJAZ1)或28個(gè)循環(huán)(GhUbiquitin7)，72℃延伸5min。獲得的PCR產(chǎn)物取10μl以0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明：本發(fā)明克隆的GhJAZ1基因在不同轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量有差異。后續(xù)的功能驗(yàn)證研究中選取具有合適表達(dá)量的超量表達(dá)系J39和J92以及干涉系JR3和JR13來進(jìn)行分析(見圖4)。實(shí)施例4：利用轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)GhJAZ1基因進(jìn)行功能驗(yàn)證具體步驟如下：A.低溫處理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)棉花抗低溫鑒定采用人工氣候箱模擬低溫環(huán)境對(duì)棉花材料進(jìn)行鑒定，低溫環(huán)境設(shè)置為8℃。選取表達(dá)量穩(wěn)定且符合要求的轉(zhuǎn)基因材料以及對(duì)照，干涉和超表達(dá)材料各選取兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)株系(干涉：JR3，JR13；超表達(dá)：J39，J92)，每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)株系選取8株長勢相同兩葉一心時(shí)期的幼苗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置三次生物學(xué)重復(fù)。在處理過程中及時(shí)記錄植株表型(如葉片萎蔫程度)，處理一天后對(duì)材料進(jìn)行室溫恢復(fù)，對(duì)葉片萎蔫枯死情況進(jìn)行拍照。另外，設(shè)計(jì)取樣實(shí)驗(yàn)，當(dāng)棉花幼苗長至兩葉一心時(shí)，選取長勢一致的幼苗進(jìn)行低溫處理，設(shè)置0h、1h、3h、6h、12h、24h六個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，樣品選取完全伸展開的兩片真葉，兩個(gè)植株為一個(gè)樣，設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品用于相關(guān)生理指標(biāo)的測量，如丙二醛、脯氨酸、葉片可溶性糖和游離脯氨酸、葉片細(xì)胞膜離子滲漏率、超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性等，確定轉(zhuǎn)基因材料的對(duì)低溫脅迫的耐受性。B.GhJAZ1轉(zhuǎn)基因植株和YZ1植株低溫處理后生理指標(biāo)的測定1)相對(duì)電導(dǎo)率測定(葉片細(xì)胞膜離子滲漏)植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要的作用。在正常情況下，細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)具有選擇透性能力。當(dāng)植物受到逆境影響時(shí)，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，以致植物細(xì)胞浸提液的電導(dǎo)率增大。膜透性增大的程度與逆境脅迫強(qiáng)度有關(guān)，也與植物抗逆性的強(qiáng)弱有關(guān)。因此，電導(dǎo)法目前已成為作物抗性栽培、育種上鑒定植物抗逆性強(qiáng)弱的一個(gè)精確而實(shí)用的方法。對(duì)GhJAZ1不同的轉(zhuǎn)基因株系分別取低溫處理后倒一葉，用雙蒸水沖洗3次，以吸水紙輕輕吸干葉片表面水分，將葉片置于15ml雙蒸水沖洗干凈并干燥后的離心管中，加入10ml雙蒸水，在真空干燥器中于0.05MPa下抽氣20min，25℃下緩慢振蕩2h，然后測定電導(dǎo)率S1，同時(shí)測定水的空白電導(dǎo)率C1，再將樣品在沸水浴中處理20min，冷卻至室溫后測定電導(dǎo)率S2，以相同方式處理水，測定其空白電導(dǎo)率C2。離子滲漏＝(S1-C1)/(S2-C2)*100％。從處理后不同株系的葉片細(xì)胞膜離子滲漏看，超表達(dá)株系較對(duì)照和干涉株系具有較低的離子滲漏(見圖5C)，說明超表達(dá)GhJAZ1基因可以提高棉花植株對(duì)低溫脅迫的耐受性。2)葉綠素含量的測定低溫可以抑制葉綠素合成有關(guān)酶的活性以及影響根系對(duì)N、Mg等礦質(zhì)元素的吸收，從而影響葉綠素的生物合成；低溫可能改變?nèi)~綠體的超微結(jié)構(gòu)打破了葉綠素酶與其底物葉綠素在空間位置上的隔離從而促進(jìn)了葉綠素的分解；也可能通過影響某些同工酶的活性來影響葉綠素的合成和降解。低溫也可能誘導(dǎo)產(chǎn)生了衰老促進(jìn)劑，使葉綠素酶的活性增加促進(jìn)葉綠素的分解。不同的植物、植物的不同部位的葉片，低溫對(duì)葉綠素含量的影響有差異。對(duì)GhJAZ1不同的轉(zhuǎn)基因株系分別取低溫處理后倒二葉，整葉片取樣，液氮磨碎加入1.3ml80％丙酮萃取過夜，用酶標(biāo)儀在波長663nm和645nm下分別測定樣品吸光度。葉綠素Ca＝12.72A663–2.59A645，葉綠素Cb＝22.88A645–4.67A663，葉綠素總量CT＝Ca+Cb。從處理后不同株系的葉片葉綠素總含量看，超表達(dá)株系較對(duì)照和干涉株系具有高的葉綠素總含量(見圖5D)，說明葉綠素的含量受低溫影響較對(duì)照及干涉株系影響較小。3)丙二醛(MDA)含量的測定植物器官衰老或在非生物逆境條件下，膜脂發(fā)生過氧化作用，丙二醛是其中的產(chǎn)物之一，通常利用它作為膜脂過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。對(duì)8℃低溫處理3h和未處理對(duì)照植株葉片進(jìn)行丙二醛含量測定。稱取0.1g左右的葉片，剪碎后加10％三氯乙酸(TCA)1mL，用預(yù)冷的研缽置于冰上研磨至勻漿狀，倒入2mL離心管中。在3000rpm/min下離心10min，取上清液0.4mL至新的2mL的離心管中，向其中加入0.67％硫代巴比妥酸(TBA)0.4mL，混合后在100℃沸水中煮30min，冷卻后再離心一次。用酶標(biāo)儀測定上清液在450nm、532nm和600nm處的吸光度值。并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮重組織中的MDA含量(μmol/g)。結(jié)果計(jì)算按公式：C/μmol/L＝6.45(A532-A600)*(V1*V)/(V2*W)。其中V1為反應(yīng)液總量，V2為反應(yīng)中提取液量，V為提取液總量，W為樣品質(zhì)量。最終結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫處理的樣品導(dǎo)致膜脂過氧化，超表達(dá)系的膜脂過氧化程度在正常情況和低溫脅迫下明顯低于干涉系和對(duì)照(見圖5E)。參考文獻(xiàn)Chinnusamy,V.,Zhu,J.andZhu,J.K.Coldstressregulationofgeneexpressioninplants.Trendsinplantscience，2007，12:444-451.DanZhu,RongtianLi,XinLiu,MingzheSun,JingWu,NingZhang,etal.ThePositiveRegulatoryRolesoftheTIFY10ProteinsinPlantResponsestoAlkalineStress.PloSone，2014，9:1-16.Hou,X.,Lee,L.Y.,Xia,K.,Yan,Y.andYu,H.DELLAsmodulatejasmonatesignalingviacompetitivebindingtoJAZs.Developmentalcell，2010，19:884-894.Hu,Y.,Jiang,L.,Wang,F.andYu,D.Jasmonateregulatestheinducerofcbfexpression-C-repeatbindingfactor/DREbindingfactor1cascadeandfreezingtoleranceinArabidopsis.ThePlantcell，2013，25:2907-2924.Kakani,V.G.,Reddy,K.R.,Koti,S.,Wallace,T.P.,Prasad,P.V.,Reddy,V.R.,etal.Differencesininvitropollengerminationandpollentubegrowthofcottoncultivarsinresponsetohightemperature.Annalsofbotany，2005，96:59-67.Pauwels,L.andGoossens,A.TheJAZproteins:acrucialinterfaceinthejasmonatesignalingcascade.ThePlantcell，2011，23:3089-3100.Song,S.,Qi,T.,Huang,H.,Ren,Q.,Wu,D.,Chang,C.,etal.TheJasmonate-ZIMdomainproteinsinteractwiththeR2R3-MYBtranscriptionfactorsMYB21andMYB24toaffectJasmonate-regulatedstamendevelopmentinArabidopsis.ThePlantcell，2011，23:1000-1013.Wen,J.Q.,Oono,K.andImai,R.Twonovelmitogen-activatedproteinsignalingcomponents,OsMEK1andOsMAP1,areinvolvedinamoderatelow-temperaturesignalingpathwayinrice.Plantphysiology，2002，129:1880-1891.Zhu,D.,Cai,H.,Luo,X.,Bai,X.,Deyholos,M.K.,Chen,Q.,etal.Over-expressionofanovelJAZfamilygenefromGlycinesoja,increasessaltandalkalistresstolerance.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications，2012，26:273-279.ZHULong-fu,HEXin,YUANDao-jun,XULian,XULi,TULi-li,SHENGuo-xin,ZHANGHong,ZHANGXian-long.Genome-WideIdentificationofGenesResponsivetoABAandCold/SaltStressesinGossypiumhirsutumbyData-MiningandExpressionPatternAnalysis.AgriculturalSciencesinChina,2011,10(4):499-508ZhuL-F,TuL-L,ZengF-C,LiuD-Q,ZhangX-L，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.作物學(xué)報(bào)，2005，31:1657-1659金雙俠，棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及突變體的創(chuàng)制，2006，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館，武漢.孫程，玉米TIFY家族ZmJAZ14基因的功能驗(yàn)證.2013中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.辛慧慧等，低溫脅迫下棉花幼苗對(duì)外源水楊酸的生理響應(yīng).植物生理學(xué)報(bào)，2014:660-664.朱龍付等，一種適合于cDNA文庫構(gòu)建的高質(zhì)量棉花RNA的簡單抽提法(英文).作物學(xué)報(bào)，2005:1657-1659。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3