本發(fā)明涉及細菌在非細胞介質中的培養(yǎng)，所述細菌的生長對氧張力敏感，所述細菌尤其為不易耐受高氧張力的細菌，所述細菌的最佳生長需要有比空氣的氧張力相對降低的氧張力的溫育氣氛，或者所述細菌甚至為嚴格厭氧菌，氧氣對其是有毒性的，且其應當在完全無氧下培養(yǎng)，或僅耐受低濃度的氧。
因此，在對氧敏感的細菌中區(qū)分出：
-微需氧(microaérophiles)細菌，即，不能夠在包含約21％，尤其1％至20％，更一般地約2-2.5％的環(huán)境氧濃度的氣氛中培養(yǎng)所述細菌，和
-嚴格厭氧菌，即，不能夠在氧氣的存在中，或在比微需氧的濃度更低的濃度中培養(yǎng)它們，所述更低的濃度尤其嚴格小于1％，更一般地小于0.1％，理想為0％。為了培養(yǎng)嚴格厭氧菌，需要在不含任何氧氣的烘箱中培養(yǎng)它們，或者在未經脫氧的管中培養(yǎng)它們，然后它們僅在管的底部生長。
在嚴格厭氧菌當中，更特別地提及細胞外細菌，即僅可在細胞外面生長的細菌。
更特別地，本發(fā)明涉及厭氧菌的培養(yǎng)，并且涉及微需氧菌在有氧氣氛中的培養(yǎng)。
背景技術：
在WO 2014/064359中，打算改善和促進細菌在非細胞培養(yǎng)中生長的情況，所述細菌的生長對氧含量敏感，所述細菌尤其為不易耐受高氧張力的細菌，所述細菌的最佳生長需要有比空氣的氧含量相對降低的氧含量的溫育氣氛，所述細菌選自以下細菌：
-厭氧菌，包括嚴格厭氧菌，和
-上面提及類型的微需氧菌。
在此處“微需氧氣氛”是貧氧的空氣，其具有小于10％，優(yōu)選5％，更優(yōu)選小于2.5％的摩爾氧比例。對于嚴格厭氧菌，如上面所提及，氧含量應當接近于0％，尤其小于0.1％，根據(jù)厭氧菌的種類，對非常少量的氧氣的耐受是可變的。
在WO 2014/064359中，加入某些抗氧化化合物是推薦的，即，在非細胞培養(yǎng)介質(milieu de culture)中加入抗壞血酸、谷胱甘肽和硫氫化鈉，其可以提供以下可能性：
-通過更快速地獲得足夠濃度的細菌來改善所述細菌的生長，從而在增殖后可被檢測，和/或通過在指定的培養(yǎng)時期(即每時間單位)后增加細菌的濃度來改善所述細菌的生長，和
-在比不含任何抗氧化化合物時更大量的氧氣的存在下，以至少一種相同生長水平或甚至以更高水平，即，在微需氧氣氛中，尤其是具有2至5％的氧含量，氧含量也可以大于5％，或甚至在有氧條件下，即在等于環(huán)境空氣的接近氧含量的氧水平(即約21％)的存在下來培養(yǎng)嚴格厭氧菌，和
-在含有更高氧張力的氣氛中以至少一種相同生長水平培養(yǎng)所述微需氧細胞內細菌，可以在不含抗氧化化合物時、在微需氧氣氛中或甚至以更高的生長水平培養(yǎng)所述細菌，這是細菌伯納特氏立克次氏體(Coxiella burnetii)的情況；和
-在微需氧氣氛中，以更高的生長速度培養(yǎng)細菌，可以在不含抗氧化化合物時、在含有高氧張力但小于空氣的氧含量的氣氛中培養(yǎng)所述細菌，這是兼性細胞內細菌結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的情況。
在WO 2014/064359中，因此提供了一種用于在細菌的非細胞培養(yǎng)介質中體外培養(yǎng)細菌的方法，所述細菌的生長對氧含量敏感，所述細菌的最佳生長需要有比空氣的氧含量相對降低的氧含量或甚至零含量的溫育氣氛，所述細菌選自厭氧菌和細胞內微需氧菌，其特征在于加入選自抗壞血酸、谷胱甘肽和硫氫化鈉的抗氧化化合物，并且在氧氣的存在下在所述培養(yǎng)介質中培養(yǎng)所述細菌。
在WO 2014/064359中，優(yōu)選抗壞血酸和谷胱甘肽，因為它們在特定的劑量能夠允許在更高的氧氣水平下的培養(yǎng)。
在WO 2014/064359中，仍然更特別地，以0.1g/L至2g/L的濃度，或以10-6M至10-2M的摩爾濃度應用所述抗氧化化合物。
其他抗氧化化合物如硫氫化鈉(NaHS)或半胱氨酸的效果較弱，且需要更高的濃度。
抗氧化化合物的加入提供了在相對更高的氧含量的存在下，或甚至在環(huán)境空氣氣氛中耐受生長的可能性，尤其是對于細胞內微需氧菌如伯納特氏立克次氏體或卡氏螺桿菌(Helicobacter cinaedi)和嚴格厭氧菌如擬桿菌屬(Bacteroides)。并且，這種加入還提供了對于某些細菌(如結核分枝桿菌)在抗氧化化合物的存在下在降低的氧張力下改善其的生長的可能性，可以在不含抗氧化化合物下在較高的氧張力下培養(yǎng)所述細菌。
在某些情況下，對于某些細菌和/或某些培養(yǎng)介質，大劑量的抗壞血酸看起來毒性太大和/或酸性太大。對于結核分枝桿菌來說尤其如此(4)。另一方面，谷胱甘肽非常昂貴。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)也可以通過向所述培養(yǎng)介質中加入尿酸(7,9-二氫-1H-嘌呤-2,6,8(3H)-三酮或2,6,8-三氧嘌呤)代替如WO 2014/064259中所描述的抗氧化化合物，獲得對所述厭氧菌或對氧氣敏感的細菌的生長的相同作用，以相似或小于如WO 2014/064359中所描述的抗壞血酸和谷胱甘肽的濃度應用所述尿酸。
盡管尿酸在某些情況下具有抗氧化性質，但是在微生物學中其常規(guī)上不作為抗氧化化合物使用，因為在某些情況下，其相反顯示氧化性質(5)。
在夸休可爾(Kwashiorkor)癥(一種兒童營養(yǎng)不良的形式)的研究工作的范圍內，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)尿酸對厭氧菌生長的重要性。他們在這些兒童中觀察到消化道中的非常特別的微生物菌群，其一方面含有非常少的厭氧菌，另一方面包含尿酸的缺乏。這種尿酸的缺乏來源于含有少量蔬菜且不含任何肉類的飲食，而尿酸來源于嘌呤的降解，例如在含有肉類的食物中發(fā)現(xiàn)了顯著量的嘌呤。為了解釋這些患者的菌群的特異性，他們希望檢查尿酸是否足以在理論上允許厭氧菌在有氧條件下培養(yǎng)，這使得他們發(fā)現(xiàn)在消化道中正常存在的少量尿酸實際上可以恢復厭氧菌的生長，在缺乏尿酸的患者中不存在所述厭氧菌。
該發(fā)現(xiàn)特別重要且是有益的，因為尿酸相比于抗壞血酸酸性較弱且毒性較弱，并且比谷胱甘肽便宜得多，即，尿酸約為1歐元/g，而谷胱甘肽為100歐元/g。
技術實現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明的目的在于細菌在非細胞培養(yǎng)介質中的體外培養(yǎng)方法，所述細菌選自厭氧菌和細胞內微需氧菌，其中在氧氣的存在下在所述培養(yǎng)介質中培養(yǎng)所述細菌，其特征在于將尿酸以至少0.1g/L的濃度加入至所述培養(yǎng)介質中。
所述細菌為其生長對氧含量敏感的細菌，所述細菌的最佳生長需要有比空氣的氧含量相對降低的氧含量的溫育氣氛。
更特別地，以至少0.2g/L，優(yōu)選0.4至2g/L，尤其0.2至0.5g/L的濃度應用尿酸，以便在有氧氣氛中，以小于或等于單獨的抗壞血酸和單獨的谷胱甘肽或混合物的濃度，獲得對氧氣敏感的所述細菌的生長的相等或甚至更好的作用，所述單獨的抗壞血酸和單獨的谷胱甘肽或混合物的濃度允許在相同的有氧環(huán)境氣氛中對所述細菌生長的相似作用。
可以將尿酸與抗壞血酸和/或谷胱甘肽作為混合物應用，但是可以在所述培養(yǎng)介質中在不含任何額外的抗氧化化合物的情況下應用尿酸。
如在下文中詳述的說明書的示例性實施方案中所闡明：
-在有氧氣氛中使用尿酸以及抗壞血酸和谷胱甘肽，非常多的厭氧菌和微需氧菌獲得了改善的生長，和
-對于某些細菌，相比于使用抗壞血酸和谷胱甘肽的混合物獲得的生長，使用尿酸獲得的生長更好，和
-在有氧氣氛中單獨使用尿酸或與抗壞血酸組合使用尿酸，某些厭氧菌和微需氧菌獲得了改善的生長，但是單獨使用抗壞血酸則沒有改善的生長。
優(yōu)選地，將尿酸與抗壞血酸組合應用，仍然優(yōu)選地，將尿酸與抗壞血酸和谷胱甘肽組合應用。
更特別地，所述培養(yǎng)介質包含組分，在能夠培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)基礎介質中也存在所述組分，所述組分至少包含：
-多種碳源，
-磷源，優(yōu)選磷酸鹽，
-氮源，優(yōu)選銨鹽，
-至少一種選自K、Mg、Na、Ca的金屬的鹽，優(yōu)選NaCl。
更特別地，所述培養(yǎng)介質為非細胞介質，其選自由定性且定量的化學或生物物質組成的無菌介質，和包含多細胞組織的研磨材料或裂解材料的提取物的非細胞介質。優(yōu)選地，所述介質包含用于將pH調節(jié)到7至7.5的pH調節(jié)緩沖物質。
更特別地，所述培養(yǎng)介質為常規(guī)的微需氧菌或厭氧菌的非細胞培養(yǎng)介質，優(yōu)選為包含組分的介質，所述組分選自多細胞組織的研磨材料或裂解材料的提取物、酶消化材料(尤其是酪蛋白、大豆和/或動物組織的酶消化材料)、蛋白胨、酵母提取物、糖(如右旋糖或葡萄糖)、NaCl鹽和/或Na2PO4鹽。
仍然更特別地，當所述細菌為細胞外細菌時，所述培養(yǎng)介質為所述研磨材料或裂解材料(尤其是血液組織或心臟組織和/或肺組織)的濾液，如下文描述的所謂的心-腦型肉湯介質，有5％綿羊血的哥倫比亞(Columbia)介質或施耐德(Schaedler)介質。其他合適的常規(guī)介質為布魯氏菌(Brucella)介質或Wilkins-Chagren介質。這些非細胞培養(yǎng)介質是本領域技術人員熟知的?？梢詫⑦@些介質與瓊脂(固體的或半固體的)或不與瓊脂(液體的)一起使用。
特別地，對于厭氧微生物可以使用多價培養(yǎng)介質，尤其是施耐德介質。
這些非細胞培養(yǎng)介質，無論它們是液體的、固體的或雙相的，均是本領域技術人員熟知的。更特別地，所述用于厭氧菌的培養(yǎng)介質可以為液體或固體或半固體，尤其是用瓊脂糖化或半瓊脂糖化的介質。
更特別地，在所述溫育氣氛中培養(yǎng)所述細菌，所述溫育氣氛包含比在不存在尿酸或任何抗氧化化合物時在相同培養(yǎng)時期中獲得相同生長水平的最大耐受張力更大的氧摩爾比例。
實際上，仍然更特別地，在所述溫育氣氛中培養(yǎng)所述細菌，所述溫育氣氛包含小于或等于20％的摩爾氧比例。
仍然更特別地，在包含大于5％的氧含量的氣氛中，尤其在含有5％CO2的空氣(即，小于16％的氧含量)中，或者甚至在環(huán)境空氣的有氧氣氛中培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的所述細菌。
仍然更特別地，在某些情況下，如下文所解釋，在所述微需氧溫育氣氛中培養(yǎng)所述細胞內微需氧細菌，所述溫育氣氛包含小于5％，優(yōu)選2至5％，仍然優(yōu)選2.5％的摩爾氧比例。
更特別地，將尿酸與抗氧化化合物一起應用，所述抗氧化化合物優(yōu)選地選自抗壞血酸和谷胱甘肽(γ-L-谷氨?；?L-半胱氨酰甘氨酸)或者甚至硫氫化鈉。優(yōu)選抗壞血酸和谷胱甘肽，因為它們在特定的劑量能夠允許在更高的氧氣水平下的培養(yǎng)。仍然更特別地，以1mg/L至2g/L，優(yōu)選至少100mg/L的濃度應用所述抗氧化化合物。
優(yōu)選地，所述抗氧化化合物為抗壞血酸和/或谷胱甘肽，優(yōu)選為至少100mg/L的濃度。
更特別地，所述細菌為可以在不存在尿酸或所述氧化化合物時，在氣氛中，在所述培養(yǎng)介質中培養(yǎng)的細菌，所述氣氛包含小于空氣中氧摩爾比例，優(yōu)選小于20％的氧摩爾比例，并且在所述尿酸的存在下在所述培養(yǎng)介質中在溫育氣氛中培養(yǎng)所述細菌，所述溫育氣氛包含小于或等于空氣中氧比例，優(yōu)選小于20％，仍然優(yōu)選大于5％的氧含量。
根據(jù)第一個實施方案，所述細菌為細胞外厭氧菌，可以在不存在所述尿酸或所述抗氧化化合物時在無氧氣氛中培養(yǎng)所述細胞外厭氧菌，并且在氧氣的存在下實現(xiàn)所述細菌的生長，所述氧氣具有小于或等于空氣中氧比例的摩爾比例。
厭氧菌可以為嚴格厭氧菌或兼性厭氧菌，所述兼性厭氧菌也被稱作需氧兼厭氧菌，即耐受氧氣但不需要其用于生長的厭氧菌，或支持無氧生長的需氧菌。
在嚴格厭氧菌當中，更特別地提及細菌，所述細菌屬于氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、另枝菌屬(Alistipes)、厭氧球菌屬(Anaerococcus)、Anaerosalibacter屬、Amazonia屬、奇異菌屬(Atopobium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、布勞特菌屬(Blautia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、巴尼斯菌屬(Barnesiella)、梭菌屬(Clostridium)、柯林斯菌屬(Collinsella)、Dielma屬、埃格特菌屬(Eggerthella)、芬戈爾德菌屬(Finegoldia)、黃桿菌屬(Flavonifractor)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、Gordonibacter屬、Guyana屬、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)、臭氣桿菌屬(Odoribacter)、糞副擬桿菌屬(Parabacteroides)、微單胞菌屬(Parvimonas)、普氏菌屬(Prevotella)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、嗜胨菌屬(Peptoniphilus)、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)、普氏菌屬(Prevotella)、Solobacterium屬、泰氏菌屬(Tissierella)、圖里克氏菌屬(Turicibacter)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和韋榮氏球菌屬(Veillonella)。
在兼性厭氧菌當中，更特別地提及細菌，所述細菌屬于放線菌屬(Actinomyces)、氣球菌屬(Aerococcus)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、巴爾通體屬(Bartonella)、西地西菌屬(Cedecea)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、Derambacter屬、艾肯菌屬(Eikenella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、真桿菌屬(Eubacterium)、加德納菌屬(Gardnerella)、孿生球菌屬(Gemella)、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、哈夫尼亞菌屬(Hafnia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、金氏菌屬(Kingella)、克雷伯菌屬(Klebsellia)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、賴氨酸桿菌屬(Lysinibacillus)、摩根氏菌屬(Morganella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)、片球菌屬(Pediococcus)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、普羅維登斯菌屬(Providencia)、沙雷菌屬(Serratia)、勞特菌屬(Raoultella)、羅氏菌屬(Rothia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)。
根據(jù)該第一個更特別的實施方案，在所謂的非細胞介質中，在小于或等于空氣的摩爾氧比例的存在下，在所述尿酸存在下，優(yōu)選在環(huán)境空氣的氣氛中培養(yǎng)細胞外厭氧菌，尤其是在人或動物消化道中的細菌。
通過多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)在尿酸存在下的有氧培養(yǎng)，在下文的示例中闡明該第一個實施方案。
這些為消化道的嚴格厭氧菌，其通常僅在嚴格無氧條件下培養(yǎng)。事實表明，當將所述細菌接種至經脫氧的管中時，培養(yǎng)菌膜僅在管的下部出現(xiàn)，而上部一直未被任何培養(yǎng)物觸及。如果加入根據(jù)本發(fā)明的200μg/ml尿酸，培養(yǎng)實際地在表面上出現(xiàn)，或甚至在500μg/ml的濃度時則完全在表面上出現(xiàn)，并且在1g/l尿酸時甚至更好，如同于500μg/ml抗壞血酸和500μg/ml谷胱甘肽的混合物。在被接種至瓊酯糖上后，細菌在24h中生成菌落。
在另一個實施方案中，所述細菌為細胞內微需氧菌，能夠在所述非細胞培養(yǎng)介質中，在微需氧氣氛中，在不存在尿酸或抗氧化化合物時培養(yǎng)所述細胞內微需氧菌，所述微需氧氣氛在溫育氣氛中具有不大于5％，優(yōu)選不大于2.5％的摩爾氧比例，并且在尿酸的存在下，在所述培養(yǎng)介質中，在微需氧溫育氣氛中培養(yǎng)所述細菌，所述微需氧溫育氣氛包含2.5％至20％，優(yōu)選5％至16％的摩爾氧比例，尤其為任選富含5％CO2的空氣。
本發(fā)明更特別地適用于微需氧菌，因為，特別是，所述尿酸的加入。
在細胞內微需氧菌當中，可以更特別地提及立克次氏體屬(Coxiella)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、幽門螺桿菌屬(Helicobacter)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和漫游球菌屬(Vagococcus)的細菌。
通過在環(huán)境空氣中培養(yǎng)的細菌結核分枝桿菌和卡氏螺桿菌的有氧培養(yǎng)闡明該實施方案。
在有氧條件下在添加了尿酸的多價培養(yǎng)介質中，測試了實施例3中提及的約250種其他種類的微需氧菌、嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌，獲得了改善的生長。
根據(jù)以下示例性實施方案的詳細描述，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將變得明顯。
具體實施方式
實施例1：多形擬桿菌用施耐德介質的培養(yǎng)。
通過本發(fā)明人的“培養(yǎng)組學(culturomics)”研究(2)獲得了厭氧菌多形擬桿菌的菌株，其也可以從不同的保藏品中獲得(CSUR P766，也根據(jù)布達佩斯條約在2014年5月19日在DSMZ微生物(德國)的保藏品中以編號DSM 28808保藏，其他菌株也可以從不同的保藏品中獲得，如菌株DSM 2079、ATCC 29148和NCTC 10582)。
對于它們的足夠量的生產，在厭氧氣氛中，在37℃，在多價培養(yǎng)介質中培養(yǎng)多形擬桿菌。對于培養(yǎng)厭氧菌，還測試了合適的施耐德介質(參考號42098；BioMérieux，La Balmes-les-Grottes，法國)。
1升的施耐德介質(由BioMérieux，Marcy l’étoile，法國出售)具有以下組分：
通過加入碳氫化合物，即1g/L大米淀粉和1g/L葡萄糖(Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，法國)，并通過加入尿酸和抗氧化化合物補充施耐德介質，即通過加入以下物質補充施耐德介質：
-0.1g/L抗壞血酸(VWR International，Louvain，比利時)、0.1g/L尿酸和0.1g/L谷胱甘肽(Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，法國)，
-或者單獨的0.1、0.2或0.3g/L尿酸作為抗氧化化合物。
此處加入碳氫化合物淀粉和葡萄糖的目的在于產生H2用于控制細菌的生長。
以0.1mg/ml的濃度應用刃天青作為氧化還原指示劑用于控制氧氣的存在(氧化的刃天青為粉色，并在不存在氧氣時變得透明)。
通過向在37℃溫育的、含有補充加入有抗氧化化合物和碳源化合物的培養(yǎng)介質的容器中接種105微生物/ml，進行多形擬桿菌在環(huán)境空氣中的有氧培養(yǎng)。通過加入10M KOH將pH調節(jié)至7.5。
通過向根據(jù)本發(fā)明補充的培養(yǎng)介質中，和向補充有上面提及的碳氫化合物但另一方面不含任何抗氧化化合物的施耐德介質中接種105微生物/ml，在有氧條件下平行地培養(yǎng)菌株。
將補充加入有1g/L大米淀粉和1g/L葡萄糖的、在無氧條件下接種有108細胞/L多形擬桿菌的培養(yǎng)介質引入作為陽性對照，用于在無氧培養(yǎng)中檢查多形擬桿菌的H2的生成。在環(huán)境氣氛(有氧條件)中平行地進行這些對照。將未接種的培養(yǎng)介質引入作為陰性對照。
通過氫氣的生成每日評估多形擬桿菌的生長。利用裝備有熱導檢測器和Chromosorb WAW 80/100目SP100柱(Alltech，Carquefou，法國)的GC-8A氣相色譜儀(Shimadzu，Champs-sur-Marne，法國)進行氫氣的測量。使用100kPa壓力的氮氣N2作為載氣。檢測器和進樣器的溫度為200℃，柱溫為150℃。
在溫育一周后，陰性對照依然為陰性的，沒有出現(xiàn)任何生長，表明此處報道的結果并非僅是其他微生物污染的結果。
陽性對照為陽性的，在多形擬桿菌的無氧培養(yǎng)中觀察到氫氣的生成。不含抗氧化化合物的、在有氧條件下接種的多形擬桿菌培養(yǎng)依然為陰性的，沒有產生氫氣。
在環(huán)境空氣(在有氧條件下)中在37℃溫育24小時后，不含任何抗氧化化合物的培養(yǎng)介質保持其粉色，表明氧氣的存在，該培養(yǎng)對于測試的菌株依然為陰性的。含有尿酸或所述抗氧化化合物的有氧培養(yǎng)介質變得透明，表明不存在氧氣。
在溫育24小時后，所有含有尿酸或所述抗氧化化合物的在有氧條件下進行的多形擬桿菌的培養(yǎng)都給出了多形擬桿菌的陽性培養(yǎng)，具有氫氣的生成。
當單獨的尿酸濃度為至少0.2g/L且單獨的尿酸大于0.3g/L時，含有尿酸但不含所述抗氧化化合物的生長結果等于用尿酸和抗壞血酸和谷胱甘肽的混合物獲得的那些結果。
這些結果表明，能夠在含有合適抗氧化劑混合物的合適介質中，特別地單獨用尿酸而不用任何抗氧化劑，在環(huán)境空氣(有氧條件)中培養(yǎng)被眾所周知地認為是嚴格厭氧菌的細菌。
在含有0.2％瓊脂(BioMérieux，Marcy l’étoile，法國)的施耐德型培養(yǎng)介質管中進行培養(yǎng)程序。
1升的施耐德介質具有以下組分：
對于每種細菌，接種2管，一個不含任何尿酸的再生的管和一個加入有500μg/ml或1mg/ml尿酸的再生的管。為了將管再生，將其放置于100℃的水浴中，直至介質中所有可見的氣泡消失。然后，對于含有尿酸的管，等待管冷卻至50℃(從原理上講直至能夠將其握在手中而不燙手)，加入尿酸的混懸液。然后通過翻轉(3-4次以確保混合良好)進行均質化。對于每種細菌，將107細菌/ml的接種物接種至施耐德管整個高度的0.2％，一個是普通管，一個是補充有尿酸的管。在嚴格無氧的烘箱中，將管在37℃溫育24-48小時。
在這些情況下，在不存在尿酸時，從管底部到介質表面以下1.5cm處觀察到細菌的正常生長，是這種細菌的厭氧性質的證明，而在500μg/ml(28X10-4M)尿酸的存在下，觀察到達到表面的生長，表明相比于不存在尿酸時，在更大的氧張力的存在下的生長。
在用500μg/ml谷胱甘肽或抗壞血酸的每個相同點進行測試。單獨用尿酸的生長與用抗壞血酸觀察到的生長相同。
最后，為了明確地驗證這種尿酸化合物允許嚴格厭氧菌在氧氣存在下的生長的能力，制備固體介質，所述介質由含有5％綿羊血的哥倫比亞介質組成，其中加入有500μg/ml或1mg/ml尿酸，或500μg/ml谷胱甘肽+500μg/ml抗壞血酸的混合物或1mg/ml抗壞血酸。將這些接種有厭氧菌的瓊酯糖在環(huán)境空氣中或在富含5％CO2的環(huán)境空氣中溫育。在含有1mg/ml尿酸或同樣1mg/ml的抗壞血酸時獲得最佳生長。
用含有5％綿羊血的哥倫比亞介質進行這些測試，1升的所述介質具有以下組分：
實施例2：尿酸對卡氏螺桿菌培養(yǎng)的作用。
使用菌株DSMZ 5359，在如實施例1中描述的相同的施耐德培養(yǎng)介質中，在相同的有氧操作條件下，以相同濃度的尿酸(除了沒有通過加入碳氫化合物、淀粉和葡萄糖補充培養(yǎng)介質)培養(yǎng)所述菌株。
在24h內在培養(yǎng)中建立細菌，并通過Maldi tof型質譜確認。
實施例3：尿酸對結核分枝桿菌生長的作用。
在該實施例中，本發(fā)明人比較了在相同的溫度(37℃)條件和氣氛條件(5％CO2)下，分枝桿菌屬結核分枝桿菌(人和動物結核病的原因)在三種固體介質上的生長。
將調節(jié)至107集落形成單位(CFU)的結核分枝桿菌H37Rv型的菌株和調節(jié)至105CFU或106CFU的結核分枝桿菌的四個臨床菌株接種至含有下文描述的MOD4介質的無菌皮氏培養(yǎng)皿中，所述介質富含100mg/L抗壞血酸(MOD5)，100mg/L尿酸(MOD6)或200mg/L尿酸(MOD7)。對于每種條件接種五個培養(yǎng)皿。
下文的表格中顯示了以天數(shù)計的菌落用肉眼的探測時間的結果。
這些結果顯示，通過加入尿酸或抗壞血酸，有生長的顯著改善，并且抗壞血酸和尿酸之間的結核分枝桿菌的生長沒有顯著不同，顯示了使用至少等于100mg/L的濃度的尿酸作為抗氧化劑用于在有氧氣氛中培養(yǎng)分枝桿菌的可能性。
該結果提供了以降序更快探測菌落得出結論的可能性，其探測：
-t＝對于MOD6或MOD7介質(尿酸)或MOD5(抗壞血酸)同樣地平均約3至5日，和
-t＝對于MOD4約8.5至10日(107cfu/mL)。
表A：MOD4介質的組成
實施例4：尿酸對在施耐德固體介質中的一組細菌的生長的作用。
1)在有氧條件(在環(huán)境空氣的氣氛中)下在37℃培養(yǎng)下面的厭氧菌和微需氧菌，在固體培養(yǎng)介質中獲得了改善的生長，所述介質在于實施例1中描述的含有0.2％瓊脂(Sigma-Aldrich，Saint-Quentin Fallavier，法國)的施耐德介質，所述施耐德介質補充有1g/L抗壞血酸(VWR，Louvain，比利時)+100mg/L谷胱甘肽(Sigma，Quentin Fallavier，法國)+400mg/L尿酸(Sigma，Quentin Fallavier，法國)。
用10M KOH將pH調節(jié)至7.5，然后放入高壓滅菌器中。將抗氧化化合物溶解于10mL蒸餾水中，用0.2μm的微孔過濾器過濾，然后在50℃加入至經高壓滅菌的介質中，從而滅菌，然后冷卻為固體形式成為瓊脂糖。
在下文的表中，生長時間對應于肉眼可見的第一個菌落的出現(xiàn)。
表1A：嚴格厭氧菌(82個種和145個菌株)。
表1B：微需氧菌(7個種，7個測試菌株)
表1C：兼性厭氧菌(154個種，421個菌株)
2)對比地測試在37℃在有氧條件下(在環(huán)境空氣的氣氛中)培養(yǎng)的13種厭氧菌和1種微需氧菌(彎曲菌屬(Campylobacter))，在固體培養(yǎng)介質中獲得了改善的生長，所述介質在于含有0.2％瓊脂的施耐德介質，所述施耐德介質補充有或未補充有：
-即，1g/L抗壞血酸，
-即，400mg/L尿酸，和
-即，1g/L抗壞血酸+400mg/L尿酸。
測試的細菌為：卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)、Clostidium massilioamazoniensis、Anaerosalibacter bizertensis、Clostrididum paraperfringens、產芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporogenes)、Peptoniphilus harei、Finegoldia magna、Turicibacter sanguinis、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes)、Bacteroides timonensis、嚙蝕艾肯菌(Eikenella corrodens)、乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)、Bifidobacterium brevis、Campylobacter ureolyticus。
表2中報道的結果顯示，僅有5種細菌(即約1/3的細菌)單獨使用尿酸(AU)或與抗壞血酸(AA)組合使用尿酸獲得了改善的生長，但是單獨使用抗壞血酸則沒有改善的生長。
在表2中：-<<o>>表示：在t＝96h時沒有用肉眼觀察到菌落，-“陽性”表示：在t＝96h時用肉眼觀察到菌落。
表2
實施例5：尿酸對在液體血培養(yǎng)介質中的厭氧菌的生長的作用。
在含有400mg/L尿酸和不含有尿酸的有氧氣氛中，和在不含有尿酸的無氧氣氛中，在37℃，在培養(yǎng)介質：BD BACTECTMPlus Aerobic/F上接種105cfu/mL進行嚴格厭氧菌的血培養(yǎng)，所述介質包含25mL富含樹脂(résines)的胰蛋白酶解酪蛋白(Trypticase)大豆肉湯(參考號：442192)。通過用BD BACTECTM 9000Series Instrumented Blood Culture Systems裝置探測CO2的產生確保生長的探測。
下文表B中報道的對比生長結果證明，在含有400mg/L尿酸(表B中的《AU》)的有氧氣氛中探測到的生長比在無氧氣氛中探測到的生長略微更快，且比在不含尿酸的有氧條件下探測到的生長顯著更快。
表B
參考書目
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