本發(fā)明僅涉及屬于橙壺菌屬(Aurantiochytrium)的破囊壺菌類。該屬通過遺傳、代謝和生理學特征來界定.

所述培養(yǎng)方法(通過該培養(yǎng)方法，在既不顯著添加鈉離子(Na⁺)也不顯著添加氯離子(Cl^-)的情況下培養(yǎng)細胞)使得能夠以高細胞密度(大約125至140g/L干物質)產(chǎn)生紅樹橙壺菌.該生物質富含DHA，其中具有15至20g/L培養(yǎng)物，優(yōu)選地20至25g/L培養(yǎng)物，或甚至25至30g/L培養(yǎng)物的比率.

非常少量的氯化鈉，特別地非常少量的氯離子(Cl^-)和鈉離子(Na⁺)，存在于對于該方法來說必需的培養(yǎng)基中.因此，在所述培養(yǎng)基中，存在小于1g/L，優(yōu)選地小于0.5g/L，更優(yōu)選地小于0.2g/L的氯離子，以及小于100mg/L，優(yōu)選地小于50mg/L，和更優(yōu)選地小于6mg/L的鈉離子(Na⁺).這使得能夠擺脫對于與培養(yǎng)基相接觸的設備來說必需的超額投資成本以及大幅降低處理排放物的成本，擺脫與在生物質中鈉鹽或氯化物的存在相關聯(lián)的弊端，并且通過減少投料(為了改善產(chǎn)率而添加到培養(yǎng)物中的產(chǎn)品)來降低培養(yǎng)基的成本.

序言

目前，原生生物是許多工業(yè)項目的目標，因為某些物種能夠積累或分泌重大量的脂質，尤其是多不飽和脂肪酸.

在多不飽和脂肪酸之中，某些ω-3系列的高度不飽和的脂肪酸(HUFA)(PUFA-ω3)，特別是二十碳五烯酸(EPA或C20：5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA或C22：6ω3)，以及某些ω-6系列的高度不飽和的脂肪酸(PUFA-ω6)，特別是花生四烯酸(ARA或AA或者二十碳四烯酸C20：4ω6)，具有公認的營養(yǎng)重要性并且在治療應用方面具有強大的潛力.

被認為是必需營養(yǎng)素的DHA對于細胞的正常的和功能性的發(fā)育來說是必需的，并且在各種生物化學過程和功能中發(fā)揮關鍵作用.DHA通過摻入到細胞膜中而對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和視網(wǎng)膜的功能來說是必不可少的，并且在視覺和記憶的機制的令人滿意的獲取和維持中發(fā)揮首要作用.

已知破囊壺菌類(特別是橙壺菌屬)產(chǎn)生DHA，當它們以異養(yǎng)方式進行培養(yǎng)時[W.K.Hong等人，(2011)，Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga，Aurantiochytrium sp.KRS101.Appl.Biochem.Biotechnol.，164(8)：1468-80].還已知橙壺菌屬產(chǎn)生類胡蘿卜素，例如蝦青素、玉米黃質、角黃素、海膽酮、β-胡蘿卜素和芬尼黃質(phoenicoxanthin)[Yokoyama，R，Honda，D.(2007)Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology，chemotaxonomic characteristics，and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.；Mycoscience，Vol.48，pp.199-211].

為了實施以工業(yè)規(guī)模由原生生物生產(chǎn)脂肪酸，應當考慮多種因素以使得該生產(chǎn)是贏利的.在這些因素之中，可以提及：

-原料和設備(其購買或租賃及其維護)的成本，以及勞動力的成本；

-生產(chǎn)的技術要求：例如預培養(yǎng)和培養(yǎng)步驟的數(shù)量和技術困難，培養(yǎng)的在線監(jiān)測，和為了對產(chǎn)物再利用而對來自所述培養(yǎng)的生物質進行處理的步驟；

-來自所述培養(yǎng)的排放物的處理.

目前用于以異養(yǎng)方式或兼養(yǎng)方式培養(yǎng)破囊壺菌科的原生生物的培養(yǎng)基包含顯著量的鹽，特別是氯化鈉.作為例子，可以提及ATCC Medium No.790這種培養(yǎng)基(11g/L的Na⁺和19g/L的Cl^-).

在生產(chǎn)油和/或其他目的分子的方法中使用氯化鈉(NaCl)來培養(yǎng)破囊壺菌科的海洋原生生物導致在投資和排放物處理方面的重大的超額成本，并且限制聯(lián)產(chǎn)物的再利用.

這是因為，氯離子引起不銹鋼的壞損，所述不銹鋼是用于制造發(fā)酵罐、培養(yǎng)基的制備和滅菌器具以及其他用于培養(yǎng)微觀藻類和處理所得生物質的設備的材料.該現(xiàn)象的后果之一是生物質的生產(chǎn)和處理(“下游加工(Down-Stream Processing)”或“DSP”)器具的過早壞損.

為了避免設備壞損這一問題，可以使用由更耐氯離子的特殊合金制成的設備。這些更耐鹽的材料是成本更高的。在該情況下，用于生產(chǎn)的投資成本大幅升高.

此外，氯化鈉(或者其他鈉鹽，例如硫酸鈉、碳酸鈉類型的鈉鹽)的使用導致在排放物處理(特別是水脫鹽)方面的重大的超額成本.

最后，在由在提取油后剩余的生物質構成的油餅型聯(lián)產(chǎn)物中鈉鹽的存在妨礙其再利用，尤其是用于動物營養(yǎng)、魚類養(yǎng)殖，或者作為用于化妝品或在制藥工業(yè)中的成分.

US 5 518 918描述了用其他類型的鈉鹽(硫酸鈉、碳酸鈉......)來代替氯化鈉.即使這使得能夠擺脫不透鋼設備的過早損耗，但在培養(yǎng)基中添加鈉鹽卻既不能允許擺脫與排放物處理相關的超額成本，也不能允許擺脫上面所指出的聯(lián)產(chǎn)物再利用的問題.

另外，用其他鈉鹽代替NaCl導致與購買替代品鹽相關的超額成本.

在Yokochi等人的標題為“Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21”的文章[(1998)Appl.Microbiol.Vol.49，pp.72-76]中，研究了蛞蝓裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)SR21這一菌株對于鹽條件的耐受性.該菌株對于高的鹽濃度具有大的耐受性，所述濃度在海水濃度的50％和200％之間.該菌株在無鹽的培養(yǎng)物中的生長比在包含50％海水的培養(yǎng)物中的生長低兩倍.我們注意到，在該研究中所使用的基礎培養(yǎng)基還包含3％的葡萄糖和1％的酵母提取物.在專利US 8,900,831中描述了聲稱“無鹽”或“低鹽濃度”的培養(yǎng)基.然而，如對于Yokoshi等人一樣，酵母提取物的添加對于微觀藻類的生長來說是必需的。但是，這樣的補充有酵母提取物的培養(yǎng)基包含超過30mg的鈉和氯的鹽.

此外，酵母提取物的添加代表了關于培養(yǎng)基的額外成本，和還代表了在為了用作食品或藥品的最終生物質的質量方面的缺點.酵母提取物不是標準化產(chǎn)品，并因此酵母提取物的批次不是同質的.因此，這對于從包含酵母提取物的培養(yǎng)基的生物質產(chǎn)生的最終產(chǎn)品的同質性具有影響.

Shabala等人[“Osmotic adjustment and requirement for sodium in marine protist thraustochytrid”(2009)Environmental Microbiology Vol.11(7)，pp.1835-1843]證明，破囊壺菌屬(Thraustochytrium)可以在具有低含量的鈉(1mM)的培養(yǎng)基中生長，條件是該培養(yǎng)基補充有諸如甘露糖醇或蔗糖的化合物，其允許該無鈉的培養(yǎng)基的滲透壓調節(jié).然而，這些化合物的存在導致與這些材料的成本相關聯(lián)的超額成本.另外，盡管添加了調節(jié)培養(yǎng)基滲透性的化合物，但是在無鹽和用甘露糖醇的情況下獲得的生物質產(chǎn)率(200,000個細胞/毫升)對于工業(yè)生產(chǎn)DHA來說仍是不足的.

在Shabala等人的最近的一篇文章[“Thraustochytrids can be grown in low-salt media without affecting PUFA production”，Marine Biotechnology(2013)15：437-444]中，通過用UV對蛞蝓裂殖壺菌SR21進行隨機誘變而獲得了一個突變體(命名為OUC88)，并對其進行了測試以確定引起脂肪酸組成的變化的環(huán)境因素.該文章的圖2顯示，一旦鹽濃度低于0.9％，生物質和脂質量就大大減少(小于20g/L的生物質和小于10g/L的脂質).

希望可以在最佳條件下培養(yǎng)破囊壺菌類，以增加待產(chǎn)生的脂肪酸的產(chǎn)率，同時避免與鋼制設備的損耗相關的問題，并降低關于發(fā)酵以及關于處理所得生物質的生產(chǎn)成本.特別地，希望提供橙壺菌屬的培養(yǎng)方法，其使得能夠減少(甚至基本上去除)培養(yǎng)基的鈉離子和氯離子，并且無需添加其他培養(yǎng)組分，所述其他培養(yǎng)組分可以導致與排放物處理相關的超額成本以及與DSP的額外步驟和最終產(chǎn)物的再利用問題相關的超額成本.

在本發(fā)明的背景下，希望獲得對于工業(yè)生產(chǎn)DHA來說足夠的生物質和脂質的產(chǎn)率.因此，希望獲得例如大于100g/L干物質，優(yōu)選地大于130g/L干物質，更優(yōu)選地大于150g/L干物質的產(chǎn)率.因此，希望獲得例如相對于干物質的總重量而言大于40％(甚至大于50％)的脂肪酸.還希望獲得例如相對于干物質的總重量而言在脂肪酸中大于30％(甚至大于40％)的DHA。

因此，正是在眾多的菌株篩選實驗結束時，申請人終于鑒定出能夠在化學成分確知的培養(yǎng)基中生長的橙壺菌屬的原生生物菌株，所述培養(yǎng)基沒有添加鈉，氯化物，有機源例如酵母提取物，滲壓劑例如甘露糖醇或蔗糖，如在Shabala等人的文章(2013)中所定義的(或者其他滲壓劑，例如山梨糖醇、聚乙二醇PEG).

在本發(fā)明條件下所培養(yǎng)的這些菌株使得能夠獲得以高的生物質(大于110g/L，優(yōu)選地大于120g/L)和多不飽和脂肪酸(尤其是DHA)(大于15g/L，優(yōu)選地大于20g/L)的產(chǎn)率來進行生產(chǎn).

[根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，本發(fā)明所涉及的一個菌株(FCC 1324)(作為如此分離和選擇出的橙壺菌屬菌株的代表)于2013年6月21日以登錄號CCAP 4062/1保藏于CCAP(藻類和原生動物保藏中心(Culture Collection of Algae and Protozoa)，Scottish Association for Marine Science，Dunstaffnage Marine Laboratory，Oban，Argyll PA371QA，蘇格蘭，英國).]

圖1：顯示了編碼核糖體RNA的小亞基的DNA序列之間的關系的系統(tǒng)發(fā)生分析.所述序列用Mega 5.1的ClustalW進行比對.通過使用最大似然法來進行所述分析。在該研究中所使用的破囊壺菌類菌株屬于下列類別：紅樹橙壺菌(Aurantiochytrium mangrovei)、裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)、和聚生裂殖壺菌(Schizochytrium aggregatum)、威瑟氏吾肯氏壺菌(Ulkenia visurgensis)、吾肯氏壺菌屬物種(Ulkenia sp.)、深洋吾肯氏壺菌(Ulkenia profunda)、葡萄壺菌屬物種(Botryochytrium sp.)、放射葡萄壺菌(Botryochytrium radiatum)、壁壺菌屬物種(Parieticytrium sp.)、沙氏壁壺菌(Parieticytrium sarkarianum)、克爾格倫不游走壺菌(Aplanochtytrium kerguelense)、斯氏不游走壺菌(Aplanochtytrium stocchinoi)、多原狀長形壺菌(Oblongichytrium multirudimentale)、長形壺菌屬物種(Oblongichytrium sp.)和致病疫霉(Phytophthora infestans).如果自展值(bootstrap value)大于75％，則其被認為是顯著的.

圖2：在錐形瓶中用具有低含量的Na⁺和Cl^-的FCC-M培養(yǎng)基來進行的生長測試.根據(jù)本發(fā)明的實施方式在培養(yǎng)基中進行了本發(fā)明所涉及的菌株(黑色的)與本發(fā)明不涉及的菌株(灰色的和劃有線的)的生長的比較。關于每個菌株的柱的長度表示光密度(實施例1).

圖3：在錐形瓶中培養(yǎng)的各種不同的破囊壺菌類菌株的脂肪酸譜(實施例2)。

(A)和(B)：以紅樹橙壺菌為例的根據(jù)本發(fā)明的類別(蛞蝓橙壺菌(Aurantiochytrium limacinum)為其成員)(圖板的前三行)與裂殖壺菌屬物種的類別(其包括菌株ATCC 20888)以及橙壺菌屬物種SEK 217和SEK209這些菌株(圖板的后三行)之間的脂肪酸譜的比較.培養(yǎng)條件描述在實施例2中.

圖4：在生物反應器中培養(yǎng)的各種不同的破囊壺菌類菌株的脂肪酸譜(實施例3和4).

(A)和(B)：根據(jù)本發(fā)明的菌株的脂質譜.(A)以相對于總PUFA(多不飽和脂肪酸)而言的百分比來表示的PUFA.(B)以相對于總飽和脂肪酸而言的百分比來表示的飽和酸.用KOH或NH₄OH來調節(jié)pH的培養(yǎng)物分別通過縮寫(KOH)或(NH₄OH)來識別.培養(yǎng)條件描述在實施例3和4中。

詳細描述

“菌株”不僅是指根據(jù)本發(fā)明所定義的橙壺菌屬的天然菌株，而且還是指所述天然菌株的突變體。

“化學成分確知的”是指任何這樣的產(chǎn)品或產(chǎn)品混合物，所述產(chǎn)品或產(chǎn)品混合物的化學組成是已知的并且構成所述產(chǎn)品或混合物的其每種組成成分的含量是已知的.

“化學成分確知的培養(yǎng)基”是指這樣的培養(yǎng)基，其中每種組成成分的含量是已知的，即不存在酵母提取物或其他復雜的蛋白質來源或其他有機材料，例如蛋白胨或其他復雜的生長試劑，其組成在自然界中和在不存在固定濃度的每種這些組分的情況下均是可變的.

“滲透壓調節(jié)試劑”是指存在于培養(yǎng)基中的使得能夠維持該培養(yǎng)基中的滲透壓的試劑.

“遺傳一致性”是指通過BLAST類型的軟件實現(xiàn)的兩個DNA序列之間的一致性。

因此，本發(fā)明的目標在于在基本上不含鈉(Na⁺)和氯化物(Cl^-)的有機培養(yǎng)基中以異養(yǎng)或兼養(yǎng)方式培養(yǎng)紅樹橙壺菌和蛞蝓橙壺菌類型的某些原生生物的方法.該培養(yǎng)方法使得能夠獲得高的生物質產(chǎn)率和脂質(特別是DHA)產(chǎn)率.

本發(fā)明所涉及的菌株具有在化學成分確知的培養(yǎng)基中以高密度進行生長的能力，在所述培養(yǎng)基中沒有添加顯著量的鈉離子和氯離子，并且沒有添加滲透壓調節(jié)試劑，例如甘露糖醇、山梨糖醇或聚乙二醇.根據(jù)最近的系統(tǒng)發(fā)生分類，它們?yōu)榧t樹橙壺菌和蛞蝓橙壺菌類型的破囊壺菌類菌株，其已知產(chǎn)生DHA[Yokoyama R等人，(2007).Taxonomic rearrangement of the genus Ulkenia sensu lato based on morphology，chemotaxonomical characteristics，and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation for Ulkenia and erection of Botryochytrium，Parietichytrium.Mycoscience.48(6)p.329-341；Yokoyama，R.，Honda，D.(2007)Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensulato based on morphology，chemotaxonomical characteristics and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes，stramenopiles)：emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.Mycoscience 48，199-211；Tsui CK等人，(2009)Labyrinthulomycetes phylogeny and its implications for the evolutionary loss of chloroplasts and gain of ectoplasmic gliding.Mol Phylogenet Evol.50(1)：p.129-40].

應當注意，按照常規(guī)，這些類別的微觀藻類的以異養(yǎng)方式的培養(yǎng)用基于海水的培養(yǎng)基來進行，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)所使用的那種，即培養(yǎng)基ATCC 790By+(1.0g酵母提取物、1.0g蛋白胨、5.0g D(+)-葡萄糖和1升海水).

所述菌株在遺傳方面以及通過其脂質譜來進行表征.

本發(fā)明所涉及的菌株通過其基因中的四個基因即18s、肌動蛋白、微管蛋白和EF1-α與本發(fā)明菌株的代表性菌株即菌株FCC 1324的基因的遺傳一致性來進行表征.菌株FCC 1324是如此分離和選擇出的新的橙壺菌屬菌株的代表，并且于2013年6月21日以登錄號CCAP 4062/1保藏于CCAP(藻類和原生動物保藏中心(Culture Collection of Algae and Protozoa)，Scottish Association for Marine Science，Dunstaffnage Marine Laboratory，Oban，Argyll PA371QA，蘇格蘭，英國).

表1(a)為在紅樹橙壺菌這一類別與在遺傳上最接近的裂殖壺菌屬物種這一類別以及其他在遺傳上接近的菌株之間的四種基因的序列的比較.所有有著與菌株CCAP 4062-1的基因具有91％至100％的一致性(根據(jù)所比較的基因)的序列的菌株可以被認為屬于橙壺菌屬.與所考慮的CCAP 4062-1的18s基因的至少92％的遺傳一致性表征了根據(jù)本發(fā)明的菌株.

對于18s基因(SEQ NO.1)具有至少92％的遺傳一致性的菌株是本發(fā)明所涉及的，并因此可以在減少鈉和氯化物的培養(yǎng)基中生長.申請人還觀察到，如此通過對于18s基因的其遺傳一致性來定義的這些菌株對于肌動蛋白基因(SEQ NO.2)具有至少96％的遺傳一致性，對于微管蛋白基因(SEQ NO.3)具有至少91％的遺傳一致性，和對于EF1-α基因(SEQ NO.4)具有至少95％的遺傳一致性.這些一致性百分比復述在表1(b)中.

表1(b)

圖1顯示了系統(tǒng)發(fā)生分析，其導致本發(fā)明所涉及的菌株的該定義.

在該研究中所使用的破囊壺菌類菌株屬于紅樹橙壺菌、裂殖壺菌屬物種和聚生裂殖壺菌類別.

所述序列用Mega 5.1的CLUSTAL W進行比對.在該圖中，位于分枝處的數(shù)字為自展值.

70％的自展值被視為界限，不應當?shù)渲恋陀谠摻缦?，以便使得兩個群之間的分枝保持顯著.根據(jù)Hillis D.M.和Bull J.J.在其文章“An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis”[(1993)Systematic Biology Vol.42，pp.182-192]中的描述，大于70％的自展(bootstrap)比例通常相應于有至少95％的可能性出現(xiàn)相應的進化枝(群)是真實的。

在圖1中，這意味著，紅樹橙壺菌這一群與裂殖壺菌屬物種這一群之間的差異是顯著的，因為分開這兩個群的結點具有100％的值；并且因此存在兩個不同的類別.這兩個群本身非常遠離聚生裂殖壺菌這一群，正如已經(jīng)由Yokoyama和Honda[(2007)，Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology，chemotaxonomic characteristics，and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.，Mycoscience Vol.48，pp.99-211]所證明的.

在圖1中，本發(fā)明所涉及的菌株為在該圖頂部的第一群的那些，并且具有紅樹橙壺菌這一名稱.

因此，作為本發(fā)明所涉及的菌株的例子，在發(fā)明人所鑒定出的經(jīng)分類的系統(tǒng)發(fā)生類群中，可以提及橙壺菌屬物種SD116(JX863672)、蛞蝓橙壺菌(AB022107)、紅樹橙壺菌(DQ367049)、蛞蝓橙壺菌SL1101(JN986842)、蛞蝓橙壺菌(JN986842)、橙壺菌屬物種LY2012(JX847370)、蛞蝓橙壺菌(HM042909)和橙壺菌屬物種BL10(FJ821477)這些菌株。括號內的編號為登錄號。

這是因為，這些菌株中的每一個與菌株CCAP 4062/1的序列具有相對于序列SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3和SEQ NO.4而言分別為至少92％、至少96％、至少91％和至少94％的一致性百分比。

例如，與序列SEQ NO.1具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的遺傳一致性的橙壺菌屬菌株是本發(fā)明所涉及的。這些菌株還與序列SEQ NO.2具有96％、97％、98％、99％或100％的遺傳一致性，與序列SEQ NO.3具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的遺傳一致性，和與序列SEQ NO.4具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的遺傳一致性.

表1(a)詳細地顯示了本發(fā)明所涉及或不涉及的菌株與菌株CCAP 4062/1的遺傳一致性的比較。

注意到，裂殖壺菌屬物種ATCC 20888(DQ367050)這一菌株和FCC1412裂殖壺菌屬物種SEK 209(AB290574)這一菌株均不屬于本發(fā)明所涉及的菌株.對于這些菌株，與SEQ NO.1的一致性值為91％.

這些菌株具有在具有非常少量的氯化鈉的化學成分確知的(即不存在酵母提取物或其他蛋白質提取物)培養(yǎng)基中以高密度進行生長的能力.該培養(yǎng)基的特征在于，其包含小于3.5g/L，優(yōu)選地小于1g/L，更優(yōu)選地小于10mg/L的鈉離子，和小于1g/L，優(yōu)選地小于0.5g/L，更優(yōu)選地小于0.2g/L的氯離子。

在實施例1中，在這樣的培養(yǎng)基(關于主培養(yǎng)基，參見表2(a))中，申請人用根據(jù)本發(fā)明的菌株以及用本發(fā)明不涉及的比較菌株在錐形瓶中進行了生長測試.所述培養(yǎng)在無機氮(NH₄)₂SO₄和作為碳源的葡萄糖存在下并且在不供給有機氮的情況下來進行.因此，圖2圖解說明了來自這些試驗的結果.結果顯示，所有的紅樹橙壺菌菌株均具有在該培養(yǎng)基上生長的能力，這與其他所測試的破囊壺菌類類別(裂殖壺菌屬物種和聚生裂殖壺菌)相反.

觀察到，關于18s、肌動蛋白、微管蛋白和EF1-α基因，根據(jù)本發(fā)明的菌株與菌株FCC 1324分別具有至少92％、至少96％、至少91％和至少95％的遺傳一致性.

本發(fā)明所涉及的菌株還通過其脂質譜來進行表征.取菌株CCAP 4062/1作為根據(jù)本發(fā)明的菌株的例子和代表.

圖3(A)和3(B)顯示了在兩種不同類別的菌株之間的脂肪酸譜的比較.由紅樹橙壺菌來舉例說明的根據(jù)本發(fā)明的類別(蛞蝓橙壺菌為其成員)(每個圖板的前三行)與裂殖壺菌屬物種的類別(其包括菌株ATCC 20888)以及橙壺菌屬物種SEK 217和SEK 209這些菌株(每個圖板的后三行)。在根據(jù)在實施例2中所描述的本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)條件下，紅樹橙壺菌這一類別的脂質譜呈現(xiàn)出占大多數(shù)的DHA(超過總PUFA的80％).

在圖3(A)中可見，ATCC 20888以及橙壺菌屬物種SEK 217和SEK 209這些菌株具有不同的譜，其中具有相對于根據(jù)本發(fā)明的菌株而言更多的EPA。

DPA(n-6)占總PUFA的大約20％，其中具有較少量的AA和EPA(參見圖3(A))。與菌株CCAP 4062/1具有遺傳相似性的其他菌株也呈現(xiàn)出該譜.

圖3(B)顯示，ATCC 20888以及橙壺菌屬物種SEK 217和SEK 209這些菌株具有不同的飽和脂肪酸譜，其中具有較少的棕櫚酸和較大量的奇數(shù)脂肪酸C15：0和C17：0。

圖4(A)顯示了以相對于總PUFA(多不飽和脂肪酸)而言的百分比來表示的PUFA.圖4(B)顯示了以相對于總飽和脂肪酸而言的百分比來表示的飽和脂肪酸.用KOH或NH₄OH來調節(jié)pH的培養(yǎng)物分別通過縮寫(KOH)或(NH₄OH)來識別.依照培養(yǎng)條件，該譜幾乎保持不變.DHA是占大多數(shù)的多不飽和脂肪酸，占總不飽和酸的差不多80％.在根據(jù)在實施例3和4中所描述的本發(fā)明實施方式的培養(yǎng)條件下，C16：0仍然是占大多數(shù)的飽和脂肪酸，占總飽和酸的大于90％.

因此，發(fā)明人定義了本發(fā)明所涉及的菌株.這些菌株具有在沒有添加顯著量的鈉和氯化物的化學成分確知的培養(yǎng)基中以高密度進行生長的能力.

這些菌株的培養(yǎng)通常以異養(yǎng)方式來進行.

根據(jù)本發(fā)明的化學成分確知的培養(yǎng)基包含對于微生物的生長來說必需的碳源、氮源和鹽.本領域技術人員熟知在發(fā)酵過程中對于微生物的生長來說必需的要素.

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，碳源為化學成分確知的來源，其選自葡萄糖、甘油，優(yōu)選地為葡萄糖.

在所述培養(yǎng)基中碳源的含量有利地為10至90g/L，或10至75g/L.

氮源有利地為化學成分確知的無機或有機來源，不包括任何含氮的復雜的有機材料，例如酵母提取物或蛋白質性質的提取物混合物.

優(yōu)選地，氮源為銨鹽，特別是硫酸銨，和/或硝酸鹽，特別是硝酸鉀.

在所述培養(yǎng)基中氮源的含量有利地為1至10g/L.

主培養(yǎng)基可以包含本領域技術人員已知用于培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的微觀藻類的任何其他組分。所述培養(yǎng)基通常包含化學成分確知的無機鹽，例如堿金屬鹽和堿土金屬，以及其他金屬的鹽.作為例子，可以提及Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的鹽.例如，可以提及硫酸鹽，例如硫酸鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸銨、硫酸鎂、或硫酸銅、硫酸鎳、硫酸鋅.還可以提及磷酸鹽，例如酸式磷酸鉀，或碳酸鹽，例如碳酸鈣.還可以提及氯化物，例如氯化鈷、氯化錳、氯化鈣.還可以提及堿金屬氧化物.還可以提及亞硒酸鹽和鉬酸鹽，例如鉬酸鈉和亞硒酸鈉。其他可用的無機鹽例如為鹵化物，例如溴化鉀或碘化鉀.

在培養(yǎng)基中各種不同鹽的含量取決于微生物為了其生長的需要.某些鹽僅作為供給微量元素以低的量進行使用，例如鋅鹽、鈷鹽、錳鹽、鉬鹽、硒鹽、鎳鹽或銅鹽.

如有必要，對于本發(fā)明的方法來說特別優(yōu)選的培養(yǎng)基另外還包含其他組成成分，例如營養(yǎng)組分，至少一種選自硫酸鎂、氯化鈣、硼酸鉀和磷酸鉀的鹽.在不使得鹽的總含量根據(jù)本發(fā)明是超標的情況下，添加所述鹽.特別優(yōu)選的是，向培養(yǎng)基中添加硫酸鎂、氯化鈣和磷酸鉀.

有利地，離子含量處于在表2(a)(參見下表)中所詳細說明的范圍內。

表2(a)：培養(yǎng)基的一般組成

在所有情況下，對在培養(yǎng)基中的這些鹽的性質和比例進行選擇，從而使得鈉離子的含量小于3.5g/L，優(yōu)選地小于1g/L，更優(yōu)選地小于10mg/L，并且氯離子的含量小于1g/L，優(yōu)選地小于500mg/L，更優(yōu)選地大約200mg/L。

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，所述培養(yǎng)基還包含額外的常量或微量營養(yǎng)素，例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，其是化學成分確知的，即不包括由復雜的來源(例如酵母)攜帶入培養(yǎng)基中的常量或微量營養(yǎng)素.通常，所述培養(yǎng)基包含本領域技術人員已知的其他介質組分.如果需要，可以添加消泡劑.然而，所述培養(yǎng)基不包含無法是化學成分確知的復雜組分.

所述維生素有利地選自硫胺素、維生素B12、泛酸鹽及其混合物.

在所述培養(yǎng)基中維生素的含量有利地處于在表2(a)中所描述的值之間.

根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式，所述化學成分確知的培養(yǎng)基的構成為：化學成分確知的碳源、化學成分確知的氮源、鹽和化學成分確知的維生素的混合物.

將會注意到，該培養(yǎng)基特別適合用于在發(fā)酵罐中，有利地在至少1000升的發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，尤其是以所謂“分批”的不連續(xù)方式、以所謂“補料分批”的半連續(xù)方式或以連續(xù)方式.

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的培養(yǎng)基的一個實例如在下面的表2(b)中那樣進行了定義.

表2(b)：培養(yǎng)基的實例

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式的培養(yǎng)基的一個實例如在下面的表2(c)中那樣進行了定義。該稱為FCC-M的培養(yǎng)基包含0.00038g/l的鈉(Na⁺)和0.437g/l的氯化物(Cl^-)。所述培養(yǎng)基不含添加的NaCl.

表2(c)：FCC-M培養(yǎng)基

常規(guī)地，在異養(yǎng)或兼養(yǎng)條件下在生物反應器或發(fā)酵罐中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的菌株期間，用增補溶液對基礎培養(yǎng)基進行補充，以維持微觀藻類的生長.還可以添加含碳底物，例如葡萄糖(增補溶液2).本領域技術人員知道確定增補溶液的每種組成成分的濃度.例如，在下面的表3(a)中指明了作為例子的組成成分的含量.

表3(a)：用于在發(fā)酵罐或生物反應器中進行的培養(yǎng)的增補溶液1和2的實例

在表3(b)中給出了這樣的增補溶液的實例.

表3(b)：用于在發(fā)酵罐或生物反應器中進行的培養(yǎng)的增補溶液1和2的實例

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，典型地，當在發(fā)酵罐或生物反應器中進行培養(yǎng)時，在添加增補溶液以維持細胞的生長之后，Na⁺的最終濃度為大約10mg/L，優(yōu)選地小于6mg/L，和Cl^-的最終濃度為大約250mg/L，優(yōu)選地小于200mg/L。

根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方式，當在錐形瓶中進行培養(yǎng)時，Na⁺的濃度小于5mg/L，優(yōu)選地小于2mg/L，和更優(yōu)選地小于1mg/L，和Cl^-的濃度為大約1g/L，優(yōu)選地小于0.750g/L，和更優(yōu)選地小于0.5g/L.

通常，在培養(yǎng)過程中，進行有機含碳底物的添加(參見例如表3(a或b)的增補溶液2)，以便允許細胞積累高濃度的脂質.在培養(yǎng)過程期間向培養(yǎng)基中添加另外的底物(增補溶液2)，以維持足夠的濃度.該有機含碳底物優(yōu)選地包含(以純的形式或以混合物形式)：葡萄糖、纖維素衍生物、蔗糖和/或甘油.有機底物的濃度通常在200mM和500mM之間.

在所述培養(yǎng)基中所包含的有機含碳底物可以由復雜的分子或底物的混合物構成.例如，由小分子構成的來自淀粉生物轉化(例如以玉米、小麥或馬鈴薯為原料)的產(chǎn)物，尤其是淀粉水解產(chǎn)物，是適合于以異養(yǎng)或兼養(yǎng)方式培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的原生生物的有機含碳底物.

在培養(yǎng)期間，pH位于4和8之間，溫度位于20℃和30℃之間，和溶解氧的濃度典型地被調節(jié)在5％和30％之間.

該方法的優(yōu)點在于提高從培養(yǎng)中獲得的生物質的產(chǎn)率.該方法的優(yōu)點還在于使得如此培養(yǎng)的原生生物富含多不飽和脂肪酸，更特別地二十二碳六烯酸(DHA).

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，在具有少量NaCl的培養(yǎng)基例如FCC-M培養(yǎng)基(表2(c))中進行預培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基包含例如作為氮源的酵母提取物和例如作為碳源的葡萄糖.在溫育時間(例如48小時)后，將細胞離心，并且將細胞粒狀沉淀在具有少量NaCl的培養(yǎng)基例如FCC-M中進行漂洗，所述培養(yǎng)基例如既不包含酵母提取物，也不包含任何其他無機或有機氮源.該操作的目的在于避免經(jīng)由在預培養(yǎng)物中酵母提取物的存在(其通常相應于主溶液的培養(yǎng)體積的1/100(v/v))而在主培養(yǎng)物中出現(xiàn)Na⁺的任何供給。

根據(jù)本發(fā)明的分離的橙壺菌屬菌株使得能夠產(chǎn)生顯著量的生物質以及脂質，其中所述脂質富含DHA.這是因為，在異養(yǎng)或兼養(yǎng)條件下的本發(fā)明的方法使得能夠獲得大于100g/L，優(yōu)選地大于120g/L的生物質產(chǎn)率，該生物質具有相對于干物質的重量而言50％至60％的脂質.DHA可以占在所述原生生物中所包含的總脂肪酸的大于15％，或大于20％，或大于30％.根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，所述原生生物因此可以具有至少0.1g/L/小時，優(yōu)選地至少0.2g/L/小時，和更優(yōu)選地至少0.3g/L/小時的DHA生產(chǎn)率(每小時在每升培養(yǎng)物中所產(chǎn)生的目的產(chǎn)物的量).

根據(jù)本發(fā)明的方法另外還包括下列步驟：

a)在具有小于1g/L，優(yōu)選地小于10mg/L的鈉(Na⁺)和小于1g/L，優(yōu)選地小于200mg/L的氯化物(Cl^-)的化學成分確知的培養(yǎng)基中，在異養(yǎng)條件下培養(yǎng)一種或多種與序列SEQ NO.1具有至少92％的遺傳一致性的網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycete)(特別是橙壺菌屬)菌株，

b)維持所述培養(yǎng)物經(jīng)過數(shù)代的步驟，

c)回收如此培養(yǎng)出的生物質的步驟.

所述“回收步驟”更特別地是指分離出其細胞數(shù)目在所述代過程中增長最大的菌株.

所述方法還可以包括下列另外的步驟：

d)回收所述菌株的脂質的步驟，和任選地，

e)從所回收的脂質中提取DHA(二十二碳六烯酸).

步驟(a)的菌株還可以與序列SEQ NO.2具有至少96％的遺傳一致性，和/或與序列SEQ NO.3具有至少91％的遺傳一致性，和/或與序列SEQ NO.4具有至少95％的遺傳一致性.

根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法使得能夠實施在具有低水平的鈉和氯化物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些橙壺菌屬菌株，其中不喪失生物質和脂質(特別是DHA)的生產(chǎn)率和高產(chǎn)率.因此，避免了用于培養(yǎng)細胞和處理所得生物質的由不銹鋼制成的發(fā)酵罐和其他設備的壞損，以及生物質的生產(chǎn)和處理(下游加工(Down-Stream Processing)”或“DSP”)器具因腐蝕而造成的過早壞損.

本發(fā)明還涉及調制出一種培養(yǎng)基，其使得能夠以高細胞密度產(chǎn)生富含DHA的根據(jù)本發(fā)明的菌株.所述培養(yǎng)基是化學成分確知的，其中具有低含量的鈉離子(Na⁺)和氯離子(Cl^-)。Na⁺的濃度通常小于100mg/L，優(yōu)選地小于50mg/L，和更優(yōu)選地小于6mg/L，并且Cl^-的濃度優(yōu)選地小于0.5g/L，和更優(yōu)選地小于200mg/L.根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，在具有小于0.5g/L的NaCl、小于6mg/L的鈉離子和小于200mg/L的氯離子的培養(yǎng)基中進行本發(fā)明所涉及的菌株的培養(yǎng)。

根據(jù)一個實施方式，所述培養(yǎng)基為FCC-M(表2(c))。如果在發(fā)酵罐或生物反應器中進行培養(yǎng)，那么增補溶液將會是所希望的，如在上面所描述的(參見例如表3(a或b)).

由于根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基是化學成分確知的，因而其既不包含生長試劑，例如酵母提取物或蛋白胨(其本身也包含一定量的氯化鈉)，也不包含滲透壓調節(jié)試劑，例如甘露糖醇或山梨糖醇.因此，在不存在這些試劑的情況下，來自所述培養(yǎng)物的生物質和脂質可以用于食品(或藥品)，而無需眾多的對于表征最終產(chǎn)物的內含物或者去除在最終產(chǎn)物中不希望的所添加的這些試劑來說必需的DSP步驟.因此，避免了與這些額外的步驟相關聯(lián)的超額成本.同樣地，在提取油后獲得的聯(lián)產(chǎn)物可以用于動物膳食，例如以油餅的形式.

本發(fā)明的方法和本發(fā)明的培養(yǎng)基的另一優(yōu)點是，來自所述培養(yǎng)的排放物不包含需要額外的處理步驟的試劑，所述額外的處理步驟導致額外的成本并且因此降低生產(chǎn)收益.

本發(fā)明的方法和培養(yǎng)基不僅使得能夠優(yōu)化從培養(yǎng)中獲得的生物質的生產(chǎn)，同時避免使用鈉離子和氯離子以及相關的超額成本的問題，而且還使得能夠使如此培養(yǎng)的生物富含多不飽和脂肪酸.

優(yōu)選地，所述菌株根據(jù)前面所述及的方法來進行培養(yǎng)，然后回收以便從中提取脂質內含物，特別是脂質(包括DHA).脂質(包括DHA)的選擇性提取方法是本領域技術人員已知的，并且例如由Bligh，E.G.和Dyer，W.J.(1959)[A rapid method of total lipid extraction and purification，Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917]進行了描述.

因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，所述菌株可以具有至少0.1g/L/小時，優(yōu)選地至少0.2g/L/小時，和更優(yōu)選地至少0.3g/L/小時的DHA生產(chǎn)率.

本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的方法中獲得的生物質和/或聯(lián)產(chǎn)物的全部或部分的用途，所述用途為作為用于人類膳食的產(chǎn)品、用于人類膳食的產(chǎn)品中的成分，或者作為用于動物膳食尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖的原料.

本發(fā)明還涉及根據(jù)在本文中所描述的實施方式的培養(yǎng)基，特別是稱為FCC-M的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)原生生物以產(chǎn)生脂質和色素的用途。

實施例1

在錐形瓶中的生長測試：

將在圖2中所列的菌株預先在包含15g/l的重構海鹽(Instant)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天，然后離心并用FCC-M溶液(表2(c))洗滌一次，隨后接種在包含50ml FCC-M培養(yǎng)基的錐形瓶中(1/1000v/v)。在26℃和攪拌(220rpm)下溫育三天后，測量細胞培養(yǎng)物的光密度.

實施例2

在錐形瓶中生長之前的脂肪酸譜：

將在圖2中所列的菌株預先在包含15g/l的重構海鹽(Instant)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天，然后離心并用FCC-M溶液(表2(c))洗滌一次，隨后接種在包含50ml FCC-M培養(yǎng)基(其中將硫酸銨替換為酵母提取物(4g/L))的錐形瓶中(1/1000v/v).從在26℃和攪拌(220rpm)下溫育3天的細胞培養(yǎng)物中測定脂肪酸譜(FAME)。

實施例3

在生物反應器中的生長和DHA產(chǎn)生測試：

在具有專用的自動裝置和經(jīng)由信息處理站的監(jiān)管的、有用的、1至2L的發(fā)酵罐(生物反應器)中進行橙壺菌屬物種的培養(yǎng).通過添加堿(NaOH或KOH)和/或酸(硫酸溶液)來調節(jié)該系統(tǒng)的pH.將培養(yǎng)基溫度固定在26℃.借助于根據(jù)Rushton結構安置在樞軸上的3個攪拌活動體(下行式泵送的三槳葉螺旋槳)來進行攪拌.通過攪拌速度(250-1200rpm)、空氣流量(0.25-1vvm)或甚至氧氣流量(0.1-0.5vvm)，在整個培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)基中調節(jié)溶解氧的壓力.整合在監(jiān)管自動裝置中的調節(jié)參數(shù)使得能夠維持5％至30％的恒定的pO₂.培養(yǎng)時間為50至200小時，優(yōu)選地65至96小時，例如72小時.

在恒溫的(26℃)圍殼中的搖動臺(140rpm)上，在包含4g作為氮源的酵母提取物和30g作為碳源的葡萄糖的FCC-M培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng).在溫育48小時后，將細胞以3000g離心5分鐘，并且將細胞粒狀沉淀用既不包含酵母提取物也不包含任何其他無機或有機氮源的FCC-M培養(yǎng)基進行漂洗。在培養(yǎng)過程中，實施增補溶液1的3次添加，以及溶液2的添加，以將葡萄糖濃度維持在200mM和500mM之間。

培養(yǎng)的監(jiān)測：

總生物質濃度通過測量干質量(在濾器GF/F，Whatman上進行過濾，然后在稱重之前，在105℃下，在烘箱中干燥最少24小時)來進行監(jiān)測。

根據(jù)傳統(tǒng)地描述在文獻[Folch J.等人，A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.J Biol Chem.1957May，226(1)：497-509]中的方法來進行總脂質含量和FAME的分析.

實施例4

在發(fā)酵罐中的培養(yǎng)：

以與在實施例3中所描述的相似的方式，在發(fā)酵罐中進行橙壺菌屬物種的培養(yǎng).通過添加氨水(NH₄OH)來就pH的調節(jié)方式對該程序進行修改，以避免與用NaOH或KOH調節(jié)pH相關聯(lián)的Na⁺或K⁺的大量供給，這可能會妨礙用于動物膳食的聯(lián)產(chǎn)物的再利用.由于通過用氨水(NH₄OH)調節(jié)pH而提供了一部分對于培養(yǎng)細胞來說必需的氮，因此不再需要在增補溶液1的組成中包括(NH₄)₂SO₄.

表3指出了該實施例的結果：

PCT/RO/134表