本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)與南方根結(jié)線蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因Misp12的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)是一類嚴(yán)重為害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的植物寄生線蟲，適應(yīng)性強(qiáng)，傳播途徑多樣，可寄生5000多種植物，危害植物根部形成根結(jié)，可導(dǎo)致全球作物的重大經(jīng)濟(jì)損失(Blok et al.,2008)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年僅對(duì)果樹和蔬菜產(chǎn)業(yè)造成的損失高達(dá)700億美元(Caboni P et al.,2012)。同時(shí)，根結(jié)線蟲的為害又加重了枯萎病、根腐病等土傳性真菌病害和部分細(xì)菌病害的發(fā)生，增加和擴(kuò)大了病毒病的發(fā)生。在我國(guó)各地區(qū)的溫室內(nèi)，南方根線蟲是當(dāng)前經(jīng)濟(jì)型蔬菜生產(chǎn)，特別是番茄、辣椒、黃瓜、茄子等主要蔬菜上的重大危害之一(李林等，2004)。傳統(tǒng)的防治方法包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治和物理防治,但均有其各自的弊端(Abawi GS，Widmer T L,2010)。近年來，利用RNA干擾(RNA interfer ence,RNAi)技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行遺傳改良提高抗病蟲害能力在生產(chǎn)上已經(jīng)有所應(yīng)用，如防治番木瓜環(huán)斑病毒病。RNAi現(xiàn)象于1995年首次在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)(Guo S et al.,1995)，雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后被切割成21～23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈，在其他作用因子的參與下能夠特異的與其同源的mRNA結(jié)合并導(dǎo)致該同源mRNA降解，從而使得內(nèi)源基因沉默。

RNAi技術(shù)同時(shí)被證明是一種比較具有潛力的植物病原線蟲防治方法，但在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中還未見報(bào)道。分離和鑒定線蟲中適合作為RNAi的靶標(biāo)基因，是實(shí)現(xiàn)線蟲基因有效沉默，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)線蟲病害防治的關(guān)鍵之一。同時(shí)，在RNAi過程中為避免脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致非靶標(biāo)基因如植物基因的沉默，選擇的靶標(biāo)基因需要高度保守。較為理想的靶標(biāo)基應(yīng)為在其它物種中無(wú)同源基因。此外，選擇的靶標(biāo)基因應(yīng)為重要的功能基因，即將其沉默后對(duì)線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育寄生等能造成顯著影響。南方根結(jié)線蟲(M.incognita)線蟲基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的公布，為利用RNAi技術(shù)提供植物抗線蟲能力的研究創(chuàng)建了平臺(tái)。

本發(fā)明通過生物信息學(xué)方法篩選到候選基因Misp12，該基因在南方根結(jié)線蟲成熟時(shí)期在食道腺細(xì)胞中高量表達(dá)，采用RACE PCR和基因組PCR技術(shù)克隆了該基因。該基因通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus Induce Gene Slice，VIGS)的方法轉(zhuǎn)入本氏煙草中(Nicotia na benthamiana)，發(fā)現(xiàn)沉默該基因后線蟲的總侵染量相對(duì)與病毒空白對(duì)照明顯下降，而且成熟的雌蟲數(shù)相比與其他齡期線蟲下降的數(shù)量尤其明顯。

申請(qǐng)者在現(xiàn)有的專利和非專利文獻(xiàn)中檢索，結(jié)果表明Misp12尚為功能未知的基因，并且在其它物種中沒有檢索到其相關(guān)同源基因。即該基因?yàn)槟戏礁Y(jié)線蟲中特異存在的重要功能基因，因此為一個(gè)理想的基因沉默靶標(biāo)位點(diǎn)。因而詳細(xì)研究基因Misp12，不僅可以作為RNAi技術(shù)控制南方根結(jié)線蟲的一個(gè)理想的安全靶標(biāo)位點(diǎn)，同時(shí)也可為研究線蟲與寄主植物寄生關(guān)系的研究提供參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)重要功能基因Misp12，其序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)重要功能基因Misp12的應(yīng)用，利用該基因在可提高植物抗南方根結(jié)線蟲能力中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

申請(qǐng)人通過基因克隆技術(shù)，從南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)中分離克隆獲得一個(gè)可能與生長(zhǎng)發(fā)育和寄生相關(guān)的特異基因及其編碼的蛋白，申請(qǐng)人將該基因命名為Misp12。

所述的Misp12基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它的編碼區(qū)域(C DS)編碼區(qū)位于SEQ ID NO:1的5’端第74位至523為堿基之間，它編碼的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)重要功能基因Misp12在提高植物抗南方根結(jié)線蟲中的應(yīng)用，

包括將基因Misp12通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus Induce Gene Slice，VIGS)方法，沉默該基因后線蟲的總侵染量相對(duì)與空白對(duì)照明顯下降，而且成熟的雌蟲數(shù)相比與其它齡期線蟲下降的數(shù)量尤其明顯。

包括利用沉默Misp12，減少線蟲入侵量并能控制雌蟲成熟數(shù)量，從而達(dá)到減少下一次入侵的作用；

包括利用沉默Misp12，在分子水平探討南方根結(jié)線蟲與寄主植物之間的互作關(guān)系和模式；

包括利用Misp12為線索，在南方根結(jié)線蟲中鑒定其參與的信號(hào)途徑，從而鑒定出更多的候選線蟲基因沉默靶標(biāo)；

還包括利用Misp12為開發(fā)新型的防治線蟲藥劑提供參考依據(jù)。即利用Misp12作為靶標(biāo) 蛋白研制針對(duì)該靶標(biāo)的藥劑從而控制線蟲數(shù)量。

更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實(shí)施方式》所述。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

Misp12基因作為靶基因，能直接減少線蟲的雌蟲數(shù)量，達(dá)到減少下一次入侵?jǐn)?shù)量，達(dá)到防治目的；靶標(biāo)基因Misp12高度保守，無(wú)其它同源基因，環(huán)保安全且避免脫靶效應(yīng)。

附圖說明

圖1本發(fā)明鑒定和分離克隆南方根結(jié)線蟲發(fā)育致病相關(guān)基因Misp12及驗(yàn)證Misp12基因功能的流程圖。

圖2為通過原位雜交方法Misp12在南方根結(jié)線蟲的表達(dá)定位示意圖。

其中圖2A為正向引物探針；圖2B為反向引物探針。

圖3通過pEGAD載體轉(zhuǎn)化Misp12基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位。

其中圖3A為Misp12帶有信號(hào)肽序列(Misp12::sp)的明場(chǎng)和暗場(chǎng)；圖3B為Misp12去除信號(hào)肽序列(Misp12::Δsp)的明場(chǎng)和暗場(chǎng)

圖4Misp12蛋白在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物信息學(xué)分析。

圖5基因Misp12在各齡期線蟲中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。

圖6基因Misp12沉默不同天數(shù)后線蟲中Misp12的表達(dá)量。

圖7通過VIGS方法將線蟲基因Misp12沉默后植物線蟲的入侵量。

其中圖7A為每株處理的入侵線蟲總數(shù)。圖7B為每株處理的各齡期線蟲的數(shù)量。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例予以進(jìn)一步說明，但并非對(duì)本發(fā)明的限制。

以下具體實(shí)施例，除非特別說明，所有培養(yǎng)基及無(wú)菌試驗(yàn)用品均采用常規(guī)的高壓蒸汽法滅菌(121℃，高壓滅菌30min)，并于室溫存放。除非特別說明，所有限制性內(nèi)切酶及聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

實(shí)施例1：

南方根結(jié)線蟲發(fā)育致病相關(guān)基因Misp12的克隆

申請(qǐng)人通過生物信息技術(shù)分析對(duì)比南方根結(jié)線蟲基因組數(shù)據(jù)和蛋白組數(shù)據(jù)得到候選分泌蛋白序列，通過分子生物學(xué)技術(shù)分離克隆到基因Misp12。通過基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Misp12在南方根結(jié)線蟲高度特異和保守，在其它動(dòng)植物及真菌細(xì)菌中都無(wú)相關(guān)同源基因；經(jīng)基因表達(dá)動(dòng)態(tài)和VIGS方法沉默分析基因Misp12與南方根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程可能相關(guān)，并具有重要作用(圖1)。

1.1南方根結(jié)線蟲基因組和蛋白組數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

通過NCBI下載南方根結(jié)線蟲基因組和蛋白組數(shù)據(jù)(http://meloidogyne.toulouse.inra.fr)。利用SignalP 3.0和THMM2.0分析其蛋白組的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)得到分泌組蛋白質(zhì)，再利用各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(包括Genebank和Swissprot等數(shù)據(jù)庫(kù))篩選其中南方根結(jié)線蟲所特有的基因和蛋白質(zhì)，從而得到候選分泌蛋白。

1.2候選基因Misp12的克隆

1.2.1RACE技術(shù)和基因組PCR獲得Misp12基因全長(zhǎng)cDNA序列

將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的含有南方根結(jié)線蟲的番茄根系清洗干凈后，通過攪拌機(jī)攪拌30s后，分別通過100目，200目，375目和500目線蟲篩，收集375目和500目線蟲篩上的根結(jié)線蟲。采用TRIzol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)提取南方根結(jié)線蟲的RNA。具體步驟如下：大約10000條蟲體加入1ml TRIzol試劑的比例加入提取液，混勻后放置于液氨冷凍30s，然后37℃中溶解1min，反復(fù)凍融4次后混勻。加入200μl氯仿，劇烈搖動(dòng)15s，在冰中放置10min；然后4℃12000r/min離心15min，取上清液移至一新的DEPC處理過的Eppendorf管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后于-20℃放置30min以上；4℃12000r/min離心15min，沉淀RNA；移去上清液后，加入1ml 70％乙醇洗滌RNA沉淀2次，洗滌時(shí)充分懸浮RNA沉淀，4℃12000r/min離心5min；棄上清后，RNA沉淀于空氣中自然干燥1min；以DEPC-H₂O于室溫溶解RNA沉淀；分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度；然后以DNAase I除去南方根結(jié)線蟲RNA樣品中的DNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

采用蛋白酶K法提取線蟲DNA。具體步驟如下：將10000條線蟲放入離心管中液氮速凍30s后用少量SiO₂研磨后加入700μl的10X PCR buffer和5μl的20mg/ml蛋白酶K混勻后65℃水浴1h，95℃水浴10min；加入等體積的PCI(酚:氯仿:異戊醇＝25:24:1)輕輕混勻，4℃12000r/min離心10min；取上清液移至新的滅菌Eppendorf管中加入等量的CI(氯仿:異戊醇＝24:1)輕輕混勻，4℃12000r/min離心10min；取上清液移至新的滅菌Eppendorf管中加入1/10體積的3M NaAc(pH 5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇混勻后于-20℃放置2h以上；12000r/min離心10min，沉淀DNA；移去上清，加入1ml 70％乙醇洗滌DNA沉淀2次；棄上清后，DNA沉淀于空氣中自然干燥后用滅菌ddH₂O于室溫溶解沉淀。

采用RACE策略，以QT引物(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，根據(jù)預(yù)測(cè)的候選基因Misp12的序列設(shè)計(jì)的2個(gè)特異引物(SP1：5’-CGGATACCAAGGAAAATAAC-3’；SP2：5’-CGGTGATGAGGTGTTATGTATGG-3’)和2個(gè)接頭引物(RACE1：5’-CCAGTGAGCAGAGT GACG-3’；RACE2：5’-ACTCACTATAGGAAGCTGCG-3’)進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得了420bp的DNA片段，對(duì)克隆到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序。利用得到的出cDNA片段和候選基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物(FullMisp12F:5’CATCAAACAATCTCCTCAAC3’；FullMisp12R：5’GGAGACAGATATTGTGAAGC3’)擴(kuò)增南方根結(jié)線蟲基因組全長(zhǎng)片段進(jìn)行測(cè)序。

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，并利用GenScan軟件進(jìn)行了閱讀框(ORF)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，位于拼接后獲得的序列第74nt的ATG為起始密碼子，該DNA片段含有一個(gè)完整的開放性閱讀框架(核苷酸的位置在74-523)，中間沒有內(nèi)含子，編碼149氨基酸(SEQ ID NO:2所示)。

實(shí)施例2：

Misp12蛋白及其在其它真菌中同源蛋白的生物信息學(xué)分析

通過NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)和Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Misp12基因推定編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列僅在南方根結(jié)線蟲中存在，在其它動(dòng)植物和真菌細(xì)菌中未見相應(yīng)的同源序列及同源蛋白質(zhì)。利用MotifScan對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行Motif分析可知其含有2個(gè)預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)，2個(gè)預(yù)測(cè)的蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)依賴cAMP和cGMP磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)(圖4)。

實(shí)施例3：

Misp12基因在南方根結(jié)線蟲中的定位及其蛋白在植物細(xì)胞中的定位

通過原位雜交的方法來檢測(cè)Misp12基因在南方根結(jié)線蟲中的表達(dá)位置，并將Misp12基因融合gfp基因后轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中觀察其在植物細(xì)胞中的定位。

3.1原位雜交試驗(yàn)

3.1.1溶液配制

(1)M9Buffer：22mM KH₂PO₄、42.3mM NaHPO₄、85.6mM NaCl、1mM MgSO₄^.7H2O

(2)固定液：3％多聚甲醛，用1×M9Buffer配制

(3)蛋白酶K：2mg/ml，用10mM Tris-HCl(PH 7.5)配制

(4)其它雜交試劑的配制參照地高辛標(biāo)記試劑盒說明書(購(gòu)置于羅氏公司)

3.1.2地高辛標(biāo)記的DNA單鏈探針合成

利用地高辛標(biāo)記試劑盒，采用單鏈引物PCR法分別合成目的基因單鏈正義探針和反義探針。設(shè)計(jì)引物為(Misp12HS：5’-CGGTGATGAGGTGTTATGTATGG-3’和Misp12HA：5’-CTGGCTGTGTTCGCTATGTTTT-3’)

(1)常規(guī)PCR擴(kuò)增靶標(biāo)序列。

體系：2.0μl 10×PCR buffer；2.0μl dNTP；1.0μl正向引物；1.0μl反向引物；0.5μl c

DNA模板；0.5μl rTaq酶；14μl水。

擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，共35cycles；72℃10min

(2)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠純化，電泳檢測(cè)。

(3)不對(duì)稱PCR分別合成地高辛標(biāo)記的正鏈探針和反鏈探針。

體系：2.0μl 10×PCR buffer；2.0μl地高辛標(biāo)記的dNTP mix(含Dig-dUTP)；2.0μl正向引物或反向引物；2.0μl PCR產(chǎn)物(上步驟純化回收獲得)；0.5μl rTaq酶；11.5μl水。

擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，共35cycles；72℃10min。

3.1.3線蟲固定

以下步驟除特殊說明外，均在1.5ml離心管中進(jìn)行，離心轉(zhuǎn)速取8000rpm，時(shí)間為1min，所用各試劑為1ml。

(1)將收集的線蟲在1×M9Buffer緩沖液中清洗三次；

(2)在3％的多聚甲醛固定液中4℃固定16h后，室溫放置4至5h；

(3)用手術(shù)刀來回切割線蟲，顯微鏡下觀察直至90％的蟲體都被切斷；

(4)用1×M9Buffer緩沖液清洗三次；

(5)室溫下，蛋白酶K處理蟲體1h；

(6)用1×M9Buffer緩沖液清洗一次；

(7)除去1×M9Buffer緩沖液，并將線蟲在-20℃處理20min；

(8)加入1ml預(yù)冷(-20℃)的甲醇懸浮蟲體，-80℃處理30s；

(9)13000rpm，30s沉淀蟲體；

(10)加入1ml預(yù)冷(-20℃)的丙酮懸浮蟲體，-80℃處理1min；

(11)13000rpm，1min沉淀蟲體，如果沉淀效果不好，可重復(fù)一次；

(12)除去丙酮，留大約100μl在管中，13000rpm，1min沉淀蟲體；

(13)滴加水至總體積200μl；

(14)除去上清液后，用1ml雜交液重懸線蟲清洗一次，然后再加入1ml雜交液。

3.1.4雜交與顯色

以下反應(yīng)除特殊要求外，均在室溫條件下進(jìn)行：

(1)1ml雜交液中，47℃預(yù)雜交15min；

(2)將探針在PCR儀中94℃變性5min；

(3)加入10μl探針至500μl雜交液中，47℃雜交16h；

(4)在4×SSC中55℃清洗3次，每次15min；

(5)在0.1×SSC/0.1％SDS中55℃清洗3次，每次10min；

(6)在馬來酸緩沖液中轉(zhuǎn)動(dòng)清洗一次，5min；

(7)在1×blocking solution中轉(zhuǎn)動(dòng)處理30min；

(8)在Antibody solution中處理30min；

(9)在washing buffer中清洗3次，每次15min；

(10)在1ml detection buffer中平衡5min；

(11)在1ml新鮮配制的color substrate solution中黑暗靜置反應(yīng)過夜；

(12)加入雙蒸水，清洗2次停止顯色，顯微鏡下觀察

原位雜交分別用正向引物和反向引物合成了Misp12的正義單鏈探針和反義探針，其中反義探針信號(hào)特異的出現(xiàn)在南方根結(jié)線蟲的腹食道腺細(xì)胞(圖2B)，而對(duì)照正義探針無(wú)雜交信號(hào)(圖2A)，說明Misp12在亞腹食道腺細(xì)胞特異表達(dá)。

3.2洋蔥表皮細(xì)胞定位試驗(yàn)

3.2.1pEGFP表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建Misp12基因的綠色熒光蛋白GFP融合表達(dá)載體，分別設(shè)計(jì)加有EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)的帶有信號(hào)肽序列和去除信號(hào)肽序列的基因特異性引物(12spEHF：5’-GCGAATTCATGTCCATCTTCCTTACTTCTGC-3’；12spEHR：5’-GCAAGCTTTTACTTCCGGGGCAACATGA-3’和12nospEHF：5’-ATGAATTCGAGGGTGCAGGCGATC-3’；12nospEHR：ATAAGCTTTTACTTCCGGGGCAACAT)，以cDNA為模板擴(kuò)增Misp12基因的ORF序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)進(jìn)行純化，回收PCR產(chǎn)物與載體pUMT18進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，挑取單克隆，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10h后PCR檢測(cè)。選取有目的片段插入的克隆送樣測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為Misp12-sp和Misp12-nosp。

提取質(zhì)粒pEGAD、Misp12-sp和Misp12-nosp，用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切，回收相應(yīng)的目標(biāo)片段，將回收的含有相同粘性末端的Misp12-sp和Misp12-nosp的ORF片段和pEGAD用T4連接酶16℃進(jìn)行連接過夜。取連接產(chǎn)物2μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受 態(tài)細(xì)胞。帶轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，挑取單克隆小量制備質(zhì)粒DNA，用EcoR I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，并用ORF特異性引物擴(kuò)增檢測(cè)，篩選重組子，命名為G-Misp12-sp和G-Misp12-n osp。

3.2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化洋蔥表皮

3.2.2.1洋蔥表皮的預(yù)培養(yǎng)

選取新鮮、生長(zhǎng)良好的洋蔥表皮，除去外面3-4層鱗片，用刀片在其內(nèi)表皮劃出面積為lcm²的小方塊，用鑷子將小方塊撕下，貼近葉肉的一面朝下，平鋪于高滲培養(yǎng)基上(MS+蔗糖30g/L+甘露醇0.4mol/L+瓊脂5.5g/L，pH 5.8)，28℃預(yù)培養(yǎng)過夜。

3.2.2.2侵染液的制備

將質(zhì)粒pEGAD、G-DFR-X和G-SRR-X通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，28℃恒溫培養(yǎng)2d，篩選轉(zhuǎn)化子。將鑒定后的轉(zhuǎn)化子接種于20mlYEB液體培養(yǎng)基(含有卡那霉素50ug/mL和利福平霉素20ug/mL)，28℃200r/min培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)物于7000×g離心8min，收集菌體，并重懸于MS懸浮培養(yǎng)基(含10mmol/L MgCl2、150mmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L MES)中，調(diào)節(jié)OD600為0.6-0.8，28℃200r/min培養(yǎng)3h。

3.2.2.3農(nóng)桿菌侵染和顯微觀察

將預(yù)培養(yǎng)后的洋蔥表皮置于100ml的三角瓶中，倒入調(diào)制好的農(nóng)桿菌菌液。浸染20min，期間搖動(dòng)數(shù)次。倒去菌液，用無(wú)菌水清洗3遍，洗去表面的農(nóng)桿菌，滅菌濾紙上吸干表面的水，接入MS固體培養(yǎng)基，20℃暗培養(yǎng)48小時(shí)后，用30％的蔗糖質(zhì)壁分離，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并采集照片。

結(jié)果觀察到帶有信號(hào)肽序列的Misp12定位在洋蔥表皮細(xì)胞的質(zhì)外體空間，而不帶有信號(hào)肽的Misp12則定位在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖3)。這說明Misp12基因具有分泌性并從線蟲體內(nèi)分泌后定位到植物細(xì)胞質(zhì)中。

實(shí)施例4：

Misp12基因在防治南方根結(jié)線蟲中的應(yīng)用：

通過構(gòu)建Misp12基因的VIGS沉默載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化本氏煙草，接種線蟲后觀察線蟲入侵量變化及發(fā)育變化來驗(yàn)證該基因是否其作用。VIGS沉默載體是指將Misp12的基因中最特異的片段連接到pTRV₂載體中，將構(gòu)建好的載體和pTRV₁分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101中，注射轉(zhuǎn)入煙草后接種南方根結(jié)線蟲，觀察線蟲入侵?jǐn)?shù)量。

4.1 VIGS沉默載體的構(gòu)建

沉默載體構(gòu)建主要通過PCR分段擴(kuò)增Misp12基因中特異性249bp片段Umisp12(其序 列為SEQ ID NO.3所示)，轉(zhuǎn)入載體pTRV₂，包括以下步驟：

(1)Misp12基因特異片段的擴(kuò)增：根據(jù)Misp12核苷酸序列，設(shè)計(jì)了特異性引物(Umis p12S:5’CCTGTCACTAACATACCATC3’；Umisp12：5’AATTAGAGACTGCTCCTGTT3’)，以南方根結(jié)線蟲基因組DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增(如圖6所示)，將擴(kuò)增片段Umisp12通過Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司)回收片段，連接到p MD18-T載體(購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。保存回收片段得到特異性片段UMisp12。

(2)對(duì)載體pTRV₂EX(Xueqiong Xiao et.al)質(zhì)粒利用Xcm I進(jìn)行單酶切，得到的質(zhì)粒片段兩端各突出一個(gè)T堿基。利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收質(zhì)粒片段，將回收的質(zhì)粒片段和特異性片段UMisp12(PCR擴(kuò)增后兩端各帶一個(gè)A堿基)利用T4連接酶16℃連接過夜，獲得沉默載體pTRV₂::UMisp12。

4.2本氏煙草的轉(zhuǎn)化

通過電轉(zhuǎn)化方法將上步得到pTRV₂::UMisp12和輔助載體pTRV₁載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，并在LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至OD值約為0.5后，8000r/min離心10min收集菌體，用等體積MMA緩沖液(10mmol/L MgCl2、150mmol/L乙酰丁香酮、10mmol/L MES)再次懸浮，25℃震蕩培養(yǎng)2h后1∶1混合。選取4～5葉齡的煙草苗(本氏煙)，用不帶針頭的1mL注射器將混合菌液從背面注射滲入煙草葉片，使菌液充滿整個(gè)葉片，每棵苗注射2～3片葉子。同時(shí)以空載體pTRV₂和pTRV₁注射處理的煙草植株作為對(duì)照組。每個(gè)處理接種100株煙草苗。

注射完畢后，煙草在溫度25℃、光照16h/8h、RH 50％的環(huán)境內(nèi)培養(yǎng)5d，取煙草根部組織提取RNA，方法同1.2.1，利用SuperScriptTM IIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR合成試劑盒(購(gòu)自上海英駿生物技術(shù)有限公司)合成第一鏈cDNA，用TRV特異引物(TRVF:5'-GCTGCTAGTTCATCTGCAC-3'；TRVR:5'-GCACGGATCTACTTAAAGAAC-3')檢測(cè)TRV的轉(zhuǎn)化情況，并用上步中的Umisp12S和Umisp12A進(jìn)行定量PCR檢測(cè)Misp12的沉默效果。對(duì)TRV陽(yáng)性植株接種南方根結(jié)線蟲200條/株。接種線蟲后的5d，10d，15d，28d，利用酸性品紅－次氯酸鈉染色法染色計(jì)數(shù)各處理的線蟲入侵?jǐn)?shù)量和各齡期線蟲數(shù)量，每個(gè)處理10次重復(fù)，試驗(yàn)進(jìn)行3次。

具體染色方法：

(1)配制5％次氯酸鈉液及酸性品紅液。酸性品紅的配制方法，將3.5克酸性品紅溶于250毫升醋酸，待溶解后，用蒸餾水定容止1000毫升；

(2)洗凈煙草幼根組織，在燒杯中加入50ml蒸餾水，再加10ml的5％次氯酸鈉液，將煙草根部放入燒杯中浸泡5min，并用玻璃棒輕輕攪拌；

(3)取出根組織，用流水沖洗45后，將根組織放入蒸餾水內(nèi)10min(除去次氯酸鈉)；

(4)倒去蒸餾水，將根組織移入另一個(gè)盛有30—40ml的蒸餾水的燒杯，在燒杯內(nèi)注入1ml酸性品紅液，在100℃水根組織染液水浴30s；

(5)冷卻后，用流水漂洗根組織，將根組織放入20—30ml酸性甘油液(在純甘油中滴入2-3滴HCl)中煮沸，使根組織褪色，取出根組織在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

沉默實(shí)驗(yàn)證明：通過VIGS的煙草感染南方根結(jié)線蟲后，南方根結(jié)線蟲中的Misp12基因的表達(dá)量明顯下降，能下降約70％(圖6)；相對(duì)于對(duì)照組，VIGS組煙草植株中各天數(shù)的線蟲入侵總量都有顯著的下降，下降了40％到50％左右(圖7A)。而各個(gè)齡期的線蟲數(shù)目比對(duì)照組也都有不同程度的下降，并且可以觀察到在28d的雌蟲總數(shù)下降幅度是最多，到達(dá)60％以上(圖7B)。

實(shí)施例5：

Misp12基因在南方根結(jié)線蟲不同發(fā)育齡期的表達(dá)情況

將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的含有南方根結(jié)線蟲的番茄根系清洗干凈后，通過攪拌機(jī)攪拌30s后，分別通過100目、200目、375目和500目線蟲篩，收集200目、375目和500目篩上的線蟲分別在體視顯微鏡下挑取各齡期的線蟲：包括侵染性2齡幼蟲(par-J2)、3齡4齡幼蟲(J3/4)，成熟的雌蟲(mature female)；非侵染性2齡幼蟲(pre-J2)直接由卵塊孵化得到，各個(gè)齡期的線蟲各收集300條。采用TRIzol試劑盒(購(gòu)自Invitrogen公司)提取RNA并除去所含的DNA，具體方法參考步驟1.2.2。對(duì)所提取根結(jié)線蟲總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)特異性引物(Umisp12S:5’CCTGTCACTAACATACCATC3’；Umisp12：5’AATTAGAGACTGCTCCTGTT3’)進(jìn)行Real-time PCR分析基因Misp12在南方根結(jié)線蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。

結(jié)果表明本發(fā)明克隆的Misp12基因在南方根結(jié)線蟲的初期表達(dá)量較低，隨著入侵后生長(zhǎng)發(fā)育過程而逐漸表達(dá)量升高，并且在線蟲成熟過程中有明顯的激增(見圖5)。

該結(jié)果與實(shí)施例4結(jié)果相吻合：沉默該基因后成熟的雌蟲數(shù)相比與其它齡期線蟲下降的數(shù)量尤其明顯，說明該基因在線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中有重要的作用。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中，可以利用該基因?qū)δ戏礁Y(jié)線蟲進(jìn)行防治，使得線蟲入侵量下降，并控制雌蟲數(shù)量減少卵塊數(shù)量，從而降低下一次線蟲入侵?jǐn)?shù)量。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 防治南方根結(jié)線蟲相關(guān)基因Misp12及其應(yīng)用

<130> 防治南方根結(jié)線蟲相關(guān)基因Misp12及其應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1202

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catcaaacaa tctcctcaac aactaataaa ctcaaaaaac accccaaaac aaccctaaaa 60

acaacccaaa aatgtccatc ttccttactt ctgctcttct aatcatttca ataatcgcta 120

tgaccgaggg tgcaggcgat cgaagcgctt caacctctac tggttgtaca acctattttg 180

gcatgcttga tcatgcggat accaaggaaa ataacaaaag aaaaactttc aaacccaacg 240

ataaaaccaa atccaacacc ttgcaagtga ctggtggggc aatgttcagc aatacctcgg 300

tggcgttggt tgtcggtgat aaggcgttat gtatggctaa gacaggaagt tcagacgatt 360

ggggaatgcg ctacgatgct ttgactggaa caatgaaatt tatcatttct gataatatta 420

ctgttgaagt gggtgtgggt ttatataatt ggtgccagac aaatggaaag gcccctgtca 480

ctaacatacc atccggagcg ttcatgttgc cccggaagta actggtggcc cacaaaaggg 540

caatcactat tgattacaac ccaaatatct ataggatttt gacattttct ggcataattt 600

aggtattttc tgacattttt ctgacatttt taactagaat taattcaatt gaaaacaaaa 660

taataggatt gacctaaatg agcgtttctt ggatatcctt ttaacaggag cagtctctaa 720

ttttgtaaga gctcctaatg tttgccctcc tccatctccc tccccctcta tgctcctacc 780

aatgactgat taagttaaaa atcgtacata aaatggagag tgtataaatc tgggtgtata 840

tacaatcagg attcgacttt ataacatttg aaggttccat ttgaagacgt ttttttcttc 900

accgacaaca agtgtgtcat ccagcttgta agctacgata ataaaactaa tgaaactctt 960

ctcaaaatta atgatgtcga cttcaaaatt atccctactg ataagaaaat ttccccgaag 1020

gcttgtacta tgaaaatgtg agcttgtact atgaaaatgt gagggaaaaa agtaaagaaa 1080

agaataacaa aaagtgtaaa tatggaagga taaaaacgaa acaaaaatga atgtgaagta 1140

aaaaataaaa agaaattcaa gtagatttaa aaaaaatgtt aagcttcaca atatctgtct 1200

cc 1202

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Ile Phe Leu Thr Ser Ala Leu Leu Ile Ile Ser Ile Ile Ala

1 5 10 15

Met Thr Glu Gly Ala Gly Asp Arg Ser Ala Ser Thr Ser Thr Gly Cys

20 25 30

Thr Thr Tyr Phe Gly Met Leu Asp His Ala Asp Thr Lys Glu Asn Asn

35 40 45

Lys Arg Lys Thr Phe Lys Pro Asn Asp Lys Thr Lys Ser Asn Thr Leu

50 55 60

Gln Val Thr Gly Gly Ala Met Phe Ser Asn Thr Ser Val Ala Leu Val

65 70 75 80

Val Gly Asp Lys Ala Leu Cys Met Ala Lys Thr Gly Ser Ser Asp Asp

85 90 95

Trp Gly Met Arg Tyr Asp Ala Leu Thr Gly Thr Met Lys Phe Ile Ile

100 105 110

Ser Asp Asn Ile Thr Val Glu Val Gly Val Gly Leu Tyr Asn Trp Cys

115 120 125

Gln Thr Asn Gly Lys Ala Pro Val Thr Asn Ile Pro Ser Gly Ala Phe

130 135 140

Met Leu Pro Arg Lys

145

<210> 3

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgtcacta acataccatc cggagcgttc atgttgcccc ggaagtaact ggtggcccac 60

aaaagggcaa tcactattga ttacaaccca aatatctata ggattttgac attttctggc 120

ataatttagg tattttctga catttttctg acatttttaa ctagaattaa ttcaattgaa 180

aacaaaataa taggattgac ctaaatgagc gtttcttgga tatcctttta acaggagcag 240

tctctaatt 249