本發(fā)明涉及蝦青素的有效的生產(chǎn)方法。更詳細(xì)而言，涉及對(duì)生產(chǎn)蝦青素的微藻進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)的光照射。

背景技術(shù)：

蝦青素是橙紅色的類胡蘿卜素中的一種，是主要大量含有在蝦或蟹等甲殼類、鮭魚、鮭魚子、鯛魚、藻類等海洋生物中的色素。已知該蝦青素具有強(qiáng)大的抗氧化作用，被用作食品用色素、化妝品、健康食品、醫(yī)藥品等。

蝦青素通過(guò)化學(xué)合成或者對(duì)細(xì)菌、酵母、微藻等進(jìn)行培養(yǎng)而生產(chǎn)。每單位干燥重量的細(xì)菌、酵母中的蝦青素含量為2重量％以下，與此相對(duì)，在對(duì)微藻中紅球藻屬(Haematococcus屬)的微藻(以下稱為紅球藻)進(jìn)行培養(yǎng)而得到的蝦青素中，由于能夠以2重量％以上的高含量進(jìn)行培養(yǎng)，并且具有安全性，所以在世界范圍內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)。在利用進(jìn)行紅球藻等的光合成的微藻的蝦青素的生產(chǎn)中需要適合其生長(zhǎng)的光照射。

蝦青素例如利用紅球藻、小球藻、柵藻等微藻而生產(chǎn)。特別是紅球藻，其通過(guò)外部環(huán)境的變化應(yīng)力而成囊化，在藻體內(nèi)蓄積蝦青素。為了蓄積蝦青素，需要陽(yáng)光或人工光線的照射。作為人工光線的光源，利用熒光燈、LED(light emitting diode：發(fā)光二極管)等。

僅利用陽(yáng)光進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，因?yàn)槭艿綒鉁刈兓?、日照時(shí)間變化影響，所以難以進(jìn)行穩(wěn)定且有效的生產(chǎn)。因此，以往嘗試了使用了人工光線之一的熒光燈的培養(yǎng)。

在專利文獻(xiàn)1中記載了在包括人工光線的以40000勒克斯的照度照射光而培養(yǎng)紅球藻的實(shí)施例中，以每單位重量干燥藻體的蝦青素含量計(jì)，得到2重量％的內(nèi)容。

在專利文獻(xiàn)2中記載了通過(guò)以光合成有效光通量投入量25000μmol-photon/m³/s以上的非常強(qiáng)的光強(qiáng)度的條件培養(yǎng)紅球藻，在21天以每單位重量干燥藻體的蝦青素含量為6.8重量％、每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量為250mg/L的高效率來(lái)生產(chǎn)蝦青素的實(shí)施例，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)300mg/L以上的蝦青素產(chǎn)量。為了使用熒光燈而得到這樣的非常強(qiáng)的光合成有效光通量投入量，需要大量的電能，此外，用于控制由熒光燈產(chǎn)生的熱的空調(diào)裝置所消耗的電能也變大。

已知LED代替熒光燈作為低功耗且發(fā)熱量少的光源，研究了使用LED生產(chǎn)蝦青素的方法。

在專利文獻(xiàn)3中，對(duì)使用各種波長(zhǎng)的LED而由紅球藻生產(chǎn)蝦青素的方法進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)僅照射具有540nm以下的波長(zhǎng)的藍(lán)光LED，成功得到了高的蝦青素生產(chǎn)率。特別是，使用以470nm為中心波長(zhǎng)的藍(lán)光LED的情況下，與相同光通量密度的熒光燈相比，能夠生產(chǎn)約2倍的蝦青素。然而，此時(shí)的每單位培養(yǎng)液的蝦青素濃度在培養(yǎng)12天后低至25mg/L，未達(dá)到商業(yè)生產(chǎn)上實(shí)用的培養(yǎng)濃度。

在專利文獻(xiàn)4中記載了通過(guò)對(duì)瓊脂平板上的紅球藻菌落交替照射藍(lán)光LED與紅光LED，可促進(jìn)紅球藻的細(xì)胞數(shù)的增加。然而，未提及成囊化之后的蝦青素生產(chǎn)階段，也未記載能否生產(chǎn)蝦青素。由于已知紅球藻在生長(zhǎng)中因應(yīng)力而發(fā)生成囊化，大量蓄積蝦青素，所以在該文獻(xiàn)中無(wú)法判斷蝦青素生產(chǎn)是否得到提高。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)平3-83577號(hào)

專利文獻(xiàn)2：日本特開(kāi)2007-97584號(hào)

專利文獻(xiàn)3：日本特開(kāi)2004-147641號(hào)

專利文獻(xiàn)4：國(guó)際公開(kāi)公報(bào)WO2013-021675

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題

尋求使用低功耗且發(fā)熱量少的LED，與僅利用具有540nm以下的波長(zhǎng)的藍(lán)光LED培養(yǎng)微藻時(shí)相比，蝦青素含量高且蝦青素濃度為100mg/L以上生產(chǎn)的培養(yǎng)方法。

技術(shù)方案

本發(fā)明的目的在于使用省電力且能夠抑制透過(guò)光的部分的溫度上升的LED，與熒光燈相比，進(jìn)行效率更高的蝦青素的生產(chǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)邊同時(shí)照射峰值波長(zhǎng)為420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED這兩方邊對(duì)微藻進(jìn)行培養(yǎng)，從而有效地生產(chǎn)蝦青素。

本發(fā)明的主旨是以下的(1)～(6)的蝦青素的生產(chǎn)方法。

(1)一種蝦青素的生產(chǎn)方法，其特征在于，在培養(yǎng)微藻而在藻體內(nèi)產(chǎn)生蝦青素的蝦青素的生產(chǎn)方法中，并用峰值波長(zhǎng)為420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)期間中的至少蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)期間的光照射。

(2)根據(jù)(1)的蝦青素生產(chǎn)方法，其中，以光通量密度計(jì)，峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED的比為1:19～19:1。

(3)根據(jù)(1)或(2)的蝦青素生產(chǎn)方法，其特征在于，峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED的光通量密度分別為20μmol/m²/s以上。

(4)根據(jù)(1)～(3)中任一項(xiàng)的蝦青素生產(chǎn)方法，其特征在于，微藻為紅球藻屬。

(5)根據(jù)(1)～(4)中任一項(xiàng)的蝦青素生產(chǎn)方法，其中，每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量為100mg/L以上。

(6)根據(jù)(5)的蝦青素生產(chǎn)方法，其中，每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量為300mg/L以上。

(7)一種微藻的培養(yǎng)液，其中，蝦青素含量為300mg/L以上。

(8)一種微藻的培養(yǎng)藻體，其中，蝦青素含量為7.0重量％以上(干燥藻體中)。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠在不大幅改變現(xiàn)有的蝦青素的制造方法和/或裝置的情況下效率良好地生產(chǎn)蝦青素。

附圖說(shuō)明

圖1是表示實(shí)施例1中使用的藍(lán)光LED與紅光LED的光譜的圖。

圖2是表示實(shí)施例2的每單位培養(yǎng)液的干燥藻體重量的圖。

圖3是表示實(shí)施例2的每單位干燥藻體的蝦青素含量的圖。

圖4是表示實(shí)施例2的每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量的圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及利用微藻的蝦青素生產(chǎn)方法，其特征是包括對(duì)微藻照射峰值波長(zhǎng)為420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED的工序。

在本發(fā)明中，可以使用能夠產(chǎn)生蝦青素的微藻。這里所說(shuō)的微藻限定于進(jìn)行光合成的微藻。作為微藻，已知有藍(lán)藻、紅藻、褐藻、綠藻、硅藻、真眼點(diǎn)藻等，但本發(fā)明的微藻限定于能夠產(chǎn)生蝦青素的微藻。作為產(chǎn)生蝦青素的微藻，通常使用屬于紅球藻屬的微藻(紅球藻)。

在紅球藻中，可以使用湖生紅球藻(Haematococcus lacustris)、雨生紅球藻(H.pluvialis)、H.capensis、H.droebakensi、H.zimbabwiensis等。其中，可優(yōu)選使用湖生紅球藻(H.lacustris)和雨生紅球藻(H.Pluvialis)。

除了紅球藻屬以外還可以使用產(chǎn)生蝦青素的微藻。例如，可舉出作為小球藻屬的Chlorella zofingiensis、單針藻屬(Monoraphidium sp.)的微藻，除此以外，還可以舉出Vischeria helvetica、Coelastrella、Scenedesmus、Chlamydomonas nivalis、Protosiphon botryoides、Neochloris wimmeri等。

作為微藻的培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基，沒(méi)有特別限制，但為了防止培養(yǎng)基的雜菌污染，優(yōu)選使用不含有碳源的獨(dú)立營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常，可以使用含有增殖所需要的氮、微量金屬的無(wú)機(jī)鹽、維生素類等的獨(dú)立營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。例如，可以使用VT培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MBM培養(yǎng)基、MDM培養(yǎng)基等培養(yǎng)基(參照藻類研究法千原光雄、西澤一俊編，共立出版(1979))、BG-11培養(yǎng)基和它們的改性培養(yǎng)基等。

另外，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微藻時(shí)，優(yōu)選通入含有二氧化碳的空氣。雖然通入不含有二氧化氧的空氣雖然也能夠進(jìn)行培養(yǎng)，但是由于微藻的生長(zhǎng)變慢，所以通入含有0.1～5％的二氧化碳，優(yōu)選含有0.5～3％的二氧化碳的空氣進(jìn)行培養(yǎng)。不通氣也能夠培養(yǎng)，但為了進(jìn)行良好的生長(zhǎng)，將通氣量設(shè)為0.01～3.0vvm，優(yōu)選為0.015～1vvm，另外，將pH設(shè)為5～10，優(yōu)選設(shè)為6～9。

作為培養(yǎng)溫度，以利用湖生紅球藻(H.lacustris)和雨生紅球藻(H.Pluvialis)的情況為例，例如在10～45℃的范圍，優(yōu)選在18～38℃的范圍。另外，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到5.0～9.5的范圍，優(yōu)選在6.0～9.0的范圍。

對(duì)于用于生產(chǎn)蝦青素的光照射而言，對(duì)微藻并用峰值波長(zhǎng)為420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED。需要在微藻的培養(yǎng)期間中、整個(gè)期間或恒定期間照射藍(lán)光LED與紅光LED這兩方。特別地，重要的是在蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)的時(shí)期(成囊細(xì)胞的時(shí)期)一并照射藍(lán)光LED與紅光LED。在照射藍(lán)光LED與紅光LED這兩方的情況下，通過(guò)同時(shí)照射，能夠效率最高地生產(chǎn)蝦青素，但在24時(shí)間以內(nèi)，交替照射藍(lán)光LED與紅光LED的方法也能夠效率良好地生產(chǎn)蝦青素?；蛘咭部梢允褂媒惶骈W爍藍(lán)光LED與紅光LED那樣的照射方法。

作為光照射工序中的光源，可以使用LED、電燈泡、熒光燈等，但由于LED以外的光源所使用的光源的光的波長(zhǎng)光譜寬，需要去除不需要的光，因此效率差。如果使用LED，則能夠在不需要去除一部分的光之類的特別的手段的情況下進(jìn)行聚焦波長(zhǎng)區(qū)域的光的照射，因此能夠以少的照射能量效率良好地生產(chǎn)蝦青素。作為L(zhǎng)ED，可以使用有機(jī)EL照明。

優(yōu)選具備多個(gè)LED芯片，以便進(jìn)行有效的照射。在使用多個(gè)光源的情況下，為了能夠進(jìn)行盡量均勻的光的照射，優(yōu)選使各光源相互隔開(kāi)均等的間隔進(jìn)行配置。另外，可以制成獨(dú)立安裝有藍(lán)光LED與紅光LED的多個(gè)芯片的面板來(lái)進(jìn)行照射，也可以使用以一定比例在同一面板內(nèi)埋入了藍(lán)光LED與紅光LED的多個(gè)芯片而成的面板進(jìn)行照射。

所照射的藍(lán)光LED的波長(zhǎng)的峰值波長(zhǎng)為420～500nm范圍，優(yōu)選為430～490nm，紅光LED的波長(zhǎng)為620～690nm范圍，優(yōu)選為630～680nm。

藍(lán)光LED、紅光LED均可以使用峰值波長(zhǎng)不同的2種以上的光。例如也可以使用峰值波長(zhǎng)為430nm和470nm的藍(lán)光LED與630nm和660nm的紅光LED進(jìn)行照射。

優(yōu)選使用藍(lán)光LED、紅光LED波長(zhǎng)寬度窄的光。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)僅選擇適于蝦青素生產(chǎn)的波長(zhǎng)區(qū)域的光進(jìn)行照射，能夠進(jìn)行更有效的蝦青素生產(chǎn)。

在培養(yǎng)微藻中同時(shí)照射的峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED的各自比例只要能夠同時(shí)照射就沒(méi)有限定，該比例以光通量密度計(jì)為1:19～19:1，優(yōu)選為1:5～5:1。更優(yōu)選1:2.5～5:1，特別優(yōu)選1:2～4:1。

光的照射方法也沒(méi)有特別限定，例如可以連續(xù)照射，或者可以設(shè)置間隔而進(jìn)行間歇性照射。這里的“間歇性照射”包括利用脈沖光進(jìn)行的照射。如果間歇性地進(jìn)行光的照射，則能夠減少耗電。

湖生紅球藻(H.lacustris)和雨生紅球藻(H.Pluvialis)等紅球藻有運(yùn)動(dòng)性，有細(xì)胞增殖繁盛的綠色的浮游細(xì)胞的狀態(tài)，以及因溫度、強(qiáng)光、鹽、水分量、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等的極端的環(huán)境變化的應(yīng)力而引起成囊化的成囊細(xì)胞的狀態(tài)。如果發(fā)生成囊化，則在藻體內(nèi)蓄積蝦青素，而呈紅色。

使用了峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED的光照射可以在浮游細(xì)胞的狀態(tài)下使用，也可以在成囊細(xì)胞的狀態(tài)下使用。由于浮游細(xì)胞略少地生產(chǎn)蝦青素，但其生產(chǎn)速度慢，因此相比而言，得到良好的細(xì)胞分裂和增殖，是有效的。成囊細(xì)胞的期間由于蝦青素生產(chǎn)速度快且高濃度地蓄積，所以能夠效率良好地生產(chǎn)蝦青素。

由于紅球藻的培養(yǎng)初期有運(yùn)動(dòng)性的浮游細(xì)胞大多細(xì)胞密度低，所以光通量密度即使在20μmol/m²/s以下也能夠良好地增殖。在浮游細(xì)胞的狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，即使使用LED以外的光源也能夠良好地增殖。另外，僅利用峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED中的一種波長(zhǎng)的LED也能夠培養(yǎng)。

因溫度、強(qiáng)光、鹽等施加應(yīng)力而使紅球藻囊化情況下的培養(yǎng)時(shí)的光通量密度沒(méi)有特別限定，例如只要是光透過(guò)寬度(直徑、厚度)為70mm以下的培養(yǎng)裝置，就能夠通過(guò)峰值波長(zhǎng)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)620～690nm的紅光LED分別為20μmol/m²/s以上，優(yōu)選分別為50μmol/m²/s以上，進(jìn)一步優(yōu)選為100μmol/m²/s以上、150μmol/m²/s以上照射，從而效率良好地生產(chǎn)蝦青素。如果是上述以上的光透過(guò)寬度的培養(yǎng)裝置，則也可以設(shè)得更大。即，在培養(yǎng)成囊細(xì)胞的狀態(tài)的紅球藻時(shí)，通過(guò)照射藍(lán)光LED與紅光LED這兩方，從而能夠效率良好地生產(chǎn)蝦青素。光通量密度的上限沒(méi)有特別限定，但從能量成本和效果的平衡考慮，優(yōu)選為3000μmol/m²/s以下，特別優(yōu)選為1000μmol/m²/s以下。

通過(guò)上述的培養(yǎng)，對(duì)于每單位培養(yǎng)液，能夠得到以100mg/L以上的濃度，優(yōu)選以300mg/L以上，更優(yōu)選以400mg/L以上的濃度含有蝦青素(游離體的形式)的培養(yǎng)液。另外，能夠得到蝦青素含量為7.0重量％以上(干燥藻體中)的微藻的培養(yǎng)藻體。

從培養(yǎng)液回收蝦青素的方法沒(méi)有特別限定。例如通過(guò)將含有蝦青素的微藻培養(yǎng)液過(guò)濾，利用離心處理等固液分離手段分離而收集了微藻細(xì)胞之后，進(jìn)行干燥(自然干燥、鼓風(fēng)干燥、熱風(fēng)式干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等)，從而能夠得到微藻的干燥物。得到的微藻的干燥物以1～10質(zhì)量％的濃度含有蝦青素(游離體的形式)。優(yōu)選以4～10質(zhì)量％的濃度含有蝦青素(游離體的形式)。

通過(guò)對(duì)含有蝦青素的濕藻體或上述干燥物進(jìn)行粉碎處理、提取、回收，從而能夠得到含有蝦青素的成分。對(duì)于蝦青素的提取和回收方法，沒(méi)有特別限制，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法。例如，在機(jī)械性地破壞微藻的干燥物之后提取蝦青素。作為提取方法，可舉出使用氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑、食用油脂進(jìn)行提取的化學(xué)的提取方法，或者通過(guò)壓榨綠藻的干燥物等的物理的提取方法?；蛘?，可以使用超臨界提取法進(jìn)行提取和回收。餾去提取溶劑而得到含有蝦青素的油。

作為對(duì)培養(yǎng)液的LED光照射方式，有從反應(yīng)器所含有的培養(yǎng)液的外側(cè)照射的外照式照射和向反應(yīng)器所含有的培養(yǎng)液中投入LED的內(nèi)照式照射，但其方式?jīng)]有特別限制，都可以使用。應(yīng)予說(shuō)明，外照式照射的情況的光通量密度使用在容器的外表面測(cè)得的值，內(nèi)照式照射的情況的光通量密度使用在與培養(yǎng)液接觸的容器表面測(cè)得的值。也可以并用外照式照射與內(nèi)照式照射。

用于蝦青素生產(chǎn)的微藻培養(yǎng)裝置只要是能夠供給二氧化碳，且能夠并用峰值波長(zhǎng)為420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行光照射的裝置，就沒(méi)有特別限制。例如，小規(guī)模的情況下，優(yōu)選使用厚度10～50mm程度的扁平培養(yǎng)瓶，直徑20～70mm程度的玻璃管。大規(guī)模的情況下，可以使用由塑料袋、玻璃制、塑料制等管或透明板構(gòu)成，且根據(jù)需要具備照明器和攪拌機(jī)的培養(yǎng)槽。大規(guī)模培養(yǎng)的情況下，優(yōu)選光透過(guò)寬度(直徑、厚度)為400mm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為70mm以下。作為這樣的培養(yǎng)槽，例如可以使用平板培養(yǎng)槽(平板培養(yǎng)藻)、管型培養(yǎng)槽、充氣型培養(yǎng)槽、中空?qǐng)A筒型培養(yǎng)槽、箱型內(nèi)照式培養(yǎng)槽等。另外，在任一情況下，均優(yōu)選使用密閉容器。例如，可以使用如日本特開(kāi)2012-29578所公開(kāi)的在LED的周圍卷繞管的類型和/或如日本特開(kāi)2014-39491所公開(kāi)的混合型的反應(yīng)器。

蝦青素的培養(yǎng)有并用設(shè)置在室外的利用陽(yáng)光的類型和設(shè)置于室內(nèi)的使用人工光線的類型這兩方的類型。利用陽(yáng)光的方法不耗費(fèi)能量成本，能夠低廉地制造，但在設(shè)備擺放稀疏的情況下，有時(shí)因混雜物、混入物等而導(dǎo)致品質(zhì)降低。在任一類型時(shí)均可以利用本發(fā)明。在利用自然光的情況下，通過(guò)在培養(yǎng)期間中的至少蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)期間，并用通過(guò)420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED進(jìn)行的照射，能夠得到本發(fā)明的效果。

僅用人工光線進(jìn)行培養(yǎng)的情況下，至少在蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)期間并用420～500nm的藍(lán)光LED與峰值波長(zhǎng)為620～690nm的紅光LED。增殖培養(yǎng)的期間可以使用熒光燈等其它光源，但也可以與蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)期間同樣地并用藍(lán)光與紅光。

藍(lán)光與紅光的光通量密度之比為1:19～19:1，優(yōu)選為1:5～5:1。進(jìn)一步優(yōu)選為1:2.5～5:1，特別優(yōu)選為1:2～4:1。

以下，使用實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例限定。

在本發(fā)明中，蝦青素量利用以下的方法測(cè)定。

利用使用了Luna 3μm Silica柱的HPLC進(jìn)行的蝦青素的定量

采取一定量的試樣，加入丙酮并粉碎。通過(guò)離心分離回收上清。向上清中加入0.05M的Tris-HCl緩沖液和膽固醇酯酶溶液，在37℃下反應(yīng)45分鐘，使蝦青素成為游離體。用石油醚提取蝦青素，餾去溶劑，進(jìn)行干燥。將其溶于己烷:丙酮＝82:18，作為HPLC用供試品溶液。按照下述的HPLC分析條件進(jìn)行測(cè)定。由于蝦青素具有幾何異構(gòu)體，所以根據(jù)這些峰的面積解析蝦青素的含量。

HPLC分析條件

使用柱：Luna 3μm Silica(2) 100A 150*4.6mm(Phenomenex公司)

使用流動(dòng)相溶劑：己烷:丙酮＝82:18(v/v)

裝置啟動(dòng)用方法：A-JUNSOU

A-JUNSOU方法的設(shè)定內(nèi)容

試樣注入量：20μL

流動(dòng)相流量：1.2mL/min

柱溫：30℃

DAD：455nm,467nm,475nm

測(cè)定時(shí)間：13分鐘

實(shí)施例1

紅球藻的培養(yǎng)(增殖培養(yǎng))

將含有細(xì)胞數(shù)50萬(wàn)個(gè)/ml的浮游細(xì)胞的湖生紅球藻(H.lacustris)NIES144株(國(guó)立環(huán)境研究所微生物系統(tǒng)保存施設(shè)保存)培養(yǎng)液15ml與BG11改性A培養(yǎng)基(表1)750ml分別注入到4根內(nèi)徑50mm、高度500mm的玻璃制透明培養(yǎng)容器中。以光通量密度成為50μmol/m²/s的方式利用熒光燈進(jìn)行連續(xù)光照射，在25℃下通入含有1％的二氧化碳的空氣，邊進(jìn)行攪拌邊培養(yǎng)。其結(jié)果，在培養(yǎng)第5天時(shí)確認(rèn)了浮游細(xì)胞的增殖分別為45萬(wàn)個(gè)/ml。

使用了各種光源的紅球藻的培養(yǎng)(蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng))

接下來(lái)，分別向培養(yǎng)液中添加氯化鈉而使氯化鈉濃度成為2g/L之后，使用7種光源，以光通量密度分別成為300μmol/m²/s的方式進(jìn)行光照射，在27℃下通入含有1％的二氧化碳的空氣，邊進(jìn)行攪拌邊培養(yǎng)，進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)。此時(shí)的光源為：熒光燈、波長(zhǎng)450nm的藍(lán)光LED的單獨(dú)照射、波長(zhǎng)660nm的紅光LED的單獨(dú)照射、波長(zhǎng)450nm的藍(lán)光LED與波長(zhǎng)660nm的紅光LED同時(shí)連續(xù)照射(藍(lán)光與紅光之比為1:2、1:1、2:1、4:1這4種)。將實(shí)驗(yàn)中使用的藍(lán)光LED與紅光LED的光譜示于圖1。在14天的培養(yǎng)之后，利用過(guò)濾法得到干燥藻體。測(cè)定干燥藻體的重量，求出每單位培養(yǎng)液的干燥藻體重量。另外，利用反相HPLC求出干燥藻體中的蝦青素含量和每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量。

[表1]

將結(jié)果示于表2。

僅進(jìn)行藍(lán)光LED的光照射的情況下，與熒光燈相比，干燥藻體重量低至2.4g/L，但蝦青素含量為3.9重量％，每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量高達(dá)94mg/L。僅進(jìn)行紅光LED的光照射的情況下，與熒光燈相比，干燥藻體重量高達(dá)3.3g/L，但蝦青素含量低至1.3重量％，每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量為43mg/L。

在同時(shí)照射藍(lán)光LED與紅光LED的情況下，與熒光燈相比，光通量密度的藍(lán)紅比為1:2、1:1、2:1、4:1的情況的蝦青素產(chǎn)量分別均高達(dá)131mg/L、162mg/L、155mg/L、156mg/L。在并用藍(lán)光與紅光的情況下，與熒光燈、單獨(dú)藍(lán)光、單獨(dú)紅光使用的情況相比，蝦青素產(chǎn)量大幅提高?？梢悦鞔_，優(yōu)選將藍(lán)光:紅光之比設(shè)為1:2～4:1。特別是，以1:1的比例同時(shí)連續(xù)照射的結(jié)果是：干燥藻體重量是與熒光燈相同的3.3g/L，但蝦青素含量為4.9重量％，每單位培養(yǎng)液的蝦青素濃度為162mg/L，是熒光燈的2倍，與僅用藍(lán)光LED的情況相比，為1.7倍。

如上所述，確認(rèn)了通過(guò)在培養(yǎng)期間中的蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng)期間同時(shí)照射藍(lán)光LED與紅光LED，從而能夠提高藻體中的蝦青素含量，其結(jié)果，能夠提高每單位培養(yǎng)液的蝦青素的產(chǎn)量。

[表2]

實(shí)施例2

紅球藻的培養(yǎng)(增殖培養(yǎng))

將含有細(xì)胞數(shù)50萬(wàn)個(gè)/ml的浮游細(xì)胞的湖生紅球藻(H.lacustris)NIES 144株培養(yǎng)液15ml與BG11改性B培養(yǎng)基(表3)750ml注入到內(nèi)徑50mm、高度500mm的玻璃制透明培養(yǎng)容器中。通過(guò)利用波長(zhǎng)450nm的藍(lán)光LED(光通量密度50μmol/m²/s)、波長(zhǎng)660nm的紅光(光通量密度LED 30μmol/m²/s)的同時(shí)連續(xù)光照射下，在25℃通入含有1％的二氧化碳的空氣，邊進(jìn)行攪拌邊培養(yǎng)。其結(jié)果，在培養(yǎng)第4天確認(rèn)了36萬(wàn)個(gè)/ml的浮游細(xì)胞的增殖。

紅球藻的培養(yǎng)(蝦青素生產(chǎn)培養(yǎng))

接下來(lái)，向培養(yǎng)液中添加氯化鈉而使氯化鈉的濃度成為2g/L之后，通過(guò)利用波長(zhǎng)450nm的藍(lán)光(光通量密度LED 300μmol/m²/s)、波長(zhǎng)660nm的紅光LED(光通量密度250μmol/m²/s)的同時(shí)連續(xù)光照射下，在28℃通入含有1％的二氧化碳的空氣，邊攪拌邊進(jìn)行蝦青素生產(chǎn)。培養(yǎng)21天，觀察經(jīng)時(shí)變化。利用過(guò)濾法得到干燥藻體，測(cè)定重量，求出每單位培養(yǎng)液的干燥藻體重量。通過(guò)反相HPLC求出蝦青素含量和每單位培養(yǎng)液的蝦青素濃度。

[表3]

將添加氯化鈉之后的培養(yǎng)天數(shù)和每單位培養(yǎng)液的干燥藻體重量、蝦青素含量(重量％)、每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量(mg/L)的結(jié)果示于圖2～圖4。在培養(yǎng)第21天，干燥藻體重量為5.8g/L，干燥藻體中的蝦青素含量為7.2重量％，蝦青素產(chǎn)量為418mg/L。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

通過(guò)本發(fā)明的方法，能夠以低能量使用量提高每單位培養(yǎng)液的蝦青素產(chǎn)量。