本申請(qǐng)描述了使用多個(gè)捕獲物(例如抗體)和多個(gè)檢測(cè)物(例如適體)來檢測(cè)和定量樣品中的分析物分子的方法和系統(tǒng)。

發(fā)明背景

本申請(qǐng)引用的所有出版物均通過引用以其整體并入，其程度就如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被具體地和單獨(dú)地指明通過引用并入一樣。以下描述包括可以用于理解本發(fā)明的信息。這不是承認(rèn)本申請(qǐng)所提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與目前要求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，或任何明確地或隱含地引用的出版物是現(xiàn)有技術(shù)。

幾乎所有用于檢測(cè)靶分子的方法在本質(zhì)上是模擬的，其從總樣品量測(cè)量平均信號(hào)。例如，通過利用吸光度或熒光，從吸光度或熒光信號(hào)推測(cè)被測(cè)量的靶標(biāo)濃度，所述吸光度或熒光信號(hào)為存在的吸收或發(fā)熒光種類的量的函數(shù)。用于測(cè)定特定蛋白量的目前的金標(biāo)準(zhǔn)是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，其需要大體積而所述大體積最終稀釋反應(yīng)產(chǎn)物，這需要數(shù)百萬酶標(biāo)記物來產(chǎn)生利用常規(guī)酶標(biāo)儀可檢測(cè)的信號(hào)。因此，為了在100μL體積中產(chǎn)生100萬個(gè)酶標(biāo)記物，靶分析物的濃度需要至少為亞皮摩爾(即，pg/ml，假定50kDa分子量)。因此ELISA的靈敏度被限制在皮摩爾范圍及以上。據(jù)估計(jì)，人血清中只有10％的蛋白質(zhì)可用目前可用的方法來檢測(cè)。此外，最具生物學(xué)意義的蛋白質(zhì)和代謝物以低豐度存在。因此，發(fā)現(xiàn)有用的蛋白質(zhì)和代謝物生物標(biāo)志物及生物標(biāo)志物模式受到了限制。

單分子計(jì)數(shù)在本質(zhì)上是數(shù)字化的，其中每一個(gè)靶分子產(chǎn)生可被計(jì)數(shù)的信號(hào)。測(cè)量信號(hào)的存在或不存在比量化信號(hào)的絕對(duì)量容易得多。因此，數(shù)字化ELISA信號(hào)具有顯著提高蛋白質(zhì)分析的檢測(cè)極限的潛力。擴(kuò)增是所有單分子檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵部分。用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的一種擴(kuò)增方法是使用酶標(biāo)記物，其可通過催化底物分子轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的產(chǎn)物分子而產(chǎn)生許多的可檢測(cè)產(chǎn)物分子。擴(kuò)增單分子的另一種方式是通過復(fù)制目標(biāo)分子。該方法是許多核酸檢測(cè)法的基礎(chǔ)，在所述方法中，使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來擴(kuò)增單個(gè)分子，從而產(chǎn)生數(shù)千至數(shù)百萬拷貝的特定DNA序列。因?yàn)楹怂岬臄U(kuò)增要高效和魯棒得多，通過檢測(cè)核酸的方法所能達(dá)到的靈敏度與檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法相比要高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)。

本申請(qǐng)描述了利用數(shù)字核酸檢測(cè)和定量法進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的方法和系統(tǒng)。具體地，核酸適體以及數(shù)字DNA擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)被用來將獲自常規(guī)ELISA的模擬信號(hào)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)以用于單分子計(jì)數(shù)。本申請(qǐng)所述的方法和系統(tǒng)利用適體作為蛋白質(zhì)與核酸之間的翻譯子(translator)。適體是基于核酸的親和試劑，其可以以高親和力和特異性結(jié)合它們的靶分子。在本申請(qǐng)中，用適體替代抗體作為夾心免疫測(cè)定中的檢測(cè)試劑。適體不僅用作檢測(cè)親和試劑，而且還用作從蛋白質(zhì)至核酸的“翻譯子”。因?yàn)楹怂徇m體可通過酶反應(yīng)被容易地?cái)U(kuò)增，因此可將數(shù)字核酸擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)，這可顯著提高測(cè)定靈敏性。本申請(qǐng)所述的方法相比ELISA進(jìn)行了改進(jìn)，因?yàn)閺牡鞍踪|(zhì)至核酸的翻譯和測(cè)量的數(shù)字化都產(chǎn)生了前所未有的測(cè)定性能。

發(fā)明概述

結(jié)合系統(tǒng)，組合物和方法而描述和說明的下列實(shí)施方式及其方面是示例性的和說明性的，而非對(duì)范圍進(jìn)行限制。

本申請(qǐng)中提供了用于檢測(cè)樣品中的靶分子或粒子的方法。所述方法包括使樣品暴露于多個(gè)捕獲物，各所述捕獲物包括對(duì)于靶分子或粒子具有親和力的結(jié)合面，以形成捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物；去除未與靶分子或粒子復(fù)合的捕獲物；使捕獲物與靶分子或粒子的復(fù)合物暴露于多個(gè)檢測(cè)物以形成捕獲物、靶分子或粒子及檢測(cè)物之間的復(fù)合物；去除不與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物；洗脫與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物；將檢測(cè)物分隔至隔室中；和檢測(cè)每一個(gè)隔室中檢測(cè)物的存在或不存在，以檢測(cè)樣品中的靶分子或粒子。

本申請(qǐng)還描述了用于檢測(cè)樣品中的靶分子的方法。該方法包括將樣品暴露于固體載體，所述載體包含對(duì)靶分子具有特異性的捕獲抗體，以形成靶-抗體復(fù)合物；去除未結(jié)合的樣品和抗體；使靶-抗體復(fù)合物暴露于特異于所述靶的檢測(cè)適體；去除未結(jié)合的適體；洗脫與靶-抗體復(fù)合的適體；將適體分隔至隔室中；和檢測(cè)每一個(gè)隔室中適體存在或不存在，以檢測(cè)樣品中的靶分子。

還提供了用于檢測(cè)樣品中的靶分子或粒子的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括一組反應(yīng)容器，其中至少一個(gè)反應(yīng)容器不包含樣品并且至少一個(gè)容器包含不含靶分子或粒子的對(duì)照樣品；多個(gè)捕獲物，各所述捕獲物包括對(duì)于靶分子或粒子具有親和力的結(jié)合面以形成捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物；多個(gè)檢測(cè)物，從而形成捕獲物、靶分子或粒子與檢測(cè)物之間的復(fù)合物；和用于洗脫與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物的試劑。

在各種實(shí)施方式中，樣品是流體樣品并且可以包括但不限于血液，血漿或尿。

在一些實(shí)施方式中，靶標(biāo)為蛋白質(zhì)或核酸或其組合。所述蛋白質(zhì)可以是單體或多聚體。其它靶標(biāo)可包括但不限于，例如，小分子、氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基糖苷類、抗生素、肽、蛋白質(zhì)、翻譯后修飾、核酸或其組合。

在一些實(shí)施方式中，多個(gè)捕獲物為下述中的任何一種或多種：抗體、適體、多肽、受體、配體、小分子或靶分子的任何其它親和試劑或其組合。在一些實(shí)施方式中，適體是核酸(DNA、RNA、XNA(核酸類似物))適體。在一些實(shí)施方式中，適體是肽適體。

在一些實(shí)施方式中，多個(gè)檢測(cè)物包括但不限于下述中的任何一種或多種：抗體、適體、多肽、受體、配體、小分子或靶分子的任何其它親和試劑或其組合。在一些實(shí)施方式中，適體是核酸(DNA、RNA、XNA(核酸類似物))適體。在一些實(shí)施方式中，適體是肽適體。

在一些實(shí)施方式中，多個(gè)檢測(cè)物包括與親和試劑綴合的DNA。在示例性實(shí)施方式中，DNA可與下述中的任何一種或多種綴合：抗體、多肽、受體、配體、小分子或適合于靶分子的任何其它親和試劑。在各種實(shí)施方式中，所述DNA作為用于數(shù)字檢測(cè)步驟的信號(hào)分子。

在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)物是一種或多種適體?？蓪⑦m體綴合于親和試劑。在示例性實(shí)施方式中，可將適體綴合于下述中的任何一種或多種：抗體、多肽、受體、配體、小分子或適合于靶分子的任何其它親和試劑。在一些實(shí)施方式中，適體是核酸(DNA、RNA、XNA(核酸類似物))適體。在一些實(shí)施方式中，適體是肽適體。在各種實(shí)施方式中，適體作為用于數(shù)字檢測(cè)步驟的信號(hào)分子。

在一些實(shí)施方式中，多個(gè)捕獲物是抗體并且多個(gè)檢測(cè)物是適體。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)捕獲物是適體并且多個(gè)檢測(cè)物是適體。在一些實(shí)施方式中，可將適體綴合于親和試劑。在一些實(shí)施方式中，不將適體綴合于親和試劑。在各種實(shí)施方式中，適體作為用于數(shù)字檢測(cè)步驟的信號(hào)分子。

多個(gè)捕獲物可結(jié)合于多種固體載體。在各個(gè)方面，所述多種固體載體包括但不限于：珠子、納米粒子、納米管(例如，碳納米管)、微量滴定板、微流體通道、電極、囊泡、細(xì)胞、膜(例如硝化纖維素)、管或其組合。

在一些實(shí)施方式中，適體通過數(shù)字檢測(cè)法來檢測(cè)。數(shù)字檢測(cè)法是下述中的任何一種或多種：數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、數(shù)字滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、數(shù)字環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)或基于核酸的數(shù)字?jǐn)U增(NASBA)。

在一些方面，所述洗脫檢測(cè)物被分隔至隔室中，從而每個(gè)隔室由0或1個(gè)檢測(cè)物組成。含有一個(gè)檢測(cè)物的隔室代表一個(gè)靶分子的存在。在一些方面，樣品中的靶分子的絕對(duì)濃度是含有一個(gè)適體的隔室的總數(shù)除以樣品的體積。

在一些實(shí)施方式中，樣品中靶分子或粒子的濃度小于約50x10^-15M，或小于約40x10^-15M，或小于約30x10^-15M，或小于約20x10^-15M，或小于約10x10^-15M，或小于約5x10^-15M，或小于約1x10^-15M。流體樣品中的靶分子或粒子的濃度可至少部分地通過測(cè)量參數(shù)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的比較來測(cè)定。

附圖簡(jiǎn)述

在參考附圖中說明了示例性的實(shí)施方式。本申請(qǐng)公開的實(shí)施方式和附圖旨在被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。

圖1根據(jù)本發(fā)明的各種實(shí)施方式描繪了基于適體的數(shù)字檢測(cè)和定量的示意圖。(a)將靶分子從初始樣品捕獲到珠子上，并使用適體進(jìn)行標(biāo)記。檢測(cè)適體相應(yīng)于靶分析物的一對(duì)一代表，并隨后從珠子表面被洗脫。(b)通過將洗脫的檢測(cè)適體分入數(shù)百至甚至數(shù)百萬個(gè)單獨(dú)的隔室(例如，油包水微滴)，以使得每一個(gè)隔室將含有0或僅1個(gè)檢測(cè)適體來進(jìn)行單DNA分子計(jì)數(shù)。進(jìn)行終點(diǎn)擴(kuò)增，并計(jì)數(shù)熒光反應(yīng)的數(shù)目。擴(kuò)增呈陽性的“亮”反應(yīng)各自含有1個(gè)靶分子，而擴(kuò)增呈陰性的“暗”反應(yīng)不含靶標(biāo)。

發(fā)明詳述

本申請(qǐng)引用的所有參考文獻(xiàn)通過引用整體并入，就如同顯示全文一樣。除非另外定義，否則本申請(qǐng)所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；以及Sambrook和Russel,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請(qǐng)中使用的許多術(shù)語的一般性指引。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可用于實(shí)施本發(fā)明的、與本申請(qǐng)所述的方法和材料類似或等同的許多方法和材料。的確，本發(fā)明絕不限于所描述的方法和材料。為了本發(fā)明的目的，在下文中定義以下術(shù)語。

如本申請(qǐng)所使用的，“載體”或“固相載體”是指使捕獲物暴露于樣品之前，捕獲物直接或間接所結(jié)合的材料。

如本申請(qǐng)所用的，“捕獲物”是指結(jié)合樣品中的靶分子或粒子的物體。所述靶分子或粒子是待檢測(cè)和/或定量的目標(biāo)分析物。所述捕獲物被用于將目標(biāo)靶分子或粒子與其余樣品分離。當(dāng)結(jié)合時(shí)，捕獲物與靶分子或粒子形成復(fù)合物。

如本申請(qǐng)所使用的，“檢測(cè)物”是指在靶分子或粒子上結(jié)合的位置不同于捕獲物在所述靶分子或粒子上的結(jié)合位置的物體。當(dāng)與捕獲物復(fù)合時(shí)或當(dāng)不與捕獲物復(fù)合時(shí)，檢測(cè)物可結(jié)合于靶分子或粒子。所述檢測(cè)物被檢測(cè)和定量，并且檢測(cè)物的量指示原始樣品中的靶分子或粒子的量。

檢測(cè)和定量非核酸分子(蛋白質(zhì)和小分子分析物)的能力已經(jīng)滯后于分析核酸的能力。這是因?yàn)楹怂岬莫?dú)特性質(zhì)：可使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，通過酶來呈指數(shù)地?cái)U(kuò)增它們，以產(chǎn)生數(shù)千至數(shù)百萬拷貝。另外，由于核酸的擴(kuò)增是高效和魯棒的，因此可使用單分子計(jì)數(shù)來數(shù)字化核酸的測(cè)量，其中將每一個(gè)DNA分子分離至離散的空間單元中并進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生信號(hào)可計(jì)數(shù)的單元。所述數(shù)字化使得能夠檢測(cè)單分子，從而產(chǎn)生前所未有的定量和靈敏度。然而，該能力還未被擴(kuò)展至非核酸靶標(biāo)，因?yàn)槊复僦笖?shù)擴(kuò)增對(duì)于蛋白質(zhì)和小分子是不可能的。本申請(qǐng)所描的方法和系統(tǒng)克服該限制并使得能夠?qū)θ魏伟蟹肿舆M(jìn)行通用的數(shù)字檢測(cè)和定量方法。所述方法利用了核酸適體以及數(shù)字DNA擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)來將獲自常規(guī)ELISA的模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成來自單分子計(jì)數(shù)的數(shù)字信號(hào)。

先前已有人嘗試使用核酸定量法來進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。然而，這些方法都聚焦于復(fù)制蛋白質(zhì)上的核酸標(biāo)記物。例如，被稱為免疫-PCR的蛋白質(zhì)靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)利用寡核苷酸標(biāo)記物，該標(biāo)記物隨后可使用定量PCR來檢測(cè)。在免疫-PCR中，DNA標(biāo)記物被復(fù)制，直至其產(chǎn)生一定水平的信號(hào)；然后將達(dá)到該點(diǎn)所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目用于計(jì)算有多少DNA標(biāo)記物原本存在于樣品中。雖然免疫-PCR法提高了蛋白檢測(cè)的靈敏度，但其不能區(qū)分少于2倍的拷貝數(shù)變異，并且可傾向于產(chǎn)生假陽性信號(hào)。此外，抗體與DNA之間的偶聯(lián)對(duì)于每一個(gè)新靶標(biāo)都需要極其仔細(xì)的優(yōu)化過程，并且每個(gè)抗體的DNA標(biāo)記物的數(shù)目是不可控的并且在批次間不一致。

與此相反，本申請(qǐng)所述的方法使用核酸適體作為檢測(cè)親和試劑，作為從蛋白質(zhì)檢測(cè)至核酸單分子計(jì)數(shù)的翻譯子。數(shù)字單分子計(jì)數(shù)技術(shù)將獲自常規(guī)qPCR的指數(shù)模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成線性數(shù)字信號(hào)，這可以顯著提高測(cè)定的靈敏度和定量的分辨率。原始樣品中的檢測(cè)適體的精確拷貝數(shù)可以被確定；如本申請(qǐng)所述，檢測(cè)適體和靶標(biāo)蛋白質(zhì)有一對(duì)一的精確比例，因此也就確定了原始樣品中靶分子(例如，蛋白質(zhì))的拷貝數(shù)。靶標(biāo)的絕對(duì)濃度很容易地被計(jì)算為等于靶分子總數(shù)除以總的測(cè)量體積。

Rissin等(Nat Biotechnol.2010Jun；28(6):595-9Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations)最近開發(fā)了平臺(tái)(稱為數(shù)字ELISA)來數(shù)字化ELISA信號(hào)用于定量蛋白質(zhì)濃度。他們的方法使用大量珠子(200,000-500,000個(gè)珠子)來確保樣品中高比例(大約70％)的分析物分子被捕獲，并且大多數(shù)珠子只捕獲單個(gè)分析物分子。所捕獲的分析物分子隨后被經(jīng)酶標(biāo)記的第二抗體結(jié)合以形成抗原/抗體夾心。將珠子(約5％-15％的珠子)物理地分離，并測(cè)定珠子與經(jīng)標(biāo)記的蛋白之間的結(jié)合，從而將ELISA信號(hào)數(shù)字化。如下實(shí)現(xiàn)夾心復(fù)合物的數(shù)字化：在底物存在的情況下將珠子加載至被設(shè)計(jì)為承載單個(gè)珠子的飛升孔的陣列中，隨后物理密封所述孔(使用橡膠墊圈或油)，并允許單一酶分子與其底物反應(yīng)以顯影(通常持續(xù)30秒到2.5分鐘)。然后用圖像分析來鑒別含有珠子的那些孔以及那些孔在特定波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度。

與數(shù)字ELISA相反，本申請(qǐng)所述的方法和系統(tǒng)使用適體作為檢測(cè)親和試劑和從蛋白質(zhì)濃度測(cè)量至核酸適體的單分子計(jì)數(shù)的翻譯子。由于核酸可通過酶指數(shù)地?cái)U(kuò)增以產(chǎn)生數(shù)千至數(shù)百萬拷貝，因而在此可使用各種數(shù)字化DNA擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，包括但不限于數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、數(shù)字滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、數(shù)字環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP)或數(shù)字基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。如下文中所詳述的，在于固體載體上形成抗體-分析物(靶標(biāo))-適體夾心復(fù)合物后，洗脫檢測(cè)適體并將其分隔為數(shù)百或甚至數(shù)百萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，以使每個(gè)隔室僅包含1個(gè)或0拷貝的檢測(cè)適體。“分隔”后，執(zhí)行上述擴(kuò)增方法之一至終點(diǎn)。通過計(jì)數(shù)“陽性”(或“1”)隔室(其中檢測(cè)適體被擴(kuò)增和檢測(cè))相對(duì)于“陰性”(或“0”)隔室(其中檢測(cè)適體不被擴(kuò)增和檢測(cè))的數(shù)目，本發(fā)明人可準(zhǔn)確地測(cè)定有多少拷貝的檢測(cè)適體存在于原始樣品中，并且由于一個(gè)適體/蛋白質(zhì)的關(guān)系，我們也知道有多少拷貝的靶蛋白分析物存在于初始樣品中。因此，將靶標(biāo)的絕對(duì)濃度容易地計(jì)算為等于靶分子的總數(shù)除以總的測(cè)量體積。

本申請(qǐng)描述了用于靶分子(例如蛋白質(zhì)和核酸)、粒子(例如，例如，細(xì)胞、細(xì)胞器和其它生物或非生物粒子)等的檢測(cè)和/或定量的系統(tǒng)和方法。

具體地，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜跈z測(cè)樣品中的靶分子或粒子的方法。該方法包括將樣品暴露于多個(gè)捕獲物，每種捕獲物包括對(duì)靶分子或粒子具有親和力的結(jié)合表面，以形成捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物；去除未與靶分子或粒子復(fù)合的捕獲物；使捕獲物與靶分子或粒子的復(fù)合物暴露于多個(gè)檢測(cè)物以便形成捕獲物、靶分子或粒子與檢測(cè)物之間的復(fù)合物；去除未與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物；洗脫與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物；將檢測(cè)物分隔至隔室中；和檢測(cè)每一個(gè)隔室中檢測(cè)物的存在或不存在，以便檢測(cè)樣品中的靶分子或粒子。

本申請(qǐng)還提供了用于檢測(cè)樣品中的靶分子的方法。該方法包括使樣品暴露于包含特異于靶分子的捕獲抗體的固體載體，以便形成靶標(biāo)-抗體復(fù)合物；去除未結(jié)合的樣品和抗體；將靶標(biāo)-抗體復(fù)合物暴露于特異于靶標(biāo)的檢測(cè)適體；去除未結(jié)合的適體；洗脫結(jié)合于靶標(biāo)-抗體復(fù)合物的適體；將所述適體分隔至隔室中；和檢測(cè)每一個(gè)隔室中適體的存在或不存在，從而檢測(cè)樣品中的靶分子。

還提供了用于檢測(cè)樣品中的靶分子或粒子的系統(tǒng)和試劑盒。所述系統(tǒng)和試劑盒包含反應(yīng)容器的陣列，其中至少一個(gè)反應(yīng)容器不含樣品并且至少一個(gè)容器包含不含靶分子或粒子的對(duì)照樣品；多個(gè)捕獲物，其每一種包含對(duì)靶分子或粒子具有親和力的結(jié)合表面，以便形成捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物；多個(gè)檢測(cè)物，以便形成捕獲物、靶分子或粒子與檢測(cè)物之間的復(fù)合物；和洗脫與捕獲物和靶分子或粒子復(fù)合的檢測(cè)物的試劑。

在各種實(shí)施方式中，所述樣品是流體樣品。樣品可以是下述中的任何一種或多種：緩沖液、血液、血漿、血清、尿、唾液和汗液、淚液、乳汁、膽汁、腦脊髓液、痰、灌洗物、淋巴、細(xì)胞裂解物、液化組織、拭子洗脫物、液化植物物質(zhì)、食品、廢水、沖洗水、飲用水。使樣品暴露于反應(yīng)容器中的捕獲物和檢測(cè)物。

反應(yīng)容器可以是下述中的任何一種或多種：試管、離心管、柱子、微陣列板、微量滴定板、微流體裝置、管、涂覆有捕獲物的管。在一些實(shí)施方式中，所述容器涂覆有捕獲物。在一些實(shí)施方式中，所述容器未涂覆有捕獲物。

樣品體積可以是下述中的任一項(xiàng)：約1μl至約20μl，約20μl至40μl，約40μl至約60μl，約60μl至約80μl，約80μl至約100μl，約100μl至約500μl，約500μl至約1μl，約1μl至約5μl，約5μl至約10μl，約10μl至約50μl，約50μl至約100μl或其組合。原始樣品可不被稀釋或被稀釋來用于本申請(qǐng)所述的方法。所述樣品可被稀釋1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、100倍或其組合。

在各種實(shí)施方式中，樣品中的靶分子或粒子的濃度小于約50x10^-15M，或小于約40x10^-15M，或小于約30x10^-15M，或小于約20x10^-15M，或小于約10x10^-15M，或小于5x10^-15M，或小于約lx10^-15M。在一些實(shí)施方式中，樣品中的靶分子或粒子的濃度在阿托摩爾(attomole)范圍內(nèi)。

靶分子或粒子

正如本領(lǐng)域中技術(shù)人員所理解的，可使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)檢測(cè)和定量大量靶分子和粒子。能夠相對(duì)于捕獲物被固定(例如，經(jīng)由包含多個(gè)捕獲組分的結(jié)合表面)的任何靶分子均可潛在地使用本申請(qǐng)所述的方法和系統(tǒng)來研究。下面描述了可包含靶分子的某些具體的潛在目的靶標(biāo)。下面所列的是示例性的和非限制性的。

在一些實(shí)施方式中，靶分子或粒子是下述中的任何一種或多種：蛋白質(zhì)、核酸、肽、碳水化合物、小分子、病毒細(xì)菌、細(xì)菌或其組合。在各種實(shí)施方式中，靶蛋白可以是單體或多聚體。應(yīng)當(dāng)理解，雖然下面的大部分討論針對(duì)為蛋白質(zhì)的靶分子，但這僅僅是舉例說明性的，并且可檢測(cè)和/或定量其它材料(例如靶粒子)。

在一些實(shí)施方式中，靶分子或粒子(例如，靶蛋白)可與各種疾病相關(guān)聯(lián)，所述疾病包括但不限于癌癥、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)性病癥、糖尿病、心血管疾病、血液病、自體免疫性疾病、炎性疾病或其組合。

與癌癥相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于以下的任何一種或多種：4-1BB、5T4、腺癌抗原、α-胎兒球蛋白、BAFF、B-淋巴瘤細(xì)胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、C-MET、CCR4、CD 152、CD 19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受體)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域-B、葉酸受體1、GD2、GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人擴(kuò)散因子受體激酶、IGF-1受體、IGF-I、IgG1、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰島素-樣生長(zhǎng)因子I受體、整聯(lián)蛋白α5β1、整聯(lián)蛋白ανβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰絲氨酸、前列腺癌細(xì)胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白或其組合。特異于癌癥的其它靶分子或粒子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯然的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

炎性疾病相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于以下的一種或多種：AOC3(VAP-1)、CAM-3001、CCL11(嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子-1)、CD 125、CD 147(basigin)、CD 154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受體)、CD25(IL-2受體的α鏈)、CD3、CD4、CD5、IFN-α、IFN-γ、IgE、IgE Fc區(qū)、IL-1、IL-12、IL-23、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-22、IL-4、IL-5、IL-5、IL-6、IL-6受體、整聯(lián)蛋白α4、整聯(lián)蛋白α4β7、Lama glama、LFA-1(CD11a)、MEDI-528、肌生成抑制素、OX-40、rhuMAbβ7、scleroscin、SOST、TGFβ1、TNF-α或VEGF-A。特異于炎性疾病的其它靶分子或粒子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯然的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

與神經(jīng)性病癥相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于β淀粉樣蛋白或MABT5102A中的任何一種或多種。特異于神經(jīng)性病癥的其它靶分子或粒子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯然的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

與糖尿病相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于L-Ιβ或CD3中的任何一種或多種。特異于糖尿病或其它代謝病癥的其它靶分子或粒子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

與癌癥相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于C5、心肌肌球蛋白、CD41(整聯(lián)蛋白α-IIb)、纖維蛋白II、β鏈、ITGB2(CD18)和鞘氨醇-1-磷酸中的任何一種或多種。特異于心血管疾病的其它抗原對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

與傳染病相關(guān)的靶分子或粒子的實(shí)例包括但不限于炭疽毒素、CCR5、CD4、聚集因子A、巨細(xì)胞病毒、巨細(xì)胞病毒糖蛋白B、內(nèi)毒素、大腸桿菌(Escherichia coli)、乙肝表面抗原、乙肝病毒、HIV-1、Hsp90、甲型流感血凝素、脂磷壁酸、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病毒糖蛋白、呼吸道合胞病毒和TNF-α中的任一種或多種。特異于傳染病的其它靶分子或粒子對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯然的，并且可將其與本發(fā)明的備選實(shí)施方式結(jié)合使用。

在各種實(shí)施方式中，至少約10％，或至少約20％，或至少約30％,或至少約40％，或至少約50％，或至少約60％，或至少約70％,或至少約80％，或至少約90％，或至少約95％，或至少約99％或至少約100％的靶分子或粒子結(jié)合捕獲物，以形成捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物。

載體

多個(gè)捕獲物直接或間接結(jié)合于載體(例如，經(jīng)由連接子)。在一些實(shí)施方式中，所述連接子可包含任何部分，或包含有利于捕獲物附著至表面的對(duì)載體結(jié)合表面的修飾。捕獲物與載體表面之間的鍵聯(lián)可包括一種或多種化學(xué)或物理(例如，通過范德華力、氫鍵、靜電相互作用、疏水/親水相互作用的非特異性附著等)鍵和/或提供此類鍵的化學(xué)連接子。

在某些實(shí)施方式中，載體的表面還可包含保護(hù)或鈍化層，其可在測(cè)定過程中減少或最小化非捕獲組分(例如，靶分子或粒子，結(jié)合配體)對(duì)結(jié)合表面的非特異性附著，所述非特異性附著可在檢測(cè)過程中導(dǎo)致假陽性信號(hào)或信號(hào)的喪失。在某些實(shí)施方式中，可被利用來形成鈍化層的材料的實(shí)例包括，但不限于：聚合物，例如聚(乙二醇)，其排斥蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合；具有此特性的天然存在的蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性劑，例如，兩性離子表面活性劑，例如磺基甜菜堿；天然存在的長(zhǎng)鏈脂質(zhì)；和核酸，例如鮭魚精子DNA。

固相載體的實(shí)例包括但不限于多種珠子、納米管(例如，碳納米管)、微量滴定板、微流體通道、電極、囊泡、細(xì)胞、膜(例如，硝化纖維素)、管或其組合。在某些實(shí)施方式中，珠子具有約0.1微米至100微米、約1.0微米至10微米、0.01微米至1微米之間的平均直徑。珠子與捕獲物見的比率可取決于珠子的尺寸。例如，1μΜ珠子可具有10⁴至10⁶個(gè)捕獲物。所述多種珠子可具有多種性質(zhì)和參數(shù)。例如，珠子可以是磁性的、聚苯乙烯、熒光的、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠、硅、氧化硅或其組合。在示例性實(shí)施例中，珠子涂覆有特異于靶蛋白的捕獲抗體。

在各種實(shí)施方式中，固體載體可以具有任何形狀(例如，球體狀、盤狀、環(huán)狀、立方體狀等)，粒子的分散體或懸浮液(例如，懸浮在流體中的多個(gè)粒子)、納米管等。在一些實(shí)施方式中，載體在用于測(cè)定的溶劑或溶液中是不可溶的或基本上不可溶的。在一些情況下，載體是固體或基本為固體(例如，基本上是無孔的)，然而，在某些情況下，載體可以是多孔的或?qū)嵸|(zhì)上多孔的、中空的、部分中空的，等等。多種載體物質(zhì)(例如固體載體)可以是非吸收性的，基本上非吸收性的，基本上吸收性的，或吸收性的。在某些情況下，固體載體可包含磁性材料，其如本申請(qǐng)所述，可有利于測(cè)定的某些方面(例如，洗滌步驟)。在某些情況下，載體表面也可包含保護(hù)層或鈍化層，其可以減少或最小化非特異性結(jié)合事件(例如，分析物分子、結(jié)合配體等)。

在各種實(shí)施方式中，捕獲物對(duì)載體表面(例如，固體載體)的附著方法取決于所使用的鍵聯(lián)的類型，并且可潛在地通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的眾多適合的偶聯(lián)化學(xué)反應(yīng)/技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。所選擇的具體附著方式將取決于載體表面的材料特征和捕獲物的性質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，可通過在每一個(gè)捕獲物上使用反應(yīng)性官能團(tuán)而將捕獲物連接至載體表面。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，可衍生結(jié)合表面以使得化學(xué)官能團(tuán)存在于載體上的結(jié)合表面上，所述化學(xué)官能團(tuán)可與捕獲物上的化學(xué)官能團(tuán)反應(yīng)，從而引起附著。可用的用于附著的官能團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于，氨基、羧基、環(huán)氧基、馬來酰亞胺基、氧代基和硫醇基團(tuán)。官能團(tuán)可直接附著或通過使用連接子(其組合在本申請(qǐng)中有時(shí)被稱為“交聯(lián)劑”)連接。交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是已知的，例如，同或異雙功能交聯(lián)劑是公知的(例如，參見1994Pierce Chemical Company catalog,關(guān)于交聯(lián)劑的技術(shù)部分,第155-200頁，或"Bioconjugate Techniques"by Greg T.Hermanson,Academic Press,1996)。交聯(lián)劑的非限制性實(shí)例包括烷基(包括取代的烷基和含有雜原子部分的烷基)、酯、酰胺、胺、環(huán)氧基以及乙二醇和衍生物。交聯(lián)劑也可包括砜基，其形成磺酰胺。

在一些實(shí)施方式中，官能團(tuán)是光活化官能團(tuán)。例如，官能團(tuán)可被光活化以將捕獲物附著于載體(例如，固體支持物)的表面。一個(gè)實(shí)例是PhotoLink^TM技術(shù)，其可從Eden Prairie,Min的SurModics,Inc.獲得。

在一些實(shí)施方式中，載體可包含鏈霉抗生物素蛋白涂覆的表面，并且捕獲物可被生物素化。使捕獲物暴露于鏈霉抗生物素蛋白涂覆的載體表面可通過生物素組分與鏈霉抗生物素蛋白之間的相互作用引起捕獲物與載體表面的締合。

在一些實(shí)施方式中，可實(shí)現(xiàn)將捕獲物附著至載體表面而無需共價(jià)修飾捕獲物的結(jié)合表面。例如，可通過使用連接子將附著官能團(tuán)添加至結(jié)合表面，所述連接子具有與捕獲組分反應(yīng)的官能團(tuán)和具有對(duì)于結(jié)合表面的結(jié)合親和力的基團(tuán)。在某些實(shí)施方式中，連接子包含能夠結(jié)合于或粘著于結(jié)合表面的蛋白質(zhì)；例如，在一個(gè)此種實(shí)施方式中，所述連接子是在其表面上具有游離氨基的血清白蛋白。隨后添加第二連接子(交聯(lián)劑)以將白蛋白的胺基附著至捕獲物(例如，至羧基)。

捕獲物

在各種實(shí)施方式中，用多個(gè)捕獲物涂覆載體(例如，固體載體)。所述捕獲物包含附著至載體(例如，固體載體)的表面和附著至靶分子或粒子的表面。在各種實(shí)施方式中，多個(gè)捕獲物結(jié)合靶分子或粒子。在各種實(shí)施方式中，如對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的，所使用的捕獲物的類型將取決于靶分子或粒子的性質(zhì)。

用于多種靶分子的捕獲物是已知的或可使用已知的技術(shù)來容易地發(fā)現(xiàn)或開發(fā)。例如，當(dāng)靶分子為蛋白質(zhì)時(shí)，捕獲物可包含蛋白質(zhì)，特別是抗體或其片段(例如，抗原結(jié)合片段(Fab)、Fab'片段、胃蛋白酶片段、F(ab')2片段、全長(zhǎng)多克隆或單克隆抗體、抗體樣片段等)、其他蛋白質(zhì)，例如受體蛋白質(zhì)、蛋白A、蛋白C等、核酸(例如，適體)或小分子。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)的捕獲物包含肽。例如，當(dāng)靶分子為酶時(shí)，合適的捕獲物可包括酶底物和/或酶抑制劑。在某些情況下，當(dāng)靶分子被磷酸化或甲基化時(shí)，捕獲物可分別包括磷酸鹽結(jié)合劑或甲基結(jié)合劑。例如，磷酸鹽結(jié)合劑可包括金屬離子親和介質(zhì)例如美國(guó)專利No.7,070,921和7,632,651中描述的那些。此外，當(dāng)靶分子是單鏈核酸時(shí)，所述捕獲物可以是互補(bǔ)核酸。類似地，靶分子可以是核酸結(jié)合蛋白并且捕獲物可以是單鏈或雙鏈核酸；或者，當(dāng)靶分子是單鏈或雙鏈核酸時(shí)，捕獲物可以是核酸結(jié)合蛋白質(zhì)?；蛘?，如美國(guó)專利No.5,270,163、5,475,096、5,567,588、5,595,877、5,637,459、5,683,867、5,705,337和相關(guān)專利中一般描述的，核酸“適體”可被開發(fā)來用于捕獲幾乎任何靶分子。同樣地，例如，當(dāng)靶分子是碳水化合物時(shí)，潛在合適的捕獲物包括例如抗體、凝集素和選擇素。正如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的，可與目標(biāo)靶分子特異性締合的任何分子可潛在地用作捕獲物。

在一些實(shí)施方式中，合適的靶分子/捕獲物對(duì)可包括，但不限于，抗體/抗原、受體/配體、蛋白質(zhì)/核酸、核酸/核酸、酶/底物和/或抑制劑、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或選擇素、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/小分子；小分子/小分子等。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，捕獲物是已知多聚化的細(xì)胞表面受體的部分(特別是細(xì)胞外部分)，例如生長(zhǎng)激素受體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(特別是GLUT4受體)和T-細(xì)胞受體，并且靶分析物分子是一種或多種靶配體。

在一些實(shí)施方式中，捕獲物可以是下述中的任何一種或多種：特異于靶分子或粒子的抗體、特異于靶分子或粒子的適體、特異于靶分子或粒子的多肽、受體、配體、小分子或其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，捕獲物是特異性結(jié)合靶分子并且不結(jié)合非靶分子的抗體。

在一些實(shí)施方式中，靶粒子是生物細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、其它脊椎動(dòng)物、昆蟲、酵母、細(xì)菌、細(xì)胞等)，并且捕獲物可以是具有對(duì)于細(xì)胞表面抗原(例如，細(xì)胞表面受體)的特異性親合力的配體。在一個(gè)實(shí)施方式中，捕獲物是粘附分子受體或其部分，其具有對(duì)于在靶細(xì)胞類型的表面上表達(dá)的粘附分子的親和力。

在一些實(shí)施方式中，靶分子對(duì)其捕獲物的結(jié)合親和力可以為至少約10⁴至約10⁶M^-1，至少約10⁵至約10⁹M^-1，至少約10⁷至約10⁹M^-1，大于約10⁹M^-1等?；蝾愃莆?。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解用于將多個(gè)捕獲物暴露于含有或懷疑含有靶分子或粒子的流體樣品以進(jìn)行初始靶標(biāo)捕獲的方法和技術(shù)。例如，可向流體樣品中直接添加多個(gè)捕獲物(例如，作為固體，作為溶液)。作為另一個(gè)實(shí)例，可將流體樣品添加至多個(gè)捕獲物(例如，在溶液中，作為固體)。在一些情況下，可攪拌(例如，攪動(dòng)、搖動(dòng)等)溶液。將捕獲物與靶分子或粒子之間形成的復(fù)合物與樣品的其余部分分離。

在一些實(shí)施方式中，可在反應(yīng)容器中暴露后和/或與捕獲物一起孵育后，洗滌樣品。在該情況下，洗滌步驟可用于洗掉未結(jié)合于捕獲物的任何分子。洗滌步驟可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行，例如，通過將反應(yīng)容器置于洗滌溶液中或通過將洗滌溶液添加至反應(yīng)容器中來進(jìn)行?？汕逑窗蟹肿?捕獲物復(fù)合物的次數(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯然的。在一些實(shí)施方式中，洗滌溶液可以是不引起反應(yīng)容器的表面或所述測(cè)定的至少兩種組分(例如，捕獲物與靶分子或粒子)之間的相互作用變化的溶液。

檢測(cè)物

該檢測(cè)物結(jié)合于靶分子或粒子與捕獲物之間形成的復(fù)合物，從而形成包含靶分子或粒子、捕獲物和檢測(cè)物的復(fù)合物。如對(duì)于本領(lǐng)域中技術(shù)人員將是顯然的，檢測(cè)物的性質(zhì)將取決于靶分子的性質(zhì)和捕獲物的性質(zhì)。

在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)檢測(cè)物包括但不限于下述中的任何一種或多種：抗體、適體、多肽、受體、配體、小分子或靶分子的任何其它親和試劑或其組合。在一些實(shí)施方式中，適體是核酸(DNA、RNA、XNA(核酸類似物))適體。在一些實(shí)施方式中，適體是肽適體。不是基于核酸的檢測(cè)物與核酸標(biāo)記物綴合。在各種實(shí)施方式中，適體和/或核酸作為用于數(shù)字檢測(cè)步驟的信號(hào)分子。

在一些實(shí)施方式中，多個(gè)檢測(cè)物包括綴合于親和試劑的DNA。在示例性實(shí)施方式中，可將DNA綴合于下述中的任何一種或多種：抗體、多肽、受體、配體、小分子或適合于靶分子的任何其它親和試劑。

在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)物是一種或多種適體?？蓪⑦m體綴合于親和試劑。在示例性實(shí)施方式中，可將適體綴合于下述中的任何一種或多種：抗體、多肽、受體、配體、小分子或適合于靶分子的任何其它親和試劑。在一些實(shí)施方式中，適體是核酸(DNA、RNA、XNA(核酸類似物))適體。在示例性實(shí)施方式中，TNFα特異性適體由序列5'-ATCCAGAGTGACGCAGCATGCTTAAGGGGGGGGCGGGTTAAGGGAGTGGGGAGGGAGCTGGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3'組成。在示例性實(shí)施方式中，TNFα特異性適體包含序列5'-ATCCAGAGTGACGCAGCATGCTTAAGGGGGGGGCGGGTTAAGGGAGTGGGGAGGGAGCTGGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3'。

在一個(gè)實(shí)施方式中，捕獲物是特異性結(jié)合靶蛋白質(zhì)的抗體并且檢測(cè)物是特異性結(jié)合靶蛋白的適體。靶蛋白可以是單體或多聚體。在示例性實(shí)施方式中，如果目標(biāo)蛋白是單體，則抗體和適體結(jié)合于靶蛋白上的兩個(gè)不同的表位。在示例性實(shí)施例中，如果目標(biāo)蛋白是多聚體，則抗體和適體與靶蛋白上的相同表位結(jié)合。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，捕獲物是特異性結(jié)合該靶蛋白的適體并且檢測(cè)物是特異性結(jié)合靶蛋白的適體。靶蛋白可以是單體或多聚體。在示例性實(shí)施方式中，如果靶蛋白是單體，則捕獲適體和檢測(cè)適體結(jié)合于靶蛋白上的兩個(gè)不同表位。在示例性實(shí)施例中，如果靶蛋白是多聚體，則捕獲適體和檢測(cè)適體結(jié)合于靶蛋白上的相同表位。

在各種實(shí)施方式中，至少約10％，或至少約20％，或至少約30％,或至少約40％，或至少約50％，或至少約60％，或至少約70％,或至少約80％，或至少約90％，或至少約95％，或至少約99％或至少約100％的捕獲物與靶分子或粒子之間的復(fù)合物結(jié)合于檢測(cè)物，以形成捕獲物、靶分子或粒子與檢測(cè)物之間的復(fù)合物。

區(qū)室化和定量

在各種實(shí)施方式中，從由靶分子或粒子、捕獲物和檢測(cè)物形成的復(fù)合物洗脫出檢測(cè)物。檢測(cè)和定量洗脫的檢測(cè)物，且檢測(cè)物的量指示原始樣品中的靶分子或粒子。在各種實(shí)施方式中，將洗脫的檢測(cè)物分隔至多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。反應(yīng)位點(diǎn)可以是油包水乳劑、雙重乳劑、微量滴定板、細(xì)胞(例如細(xì)菌)、微流體裝置中的微滴、微流體裝置中的微腔室或納米腔室中的任一種。

在一些實(shí)施方式中，當(dāng)檢測(cè)物是適體時(shí)，洗脫檢測(cè)適體并將其區(qū)室化從而使每個(gè)隔室有0個(gè)或1個(gè)適體。

洗脫后，稀釋含有適體的洗脫物，然后將其分隔至更小的體積中。例如，可將100μL洗脫體積稀釋至1mL，然后離散成10⁹個(gè)各自體積為1pL的隔室(半徑為約6μm的微滴)。

本申請(qǐng)所述的系統(tǒng)使得能夠通過計(jì)數(shù)含有適體的隔室的數(shù)目來進(jìn)行數(shù)字定量。為了使該方法精確，不止一個(gè)適體存在于單個(gè)隔室中的概率必須很低。為了減少這種可能性，必須使隔室的數(shù)目大于洗脫物中的適體的數(shù)目。因此，總的隔室數(shù)目設(shè)定了精確定量的上限和動(dòng)態(tài)范圍。

在上面的實(shí)例中，如果存在一個(gè)適體，則其將被容易地計(jì)數(shù)。如果存在100個(gè)適體，則極不可能的是，在100億個(gè)隔室當(dāng)中，一個(gè)隔室會(huì)包含不止1個(gè)適體，因此，這些同樣將被容易地精確計(jì)數(shù)。然而，當(dāng)適體的數(shù)目接近液滴的數(shù)目時(shí)，精確性降低。例如，當(dāng)存在100億個(gè)適體時(shí)，大多數(shù)隔室將含有不止一個(gè)適體，從而計(jì)數(shù)將低估實(shí)際的數(shù)量。隔室的數(shù)量的限制依賴于可被處理的總體積，和可被計(jì)數(shù)的隔室的數(shù)目。隔室尺寸的下限由精確地感測(cè)小隔室中陽性信號(hào)的能力限定(較小隔室＝>較低的絕對(duì)信號(hào))。

上限可通過進(jìn)行初始樣品體積的連續(xù)稀釋來容易地?cái)U(kuò)展。隔室的數(shù)目也可以通過分隔至具有遞增尺寸的空間來減少，其中來自每一個(gè)空間的信號(hào)對(duì)應(yīng)于特定濃度上的概率。

區(qū)室化的檢測(cè)物可通過使用任何檢測(cè)方法來檢測(cè)和定量，所述檢測(cè)方法是例如數(shù)字PCR、家族染料、測(cè)定濁度的變化、分子信標(biāo)探針、液滴數(shù)字PCR、定量PCR、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、環(huán)介導(dǎo)的擴(kuò)增(LAMP)或基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、吸光度(例如金納米粒子的聚集)。

本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)

本申請(qǐng)所述的方法提供了優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)(例如，如Csordas等(Detection of Proteins in Serum by Micromagnetic Aptamer PCR(MAP)Technology.Agnew.Chem.Int.Ed.2010第49卷，第355-358頁)中描述的微磁適體PCR(MAP)技術(shù))的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。

在本申請(qǐng)所述的方法中，適體從靶蛋白上被洗脫并繼而被擴(kuò)增用于檢測(cè)。相反地，MAP洗脫P(yáng)CR反應(yīng)中帶有珠子的整個(gè)復(fù)合物，這是有問題的，因?yàn)椋?i)MAP獲取多個(gè)適體/珠子，這將使得單分子計(jì)數(shù)不可能；和(ii)額外的蛋白質(zhì)和珠子表面?zhèn)﹄S后的PCR反應(yīng)的效率，并由此限制檢測(cè)的速度和靈敏度。

此外，MAP需要連續(xù)的微流體洗滌，而本申請(qǐng)所述的方法可通過使用簡(jiǎn)單的分批洗滌法來避免微流體洗滌，并且對(duì)于抗體-適體夾心仍獲得高檢測(cè)靈敏度。

另外，來自MAP的最終信號(hào)高度依賴于洗脫體積(大約300μL)，并且從而是測(cè)試間變異的主要來源。本申請(qǐng)所述的方法不依賴于原始樣品的體積。這是重要的，因?yàn)殡y以從具有固定體積的裝置洗脫磁珠，因?yàn)槠淇扇Q于流速、氣泡形成、珠子聚集、至通道表面的磁性粘附、基于蛋白質(zhì)的至表面的粘附以及流體損失而變化。MAP在測(cè)定開始時(shí)就一次混合了所有組分，包括捕獲抗體、靶標(biāo)和適體。本申請(qǐng)所述的方法描述了利用多重洗滌來減少背景結(jié)合的多步驟免疫測(cè)定。本方法不需要使用磁珠，然而MAP法需要它們來用于磁性捕獲階段。

對(duì)于MAP，珠子的量必須受到精確地控制。MAP中使用的珠子量的變化導(dǎo)致可變的捕獲、可變的洗脫和可變PCR效率，這全都導(dǎo)致定量不佳。

MAP不能使用太多磁珠，因?yàn)槠鋾?huì)阻塞芯片，影響洗滌效率。連續(xù)洗滌而無靶蛋白的損失需要具有極低離解速率的結(jié)合劑。本申請(qǐng)所述的方法使用分批洗滌，這對(duì)結(jié)合劑的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)沒有要求，從而允許定量對(duì)于其不存在緩慢-離解速率結(jié)合劑的靶標(biāo)。

數(shù)字測(cè)量的所有性能指標(biāo)體系(包括靈敏度、精確度和動(dòng)態(tài)范圍)隨著數(shù)字反應(yīng)的總數(shù)增加而改善。在數(shù)字ELISA中，免疫復(fù)合物的數(shù)字化隨后通過將珠子加載至由玻璃制成的含有50,000飛升孔(約25,000-30,000個(gè)珠子將被加載至孔中)的陣列來實(shí)現(xiàn)。本申請(qǐng)所述的方法通過將檢測(cè)物(例如，檢測(cè)適體)分隔至高達(dá)1億個(gè)單獨(dú)的液滴反應(yīng)器中來增加靈敏度，該方法相較于數(shù)字ELISA獲得4,000倍的改善。

加載至數(shù)字ELISA中微孔內(nèi)的珠子的數(shù)目限制了測(cè)定動(dòng)態(tài)范圍。相反地，本申請(qǐng)所述的方法顯著提高了該測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍，因?yàn)楸旧暾?qǐng)所述的方法相較于數(shù)字ELISA法提供了4,000倍的分隔數(shù)目。

在本申請(qǐng)的方法中，檢測(cè)適體的分隔不依賴于珠子。本申請(qǐng)所述的方法可將檢測(cè)適體分隔至具有不同體積的反應(yīng)中；具有不同體積的隔室使所有隔室的總體積與最小隔室的尺寸和數(shù)目之間的關(guān)聯(lián)被取消。最小的隔室使得能夠定量高濃度，而具有大體積的隔室使得能夠通過有效地增加總體積來獲得高靈敏度。通過使用該多體積方法，進(jìn)行“數(shù)字化”(單一分子)測(cè)量所需的隔室總數(shù)可被最小化，同時(shí)維持高動(dòng)態(tài)范圍和高分辨率。該方法也非常適用于即時(shí)護(hù)理目的，因?yàn)槠渫ㄟ^最小化用于數(shù)字測(cè)量的隔室數(shù)目來允許更簡(jiǎn)單的儀器設(shè)計(jì)，并且有利于開發(fā)新的高性能診斷工具用于資源有限的應(yīng)用。

在數(shù)字ELISA中，大量珠子(通常200,000-500,000個(gè))被用于捕獲樣品中的蛋白質(zhì)，以確保大多數(shù)珠子只捕捉單個(gè)分析物分子。該方法使用過量的捕獲試劑，并因此增加背景信號(hào)，并由于三個(gè)主要來源而限制測(cè)定靈敏度：(i)在靶蛋白不存在的情況下標(biāo)記試劑與珠子的非特異性相互作用；(ii)為內(nèi)源的并且結(jié)合珠子、經(jīng)酶標(biāo)記并產(chǎn)生假陽性信號(hào)的基質(zhì)(例如，血清或血漿)中分子的相互作用；和(iii)免疫衍生的、與捕獲或檢測(cè)抗體特異性相互作用并產(chǎn)生假陽性信號(hào)的基質(zhì)(例如，血清或血漿)中的分子(通常稱為異嗜性抗體)的相互作用。

通過使用本申請(qǐng)的方法，除了采用適體代替抗體作為檢測(cè)試劑外，測(cè)定的前端(圖1a)可從其它常規(guī)ELISA平臺(tái)直接改造而來。背景信號(hào)通過使用本申請(qǐng)所述的方法而被顯著減小，因?yàn)椴恍枰^量的珠子，從而引起檢測(cè)極限的提高。

數(shù)字ELISA有3個(gè)步驟：捕獲珠子與樣品的孵育，捕獲的蛋白質(zhì)與檢測(cè)抗體的孵育，以及檢測(cè)標(biāo)記蛋白質(zhì)與酶綴合物的孵育。每個(gè)步驟的效率可因不同的靶分析物而顯著變化。每次開發(fā)新的測(cè)定，都需要進(jìn)行針對(duì)固定的孵育時(shí)間優(yōu)化檢測(cè)抗體和酶的濃度的過程，以確保每個(gè)珠子(每一個(gè)隔室)上僅有一個(gè)檢測(cè)抗體，并將背景降低至泊松噪聲底線。通過使用本申請(qǐng)所述的方法，洗脫的適體在溶液中是單體，以使得它們可被容易地稀釋并被分隔至數(shù)百萬個(gè)單獨(dú)的液滴反應(yīng)器中，以及使用任何數(shù)字核酸測(cè)量法來定量而無需任何特定的優(yōu)化。此外，測(cè)量的前端(圖1a)與后端(圖1b)完全解連，并且除使用檢測(cè)適體代替檢測(cè)抗體外，我們可采用來自常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化的條件。

在數(shù)字ELISA中，有利的是，大多數(shù)珠子保持為單體，以使得珠子可適合尺寸針對(duì)單個(gè)珠子的微孔。不幸的是，取決于涂布條件和涂布抗體的溶解度性質(zhì)，珠子可在抗體偶聯(lián)過程中表現(xiàn)出不同量的聚集。必須基于最大化抗體偶聯(lián)效率同時(shí)使珠子維持單體狀態(tài)來優(yōu)化偶聯(lián)反應(yīng)條件。對(duì)于本申請(qǐng)所述的方法，這不是一個(gè)問題，因?yàn)闄z測(cè)適體可容易地從固體載體洗脫，然后被分隔至數(shù)百萬個(gè)皮升液滴反應(yīng)器中。

用于數(shù)字ELISA的檢測(cè)抗體的生物素化和鏈霉抗生物素蛋白-酶綴合物的制備需要極其小心。數(shù)字ELISA中的信號(hào)和背景都取決于摻入的生物素的數(shù)目；該數(shù)目可隨著不同的檢測(cè)抗體而廣泛地變化。商業(yè)來源的鏈霉抗生物素蛋白-酶綴合物常常聚集，這對(duì)單分子測(cè)定具有顯著的影響。取代高數(shù)量的含有單個(gè)酶的孔，聚集的鏈霉抗生物素蛋白-酶綴合物將產(chǎn)生包含較少，更明亮的孔的陣列圖像，并且可嚴(yán)重地影響測(cè)定的檢測(cè)效率。在本申請(qǐng)所述的方法中，當(dāng)抗體-分析物-適體夾心復(fù)合物在固體載體上形成時(shí)，適體對(duì)應(yīng)于靶分析物的一對(duì)一呈現(xiàn)。由于該一個(gè)適體/蛋白的關(guān)系，我們可通過單適體(核酸)計(jì)數(shù)法(例如數(shù)字PCR)確切地知道有多少拷貝的靶分析物存在于初始樣品中。

使用適體取代抗體作為檢測(cè)親和試劑可消除檢測(cè)試劑與免疫衍生的基質(zhì)(例如，血清或血漿)中的分子之間的特異性相互作用，從而為通常已知的異嗜性抗體問題提供了解決方案。

上述各種方法和技術(shù)提供了許多方式來實(shí)施本申請(qǐng)。當(dāng)然，應(yīng)理解，根據(jù)本申請(qǐng)所述的任何特定實(shí)施方式不必然實(shí)現(xiàn)所有所述目標(biāo)或優(yōu)勢(shì)。因此，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本申請(qǐng)教導(dǎo)的方法可以用來實(shí)現(xiàn)或優(yōu)先實(shí)現(xiàn)一個(gè)優(yōu)勢(shì)或一組優(yōu)勢(shì)而不必實(shí)現(xiàn)如本申請(qǐng)教導(dǎo)或建議的其它目標(biāo)或優(yōu)勢(shì)。本申請(qǐng)?zhí)峒傲烁鞣N備選方案。應(yīng)當(dāng)理解，一些優(yōu)選實(shí)施方式明確地包括一個(gè)，另一個(gè)，或數(shù)個(gè)特征，而其它實(shí)施方式明確排除一個(gè)，另一個(gè)，或數(shù)個(gè)特征，而仍然有其它實(shí)施方式通過包含一個(gè)、另一個(gè)或數(shù)個(gè)有利特征來調(diào)節(jié)特定的特征。

此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到來自不同實(shí)施方式的各種特征的適用性。類似地，上文中論述的各種元素、特征和步驟以及每個(gè)這類元素、特征或步驟的其它已知等同物，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員以各種組合用于按照本申請(qǐng)所述的原理來實(shí)施所述方法。在各種元素、特征和步驟當(dāng)中，一些元素、特征和步驟被明確地包含在不同的實(shí)施方式中而其它元素、特征和步驟被明確地排除在不同的實(shí)施方式中。

實(shí)施例

以下實(shí)施例不旨在將權(quán)利要求的范圍限制于本發(fā)明，而是旨在為某些實(shí)施方式的示例。本領(lǐng)域技術(shù)人員想到的示例性方法的變化旨在落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

用于腫瘤壞死因子α(TNFα)的基于適體的超靈敏測(cè)定

在4℃下用PBS中5μg/ml的TNFα抗體(eBioscience，目錄編號(hào)14-7349-85)對(duì)ELISA孔(Thermo Scientific，目錄編號(hào)：15031)，進(jìn)行過夜功能化。在即將使用前，在以約500RPM輕輕搖動(dòng)的情況下用300μL AptaBuffer(PBS+0.05％Tween-20+2.5mM MgCl₂+1mM CaCl₂+1％BSA+0.5mg/mL硫酸葡聚糖+0.1mg/mL鮭魚精子DNA)封閉ELISA孔，進(jìn)行至少30分鐘。

隨后，將含有目標(biāo)蛋白(TNFα，Shenandoah Biotechnology，目錄編號(hào)：100-111)的測(cè)試樣品(50μL)添加至洗滌過的ELISA孔，伴隨輕輕搖動(dòng)孵育1小時(shí)。在靶標(biāo)-捕獲物孵育后，用PBSMCT(PBS+0.05％Tween-20+2.5mM MgCl₂+1mM CaCl₂)洗滌ELISA孔一次，將5nM檢測(cè)TNFα適體添加至孔中，并伴隨輕輕搖動(dòng)孵育30分鐘。隨后在用檢測(cè)適體孵育后，用300μL PBS-MCT洗滌ELISA板4次。在一個(gè)實(shí)施方式中，TNFα適體的序列為5'-ATCCAGAGTGACGCAGCATGCTTAAGGGGGGGGCGGGTTAAGGGAGTGGGGAGGGAGCTGGTGTGGACACGGTGGCTTAGT-3'

對(duì)于洗脫步驟，將100μL的PCR級(jí)水添加至每一個(gè)ELISA孔。在95℃下加熱板10分鐘后，我們將100μL包含檢測(cè)適體的洗脫物添加至新管中。將洗脫物稀釋10倍，隨后用LifeTechnologies的3D數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量。

雖然已在某些實(shí)施方式和實(shí)施例的情境中公開了本申請(qǐng)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本申請(qǐng)的實(shí)施方式延伸超過具體公開的實(shí)施方式至其它替代實(shí)施方式和/或其用途以及變型和等同物。

在一些實(shí)施方式中，術(shù)語“一個(gè)/一種(a)”、“一個(gè)/一種(an)”、“該(the)”以及描述本申請(qǐng)的具體實(shí)施方式的情境中(尤其在某些以下權(quán)利要求的情境中)使用的類似指代可被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。本申請(qǐng)引用的數(shù)值范圍僅僅意欲用作單獨(dú)指代落入該范圍內(nèi)的每個(gè)獨(dú)立數(shù)值的速記方法。除非本申請(qǐng)另外標(biāo)明，否則每個(gè)獨(dú)立數(shù)值都包含在該說明書內(nèi)，就如同其是單獨(dú)在本文中被引述的一樣。除非本申請(qǐng)另有指示或根據(jù)上下文明顯矛盾，否則本申請(qǐng)描述的所有方法可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞驅(qū)嵤?。針?duì)本申請(qǐng)的某些實(shí)施方式提供的任何和所有實(shí)例或者示例性語言(如，“例如”)的使用僅旨在更好地闡明本申請(qǐng)而非限制本申請(qǐng)的范圍，除非另有規(guī)定。說明書中的所有語言都不應(yīng)解釋為指示對(duì)實(shí)施本申請(qǐng)所必需的、未要求保護(hù)的元素。

本申請(qǐng)描述了本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方式，包括本發(fā)明人已知的用于進(jìn)行本申請(qǐng)的最佳模式。在閱讀前述說明后，對(duì)那些優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行的變化對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將變得明顯。預(yù)期本領(lǐng)域技術(shù)人員，適當(dāng)時(shí)，可采用此類變化，并且可以以與本申請(qǐng)具體描述的方式不同的其它方式實(shí)踐本申請(qǐng)。因此，如適用的法律允許，本申請(qǐng)的許多實(shí)施方式(包括在此附上的權(quán)利要求中述及的主題的所有變型和等同物)。此外，除非本申請(qǐng)另外指出或者明顯地與上下文矛盾，否則上述元素在其所有可能的變型中的任何組合都被本發(fā)明包括在內(nèi)。

本申請(qǐng)引用的所有專利、專利申請(qǐng)、專利申請(qǐng)的公開以及其它材料例如文章、書、說明書、出版物、文件、事物等，都出于所有目的(除與其相關(guān)的任何審查文件歷史，其與本申請(qǐng)文件不一致或矛盾任何方面，或其可對(duì)現(xiàn)在或以后與本申請(qǐng)件相關(guān)的權(quán)利要求的最廣范圍具有限制影響的任何方面外)，均在此通過引用整體并入本申請(qǐng)。例如，在與任何并入的材料相關(guān)的術(shù)語的描述、定義和/或使用與和本申請(qǐng)相關(guān)的術(shù)語的描述、定義和/或用途之間存在任何不一致或矛盾時(shí)，以本申請(qǐng)文件中的術(shù)語的描述、定義和/使用為準(zhǔn)。

應(yīng)該理解，本文公開的本申請(qǐng)的實(shí)施例是對(duì)本申請(qǐng)實(shí)施方式的原理的說明?？刹捎玫钠渌薷目纱嬖谟诒旧暾?qǐng)的范圍內(nèi)。因此，例如，但非限制性地，可按照本申請(qǐng)的教導(dǎo)使用本申請(qǐng)的實(shí)施例的備選配置。因此，本申請(qǐng)的實(shí)施方式不限于僅為所顯示和描述的實(shí)施方式。