本發(fā)明涉及一種GyV5新型環(huán)形病毒VP3蛋白的制備方法。此發(fā)明可直接提供VP3蛋白作為GyV5診斷抗原；作為免疫原獲得抗VP3多克隆抗體；為開展GyV5血清學(xué)流行病學(xué)調(diào)查及VP3功能研究提供有效免疫學(xué)試劑，填補(bǔ)國內(nèi)外空白。

背景技術(shù)：

雞傳染性貧血病毒(Chicken Infectious Anemia Virus，CAV)一直被認(rèn)為是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)中環(huán)形病毒屬(Gyrovirus)唯一成員。直到2011年，Rijsewijk等從發(fā)病雞的血清樣品中檢測(cè)到新型環(huán)形病毒序列，即環(huán)形病毒屬中第二個(gè)成員，命名為AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮膚棉試樣品中檢測(cè)到首個(gè)與AGV2高度同源的人源環(huán)形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型環(huán)形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)鑒定，并具有潛在的公共衛(wèi)生意義。然目前尚無檢測(cè)GyV5抗原及其抗體的血清學(xué)方法。因此，對(duì)GyV5病毒早期表達(dá)蛋白VP3基因在體外進(jìn)行克隆，構(gòu)建VP3表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)其表達(dá)，將為深入開展GyV5蛋白抗原及其抗體檢測(cè)、血清學(xué)調(diào)查，明確GyV5在雞群以及人群中的感染復(fù)制情況提供有效診斷試劑；并為探究GyV5VP3生物學(xué)功能具有重要意義。在傳統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建中，往往需要設(shè)計(jì)選擇限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切、連接的方法構(gòu)建載體，實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。但有時(shí)由于找不到合適的酶切位點(diǎn)，往往導(dǎo)致克隆過程繁瑣，效率低下。本發(fā)明中將利用不依賴于酶切位點(diǎn)及限制性內(nèi)切酶的重組酶ExnaseTM II體外重組技術(shù)克隆GyV5病毒VP3基因，簡(jiǎn)化克隆過程，實(shí)現(xiàn)VP3基因快速克隆表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種GyV5新型環(huán)形病毒VP3蛋白制備方法，實(shí)現(xiàn)VP3蛋白的表達(dá)。

本發(fā)明的原理和最核心的關(guān)鍵技術(shù)是科學(xué)地設(shè)計(jì)擴(kuò)增出pGEX-6p-1線性化載體以及GyV5病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重組酶ExnaseTM II不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接在體外快速重組克隆VP3，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、實(shí)現(xiàn)GyV5的VP3蛋白與GST的融合表達(dá)，并獲得純化的VP3融合蛋白。

本發(fā)明所述的GyV5新型環(huán)形病毒VP3蛋白的制備方法，以pGEX-6p-1質(zhì)粒以及GyV5病毒VP3基因?yàn)槟０澹琍CR分別擴(kuò)增出含pGEX-6p-1線性化載體以及GyV5病毒VP3基因片段(附圖1，步驟1)，并利用重組酶ExnaseTM II進(jìn)行快速重組克隆(附圖1，步驟2)；陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)VP3蛋白表達(dá)(附圖1，步驟3)。

上述方法包括以下步驟：

1)利用下述引物，以pGEX-6p-1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出pGEX-6p-1線性化表達(dá)載體；

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQ ID NO.2)；

2)利用下述引物，以GyV5-VP3基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增出VP3基因；

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTTGGCTGACGAGTT3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAGTTCTTCTTGTA3’(SEQ ID NO.4)；

3)利用重組酶ExnaseTM II對(duì)步驟1)和2)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行快速重組克?。魂栃钥寺〗?jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行表達(dá)鑒定與純化。

本發(fā)明公開了PCR擴(kuò)增pGEX-6p-1線性化載體引物以及PCR擴(kuò)增GyV5病毒VP3基因引物序列。本發(fā)明還公開了一種基于重組酶ExnaseTM II將線性化的pGEX-6p-1線性化載體與GyV5病毒VP3基因片段PCR產(chǎn)物不經(jīng)酶切連接反應(yīng)，直接重組克隆技術(shù)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)VP3蛋白表達(dá)。

本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物及基于重組酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速構(gòu)建 GyV5病毒VP3基因的原核表達(dá)載體。本發(fā)明獲得的GyV5病毒VP3表達(dá)及純化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作為GyV5診斷抗原；作為免疫原獲得抗VP3多克隆抗體；為開展GyV5流行病學(xué)調(diào)查提供有效診斷試劑；并為進(jìn)一步探究VP3生物學(xué)功能具有重要意義。

附圖說明

圖1一種GyV5新型環(huán)形病毒VP3蛋白制備方法策略示意圖

步驟1：以人工合成的GyV5病毒VP3基因?yàn)槟０澹靡?，PCR分別擴(kuò)增出含pGEX-6p-1線性化載體以及GyV5病毒VP3基因片段。

步驟2：利用重組酶ExnaseTM II進(jìn)行快速重組克隆。

步驟3：陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)VP3蛋白表達(dá)。

圖2 PCR擴(kuò)增GyV5病毒VP3片段

泳道1，GyV5病毒VP3片段PCR產(chǎn)物；泳道M，DNA Marker。

圖3 PCR擴(kuò)增線性化載體pGEX-6p-1

泳道1，線性化載體pGEX-6p-1的PCR產(chǎn)物；泳道M，DNA Marker。

圖4 SDS-PAGE分析GyV5病毒VP3基因的表達(dá)

泳道1、2代表IPTG誘導(dǎo)的VP3超聲裂解樣品上清和沉淀；泳道3、4是純化的VP3蛋白；泳道5、6是GST超聲裂解樣品上清和沉淀。

圖5 Western blot鑒定抗AGV5VP3蛋白多克隆抗體

1,轉(zhuǎn)染EGFP-VP3表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解物；2，為轉(zhuǎn)染對(duì)照EGFP表達(dá)質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解物。

具體實(shí)施方式

為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，以下實(shí)施方式結(jié)合附圖給出了GyV5新型環(huán)形病毒VP3蛋白制備的示例。

實(shí)施例

1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增含pGEX-6p-1線性化載體以及GyV5病毒VP3基因片段引物：擴(kuò)增pGEX-6p-1線性化載體上游引物位于pGEX-6p-1質(zhì)粒1022-1047位；且在5’端帶有額外TAA堿基；擴(kuò)增pGEX-6p-1線性化載體下游引物位于pGEX-6p-1質(zhì)粒916-941位；且在5’端帶有額外CAT堿基。擴(kuò)增GyV5病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密碼ATG及其后14個(gè)堿基，且在5’端帶有16個(gè)與pGEX-6p-1線性化載體下游引物反向互補(bǔ)堿基；擴(kuò)增GyV5病毒 VP3基因下游引物包括VP3基因終止密碼TAA及其前14個(gè)堿基，且在5’端帶有16個(gè)與pGEX-6p-1線性化載體上游引物反向互補(bǔ)堿基。具體引物序列如下，由Life Technologies上海賽默飛世爾科技公司合成。

pGEX-6p-1線性化表達(dá)載體引物：

上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQ ID NO.2)；

GyV5-VP3基因引物：

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTTGGCTGACGAGTT3’(SEQ ID NO.3)；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAAAGTTCTTCTTGTA3’(SEQ ID NO.4)。

2)pGEX-6p-1線性化載體以及GyV5病毒VP3基因片段PCR擴(kuò)增：以pGEX-6p-1質(zhì)粒以及合成的GyV5VP3基因(GenBank:KF294861.1)為模版，上述1)中引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖1中的步驟1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：40μl水，5μl 10倍緩沖液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的pGEX-6p-1質(zhì)?；騪cGyV5-VP3質(zhì)粒，1μl商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃變性5分鐘,隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94℃變性30秒,58℃退火30秒，72℃延伸3分鐘),最后72℃延伸10分鐘。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。如圖2所示，其中泳道M為DNA Marker，其中泳道1為GyV5病毒VP3片段PCR產(chǎn)物。如圖3所示，其中泳道M為DNA Marker，泳道1為線性化載體pGEX-6p-1的PCR產(chǎn)物。

3)GyV5病毒VP3片段快速克隆pGEX-6p-1載體：將以上純化的表達(dá)線性化載體pGEX-6p-1以及GyV5病毒VP3片段PCR產(chǎn)物在商品化重組酶ExnaseTM II的作用下進(jìn)行重組克隆。如圖1中的步驟2。具體重組反應(yīng)體系如下：純化的GyV5病毒VP3片段產(chǎn)物50-100ng，純化的pGEX-6p-1表達(dá)線性化載體50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的緩沖液，其它補(bǔ)加水 至20μl。反應(yīng)物于37℃作用30分鐘后，置冰上5分鐘。隨后將20μl反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到常規(guī)感受態(tài)細(xì)菌，涂LB板。次日挑取細(xì)菌克隆進(jìn)行質(zhì)粒制備，陽性克隆鑒定。

4)GyV5病毒VP3蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其純化:將獲得的含GyV5病毒VP3基因的陽性克隆(命名為pGEX-VP3)轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(0.1mmol/ml)后收集細(xì)菌，進(jìn)行超聲(40赫茲)破碎。將超聲破碎樣品離心后分上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE(5％的濃縮膠，10％的分離膠)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST單抗為一抗，羊抗鼠HRP標(biāo)記的IgG為二抗)鑒定表達(dá)。在圖4中，VP3蛋白可在超聲破碎樣品上清中以可溶性形式存在。在確定VP3的可溶性表達(dá)基礎(chǔ)上，將超聲破碎樣品上清通過GST純化柱進(jìn)行了VP3蛋白的純化。圖4中泳道1、2代表IPTG誘導(dǎo)的VP3純化前超聲裂解樣品上清和沉淀，泳道3、4是VP3蛋白純化后SDS-PAGE分析結(jié)果,泳道5、6是GST超聲裂解樣品上清和沉淀。為進(jìn)一步測(cè)定純化后蛋白的抗原性，評(píng)價(jià)其能否作為免疫原及診斷用抗原，將純化的VP3蛋白免疫小鼠，并通過western blot分析證明了獲得的抗GyV5病毒VP3蛋白的小鼠多抗能與在293T細(xì)胞中表達(dá)的VP3蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)(圖5)。這一結(jié)果表明本發(fā)明表達(dá)的VP3蛋白具有很好的反應(yīng)性及免疫原性，在GyV5血清學(xué)診斷中將具有良好的應(yīng)用前景。