本發(fā)明涉及一種頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法。
背景技術：
頭花蓼(Polygonum capitatum Buch-Ham.ex D.Don)為蓼科多年生草本植物，是苗族地區(qū)的常用草藥，主要用于清熱解毒、利尿通淋、腎盂腎炎、尿路結石、膀胱炎、痢疾、風濕痛、跌打損傷、尿道感染、瘡瘍濕疹等癥。目前開發(fā)出以頭花蓼為單方的熱淋清膠囊、熱淋清顆粒等制劑。并收載于《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑》中，2000年進入國家基本藥物目錄。苗藥頭花蓼是貴州省中藥現(xiàn)代化2010年前重點發(fā)展的“六大苗藥”和“十五”期間重點培育發(fā)展的“七大中藥產業(yè)鏈”中的品種之一。
現(xiàn)階段，由于頭花蓼的栽培資源在遺傳背景來上來源于混雜野生群體，人工種植種源缺乏，規(guī)模繁殖和試種品種單一?，F(xiàn)在頭花蓼不僅存在連作障礙，而且一些栽培產區(qū)的種質資源已產生了明顯的遺傳分化，植株發(fā)生變異，產量和品質下降，這不僅嚴重影響了頭花蓼栽培的推廣及整個產業(yè)的良性發(fā)展，也制約了頭花蓼良種選育的進程。迄今為止，有研究者通過帶節(jié)莖段、莖尖、無菌萌發(fā)苗獲取頂芽為外殖體開展組織培養(yǎng)快速繁殖，但缺乏再生體系的研究。因此，開展頭花蓼再生體系和毛狀根培養(yǎng)的研究，以期為頭花蓼種質資源的改良和黃酮化合物的生產提供基礎的參考資料。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法，能開展頭花蓼再生體系和毛狀根培養(yǎng)的研究。
為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案，本發(fā)明的頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法是。
1.菌種活化：將-70□下保存的發(fā)根農桿菌(C58C1)菌種按1：1000的比例接種于YEB液體培養(yǎng)基中，同時添加Rif(利福平)至濃度40mg/L，28□、200rpm(轉/分鐘)活化24h，再按1：1000的比例轉至YEB+20mg/L Kan(卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，添加濃度為100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm進行二次活化，6～7h后菌液A600達0.3～0.4時接種侵染頭花蓼幼苗外植體。
2.毛狀根誘導：將無菌真葉、幼莖用活化好的菌液侵染外植體5～20min，取出后用濾紙吸干菌液，置于MS+100mg/L AS的培養(yǎng)基上，25±1□黑暗共培養(yǎng)0～3d，用無菌水沖洗干凈后接種于附加500mg/L Cef(頭孢噻腭鈉)的MS固體培養(yǎng)基上，進行篩選培養(yǎng)，反復繼代除菌至無菌，再轉入MS固體培養(yǎng)基上誘導毛狀根。
3.毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立：待毛狀根長約0.5cm時，選擇顏色白且粗壯的毛狀根，將其剪下，接種于1/2MS+IBA0.2mg/L液體培養(yǎng)基中，135rpm，25±1□條件下暗培養(yǎng)，每7d繼代一次；或不剪下連同外植體一起接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，25±1□暗培養(yǎng)，每4d繼代一次。50d后收獲單克隆毛狀根并測鮮重，每個單克隆取 少量用于分子檢測，其余液氮速凍后備用。
4.毛狀根的PCR檢測：毛狀根和非轉化根DNA的提取用常規(guī)CTAB法。Ri質粒序列設計rolB和rolC的引物參考文獻[9]。PCR條件為94□預變性5分鐘；94□變性40s，55□退火40s，72反應1min，35個循環(huán)；最后72□延伸8min。PCR擴增產物用0.1％瓊脂糖凝膠(Gold-view染色)電泳(120V、100mA、20min)進行檢測。電泳結果于凝膠成像系統(tǒng)(UV 260nm)下觀察拍照。
本發(fā)明的有益效果是：該頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法，建立了頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系，為實現(xiàn)黃酮化合物的工業(yè)化大規(guī)模生產奠定基礎，此外，所有過程均在人的控制范圍，可消除農藥和其它重金屬的污染，利于中藥產品的質量控制，具有良好的社會效益。
具體實施方式
本發(fā)明的一種頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法是：
1.菌種活化：將-70□下保存的發(fā)根農桿菌(C58C1)菌種按1：1000的比例接種于YEB液體培養(yǎng)基中，同時添加Rif(利福平)至濃度40mg/L，28□、200rpm(轉/分鐘)活化24h，再按1：1000的比例轉至YEB+20mg/L Kan(卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，添加濃度為100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm進行二次活化，6～7h后菌液A600達0.3～0.4時接種侵染頭花蓼幼苗外植體。
2.毛狀根誘導：將無菌真葉、幼莖用活化好的菌液侵染外植體5～20min，取出后用濾紙吸干菌液，置于MS+100mg/L AS的培養(yǎng)基上， 25±1□黑暗共培養(yǎng)0～3d，用無菌水沖洗干凈后接種于附加500mg/L Cef(頭孢噻腭鈉)的MS固體培養(yǎng)基上，進行篩選培養(yǎng)，反復繼代除菌至無菌，再轉入MS固體培養(yǎng)基上誘導毛狀根。
3.毛狀根離體培養(yǎng)體系的建立：待毛狀根長約0.5cm時，選擇顏色白且粗壯的毛狀根，將其剪下，接種于1/2MS+IBA0.2mg/L液體培養(yǎng)基中，135rpm，25±1□條件下暗培養(yǎng)，每7d繼代一次；或不剪下連同外植體一起接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，25±1□暗培養(yǎng)，每4d繼代一次。50d后收獲單克隆毛狀根并測鮮重，每個單克隆取少量用于分子檢測，其余液氮速凍后備用。
4.毛狀根的PCR檢測：毛狀根和非轉化根DNA的提取用常規(guī)CTAB法。Ri質粒序列設計rolB和rolC的引物參考文獻[9]。PCR條件為94□預變性5分鐘；94□變性40s，55□退火40s，72反應1min，35個循環(huán)；最后72□延伸8min。PCR擴增產物用0.1％瓊脂糖凝膠(Gold-view染色)電泳(120V、100mA、20min)進行檢測。電泳結果于凝膠成像系統(tǒng)(UV 260nm)下觀察拍照。
該頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系建立的方法，建立了頭花蓼毛狀根培養(yǎng)體系，為實現(xiàn)黃酮化合物的工業(yè)化大規(guī)模生產奠定基礎，此外，所有過程均在人的控制范圍，可消除農藥和其它重金屬的污染，利于中藥產品的質量控制，具有良好的社會效益。
對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其 他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內，不應將權利要求中的任何標記視為限制所涉及的權利要求。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。