含有β-胡蘿卜素的菌粉、微生物油及油懸液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供含有β?胡蘿卜素的菌粉、微生物油或油懸液,所述β?胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其特征在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉霉 BT7251(+) CCTCC M 2014378;三孢布拉霉 BT7603(?) CCTCC M 2014379。本發(fā)明的三孢布拉霉突變株進(jìn)行常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)后,可獲得較高產(chǎn)量的β?胡蘿卜素。同時(shí),整個(gè)發(fā)酵工藝簡單,便于控制,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。CCTCC NO: M201437820140808CCTCC NO: M201437920140808
【專利說明】
含有β-胡蘿卜素的菌粉、微生物油及油懸液
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及含有β-胡蘿卜素的菌粉、微生物油及油懸液。
【背景技術(shù)】
[0002] β-胡蘿卜素是500多種胡蘿卜素中的一種,是維生素 A的前體,也稱維生素 A原,它的 稀溶液呈橙黃色至黃色。胡蘿卜素廣泛存在于植物、藻類和真菌中,但動(dòng)物和人體內(nèi)不能 合成胡蘿卜素,必須從外界攝取。作為食品添加劑,胡蘿卜素能起到色素和營養(yǎng)強(qiáng)化劑的作 用,同時(shí)β-胡蘿卜素是強(qiáng)力抗氧化劑,有抑制癌細(xì)胞增殖和提高機(jī)體免疫力等作用。獨(dú)有的 營養(yǎng)價(jià)值和藥用療效使胡蘿卜素受到世界各國醫(yī)學(xué)界和食品商的重視。
[0003] 目前β-胡蘿卜素的制備方法主要包括以下幾種:一、化學(xué)合成,即采用有機(jī)化工原 料,通過化學(xué)合成反應(yīng),人工合成胡蘿卜素?;瘜W(xué)合成法生產(chǎn)胡蘿卜素技術(shù)復(fù)雜、難度大、活 性低、毒性強(qiáng),不能完全被人體吸收,并對(duì)人體產(chǎn)生一定程度的毒副作用,不少國家已限制 使用。二、植物提取法,即從植物原料,例如胡蘿卜等植物中采用有機(jī)溶劑,如石油醚、氯仿、 丙酮、乙醚、乙醇等萃取β-胡蘿卜素。但是,使用該方法需要消耗大量的原材料,且提取收率 不高,很難適應(yīng)于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。三、生物發(fā)酵法,即利用微生物培養(yǎng)技術(shù),通過微生 物的培養(yǎng),利用微生物在其體內(nèi)合成胡蘿卜素,然后自微生物體內(nèi)分離得到胡蘿卜素。該 方法的生產(chǎn)成本低,胡蘿卜素產(chǎn)品純度高,回收率高,可達(dá)90%以上。因此,采用微生物發(fā) 酵法生產(chǎn)胡蘿卜素有廣闊的應(yīng)用前景。特別的,用三孢布拉霉菌株發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素, 其工藝的安全性高,成本低廉,且著色能力強(qiáng),因此受到生產(chǎn)廠商的格外青睞。
[0004] 專利申請?zhí)枮?01210208891.0的中國專利申請公開了一種利用三孢布拉氏霉菌 發(fā)酵制備胡蘿卜素的方法,包括將三孢布拉氏霉菌ATCC14271( + )和ATCC14272(_)活化后, 經(jīng)過種子培養(yǎng),在優(yōu)選的發(fā)酵工藝條件下按一定的接種量和接種比接入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā) 酵,最終得到β-胡蘿卜素含量較高的菌絲體。但是,使用該菌種制得的β-胡蘿卜素產(chǎn)量較低, 最高產(chǎn)量不超過1.3g/L。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的主要目的是提供一種含有β_胡蘿卜素的菌粉、微生物油及油懸液。
[0006] 為達(dá)到上述目的,本發(fā)明提供含有β_胡蘿卜素的菌粉,所述β_胡蘿卜素由三孢布拉 霉突變株發(fā)酵所獲得,其特征在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉氏霉 Blakeslea trispora BT7251( + )CCTCCM 2014378;三抱布拉氏霉Blakeslea trispora BT7603(-)CCTCC M 2014379;或
[0007] 含有β-胡蘿卜素的微生物油,所述β-胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其 特征在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC),保藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7251( + )CCTCC M 2014378;三孢布拉氏霉Blakeslea trispora ΒΤ7603(_) CCTCC M 2014379?;颍?br>[0008] 含有β-胡蘿卜素的油懸液,所述β-胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其特 征在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC), 保藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7251( + )CCTCC M 2014378;三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7603(-)CCTCC M 2014379〇
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于:三孢布拉霉突變株進(jìn)行常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)后,可獲得較高 產(chǎn)量的胡蘿卜素。同時(shí),整個(gè)發(fā)酵工藝簡單,便于控制,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容,特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。
[ο。"] 三孢布拉霉突變株的選育方法
[0012] 1)取市售的三孢布拉霉正菌(保藏編號(hào)為:CCTCCAF97006( + ))和三孢布拉霉負(fù)菌 (保藏編號(hào)為:CCTCCAF96002(-))為出發(fā)菌株。
[0013] 2)將兩株出發(fā)菌株培養(yǎng)5天至孢子成熟。
[0014] 3)通過紗布或?yàn)V紙過濾得到純的孢子液,將孢子液注入到無菌培養(yǎng)皿,經(jīng)無菌風(fēng) 風(fēng)干,成為菌斑。將含菌斑的培養(yǎng)皿無菌移入高能粒子束注入機(jī)中,經(jīng)過高能離子束注入誘 變。
[0015] 4)將正、負(fù)菌株的菌斑分別用無菌水洗脫,獲得的正菌和負(fù)菌分別按照一對(duì)一的 關(guān)系接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板上的距離中心1/3距離處,于27°C,濕度 50 %的丨旦溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天,此時(shí)可見正、負(fù)菌株匍·菌絲在平板的中心處結(jié)合在一起,產(chǎn) 生紅色物質(zhì)。
[0016] 5)用30mm的打孔器將平板中心的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基取出,置于玻璃 試管中搗碎,加入5ml的乙酸乙酯浸泡,直至瓊脂的紅色褪盡,取上層乙酸乙酯檢測色素在 455nm處的吸光值。
[0017] 6)從吸光值較高樣品中選出30個(gè)平板,進(jìn)行第二輪高能離子束注入誘變,再進(jìn)行 第4和第5步的操作,得到吸光值較高的3個(gè)平板。
[0018] 7)從3個(gè)平板中獲得三株正、負(fù)菌株,3株正、負(fù)菌株進(jìn)行液體搖瓶培養(yǎng),根據(jù)搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果,篩選胡蘿卜素含量最高的正、負(fù)菌株,獲得本發(fā)明的三孢布拉霉突變株。 該三孢布拉霉菌株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏地址是, 中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào):三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7251( + )CCTCC M 2014378;三孢布拉氏霉Blakeslea trispora BT7603(-)CCTCC M 2014379。
[0019] 8)它具有以下生理生化特性:
[0020] 1、正、負(fù)菌生長于PDA斜面培養(yǎng)基,在27 °C下生長2天后,在培養(yǎng)基表面會(huì)形成白色 菌落,并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,正株菌絲淺黃色,負(fù)株菌絲鮮黃色,第4天菌絲布滿整個(gè)斜面。 [0021 ] 2、孢子形成于第3天,第4天布滿整個(gè)斜面;正株孢子黑,較為疏松,負(fù)菌孢子較小, 非常密集。
[0022] 3、用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基中可利用的碳源為:葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉等??衫玫牡?源主要為酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉、黃豆餅粉或玉米粉。
[0023] 本發(fā)明三孢布拉霉菌株的應(yīng)用
[0024] 以下均利用本發(fā)明的三孢布拉霉菌株作為起始菌種,使用不同的制備方法來制備 胡蘿卜素。
[0025] 方法 1
[0026] (1)菌種活化:無菌環(huán)境下將三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別接種到斜面HM培養(yǎng)基中, 置于培養(yǎng)箱內(nèi),27°C培養(yǎng)5d,待三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別長出孢子后,在無菌條件下,用無 菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來,并配制成均勻的孢子懸液,使正、負(fù)菌株孢子懸 液的濃度分別達(dá)到:IO3~IO 6個(gè)孢子/mL,IO3~IO6個(gè)孢子/mL。
[0027] (2)種子培養(yǎng):正、負(fù)菌株分別以孢子懸液的方式接種到種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng) 基裝在1000 mL的三角瓶中,裝液量IOOmL,培養(yǎng)溫度為27°C,轉(zhuǎn)速220r/min,正、負(fù)菌培養(yǎng)時(shí) 間為18小時(shí),得到三孢布拉霉正、負(fù)菌株種子液。
[0028] (3)種子擴(kuò)大培養(yǎng):最終發(fā)酵罐的體積為2m3,依次選用容積為10L,100L的種子罐 擴(kuò)大培養(yǎng)種子液,種子罐中培養(yǎng)基裝量為60%(體積比),將步驟(2)的搖瓶種子發(fā)酵液按照 正、負(fù)菌株比例為1:10的比例接種到種子罐中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng),其中種子培養(yǎng)基為:碳源 為葡萄糖;氮源為酵母粉和玉米粉;無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂;植物油為:玉米油。
[0029] (4)發(fā)酵培養(yǎng):種子罐中菌濃達(dá)到20%后,通過移種管道接入到裝有1.2m3發(fā)酵培 養(yǎng)基的2m3發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基配方,接種量5% (體積比),溫度: 27°C ± 1°C ;轉(zhuǎn)速:200r/min;風(fēng)量:2vvm;溶氧控制:20% 以上;周期:120h;罐壓:0· I^Mpac3PH 通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)到6.8,在72前流加40g/L的植物油。
[0030] (5)檢測。
[0031] A、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0032] 取IOmgP-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品,溶于IL乙酸乙酯中,制成母液。分別取2.5mI、5m 1、 7.5ml、IOml、12.5ml定容至25ml。測量β-胡蘿卜素各濃度在455nm處的吸光值,根據(jù)吸光值和 β-胡蘿卜素的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線y = ax+b (X單位為mg/L),R2 = 0.999。
[0033] B、發(fā)酵液樣品處理和檢測
[0034] a.將取V1mL發(fā)酵液用紗布過濾并用壓片機(jī)壓干,得到濕菌體,稱取濕菌體濕重,記 錄重量ω 1。計(jì)算菌體濕重濃度ci(g/L) = 1000*wi/vi。
[0035] b.稱取濕菌體0.02-0.03克,稱重并記錄重量w2(g)。
[0036] c.將稱重后的濕菌體置于勻漿器中,在勻漿器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至 菌渣無色為止。
[0037] d.將提取液移入25毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度并搖勻。
[0038] e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液,轉(zhuǎn)移至10毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定 容至刻度搖勻。
[0039] f.用可見光分光光度計(jì)在454nm處檢測樣品吸光度yi。
[0040] g.根據(jù)吸光值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酸乙酯溶液中胡蘿卜素的含量。
[0041] xi(mg/L) = (yi-b)/a
[0042] hj-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量計(jì)算公式為:P(g/L) =101(^0.025^/^/100(^
[0043] i ·若無 e步驟,則產(chǎn)量計(jì)算公式為P(g/L) =xi*0.025*ci/w2/1000。
[0044]最終測得β_胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量為3.2g/L。
[0045] 方法 2
[0046] (1)菌種活化:無菌環(huán)境下將三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別接種到斜面HM培養(yǎng)基中, 置于培養(yǎng)箱內(nèi),27°C培養(yǎng)5d,待三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別長出孢子后,在無菌條件下,用無 菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來,并配制成均勻的孢子懸液,使正、負(fù)菌株孢子懸 液的濃度分別達(dá)到:IO 3~IO6個(gè)孢子/mL,IO3~IO6個(gè)孢子/mL。
[0047] (2)種子培養(yǎng):正、負(fù)菌株分別以孢子懸液的方式接種到種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng) 基裝在1000 mL的三角瓶中,裝液量IOOmL,培養(yǎng)溫度為27°C,轉(zhuǎn)速220r/min,正、負(fù)菌培養(yǎng)時(shí) 間為18小時(shí),得到三孢布拉霉正、負(fù)菌株種子液。
[0048] (3)種子擴(kuò)大培養(yǎng):最終發(fā)酵罐的體積為12m3,依次選用容積為IOL,IOOL,2m 3的種 子罐擴(kuò)大培養(yǎng)種子液,種子罐中培養(yǎng)基裝量為60% (體積比),將步驟(2)的搖瓶種子發(fā)酵液 按照正、負(fù)菌株比例為1:15的比例接種到種子罐中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng),其中種子培養(yǎng)基為: 碳源為葡萄糖;氮源為酵母浸粉和玉米粉;無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂;植物油為:棉籽 油。
[0049] (4)發(fā)酵培養(yǎng):種子罐中菌濃達(dá)到20%后,通過移種管道接入到裝有7m3發(fā)酵培養(yǎng) 基的12m3發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基配方,接種量15% (體積比),溫度: 27°C ± 1°C ;轉(zhuǎn)速:200r/min;風(fēng)量:2vvm;溶氧控制:25%以上;周期:120h;罐壓:0 · 12Mpa。通 過氫氧化鈉調(diào)節(jié)到6.8,在72前流加40g/L的植物油。
[0050] (5)檢測。
[0051 ] A、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0052] 取IOmgP-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品,溶于IL乙酸乙酯中,制成母液。分別取2.5ml、5ml、 7.5ml、IOml、12.5ml定容至25ml。測量β-胡蘿卜素各濃度在455nm處的吸光值,根據(jù)吸光值和 β-胡蘿卜素的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線y = ax+b (X單位為mg/L),R2 = 0.999。
[0053] B、發(fā)酵液樣品處理和檢測
[0054] a.將取V1mL發(fā)酵液用紗布過濾并用壓片機(jī)壓干,得到濕菌體,稱取濕菌體濕重,記 錄重量ω 1。計(jì)算菌體濕重濃度ci(g/L) = 1000*wi/vi。
[0055] b.稱取濕菌體0.02-0.03克,稱重并記錄重量W2(g)。
[0056] c.將稱重后的濕菌體置于勻漿器中,在勻漿器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至 菌渣無色為止。
[0057] d.將提取液移入25毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度并搖勻。
[0058] e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液,轉(zhuǎn)移至10毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定 容至刻度搖勻。
[0059] f.用可見光分光光度計(jì)在454nm處檢測樣品吸光度yi。
[0060] g.根據(jù)吸光值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酸乙酯溶液中胡蘿卜素的含量。
[0061] xi(mg/L) = (yi-b)/a
[0062] hj-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量計(jì)算公式為:P(g/L) =101(^0.025^/^/100(^
[0063] i.若無 e步驟,則產(chǎn)量計(jì)算公式為?(8/〇 = 11*〇.〇25*(31/\¥2/1〇〇〇。最終測得0-胡蘿 卜素發(fā)酵產(chǎn)量為3.5g/L。
[0064]方法 3
[0065] (1)菌種活化;無菌環(huán)境下將三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別接種到斜面HM培養(yǎng)基中, 置于培養(yǎng)箱內(nèi),27°C培養(yǎng)5d,待三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別長出孢子后,在無菌條件下,用無 菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來,并配制成均勻的孢子懸液,使正、負(fù)菌株孢子懸 液的濃度分別達(dá)到:IO3~IO 6個(gè)孢子/mL,IO3~IO6個(gè)孢子/mL。
[0066] (2)種子培養(yǎng);正、負(fù)菌株分別以孢子懸液的方式接種到種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng) 基裝在1000 mL的三角瓶中,裝液量IOOmL,培養(yǎng)溫度為27°C,轉(zhuǎn)速220r/min,正、負(fù)菌培養(yǎng)時(shí) 間為18小時(shí),得到三孢布拉霉正、負(fù)菌株種子液。
[0067] (3)種子擴(kuò)大培養(yǎng);最終發(fā)酵罐的體積為45m3,依次選用容積為IOL,100L,2m 3,12m3 的種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)種子液,種子罐中培養(yǎng)基裝量為60 % (體積比),將步驟(2)的搖瓶種子發(fā) 酵液按照正、負(fù)菌株比例為1:20的比例接種到種子罐中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng),其中種子培養(yǎng) 基為:碳源為葡萄糖;氮源為酵母粉和玉米粉;無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂;植物油為:毛 豆油。
[0068] (4)發(fā)酵培養(yǎng);種子罐中菌濃達(dá)到20 %后,通過移種管道接入到裝有25m3發(fā)酵培養(yǎng) 基的50m3發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基配方,接種量20% (體積比),溫度: 27°C ± 1°C ;轉(zhuǎn)速:200r/min;風(fēng)量:2vvm;溶氧控制:30%以上;周期:120h;罐壓:0 · 12Mpa。通 過氫氧化鈉調(diào)節(jié)到6.8,在72前流加40g/L的植物油。
[0069] (5)檢測:
[0070] A、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0071] 取IOmgP-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品,溶于IL乙酸乙酯中,制成母液。分別取2.5mI、5m 1、 7.5ml、IOml、12.5ml定容至25ml。測量β-胡蘿卜素各濃度在455nm處的吸光值,根據(jù)吸光值和 β-胡蘿卜素的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線y = ax+b (X單位為mg/L),R2 = 0.999。
[0072] B、發(fā)酵液樣品處理和檢測
[0073] a.將取V1mL發(fā)酵液用紗布過濾并用壓片機(jī)壓干,得到濕菌體,稱取濕菌體濕重,記 錄重量ω 1。計(jì)算菌體濕重濃度ci(g/L) = 1000*wi/vi。
[0074] b.稱取濕菌體0.02-0.03克,稱重并記錄重量W2 (g)。
[0075] c.將稱重后的濕菌體置于勻漿器中,在勻漿器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至 菌渣無色為止。
[0076] d.將提取液移入25毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度并搖勻。
[0077] e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液,轉(zhuǎn)移至10毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定 容至刻度搖勻。
[0078] f.用可見光分光光度計(jì)在454nm處檢測樣品吸光度yi。
[0079] g.根據(jù)吸光值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酸乙酯溶液中β_胡蘿卜素的含量。
[0080] xi(mg/L) = (yi_b)/a〇
[0081 ] h.e-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量計(jì)算公式為:P(g/L) =101(^0.025^/^2/100(^
[0082] i.若無 e步驟,則產(chǎn)量計(jì)算公式為?(8/〇 = 11*〇.〇25*(31/\¥2/1〇〇〇。最終測得0-胡蘿 卜素發(fā)酵產(chǎn)量:4.6g/L。
[0083]方法 4
[0084] (1)菌種活化:無菌環(huán)境下將三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別接種到斜面HM培養(yǎng)基中, 置于培養(yǎng)箱內(nèi),27°C培養(yǎng)5d,待三孢布拉霉正、負(fù)菌株分別長出孢子后,在無菌條件下,用無 菌生理鹽水將斜面培養(yǎng)基中孢子刮洗下來,并配制成均勻的孢子懸液,使正、負(fù)菌株孢子懸 液的濃度分別達(dá)到:IO3~IO6個(gè)孢子/mL,IO3~IO6個(gè)孢子/mL。
[0085] (2)種子培養(yǎng):正、負(fù)菌株分別以孢子懸液的方式接種到種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng) 基裝在1000 mL的三角瓶中,裝液量IOOmL,培養(yǎng)溫度為27°C,轉(zhuǎn)速220r/min,正、負(fù)菌培養(yǎng)時(shí) 間為18小時(shí),得到三孢布拉霉正、負(fù)菌株種子液。
[0086] (3)種子擴(kuò)大培養(yǎng):最終發(fā)酵罐的體積為200m3,依次選用容積為10L,100L,5m3, 50m3的種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)種子液,種子罐中培養(yǎng)基裝量為60% (體積比),將步驟(2)的搖瓶種 子發(fā)酵液按照正、負(fù)菌株比例為1:25的比例接種到種子罐中進(jìn)行種子擴(kuò)大培養(yǎng),其中種子 培養(yǎng)基為:碳源為葡萄糖;氮源為酵母粉和豆餅粉;無機(jī)鹽為磷酸二氫鉀、硫酸鎂;植物油 為:毛棉油。
[0087] (4)發(fā)酵培養(yǎng):種子罐中菌濃達(dá)到20%后,通過移種管道接入到裝有120m3發(fā)酵培 養(yǎng)基的200m3發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)酵培養(yǎng)基同種子培養(yǎng)基配方,接種量25% (體積比),溫 度:27 °C ± I °C ;轉(zhuǎn)速:200r/min ;風(fēng)量:2vvm ;溶氧控制:35 %以上;周期:120h ;罐壓: 0.12Mpa。通過氫氧化鈉調(diào)節(jié)到6.8,在72前流加40g/L的植物油。
[0088] (5)檢測:
[0089] A、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
[0090] 取IOmgP-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品,溶于IL乙酸乙酯中,制成母液。分別取2.5mI、5m 1、 7.5ml、IOml、12.5ml定容至25ml。測量β-胡蘿卜素各濃度在455nm處的吸光值,根據(jù)吸光值和 β-胡蘿卜素的濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線y = ax+b (X單位為mg/L),R2 = 0.999。
[0091] B、發(fā)酵液樣品處理和檢測
[0092] a.將取V1mL發(fā)酵液用紗布過濾并用壓片機(jī)壓干,得到濕菌體,稱取濕菌體濕重,記 錄重量ω 1。計(jì)算菌體濕重濃度ci(g/L) = 1000*wi/vi。
[0093] b·稱取濕菌體0·02-0.03克,稱重并記錄重量w2(g)。
[0094] c.將稱重后的濕菌體置于勻漿器中,在勻漿器中加入3ml乙酸乙酯研磨提取直至 菌渣無色為止。
[0095] d.將提取液移入25毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度并搖勻。
[0096] e.用1毫升胖肚吸管吸取1毫升上述溶液,轉(zhuǎn)移至10毫升容量瓶中,用乙酸乙酯定 容至刻度搖勻。
[0097] f.用可見光分光光度計(jì)在454nm處檢測樣品吸光度yi。
[0098] g.根據(jù)吸光值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酸乙酯溶液中β_胡蘿卜素的含量。
[0099] xi(mg/L) = (yi_b)/a
[0100] hj-胡蘿卜素發(fā)酵產(chǎn)量計(jì)算公式為:P(g/L) =1010^0.025^(^/^/100(^
[01 01 ] i ·若無 e步驟,則產(chǎn)量計(jì)算公式為P(g/L) = X1*0 · 025*ci/w2/1000。最終測得β-胡蘿 卜素發(fā)酵產(chǎn)量:5.2g/L。
[0102] 從以上實(shí)施例可以看出,使用本發(fā)明三孢布拉霉正、負(fù)菌株突變株制備β-胡蘿卜 素,其工藝簡單、β-胡蘿卜素產(chǎn)量高,且便于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
[0103] 制備含有β-胡蘿卜素的菌粉。
[0104] 將以上任一方法所制得的β-胡蘿卜素發(fā)酵液經(jīng)離心或板框進(jìn)行固液分離,得到濕 菌體。按照以下參數(shù)使用離心噴霧的方式進(jìn)行干燥即得胡蘿卜素菌粉。
[0106] 制備含有β-胡蘿卜素的微生物油。
[0107] 將以上任一方法所制得的β-胡蘿卜素發(fā)酵液經(jīng)離心或板框進(jìn)行固液分離,得到濕 菌體,加入1:10(m/V)的無水乙醇,混勻后用膠體磨循環(huán)破碎1小時(shí),過濾得到乙醇濾液及破 碎濕菌體。破碎濕菌體加入I: I〇 (m/v)的乙酸乙酯,55攝氏度下萃取三次,每次1小時(shí)。每次 過濾得到溶劑相及濾渣。收集溶劑相,真空脫溶后得到含胡蘿卜素的微生物油。
[0108] 制備含有胡蘿卜素的晶體。
[0109]將前述制得的含有胡蘿卜素的微生物油中加入l:l(m/v)的乙酸乙酯,在5攝氏度 下緩慢攪拌結(jié)晶4小時(shí),過濾,得到含有β-胡蘿卜素粗晶體。進(jìn)一步通過真空干燥脫除溶劑, 得到含有胡蘿卜素晶體成品。
[0110] 制備含有β-胡蘿卜素的油懸液。
[0111] 將前述制得的β-胡蘿卜素晶體成品按目標(biāo)重量比(例如30%)與葵花籽油混合,抽 真空,加熱至150攝氏度,攪拌10分鐘,待β-胡蘿卜素熔融并混合均勻后,快速降溫至室溫。即 制得胡蘿卜素油懸液。
[0112] 制備含有胡蘿卜素的微膠囊。
[0113] 首先,按照下述配方經(jīng)3500rpm的剪切機(jī)剪切得到壁材溶液。
[0115]然后,邊剪切邊加入前述制得的含有β-胡蘿卜素的微生物油16kg,添加完后在 8000rpm的轉(zhuǎn)速下繼續(xù)剪切l(wèi)Omin。剪切結(jié)束后,在40MPa下進(jìn)行均質(zhì),得到的均質(zhì)液在下述 條件下進(jìn)行壓力式噴霧即可得到胡蘿卜素的微膠囊。
[0117] 制備含有胡蘿卜素的脂肪粉。
[0118] 首先,將前述制得的含有β-胡蘿卜素的微生物油16kg與DHA藻油IOkg在常溫下使用 攪拌IO Or pm混合I Om i η,得到混合油脂。
[0119] 然后,按照下述配方經(jīng)4500rpm的剪切機(jī)剪切得到壁材溶液。
[0122]接著,邊剪切邊加入前述制得的含有β-胡蘿卜素和DHA的混合油26kg,添加完后在 1000 Orpm的轉(zhuǎn)速下繼續(xù)剪切15min。剪切結(jié)束后,在40MPa下進(jìn)行均質(zhì),得到的均質(zhì)液在下述 條件下進(jìn)行離心噴霧即可得到胡蘿卜素和DHA
的混合脂肪粉。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 含有β-胡蘿卜素的菌粉,所述β-胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其特征在 于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏 地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉霉BT7251( + ) CCTCC Μ 2014378;三 孢布拉霉 BT7603(_) CCTCC Μ 2014379。2. 含有胡蘿卜素的微生物油,所述胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其特 征在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC), 保藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉霉BT7251 ( + ) CCTCC Μ 2014378;三孢布拉霉 BT7603(_) CCTCC Μ 2014379。3. 含有胡蘿卜素的油懸液,所述胡蘿卜素由三孢布拉霉突變株發(fā)酵所獲得,其特征 在于:所述三孢布拉霉突變株于2014年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保 藏地址是,中國,武漢,武漢大學(xué),保藏編號(hào)為:三孢布拉霉BT7251( + ) CCTCC Μ 2014378; 三孢布拉霉 BT7603(_) CCTCC Μ 2014379。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105861323SQ201610276071
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月17日
【發(fā)明人】汪志明, 李翔宇, 余超, 陸姝歡, 周強(qiáng), 肖敏, 張玉良
【申請人】嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司