本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用生產(chǎn)微生物油脂的方法。

背景技術(shù)：

生物質(zhì)廢棄物種類多樣，包括以木質(zhì)纖維素、糞污等富含多糖和有機(jī)質(zhì)的物質(zhì)，其中木質(zhì)纖維素是自然界含量和產(chǎn)量最為豐富的多糖，糞污等富含有機(jī)質(zhì)的生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)量更是隨著現(xiàn)代社會(huì)對(duì)畜牧業(yè)的巨大需求急劇飆升。但是由于木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜緊密、糞污等含有的有機(jī)質(zhì)種類繁多，采用傳統(tǒng)的單菌發(fā)酵方式難以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)這些生物質(zhì)廢棄物的高效利用，造成其中富含的糖類和有機(jī)質(zhì)等資源的巨大浪費(fèi)。近年來的研究顯示，相較于純培養(yǎng)單菌，天然菌群由于存在多菌協(xié)同機(jī)制，能夠更好地模擬自然界中對(duì)生物質(zhì)廢棄物的消解過程，因而能夠更為高效的實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)廢棄物的轉(zhuǎn)化利用，獲得包括單糖、有機(jī)酸醇等在內(nèi)的多種發(fā)酵產(chǎn)物。

微生物油脂是由微生物包括細(xì)菌、酵母、霉菌和藻類等在特定條件下通過同化外界碳源，在菌體內(nèi)合成的脂肪類化合物。微生物產(chǎn)油脂具有單體油脂含量高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)投入低、不受季節(jié)影響等優(yōu)勢(shì)。常規(guī)方法采用葡萄糖、甘油等作為碳源，采用包括斯達(dá)氏酵母、淺白色隱球酵母、彎隱球酵母、斯達(dá)氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母等作為發(fā)酵菌株，雖然能夠獲得高達(dá)65％以上的油脂收率，但是由于葡萄糖、甘油等作為原料成本較高，限制了微生物產(chǎn)油的發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，粘紅酵母和解脂耶羅維亞酵母等產(chǎn)油酵母不僅能夠利用葡萄糖和甘油等價(jià)格高昂的原料作為產(chǎn)油碳源，還可以利用包括五碳糖、多種有機(jī)酸和醇類物質(zhì)作為碳源進(jìn)行油脂的積累。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用生產(chǎn)微生物油脂的方法。

本發(fā)明提供的菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用生產(chǎn)微生物油脂的方法包括如下步驟：

1)制備用于降解生物質(zhì)廢棄物的微生物菌群；

2)用所述微生物菌群發(fā)酵生物質(zhì)廢棄物，得到發(fā)酵產(chǎn)物；

3)用產(chǎn)油微生物對(duì)所述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)，得到微生物油脂。

上述方法中，

所述產(chǎn)油微生物為產(chǎn)油酵母、產(chǎn)油細(xì)菌或其他能夠用于生產(chǎn)微生物油脂的微生物。

上述方法中，

所述制備用于降解生物質(zhì)廢棄物的微生物菌群的方法為如下(1)或(2)或(3)或(4)：

(1)將腐殖土在含有微晶纖維素的菌群富集培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，選取微晶纖維素降解率大于90％的發(fā)酵液，其中所含菌群即為所述目的微生物菌群；

(2)將污水在含有糞污的菌群富集培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，選取總有機(jī)碳降解率大于90％的發(fā)酵液，其中所含菌群即為目的微生物菌群；

(3)將如下菌混勻得到目的微生物菌群：Clostridium cellulosi、Clostridium stercorarium、Clostridium thermocellum、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Thermobacillus composti和Bacillus coagulans；

(4)將如下菌混勻得到目的微生物菌群：Aminobacterium colombiense、Anaerococcus prevotii、Syntrophomonas wolfei、Clostridium thermocellum、Methanosarcina barkeri、Thermanaerovibrio acidaminovorans、Kosmotoga olearia、Alkaliphilus metalliredigens、Psychrobacter cryohalolentis。

上述方法中，所述腐殖土可以是以農(nóng)林廢棄物長(zhǎng)期堆放獲得或堆肥獲得，還可以是自然界植物積累獲得。

上述方法中，所述污水可以是生活污水，還可以是工業(yè)污水。

上述方法中，所述含有微晶纖維素的菌群富集培養(yǎng)基為將微晶纖維素(獲取自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)和菌群富集培養(yǎng)基混勻得到的；所述微晶纖維素在所述含有微晶纖維素的菌群富集培養(yǎng)基中的濃度為30g/L；

所述含有糞污的菌群富集培養(yǎng)基為將糞污(獲取自北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司)和菌群富集培養(yǎng)基混勻得到的；所述糞污在所述含有糞污的菌群富集培養(yǎng)基中的濃度為100g/L；

所述菌群富集培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在菌群富集培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O，0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·5H₂O 0.005g/L，H₃BO₃0.005g/L，NiCl₂·2H₂O 0.005g/L，CoCl₂·6H₂O 0.005g/L，CuCl₂·2H₂O 0.005g/L，所述菌群富集培養(yǎng)基的pH為8.0±0.1。

上述方法中，(1)中所述的目的微生物菌群主要含有如下：Euryarchaeota、Actinobacteria、Bacterioidetes、Spirochaetes,Cyanobaceteria、Thermotogae、Fusobacteria等七大綱的菌株，具體包括Clostridium cellulosi、Clostridium stercorarium、Clostridium thermocellum、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Thermobacillus composti、Bacillus coagulans等纖維素、半纖維素降解菌株；

上述方法中，(2)中所述的目的微生物菌群主要含有如下：Firmicutes、Proteobacteria、Bacterioidetes、Euryarchaeota、Thermotogae,Actinobacteria、Cyanobaceteria、Fusobacteria、Planctomycetes等九大綱的菌株，其中具體包括Aminobacterium colombiense、Anaerococcus prevotii、Syntrophomonas wolfei、Clostridium thermocellum、Methanosarcina barkeri、Thermanaerovibrio acidaminovorans、Kosmotoga olearia、Alkaliphilus metalliredigens、Psychrobacter cryohalolentis等產(chǎn)酸菌株。

上述方法中，

步驟2)，所述發(fā)酵為將所述微生物菌群、所述生物質(zhì)廢棄物和菌群發(fā)酵培養(yǎng)基混勻，發(fā)酵；

所述微生物菌群、所述生物質(zhì)廢棄物和所述菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為(2-3)g：(0-200)g：1L；

步驟3)，所述產(chǎn)油發(fā)酵為將所述產(chǎn)油微生物、所述發(fā)酵產(chǎn)物和產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基混勻，產(chǎn)油發(fā)酵；

所述產(chǎn)油微生物、所述發(fā)酵產(chǎn)物和所述產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為1×10⁶cfu：10g：1L。

上述方法中，

所述生物質(zhì)廢棄物為富含碳源的廢棄物，且所述微生物菌群、所述生物質(zhì)廢棄物和所述菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為(2-3)g：(0-100)g：1L；

或所述生物質(zhì)廢棄物為富含有機(jī)質(zhì)的廢棄物，且所述微生物菌群、所述生物質(zhì)廢棄物和所述菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為(2-3)g：(0-200)g：1L，且所述生物質(zhì)廢棄物中有機(jī)碳和有機(jī)氮的質(zhì)量比為(10-50)g：1g。

上述方法中，所述生物質(zhì)廢棄物的質(zhì)量不為0。

上述方法中，所述微生物菌群、所述生物質(zhì)廢棄物和所述菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為2g：25g：1L或2g：50g：1L或2g：75g：1L或2g：100g：1L或3g：25g：1L或3g：50g：1L或3g：75g：1L或3g：100g：1L。

上述方法中，

所述發(fā)酵的條件為30-75℃、200rpm、厭氧培養(yǎng)72-96h；

所述產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20-40℃、200rpm、通氣量0.5-2.0vvm培養(yǎng)72-120h；

在步驟2)和步驟3)之間還包括如下步驟：收集分子量大小為42-1000的發(fā)酵產(chǎn)物；

所述收集的方式具體為將發(fā)酵產(chǎn)物過截留分子量為500-1000的聚砜濾膜，收集濾液。

上述方法中，所述菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨2.1g/L，酵母粉1g/L，尿素2.1g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·5H2O 0.005g/L，H₃BO₃0.005g/L，NiCl₂·2H₂O 0.005g/L，CoCl₂·6H₂O 0.005g/L，CuCl₂·2H₂O 0.005g/L；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為8.0±0.1；

所述產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：無氨基酵母氮源34g/L，硫酸銨88g/L，酵母提取物2g/L。

上述方法中，所述產(chǎn)油酵母為粘紅酵母Kodamaeaohmeri或解脂耶羅維亞酵母Trichosporonoidesspathulata。

上述方法中，所述富含碳源的生物質(zhì)廢棄物為木質(zhì)纖維素；所述富含有機(jī)質(zhì)的生物質(zhì)廢棄物為糞污或有機(jī)廢水或有機(jī)廢渣。

本發(fā)明有以下益處：本發(fā)明采用生物質(zhì)廢棄物為原料，相較于葡萄糖、甘油等，能大幅度降低生物油脂生產(chǎn)的原料成本，對(duì)資源的再利用和降低生物油脂生產(chǎn)過程中碳排放具有重要的意義，而且本發(fā)明采用菌群進(jìn)行生物質(zhì)廢棄物的利用，相較于純培養(yǎng)單菌，培養(yǎng)過程不需要無菌操作，有效降低了成本，同時(shí)菌群中多菌協(xié)同效應(yīng)能更高效的實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)中的纖維素和半纖維素等成分降解和轉(zhuǎn)化。

本發(fā)明提供了一種菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用以生物質(zhì)廢棄物為原料生產(chǎn)生物油脂的方法。該方法利用天然菌群分解生物質(zhì)廢棄物中的多聚糖、蛋白質(zhì)和脂肪等有機(jī)質(zhì)，將生物質(zhì)廢棄物轉(zhuǎn)化為含有糖、有機(jī)酸和醇類的混合有機(jī)物，進(jìn)一步利用產(chǎn)油微生物轉(zhuǎn)化該混合有機(jī)物為生物油脂。本發(fā)明創(chuàng)造性地結(jié)合了天然菌群對(duì)于纖維素類生物質(zhì)的高效降解能力和產(chǎn)油微生物的生物油脂生產(chǎn)能力，不僅有效擴(kuò)大生物油脂生產(chǎn)的原料來源，而且還簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程、降低了生產(chǎn)成本、減少了環(huán)境污染，為高效轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)油脂提供了一條低成本的新途徑，對(duì)國(guó)家新能源技術(shù)發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。

附圖說明

圖1為不同濃度底物(木質(zhì)纖維素)為原料的菌群發(fā)酵產(chǎn)物的變化。

圖2為不同濃度底物(糞污)為原料的菌群發(fā)酵產(chǎn)物的變化。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的菌群富集培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在菌群富集培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O，0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·5H₂O 0.005g/L，H₃BO₃0.005g/L，NiCl₂·2H₂O 0.005g/L，CoCl₂·6H₂O 0.005g/L，CuCl₂·2H₂O 0.005g/L，pH為8.0±0.1。操作中接種量為10％，培養(yǎng)基無需滅菌，培養(yǎng)條件為55℃，靜置培養(yǎng)。

下述實(shí)施例中的菌群發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在菌群發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨2.1g/L，酵母粉1g/L，尿素2.1g/L，氯化鈉5g/L，碳酸鈣5g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.05g/L，MnSO₄·5H2O 0.005g/L，H₃BO₃0.005g/L，NiCl₂·2H₂O 0.005g/L，CoCl₂·6H₂O 0.005g/L，CuCl₂·2H₂O 0.005g/L，pH為8.0±0.1。

下述實(shí)施例中的產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L。除葡萄糖外培養(yǎng)基其他成分121℃滅菌20分鐘，葡萄糖配制成50％母液后采用無菌0.22μm無菌濾器過濾后加入培養(yǎng)基中。接種量為10％，培養(yǎng)條件為37℃，200rpm，培養(yǎng)24h。

下述實(shí)施例中的產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基的溶劑為水，溶質(zhì)及其在產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：無氨基酵母氮源34g/L，硫酸銨88g/L，酵母提取物20g/L。

實(shí)施例1、菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)微生物油脂的方法

一、轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物的菌群篩選

1、以木質(zhì)纖維素為底物的菌群的篩選

取5g采集的樣品(腐殖土，樣品于2013年采集自海南五指山)，將其接入含有30g/L微晶纖維素的菌群富集培養(yǎng)基中，在55℃條件下靜置培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)5個(gè)月，得到天然菌群發(fā)酵液，檢測(cè)天然菌群發(fā)酵液中微晶纖維素含量，計(jì)算微晶纖維素降解率，選取微晶纖維素降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液。微晶纖維素降解率的計(jì)算公式為(1-m/3)％，其中m為：100mL天然菌群發(fā)酵液離心后分別采用檸檬酸和無菌水清洗三次，烘干并稱重沉淀為m。初始菌群主要含有如下：Euryarchaeota、Actinobacteria、Bacterioidetes、Spirochaetes、Cyanobaceteria、Thermotogae、Fusobacteria等七大綱的菌株，具體包括Clostridium cellulosi、Clostridium stercorarium、Clostridium thermocellum、Tepidanaerobacter acetatoxydans、Thermobacillus composti、Bacillus coagulans等纖維素、半纖維素降解菌株。

二、菌群轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素

本發(fā)明以富含碳源的木質(zhì)纖維素為底物，用步驟一獲得的微晶纖維素降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟如下：

1、菌群擴(kuò)大培養(yǎng)

將上述步驟一獲得的微晶纖維素降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液作為種子以10％(體積比)的接種量接種于含有100g/L微晶纖維素的菌群富集培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)，得到發(fā)酵液。將獲得的發(fā)酵液作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的種子液。上述擴(kuò)大培養(yǎng)的條件：在55℃無氧條件下，以30rpm攪拌培養(yǎng)96h。

2、木質(zhì)纖維素的堿蒸餾預(yù)處理

稱取6kg的木質(zhì)纖維素與氫氧化鈉水溶液混合，使氫氧化鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到12％，平鋪于小型塔板式蒸餾釜(直徑為0.4米，高度為0.45米)中；向蒸餾釜通入0.18Mpa的蒸汽，保持操作溫度在95℃，計(jì)時(shí)35分鐘，得到蒸餾后物料；將蒸餾后物料用清水洗至pH小于8，擠出多余水分后，得到堿蒸餾預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素，烘干備用。

3、菌群轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素

分別將25g、50g、75g、100g的堿蒸餾預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素與2g步驟1獲得的種子液和1L的菌群發(fā)酵培養(yǎng)基混勻，分別得到含有25g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5％)、50g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％)、75g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5％)、100g/L堿蒸餾處理的木質(zhì)纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基；將步驟1獲得的種子液分別轉(zhuǎn)接到含有不同濃度的堿蒸餾處理的木質(zhì)纖維素的菌群發(fā)酵培養(yǎng)基中(種子液與含有不同濃度的堿蒸餾處理的木質(zhì)纖維素的發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：10)，在55℃無氧條件下，以30rpm攪拌培養(yǎng)96h，至木質(zhì)纖維素底物降解率達(dá)到90％以上，得到菌群發(fā)酵液，并將菌群發(fā)酵液通過濾膜(截留分子量500-1000)過濾，收集濾液。

4、發(fā)酵液中有機(jī)產(chǎn)物濃度測(cè)定

采用裝有Varian色譜柱CP-Wax 57CB的安捷倫7890A氣相檢測(cè)上述步驟3中的濾液中的有機(jī)產(chǎn)物(葡萄糖、有機(jī)酸和有機(jī)醇)含量。具體步驟如下：取定量體積濾液加入等體積的4g/L異丙醇內(nèi)標(biāo)，輕彈混勻后，加入氣相樣品瓶，放入樣品盤，乙醇檢測(cè)平臺(tái)選用裝置了Varian強(qiáng)極性的CP-Wax 57CB色譜柱的安捷倫7890A氣相進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器為FID，最高柱溫為210℃，進(jìn)樣口200℃，檢測(cè)器230℃，載氣為氮?dú)狻?/p>

不同濃度(25g/L、50g/L、75g/L、100g/L)的堿蒸餾處理的木質(zhì)纖維素的發(fā)酵液中總產(chǎn)物濃度的變化趨勢(shì)如圖1所示。從圖1中可以看出：菌群能夠高效轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生成包括葡萄糖、有機(jī)酸和有機(jī)醇在內(nèi)的多種產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5-7.5％木質(zhì)纖維素時(shí)間短于96h，在木質(zhì)纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5％時(shí)獲得的總產(chǎn)物(糖、有機(jī)酸和醇類)濃度達(dá)到最高，約為4％。

三、產(chǎn)油微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂

1、分別將解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolyticaATCC 20177，購自美國(guó)菌種保藏中心)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis ATCC 32765，購自美國(guó)菌種保藏中心)按照10％(體積比，cfu約為1×10⁶)的接種量接種于產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基中，分別得到ATCC 20177種子液和ATCC 32765種子液；

2、將步驟二的3中獲得的濾液和產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基(pH調(diào)整至4.0，濾液和產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為9：1)混勻，得到發(fā)酵培養(yǎng)體系。

3、將步驟1獲得的ATCC 20177種子液和ATCC 32765種子液按照10％(體積比，cfu約為1×10⁶)的接種量分別接種至步驟2獲得的發(fā)酵培養(yǎng)體系中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，200rpm，通氣量1.0vvm，培養(yǎng)時(shí)間為72h，培養(yǎng)后停止攪拌與通氣，待酵母沉降后，采用蠕動(dòng)泵移去上清液，分別補(bǔ)加新的通過濾膜過濾的步驟二的3中獲得的濾液，使糖、有機(jī)酸和醇類總濃度維持在發(fā)酵體系的1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上，調(diào)整pH至4.0，設(shè)置培養(yǎng)條件為28℃，200rpm，通氣量1.0vvm，繼續(xù)培養(yǎng)72h，得到ATCC 20177發(fā)酵液和ATCC 32765發(fā)酵液。

四、產(chǎn)油酵母細(xì)胞干重和油脂重量的測(cè)定

1、分別取100ml上述步驟三獲得的ATCC 20177發(fā)酵液和ATCC 32765發(fā)酵液，在5000rpm下離心10min，棄上清，取沉淀；用無菌水洗滌沉淀兩次，并在-60℃下冷凍干燥24h，分別得到絕干酵母菌體，通過重量分析確定產(chǎn)油酵母細(xì)胞干重質(zhì)量。

2、索氏抽提法提取酵母細(xì)胞內(nèi)油脂

將步驟1獲得的絕干酵母菌體研磨成粉后，準(zhǔn)確稱取5g，放入稱重的濾紙中包好，放入索氏抽提器中加入正己烷進(jìn)行抽提，每次循環(huán)時(shí)間約為10min，抽提總時(shí)間12h；室溫冷卻，將抽提液中正己烷用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收，氮?dú)饬髯鳛楸Ｗo(hù)器，操作溫度為55℃，轉(zhuǎn)速20rpm，回收油脂后稱重獲得油脂產(chǎn)量。

解脂耶羅維亞酵母的細(xì)胞干重、油脂重量及菌體含油量的檢測(cè)結(jié)果如表1所示；粘紅酵母的細(xì)胞干重、油脂重量及菌體含油量的檢測(cè)結(jié)果如表2所示。從表1和表2中可以看出，不同產(chǎn)油酵母獲得最佳產(chǎn)油效果對(duì)應(yīng)的菌群發(fā)酵木質(zhì)纖維素量不同，解脂耶羅維亞酵母轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約16.6g/L，對(duì)應(yīng)的生物質(zhì)廢棄物濃度為50g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％)，其從木質(zhì)纖維素原料到油脂的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.332g/g(16.6g/50g)；粘紅酵母轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約12.2g/L，對(duì)應(yīng)的生物質(zhì)廢棄物濃度為7.5％，其從木質(zhì)纖維素原料到油脂的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.163g/g(12.2g/75g)。

表1、不同濃度木質(zhì)纖維素下解脂耶羅維亞酵母菌體干重、油脂重量及菌體含油量

表2、不同濃度生物質(zhì)廢棄物下粘紅酵母菌體干重、油脂重量及菌體含油量

本實(shí)例采用菌群進(jìn)行生物質(zhì)廢棄物的利用，相較于純培養(yǎng)單菌，能夠高效的實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)廢棄物中多糖和有機(jī)質(zhì)的降解，在獲得葡萄糖等六碳糖單糖和木糖等五碳糖單糖以及多種寡聚多糖同時(shí)，其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、醇等同樣可以作為碳源被采用的產(chǎn)油酵母同化，實(shí)現(xiàn)高效的以生物質(zhì)廢棄物為原料進(jìn)行生物油脂的生產(chǎn)。獲得的菌群能夠高效轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物，轉(zhuǎn)化2.5-7.5％生物質(zhì)廢棄物時(shí)間短于96h，在生物質(zhì)廢棄物(木質(zhì)素廢棄物)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5％時(shí)獲得的總產(chǎn)物(糖、有機(jī)酸和醇類物質(zhì))濃度達(dá)到最高，約為4％；以菌群發(fā)酵產(chǎn)物為原料，產(chǎn)油微生物產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約16.6g/L，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到0.332g/g(16.6g/50g)。

實(shí)施例2、一種菌群和產(chǎn)油微生物聯(lián)用以糞污為原料生產(chǎn)微生物油脂的方法

一、轉(zhuǎn)化糞污的菌群篩選

取10g采集的樣品(污水，樣品于2013年采集自北京大紅門污水處理廠)，將其接入含有100g/L糞污(獲取自北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司)的菌群富集培養(yǎng)基中，在55℃條件下靜置培養(yǎng)，連續(xù)傳代5個(gè)月，得到天然菌群發(fā)酵液，檢測(cè)天然菌群發(fā)酵液中TOC，計(jì)算TOC降解率，選取TOC降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液。TOC為總有機(jī)碳，TOC降解率采用基于快速消解分光光度法的美國(guó)哈希1950Plus TOC分析儀進(jìn)行測(cè)定。初始菌群主要含有如下：Firmicutes、Proteobacteria、Bacterioidetes、Euryarchaeota、Thermotogae、Actinobacteria、Cyanobaceteria、Fusobacteria、Planctomycetes等九大綱的菌株，其中具體包括Aminobacterium colombiense、Anaerococcus prevotii、Syntrophomonas wolfei、Clostridium thermocellum、Methanosarcina barkeri、Thermanaerovibrio acidaminovorans、Kosmotoga olearia、Alkaliphilus metalliredigens、Psychrobacter cryohalolentis等產(chǎn)酸菌株。

二、菌群轉(zhuǎn)化糞污

本發(fā)明以富含有機(jī)質(zhì)的糞污為底物，用步驟一獲得的TOC降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體步驟如下：

1、菌群擴(kuò)大培養(yǎng)

將上述步驟一篩選獲得的TOC降解率達(dá)到90％以上的天然菌群發(fā)酵液作為種子以10％(體積比)的接種量接種于含有100g/L糞污的菌群富集培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 得到發(fā)酵液。將獲得的發(fā)酵液作為后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的種子液。上述擴(kuò)大培養(yǎng)的條件：在55℃無氧條件下，以30rpm攪拌培養(yǎng)96h。

2、糞污的總有機(jī)碳和總有機(jī)氮的測(cè)定

稱取100g的糞污，在65℃干燥箱烘干至恒重，得到絕干樣品，將絕干樣品用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，并過分子篩，取40目與80目之間樣品，得到篩選后的樣品；采用哈希1950Plus TOC分析儀分析篩選后的樣品的總有機(jī)碳含量(TOC為總有機(jī)碳，TOC降解率采用基于快速消解分光光度法的美國(guó)哈希1950Plus TOC分析儀進(jìn)行測(cè)定)；采用凱氏定氮儀測(cè)定篩選后的樣品的總有機(jī)氮含量(采用基于凱氏定氮法的上海雷磁KDN-1型自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果換算出糞污樣品中有機(jī)碳源和有機(jī)氮源的比例，并通過補(bǔ)加纖維素(補(bǔ)碳)或者尿毒(補(bǔ)氮)使有機(jī)碳源和有機(jī)氮源的比例在(10-50):1。本發(fā)明的有機(jī)碳源和有機(jī)氮源的比例為15：1。

3、菌群轉(zhuǎn)化糞污

分別將25g、50g、75g、100g的糞污與3g步驟1獲得的種子液和1L的菌群發(fā)酵培養(yǎng)基混勻，分別得到含有25g/L、50g/L、75g/L、100g/L堿蒸餾處理的糞污的發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為1g/L的四碘化碳(CI₄)，在55℃無氧條件下，以30rpm攪拌培養(yǎng)96h，至糞污降解率達(dá)到90％以上，得到菌群發(fā)酵液，并將菌群發(fā)酵液通過濾膜(截留分子量500-1000)過濾，收集濾液。

4、發(fā)酵液中有機(jī)產(chǎn)物濃度測(cè)定

采用裝有Varian色譜柱CP-Wax 57CB的安捷倫7890A氣相檢測(cè)上述步驟3中的濾液中的有機(jī)產(chǎn)物(葡萄糖、有機(jī)酸和有機(jī)醇)含量。具體步驟如下：取定量體積濾液加入等體積的4g/L異丙醇內(nèi)標(biāo)，輕彈混勻后，加入氣相樣品瓶，放入樣品盤，乙醇檢測(cè)平臺(tái)選用裝置了Varian強(qiáng)極性的CP-Wax 57CB色譜柱的安捷倫7890A氣相進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)器為FID，最高柱溫為210℃，進(jìn)樣口200℃，檢測(cè)器230℃，載氣為氮?dú)狻?/p>

不同濃度(25g/L、50g/L、75g/L、100g/L)的糞污的發(fā)酵液中總產(chǎn)物濃度變化趨勢(shì)如圖2所示。從圖中可以看出：菌群能夠?qū)⒓S污中的有機(jī)碳和有機(jī)氮源轉(zhuǎn)化為包括有機(jī)酸和有機(jī)醇在內(nèi)的多種產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5-7.5％的糞污時(shí)間短于96h，在糞污的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5％時(shí)獲得的總產(chǎn)物(有機(jī)酸和醇類物質(zhì))濃度達(dá)到最高，約為4.3％。

三、產(chǎn)油微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物油脂

1、分別將解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolyticaATCC 20177，購自美國(guó)菌種保藏中心)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis ATCC 32765，購自美國(guó)菌種保藏中心)按 照10％(體積比，cfu約為1×10⁶)的接種量接種于產(chǎn)油微生物培養(yǎng)基中，分別得到ATCC 20177種子液和ATCC 32765種子液；

2、將步驟二的3中獲得的濾液和產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基(pH調(diào)整至4.0，濾液和產(chǎn)油發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為9：1)混勻，得到發(fā)酵培養(yǎng)體系。

3、將步驟1獲得的ATCC 20177種子液和ATCC 32765種子液按照10％(體積比，cfu約為1×10⁶)的接種量分別接種至步驟2獲得的發(fā)酵培養(yǎng)體系中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28℃，200rpm，通氣量1.0vvm，培養(yǎng)時(shí)間為72h，培養(yǎng)后停止攪拌與通氣，待酵母沉降后，采用蠕動(dòng)泵移去上清液，分別補(bǔ)加新的通過濾膜過濾的步驟二的3中獲得的濾液，使總有機(jī)酸濃度維持在發(fā)酵體系的5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以上，調(diào)整pH至4.0，設(shè)置培養(yǎng)條件為28℃，200rpm，通氣量1.0vvm，繼續(xù)培養(yǎng)72h，得到ATCC 20177發(fā)酵液和ATCC 32765發(fā)酵液。

四、產(chǎn)油酵母細(xì)胞干重和油脂重量的測(cè)定

1、取100ml上述步驟三獲得的，得到ATCC 20177發(fā)酵液和ATCC 32765發(fā)酵液，在5000rpm下離心10min，棄上清，取沉淀；用無菌水洗滌沉淀兩次，并在-60℃下冷凍干燥24h，得到絕干酵母菌體，通過重量分析確定產(chǎn)油酵母細(xì)胞干重質(zhì)量。

2、索氏抽提法提取酵母細(xì)胞內(nèi)油脂

將步驟1獲得的干菌體研磨成粉后，準(zhǔn)確稱取5g，放入稱重的濾紙中包好，放入索氏抽提器中加入正己烷進(jìn)行抽提，每次循環(huán)時(shí)間約為10min，抽提總時(shí)間12h；室溫冷卻，將抽提液中正己烷用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收，氮?dú)饬髯鳛楸Ｗo(hù)器，操作溫度為55℃，轉(zhuǎn)速為20rpm，回收油脂后稱重獲得油脂產(chǎn)量。

解脂耶羅維亞酵母的細(xì)胞干重、油脂重量及菌體含油量的檢測(cè)結(jié)果如表3所示；粘紅酵母的細(xì)胞干重、油脂重量及菌體含油量的檢測(cè)結(jié)果如表4所示。從表3和表4中可以看出，不同產(chǎn)油酵母獲得最佳產(chǎn)油效果對(duì)應(yīng)的菌群發(fā)酵糞污量不同，解脂耶羅維亞酵母轉(zhuǎn)化糞污產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約19.8g/L，對(duì)應(yīng)的糞污濃度為75g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5％)，其從糞污到油脂的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.264g/g(19.8g/75g)；粘紅酵母轉(zhuǎn)化糞污產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約14.2g/L，對(duì)應(yīng)的糞污濃度為75g/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5％)，其從糞污到油脂的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了0.189g/g(14.2g/75g)。

表3、不同濃度糞污下解脂耶羅維亞酵母菌體干重、油脂重量及菌體含油量

表4、不同濃度糞污下粘紅酵母菌體干重、油脂重量及菌體含油量

本實(shí)例采用菌群進(jìn)行生物質(zhì)廢棄物的利用，相較于純培養(yǎng)單菌，能夠高效的實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)廢棄物中多糖和有機(jī)質(zhì)的降解，在獲得葡萄糖等六碳糖單糖和木糖等五碳糖單糖以及多種寡聚多糖同時(shí)，其代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸、醇等同樣可以作為碳源被采用的產(chǎn)油酵母同化，實(shí)現(xiàn)高效的以生物質(zhì)廢棄物為原料進(jìn)行生物油脂的生產(chǎn)。獲得的菌群能夠高效轉(zhuǎn)化生物質(zhì)廢棄物，轉(zhuǎn)化2.5-7.5％糞污時(shí)間短于96h，在生物質(zhì)廢棄物(糞污)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到7.5％時(shí)獲得的總產(chǎn)物(有機(jī)酸和醇類物質(zhì))濃度達(dá)到最高，約為4.3％；以菌群發(fā)酵產(chǎn)物為原料，產(chǎn)油微生物產(chǎn)油脂濃度最高達(dá)到約19.8g/L，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到0.264g/g(19.8g/75g)。