專利名稱：：尿酸氧化酶的酶活性分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及尿酸氧化酶的活性分析方法。
背景技術(shù)：
：尿酸是人體內(nèi)嘌呤類化合物代謝的最終產(chǎn)物，血尿酸水平取決于尿酸產(chǎn)生和排泄之間的動態(tài)平衡。尿酸的生成增加或尿酸排泄減少時都可導(dǎo)致血中尿酸鹽濃度升高。血漿尿酸飽和度37℃，pH7.4時為380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)。臨床上血尿酸含量升高與以下情況有關(guān)(1)白血病及其他惡性腫瘤，由于惡性細(xì)胞增殖周期快、核酸分解加強(qiáng)，因此血中尿酸升高。腫瘤化療后血尿酸升高更明顯。子癇病人也可升高。(2)痛風(fēng)是核蛋白和嘌呤代謝失調(diào)所致，其病人血尿酸可明顯升高。(3)急慢性腎小球腎炎及腎功能受損，一般伴有血清尿酸增高。(4)有些疾病如牛皮癬、肉瘤可導(dǎo)致血尿酸升高。(5)肝疾病，氯仿、四氯化碳及鉛中毒，飲酒等均可使血尿酸水平增高。(6)有些藥物如乙胺丁醇、水楊酸鹽。高尿酸血癥是由于體質(zhì)的遺傳、飲食，尤其是尿酸的根源嘌呤體攝取過多，或者是酗酒、壓力等其中兩種以上的原因組合而產(chǎn)生的。高尿酸血癥如果放任不管時，除了癌癥以外，與糖尿病、高血壓、肥胖或高膽固醇血癥等幾乎所有的成人病都有密切的關(guān)系。也可能導(dǎo)致腎障礙、動脈硬化、腦中風(fēng)、心臟病等嚴(yán)重的疾病，因此是非常重大的代謝異常癥狀。尿酸氧化酶(尿酸氧化還原酶，EC1.7.3.3，UrateOxidase，Uricase)是將尿酸氧化為尿囊素的酶，在自然界普遍存在，是最古老的一種酶。大多數(shù)哺乳動物體內(nèi)，該酶參與嘌呤代謝，氧化尿酸。人類和一些靈長類動物體內(nèi)缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人類和這些動物嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。尿酸氧化酶氧化尿酸為溶解度更高的尿囊素，而且作用迅速。研制重組尿酸氧化酶制劑應(yīng)用于臨床，可使適用人群預(yù)防和治療高尿酸血癥，同時提高生活質(zhì)量，可獲得良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。但重組產(chǎn)品發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵是酶活性的高低。1992年，Legoux等在《TheJournalofBiologicalChemistry》雜志第267卷第12期發(fā)表了題為《CloningandExpressioninEscherichiacolioftheGeneEncodingAspergillusflavusUrateOxidase》的論文，其中采用的酶活性分析方法為分光光度法，通過在酶提取物存在下尿酸溶液292nm的吸收值降低計算酶活性。反應(yīng)混合物采用pH8.9的TEA緩沖液，加入50μl尿酸氧化酶提取物和0.18μmol尿酸，終體積3ml。酶活性單位定義為在30℃和pH8.9，每分鐘將1μmol尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素的酶量。來自法國Sanofi-Synthelabo公司的科研人員AlainBayol等在《DrugDevelopmentandIndustrialPharmacy》雜志2004年第30第8期上發(fā)表了一篇題為《StabilizationofRasburicaseandPhysico-ChemicalCharacterizationoftheResultingInjectableFormulation》的文章，關(guān)于酶活性分析的方法參考了Legoux等建立的方法，酶活性單位定義為在30℃和pH8.9，每分鐘將1μmol尿酸轉(zhuǎn)化為尿囊素的酶量。上述方法采用20％的KOH終止酶反應(yīng)，隨著時間樣品吸光度逐漸下降，而且有線性關(guān)系。經(jīng)線性回歸，每分鐘292nm吸收值降低約0.001個單位，代入酶比活性計算公式引起的酶比活性變化是0.075EAU，對酶活性的分析誤差為0.41％，即使分析在10分鐘內(nèi)完成，僅放置時間就使分析誤差達(dá)到5％。實驗動物大多數(shù)體內(nèi)本身具有內(nèi)源性尿酸氧化酶，給藥后外源性酶活性的變化很難了解，而且血清在292nm的吸收值很高，干擾反應(yīng)后紫外分光光度法的應(yīng)用。因此，就有必要建立穩(wěn)定可靠的尿酸氧化酶活性分析方法和適合于外源性尿酸氧化酶體內(nèi)酶活性的測定方法。
發(fā)明內(nèi)容為了解決實驗動物體內(nèi)本身具有內(nèi)源性尿酸氧化酶，干擾酶反應(yīng)后紫外分光光度法的應(yīng)用，同時解決KOH終止酶反應(yīng)分析誤差大的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定可靠，適合于外源性的尿酸氧化酶活性分析方法。為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括體外酶活性分析和體內(nèi)酶活性測定，體內(nèi)酶活性測定是通過給體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物體內(nèi)注射尿酸氧化酶后采集血清，然后再進(jìn)行體外酶活性分析。作為優(yōu)選，所述的體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物為高等靈長類、鳥類、兩棲類動物。作為優(yōu)選，體外酶活性分析為采用酶反應(yīng)，酸終止液終止后紫外分光光度法進(jìn)行尿酸氧化酶的體外酶活性分析。作為再優(yōu)選，紫外分光光度法測定采用檢測波長為280～300nm。作為優(yōu)選，終止液是硫酸、鹽酸、硝酸、醋酸、磷酸、三氯乙酸、三氟乙酸中的一種或多種混合物，酸的濃度為0.1～10mol/L。作為最優(yōu)選，終止液為3.5mol/L的硫酸。作為優(yōu)選，酶反應(yīng)的溫度為25～37℃，pH為6.0～10.0，尿酸濃度為10～200μmol/L，酶量為0.01～5μg/mL，反應(yīng)時間1～30min。作為優(yōu)選，酶反應(yīng)溫度30℃，pH8.9，尿酸濃度為60μmol/L，酶量為0.2μg/mL，反應(yīng)時間5min，檢測波長292nm。上述的尿酸氧化酶氨基酸序列可以是來源于細(xì)菌、真菌、酵母、植物、動物的尿酸氧化酶。作為優(yōu)選，所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是來源于枯草桿菌、黃曲霉、假絲酵母、果蠅、鼠。動物體內(nèi)給予外源性尿酸氧化酶后，不同時間取血清進(jìn)行酶活性分析。動物采用高等靈長類動物如猴子、類人猿、鳥類、兩棲類等體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物體，可排除動物體內(nèi)內(nèi)源性尿酸氧化酶的影響。解決了由于血清成分十分復(fù)雜，蛋白質(zhì)濃度比較高，還含有色素等，5mL酶反應(yīng)液中即使加入0.1mL血清，酶反應(yīng)結(jié)束有用20％KOH終止反應(yīng)，292nm的吸收值就達(dá)到1.5，大大超過了分光光度法的測定范圍的技術(shù)缺陷。本發(fā)明的實驗動物體內(nèi)不含尿酸氧化酶，適合于了解外源性制劑的酶活性在動物體內(nèi)的變化情況。酶反應(yīng)結(jié)束后用酸終止反應(yīng)，產(chǎn)物吸收值在分光光度法的測定范圍內(nèi)，大大減小了誤差。圖1為實施例1雞給藥后體內(nèi)酶比活性變化情況示意圖。具體實施例方式實施例11.測定的基本原理尿酸氧化酶能夠在體外一定的條件下特異性地將尿酸氧化為尿囊素，尿酸在尿酸氧化酶的氧化分解作用下濃度的降低反映了酶活性的高低。本法依據(jù)尿酸氧化酶氧化尿酸為尿囊素，尿酸的最大吸收波長292nm，氧化產(chǎn)物尿囊素的最大吸收波長224nm，兩者最大吸收波長不同，在一定范圍內(nèi)尿酸292nm吸收值與其濃度成正比，可用分光光度法進(jìn)行尿酸的定量的測定。選擇合適的酶和底物尿酸濃度，pH8.9，30℃反應(yīng)一定時間，以不同濃度的尿酸標(biāo)準(zhǔn)品對292nm的吸收值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)反應(yīng)體系292nm吸收值的降低以標(biāo)準(zhǔn)曲線計算反應(yīng)氧化分解的尿酸量，再計算出單位時間單位質(zhì)量的尿酸氧化酶氧化分解的尿酸量，即為該條件下酶的比活性。建立尿酸氧化酶的酶活性分析方法，反應(yīng)總體積為5ml，反應(yīng)起始尿酸0.4μmol，反應(yīng)溫度30℃，pH8.9，時間5min，反應(yīng)結(jié)束后用分光光度法測定292nm吸收值，通過吸收值的降低計算轉(zhuǎn)化的尿酸，再計算酶活性。動物體內(nèi)給予尿酸氧化酶后不同時間采集血樣，并收集血清進(jìn)行酶活性分析。酶活性的變化反應(yīng)了尿酸氧化酶在動物體內(nèi)代謝情況。2.實驗材料及設(shè)備A、測活緩沖液7.5g三乙醇胺、0.38gEDTA溶于900ml去離子水，用6mol/L的鹽酸調(diào)pH8.9后定容至1000ml。B、尿酸標(biāo)準(zhǔn)液33.6mg尿酸用1000ml測活緩沖液溶解配制成200μmol/L貯液。C、反應(yīng)終止液3.5mol/L硫酸。E、紫外分光光度計。F、供試品含尿酸氧化酶的動物血清。G、其他試管、移液管、恒溫水浴鍋、秒表。3.測定方法A、雞靜脈注射尿酸氧化酶，給藥劑量分別為0.2mg/kg和0.4mg/kg，給藥后0.5h、1h、3h、5h、10h、20h分別取血收集血清。B、取測活緩沖液2.5ml，加入尿酸貯液2ml，混勻后置30℃水浴平衡5min。C、向上述反應(yīng)液中加入0.1ml動物血清，混合均勻后于30℃反應(yīng)5min。D、反應(yīng)結(jié)束后加入0.5ml反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。E、按紫外-可見分光光度計操作說明在波長292nm處測定吸收度。F、取測活緩沖液2.5ml，加入尿酸貯液2ml和0.5ml反應(yīng)終止液，再加入0.1ml血清樣品，混合均勻后于30℃反應(yīng)5min后做為反應(yīng)管尿酸起始值，取測活緩沖液4.5ml和0.5ml反應(yīng)終止液，再加入0.1ml供試品，混合均勻后做為樣品空白。G、取尿酸標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml分別置于試管中，分別加測活緩沖液4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml使終體積為4.5ml?；靹蚝笾?0℃水浴平衡5min。加入0.5ml反應(yīng)終止液和0.1ml未給藥動物血清，吸收度測定方法同步驟“D”。H、確量取4.5ml測活緩沖液，30℃水浴平衡5min，加入0.5ml反應(yīng)終止液和0.1ml未給藥動物血清作為空白對照。I、標(biāo)準(zhǔn)曲線尿酸濃度對應(yīng)其吸收度，求直線回歸方程，將測得供試品反應(yīng)管吸收度代入直線回歸方程，即得供試品反應(yīng)管尿酸的濃度。根據(jù)注射的酶量計算比活性。4.結(jié)果計算A、標(biāo)準(zhǔn)曲線以5ml反應(yīng)管中尿酸微摩爾數(shù)m為橫坐標(biāo)，A292nm吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸A292＝Km。B、酶活性計算酶活性(EAU)單位定義30℃，pH8.9，每分鐘將1μmol尿酸氧化為尿囊素所需的酶量。酶比活性(SA，SpecificActivity)每毫克蛋白質(zhì)所含的酶活性單位數(shù)。SA=100*(A0-As)K*C*V]]>式中C為酶濃度mg/mL；V為給藥體積；A0為起始吸收值A(chǔ)s為反應(yīng)后的平均吸收值；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸系數(shù)；C、雞給藥后體內(nèi)酶比活性變化情況見圖1。實施例2酶反應(yīng)體積5ml，緩沖液TEA(7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)，pH8.9，尿酸60μmol/L，30℃保溫，反應(yīng)時間5min，分別用20％KOH和3.5mol/L硫酸終止反應(yīng)，檢測波長292nm。具體測定方法如實施例1。不同時間測定，結(jié)果見表一。表一不同終止方法吸收值變化實施例3酶反應(yīng)體積5ml，緩沖液TEA(7.5g三乙醇胺；0.38gEDTA)，pH10，尿酸180μmol/L，35℃保溫，反應(yīng)時間25min，用9mol/L硫酸終止反應(yīng)，檢測波長292nm。具體測定方法如實施例1。權(quán)利要求1.尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括體外酶活性分析和體內(nèi)酶活性測定，其特征在于體內(nèi)酶活性測定是通過給體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物體內(nèi)注射尿酸氧化酶后采集血清，然后再進(jìn)行體外酶活性分析。2.如權(quán)利要求1所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物為高等靈長類、鳥類、兩棲類動物。3.如權(quán)利要求1或2所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于體外酶活性分析為采用酶反應(yīng)，酸終止液終止后紫外分光光度法進(jìn)行尿酸氧化酶的體外酶活性分析。4.如權(quán)利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于紫外分光光度法測定采用檢測波長為280～300nm。5.如權(quán)利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于終止液是硫酸、鹽酸、硝酸、醋酸、磷酸、三氯乙酸、三氟乙酸中的一種或多種混合物，酸的濃度為0.1～10mol/L。6.如權(quán)利要求5所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于終止液為3.5mol/L的硫酸。7.如權(quán)利要求3所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于酶反應(yīng)的溫度為25～37℃，pH為6.0～10.0，尿酸濃度為10～200μmol/L，酶量為0.01～5μg/mL，反應(yīng)時間1～30min。8.如權(quán)利要求7所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于酶反應(yīng)溫度30℃，pH8.9，尿酸濃度為60μmol/L，酶量為0.2μg/mL，反應(yīng)時間5min，檢測波長292nm。9.如權(quán)利要求1或2所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是來源于細(xì)菌、真菌、酵母、植物、動物的尿酸氧化酶。10.如權(quán)利要求9所述的尿酸氧化酶的酶活性分析方法，其特征在于所述的尿酸氧化酶氨基酸序列是來源于枯草桿菌、黃曲霉、假絲酵母、果蠅、鼠。全文摘要本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及尿酸氧化酶的活性分析方法。尿酸氧化酶的酶活性分析方法，包括體外酶活性分析和體內(nèi)酶活性測定，體內(nèi)酶活性測定是通過給體內(nèi)不含尿酸氧化酶的動物體內(nèi)注射尿酸氧化酶后采集血清。體外酶活性分析為采用酶反應(yīng)，酸終止液終止后紫外分光光度法進(jìn)行尿酸氧化酶的體外酶活性分析。本發(fā)明的實驗動物體內(nèi)不含尿酸氧化酶，可排除動物體內(nèi)內(nèi)源性尿酸氧化酶的影響。適合于了解外源性制劑的酶活性在動物體內(nèi)的變化情況。酶反應(yīng)結(jié)束后用酸終止反應(yīng)，產(chǎn)物吸收值在分光光度法的測定范圍內(nèi)，大大減小了誤差。文檔編號G01N33/96GK1840689SQ200610049079公開日2006年10月4日申請日期2006年1月16日優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日發(fā)明者劉國安,劉沐榮,康經(jīng)武申請人:杭州北斗生物技術(shù)有限公司