相關(guān)申請

基于35u.s.c.§119(e)，本申請主張2014年8月1日提交的美國臨時專利申請us62/032,350的權(quán)益，該臨時專利申請通過引用而以其整體并入本文。

本發(fā)明關(guān)于用于檢測誘發(fā)假性過敏型反應的化合物的細胞和方法，以及減輕假性過敏型反應嚴重性的方法。

背景技術(shù)：

多數(shù)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)許可的藥物與假性過敏型反應有關(guān)，這些反應是藥物副作用的一部分。在本文中揭示的本發(fā)明之前，對測定何種藥物有可能造成假性過敏型反應的細胞株和方法存在需求。此外，在本文中揭示的本發(fā)明之前，對減輕假性過敏型反應嚴重性的方法和發(fā)現(xiàn)阻斷這些響應的拮抗劑的篩選存在需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于，至少部分基于，包含表達mas相關(guān)g蛋白偶聯(lián)受體成員x2(mrgprx2)或mrgprb2的重組核酸的分離細胞。例如該重組核酸表達mrgprx2?；蛘?，該重組核酸表達mrgprb2。一些例子中，該細胞進一步包含表達gtp結(jié)合蛋白α15(gα15)的重組核酸。其它例子中，該表達mrgprx2的重組核酸包含一個或多個突變。例如，該一個或多個突變產(chǎn)生不能活化信號轉(zhuǎn)導通道的mrgprx2蛋白?；蛘撸摫磉_mrgprb2的重組核酸包含一個或多個突變。例如，該一個或多個突變產(chǎn)生不能活化信號轉(zhuǎn)導通道的mrgprb2蛋白。一些例子中，這一細胞進一步包含表達gtp結(jié)合蛋白α15(gα15)的重組核酸。

優(yōu)選地，該分離細胞包含人類胚胎腎293(hek293)細胞。

也提供減輕由給藥化合物至該對象誘發(fā)的對象體內(nèi)假性過敏型反應嚴重性的方法，該方法包含給藥該化合物至該對象；給藥mrgprb2或mrgprx2拮抗劑至該對象，從而減輕該對象體內(nèi)假性過敏型反應的嚴重性。

例如，本文揭示的方法將假性過敏型反應的嚴重性降低至少1％，如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。

該對象優(yōu)選需要此治療的哺乳動物，如已經(jīng)診斷具有假性過敏反應或其傾向的對象。該哺乳動物是任何哺乳動物，如人、靈長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬、以及家畜及馴養(yǎng)的食用動物如牛、綿羊、豬、雞、和山羊。優(yōu)選的具體實施例中，該哺乳動物是人。

該抑制劑或拮抗劑可包括但不限于核酸、肽、抗體、或結(jié)合至其具體靶標或該靶標天然配體并調(diào)節(jié)生物活性的小分子。

一方面，該拮抗劑包含抗體或其片段、結(jié)合蛋白、多肽、或其組合。本文所揭示的是抗mrgprx2抗體。適當?shù)目筸rgprx2抗體包括sab2900154-50ug(st.louis,missouri)、pa5-32930(thermoscientific,waltham,ma)、ta317038(origene,rockville,md)、和038585(unitedstatesbiological,boston,ma)，其各自通過引用而并入本文。但是，技術(shù)人員可輕易鑒別用于本文中揭示方法中的額外的抗mrgprx2(或抗mrgprb2)抗體。一些例子中，本文中揭示的抗mrgprx2(或抗mrgprb2)抗體以0.1μg/ml至500mg/ml的濃度給藥。

一些例子中，該拮抗劑包含小分子。小分子是質(zhì)量小于2000道爾頓的化合物。該小分子的分子質(zhì)量優(yōu)先小于1000道爾頓，更優(yōu)選小于600道爾頓，如該化合物小于500道爾頓、小于400道爾頓、小于300道爾頓、小于200道爾頓、或小于100道爾頓。

小分子是有機的或無機的。例示性有機小分子包括，但不限于，脂肪烴、醇、醛、酮、有機酸、酯、單糖和二糖、芳香烴、氨基酸、和脂質(zhì)。例示性無機小分子包含微量元素、離子、自由基、和代謝物?；蛘?，小分子可合成性設(shè)計為由片段、或小部分、或更長氨基酸鏈組成，以結(jié)合酶袋。典型地，小分子小于一千道爾頓。

一些例子中，該拮抗劑包含核酸分子。例如，核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna)抑制mrgprx2或mrgprb2多肽的表達，從而抑制mrgprx2或mrgprb2的活性。一些例子中，該核酸包含小干擾rna(sirna)、rna干擾(rnai)、信使rna(mrna)、小發(fā)夾rna或短發(fā)夾rna(shrna)、雙鏈核糖核酸(dsrna)、反義rna或微rna、或其任意部位。因此，適當?shù)膍rgprx2拮抗劑包括mrgprx2sirna和mrgprx2shrna，其各自可從例如origene、rockville、md或生命科技公司(lifetechnologies,grandisland,ny)購買，且通過引用而并入本文。同樣，適當?shù)膍rgprb2拮抗劑包括mrgprb2sirna和mrgprb2shrna，其各自可從例如origene、rockville、md或生命科技公司(lifetechnologies,grandisland,ny)購買，且通過引用而并入本文。但是，技術(shù)人員可輕易鑒別抑制/拮抗mrgprx2或mrgprb2的其它核酸。

該拮抗劑在給藥該化合物至該對象之前、同時或之后給藥。

可采用多種給藥途徑。例如，該拮抗劑可外用給藥、口服給藥、經(jīng)吸入給藥或經(jīng)注射給藥。

該拮抗劑的有效量為從0.001mg/kg至250mg/kg體重，如，0.001mg/kg、0.05mg/kg0.01mg/kg、0.05mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、或250mg/kg體重。最后，主治醫(yī)生或獸醫(yī)決定適宜的量和劑量方案。

一些例子中，該拮抗劑每天至少給藥一次、每周至少給藥一次、或每月至少給藥一次。該拮抗劑給藥持續(xù)時間為一天、一周、一個月、兩個月、三個月、六個月、9個月、或一年。一些例子中，該拮抗劑每天給藥，如每24小時給藥?；蛘撸撧卓箘┏掷m(xù)給藥或每天給藥若干次，如每1小時、每2小時、每3小時、每4小時、每5小時、每6小時、每7小時、每8小時、每9小時、每10小時、每11小時、或每12小時給藥一次。

通過將mrgprb2或mrgprx2拮抗劑給藥至對象而實施治療該對象體內(nèi)假性過敏型反應的方法，從而治療該對象體內(nèi)的假性過敏型反應。

通過下述實施確定化合物是否誘發(fā)假性過敏型反應的方法：令本文中揭示的分離細胞與備選化合物接觸，測定mrgprx2或mrgprb2的活化，其中，mrgprx2或mrgprb2的活化確定了該備選化合物誘發(fā)了假性過敏型反應。

例如，通過鑒別細胞內(nèi)鈣相對于該化合物缺失下細胞內(nèi)鈣水平的增加而檢測mrgprx2或mrgprb2的活化。一些例子中，細胞內(nèi)鈣的水平增加了至少1％，如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％。使用本文中揭示的方法或技術(shù)人員可獲得的方法測定細胞內(nèi)鈣的濃度。

例示性備選化合物包括亮丙瑞林、戈舍瑞林、組氨瑞林、曲普瑞林、西曲瑞克、加尼瑞克、地加瑞克(degarelix)、奧曲肽、蘭瑞肽(lanreotide)、帕瑞肽(pasireotide)、舍莫瑞林(sermorelin)、替莫瑞林(tesamorelin)、艾替班特(icatibant)、醋酸格拉替雷(glatirameracetate)、特立帕肽、普蘭林肽、爭光霉素、艾塞那肽(exenatide)、胰高血糖素、利拉魯肽、恩夫韋地(enfuvirtide)、和粘桿菌素(colistimethate)。

其它例示性備選化合物包括琥珀酰膽堿、筒箭毒堿、阿曲庫銨、美維庫銨、和羅庫溴銨。

篩選出一個備選的mrgprx2拮抗劑，證實其抵消或抑制、降低、或壓制mrgprx2多肽的生物學活性。還提供識別mrgprx2或mrgprb2拮抗劑的方法，該方法包含令本文中揭示的分離細胞與誘發(fā)假性過敏型反應的化合物接觸，令本文中揭示的分離細胞與備選拮抗劑接觸，檢測mrgprx2或mrgprb2的活化，其中，mrgprx2或mrgprb2的活化相對于該備選拮抗劑缺失下mrgprx2或mrgprb2活化的降低確定了該備選化合物為拮抗劑。

還提供識別mrgprx2或mrgprb2激動劑的方法，該方法包含：令本文中揭示的分離細胞與誘發(fā)假性過敏型反應的化合物接觸，令本文中揭示的分離細胞與備選激動劑接觸，檢測mrgprx2或mrgprb2的活化，其中，mrgprx2或mrgprb2的活化相對于該備選激動劑缺失下mrgprx2或mrgprb2活化的增加確定了該備選化合物是激動劑。

定義

除非定義排除，本文中使用的全部科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所一般理解的意義。下述參考文獻向技術(shù)人員提供本發(fā)明中使用多數(shù)術(shù)語的通常定義：《劍橋科技詞典》(thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walkered.,1988))；《遺傳性詞匯(第五版)》(theglossaryofgenetics,5thed.,r.riegeretal.(eds.),springerverlag(1991))；和《哈珀柯林斯生物學詞典》(hale&marham的,theharpercollinsdictionaryofbiology(1991))。本文中，除非明確排除，下述術(shù)語具有其下方所述的意義。

本文中揭示的抗體及其片段包括，但不限于，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、dab(域抗體)、單鏈單體、fab、fab’和f(ab’)2片段、fv、scfvs。抗體片段具有其各自抗體的免疫學活性。一些具體實施例中，抗體的片段含有1500個或更少、1250個或更少、1000個或更少、900個或更少、800個或更少、700個或更少、600個或更少、500個或更少、400個或更少、300個或更少、200個或更少氨基酸。例如，蛋白質(zhì)或肽抑制劑含有1500個或更少、1250個或更少、1000個或更少、900個或更少、800個或更少、700個或更少、600個或更少、500個或更少、400個或更少、300個或更少、200個或更少、100個或更少、80個或更少、70個或更少、60個或更少、50個或更少、40個或更少、30個或更少、25個或更少、20個或更少、10個或更少氨基酸。例如，本發(fā)明的核酸抑制劑含有400個或更少、300個或更少、200個或更少、150個或更少、100個或更少、90個或更少、80個或更少、70個或更少、60個或更少、50個或更少、40個或更少、35個或更少、30個或更少、28個或更少、26個或更少、24個或更少、22個或更少、20個或更少、18個或更少、16個或更少、14個或更少、12個或更少、10個或更少核苷酸。

本文中使用的術(shù)語“抗體”(ab)包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)所希望的生物學活性即可。本文中，術(shù)語“免疫球蛋白”(ig)與“抗體”互換使用。

“分離抗體”是已經(jīng)從其天然環(huán)境成分中分離及/或回收的抗體。其天然環(huán)境的雜質(zhì)成分是將會感染該抗體診斷或治療用途的材料，且可包括酶、技術(shù)、和其它類似蛋白質(zhì)或非類似蛋白質(zhì)的溶質(zhì)。一個優(yōu)選的具體實施例中，該抗體經(jīng)純化：(1)至大于95重量％的抗體，通過勞里法(lowrymethod)測得，且最優(yōu)選大于99重量％；(2)至足以獲得至少15個n端殘基或內(nèi)部氨基酸序列的程度，通過使用旋轉(zhuǎn)杯測序儀獲得；或(3)至同質(zhì)性，通過sds-page在減壓或非減壓條件下使用考馬斯亮藍或優(yōu)選使用印染色而獲得。由于該抗體天然環(huán)境中的至少一種成分不存在，分離抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。但通常情況下，分離抗體將通過至少一個純化步驟進行制備。

基本的四鏈抗體單元是由兩個完全相同的輕(l)鏈和兩個完全相同的重(h)鏈構(gòu)成的異四聚體糖蛋白。igm抗體由5個該基本的異四聚體單元以及另外的稱為j鏈的多肽一起構(gòu)成，并因此含有10個抗原結(jié)合位點，而所分泌的iga抗體可聚合以形成包含2至5個該疾病4鏈單元和j鏈的多價集合體。在igg的例子中，該4鏈單元通常為約150,000道爾頓。每一l鏈通過一個共價二硫鍵鏈接至一個h鏈，而該兩個h鏈通過一個或多個二硫鍵彼此鏈接，二硫鍵的多寡取決于該h鏈的同種型。每一h鏈和l鏈也具有規(guī)則間隔的鏈間二硫橋。每一h鏈在n端具有可變域(vh)，對于α鏈和γ鏈，其各自在可變域(vh)后連有三個恒定域(ch)，而μ同種型和ε同種型中為四個ch域。每一l鏈在n端具有可變域(vl)，其另一端跟隨有恒定域(cl)。vl與vh對準，而cl與重鏈的第一個恒定域(ch1)對準。據(jù)信，特定的氨基酸殘基形成該輕鏈與重鏈可變域之間的干擾。vh與vl一起的配對形成單抗原結(jié)合位點。對于不同種類的抗體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，參見如《基礎(chǔ)和臨床免疫學(第八版)》(basicandclinicalimmunology,8thedition,danielp.stites,abbai.terrandtristramg.parslow(eds.),appleton&lange,norwalk,conn.,1994)中的第6章第71頁。

基于其恒定域(cl)的氨基酸序列，來自任何脊椎動物種的l鏈可歸為明顯截然不同的兩種類型中的一種，稱為κ和λ。依據(jù)其重鏈(ch)的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可歸為不同的類別或同種型。存在5個類別的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg、和igm，分別具有指定為α、δ、ε、γ、和μ的重鏈。基于ch序列和功能的相對微小差異，γ類和α類進一步分為多個子類，如人類表達下述子類：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、和iga2。

術(shù)語“可變”指代下述事實：抗體中v域的某些碎片的序列差異極大。v域介導抗原結(jié)合，并定義特定抗體對于其特定抗原的特異性。但是，橫跨該可變域中110個氨基酸跨度，可變性為不均勻分布。反之，v區(qū)域由通過極度可變的稱為“高變區(qū)”的較短區(qū)域分隔的稱為骨架區(qū)(fr)的相對不變的伸張組成，該骨架區(qū)包含15至30個氨基酸，而每一高變區(qū)的長度為9至12個氨基酸。原始重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個fr，極大地采用β-折疊構(gòu)型，通過三個高變區(qū)連接，形成圈狀連接，且在一些例子中，形成該β-折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每一鏈中的高變區(qū)通過fr保持為極其靠近，且該些高變區(qū)形成另一鏈，促成抗體中抗原結(jié)合位點的形成(見，kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。恒定域并不直接牽涉入抗體至抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)多種效應子功能，如抗體依賴性細胞內(nèi)細胞毒性(adcc)中抗體的參與。

當用于本文中時，術(shù)語“高變區(qū)”指抗體中可響應抗原結(jié)合的氨基酸殘基。該高變區(qū)通常包含來自“互補性決定區(qū)”或“cdr”的氨基酸殘基(如，當根據(jù)kabat編號系統(tǒng)編號時，vl中的大約殘基24至34(l1)、50至56(l2)和89至97(l3)，vh中的大約殘基31至35(h1)、50至65(h2)和95至102(h3)；kabat等，《免疫性靶標蛋白質(zhì)的序列(第五版)》(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))；及/或來自“高變?nèi)Α钡哪切埢?如，當根據(jù)chothia編號系統(tǒng)編號時，vl中的殘基24至34(l1)、50至56(l2)和89至97(l3)，vh中的26至32(h1)、52至56(h2)和95至101(h3)；chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987))；及/或來自“高變?nèi)Α?cdr的那些殘基(如，當根據(jù)imgt編號系統(tǒng)編號時，vl中的殘基27至38(l1)、56至65(l2)和105至120(l3)，vh中的27至-38(h1)、56至65(h2)和105至120(h3)；lefranc,m.p.etal.nucl.acidsres.27:209-212(1999)，ruiz,m.eal.nucl.acidsres.28:219-221(2000))。視需要，該抗體在下述位置的一處或多處具有對稱性插入內(nèi)容：當根據(jù)aho編號時，vl中的28、36(l1)、63、74至75(l2)和123(l3)，vh中的28、36(h1)、63、74至75(h2)和123(h3)；honneger,a.andplunkthun,a.j.mol.biol.309:657-670(2001))。

本文中使用的術(shù)語“單克隆抗體”指從大體上同質(zhì)抗體的群落中獲得抗體，即，除了可能少量存在的天然可能出現(xiàn)的突變之外，該群落包含的獨立抗體完全相同。單克隆抗體為高度特異性，指向單一的抗原性位點。此外，與包括指向不同決定因素(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑對比，每一單克隆抗體均指向該抗原上的單一決定因素。除了它們的特異性之外，該單克隆抗體的優(yōu)勢在于，它們可合成為不被其它抗體污染。修飾語“單克隆”不解釋為需要通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，可用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過kohler等人于nature,256:495(1975)中首次揭示的雜種細胞方法制備，或可使用重組dna方法在細胞、真核動物或植物細胞中作成(見，如，us4,816,567)。例如，“單克隆抗體”也可使用clackson等人在nature,352:624-628(1991)中和marks等人在j.mol.biol.,222:581-597(1991)中揭示的方法從噬菌體抗體庫中分離。

單克隆抗體包括“嵌合”抗體以及此類抗體的片段，在該嵌合抗體中，重鏈及/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或子類的抗體中的相應序列完全相同或同源，而該鏈的剩余部分與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或子類的抗體中的相應序列完全相同或同源，只要他們展現(xiàn)所希望的生物學活性即可(見，us4,816,567；以及morrisonetal.,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855(1984))。也提供源自人類抗體的可變域抗原結(jié)合序列。據(jù)此，本文中最感興趣的嵌合抗體包括具有一個或多個人類抗原結(jié)合序列(如，cdrs)且含有一個或多個源自非人類抗體的序列如fr或c區(qū)域序列的抗體。此外，本文中最感興趣的嵌合抗體包括那些包含一個抗體類別或資料的人類可變域抗原結(jié)合序列和源自另一抗體類別或子類的另一序列如fr或c區(qū)域序列的抗體。本文中最感興趣的嵌合抗體也包括那些含有與本文揭示者相關(guān)的或源自不同物種如非人靈長類(如，舊大陸猴、猿等)的可變域抗原結(jié)合序列的抗體。嵌合抗體也包括靈長源化(primatized)抗體和人源化抗體。

此外，嵌合抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。做出這些修飾以進一步精細化抗體性能。進一步詳細而言，見，jonesetal.,nature321:522-525(1986)；riechmannetal.,nature332:323-329(1988)；及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。

“人源化抗體”通常認為是人類抗體，其具有一個或多個從非人類來源引入該人類抗體中的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基往往指代為“導入”殘基，其典型取自“導入”可變域。傳統(tǒng)上，人源化遵循winter及其合作者的方法(jonesetal.,nature,321:522-525(1986)；reichmannetal.,nature,332:323-327(1988)；verhoeyenetal.,science,239:1534-1536(1988))通過以導入高變區(qū)序列取代人類抗體的相應序列而實施。據(jù)此，該“人源化”抗體是嵌合抗體(us4,816,567)，其中，實質(zhì)上小于完整的人類可變域已經(jīng)由來自非人類物種的相應序列所取代。

“人類抗體”是僅含有人類天然產(chǎn)生的抗體中存在的序列的抗體。但是，本文中，人類抗體可包含天然出現(xiàn)的人類抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基或修飾，包括本文中揭示的那些修飾和變體序列。典型作成這些以進一步精細化或提升抗體性能。

“全(intact)”抗體是包含抗原結(jié)合位點以及cl和至少重鏈恒定域ch1、ch2及ch3的抗體。該恒定域可以是天然序列恒定域(如，人類天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，該全抗體具有一種或多種效應子功能。

“抗體片段”包含全抗體的一部分，優(yōu)選該全抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；雙體；線性抗體(見，us5,641,870；zapataetal.,proteineng.8(10):1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；及從抗體片段形成的多特異性抗體。

短語抗體的“功能性片段或類似物”是具有與全長度抗體一樣的定性生物學活性的化合物。例如，抗ige抗體的功能性片段或類似物能結(jié)合至ige免疫球蛋白，結(jié)合方式為防止該分子具有結(jié)合至高親和性受體fcεri的能力或?qū)嵸|(zhì)上減輕該能力。

抗體的木瓜蛋白酶消解產(chǎn)生兩個完全相同的抗原結(jié)合片段，稱為“fab”片段，以及殘留的“fc”片段，消解反應容易結(jié)晶的能力。該fab片段由整體l鏈和h鏈的可變區(qū)域(vh)以及一條重鏈的第一恒定域(ch1)一起組成。每一fab片段關(guān)于抗原結(jié)合為單價，即，其具有單一抗原結(jié)合位點。抗體的胃蛋白酶處理導致單一的大f(ab')2片段，這大致與兩個二硫鍵鏈接的fab片段一致，具有二價抗原結(jié)合活性且仍能交聯(lián)抗原。fab'片段與fab片段的差異在于，前者在ch1域的碳端具有額外的少數(shù)殘基，包括一個或多個來自抗體鉸接區(qū)域的半胱氨酸。本文中，fab'-sh為fab'的指定，其中，該恒定域的半胱氨酸殘基承載自由巰基。f(ab')2抗體片段最初被生產(chǎn)為fab'片段的一部分，其具有界于其間的鉸接半胱氨酸?？贵w片段的其它化學偶聯(lián)也是已知的。

“fc”片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩個h鏈的碳端部位。通過該fc區(qū)內(nèi)的序列測定抗體的效應子功能，該區(qū)也是通過在某些類型的細胞中發(fā)現(xiàn)的fc受體(fcr)識別的部分。

“fv”是含有完全抗原識別位點和結(jié)合位點的最小的抗體片段。這一片段由一條重鏈和一條輕鏈可變區(qū)域以緊密、非共價聯(lián)合的二聚體所組成。從這兩個域的折疊發(fā)散出六個高變?nèi)?從h鏈和l鏈各形成三個圈)，其有助于用于抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予該抗體以抗原結(jié)合特異性。但是，甚至單一可變域(或fv的一半僅包含三個對于抗原為特異性的cdr)即具有識別并接合抗原的能力，但其親和性低于該整體結(jié)合位點。

“單鏈fv”也縮寫為“sfv”或“scfv”，是包含連接為單個多肽鏈的vh抗體域和vl抗體域的抗體片段。優(yōu)選地，該sfv多肽進一步包含界于vh域與vl域之間的多肽鏈接基，令該sfv能形成所希望的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)。對于sfv的綜述，參見pluckthun在《單克隆抗體藥物學》(thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994))；下文的borrebaeck1995。

術(shù)語“雙體”指小抗體片段，通過使用短鏈接基(約5至10個殘基)在vh域與vl域之間構(gòu)造sfv片段(見先前段落)而制備，因此實現(xiàn)v域的鏈間而非鏈內(nèi)配對，獲得二價片段，即具有兩個抗原接合位點的片段。雙特異性雙體是兩個“交叉”sfv片段的異二聚體，其中，兩個抗體的vh域和vl域存在于不同的多肽鏈上。雙體更完全地揭示于例如ep404,097、wo93/11161、和hollingeretal.,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中。

本文中，“使內(nèi)化”的抗體是在結(jié)合至哺乳動物細胞上的抗原(如，細胞表面多肽或受體)時通過(即，進入)該細胞而取得。當然，該內(nèi)化抗體將包括抗體片段、人類或嵌合抗體、及抗體共軛體。對于某些治療性應用，預期體內(nèi)的內(nèi)化。經(jīng)內(nèi)化的抗體分子的數(shù)目將足以或適于殺死細胞或抑制其生長，尤其是被感染的細胞。依據(jù)該抗體或抗體共軛體的潛能，一些例子中，將單個抗體分子攝取入該細胞內(nèi)足以殺死該抗體所結(jié)合的靶標細胞。例如，某些毒素具有高殺傷潛能，故共軛至該抗體的一個分子的該毒素足以殺死被感染的該細胞。

本文中，若抗體與抗原以可檢測的水平反應，則稱該抗體為“免疫特異性”、“對抗原為特異性”或“特異性結(jié)合至抗原”，該反應的水平優(yōu)選為親和常數(shù)ka大于或等于約10⁴m^-1，或大于或等于約10⁵m^-1，大于或等于約10⁶m^-1，大于或等于約10⁷m¹，或大于或等于10⁸m^-1?？贵w對于其共軛抗原的親和性一般也表達為解離常數(shù)kd，且在某些具體實施例中，若hum2e抗體特異性結(jié)合的kd為小于或等于10^-4m，小于或等于約10^-5m，小于或等于約10^-6m，小于或等于10^-7m，或小于或等于10^-8m，則該抗體結(jié)合至m2e?？墒褂脗鹘y(tǒng)技術(shù)，例如，scatchard(ann.n.y.acad.sci.usa51:660(1949))等人揭示的那些，輕易測得抗體的親和性。

通常，可使用免疫檢測方法測定并評估抗體至抗原、細胞或其組織的結(jié)合性質(zhì)，該方法包括，例如，基于免疫熒光的試驗，如免疫組化(ihc)及/或熒光活化細胞分選(facs)。

具有所指定抗體的“生物學特征”的抗體，是具有將該抗體與其它抗體區(qū)分開來的一個或多個生物學特征的抗體。例如，某些具體實施例中，具有所指定抗體的生物學特征的抗體將結(jié)合通過所指定抗體結(jié)合的相同表位，及/或具有與所指定抗體相同的效應子功能。

術(shù)語“拮抗劑抗體”以其最廣義使用，且包括部分地或完全地阻斷、抑制、或中和其特異性結(jié)合的表位、多肽或細胞的生物學活性的抗體。鑒別拮抗劑抗體的方法可包含令可特異性結(jié)合備選拮抗劑抗體的多肽或細胞與該備選拮抗劑抗體接觸，并測量一般與該多肽或細胞相關(guān)的一種或多種生物學活性的可檢測的改變。

抗體“效應子功能”指那些歸因于抗體的fc區(qū)域(天然序列fc區(qū)域或氨基酸變體fc區(qū)域)并隨著抗體同種型而變的生物學活性?？贵w效應子功能的實例包括：c1q結(jié)合劑補體依賴性細胞毒性；fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)；吞噬作用；細胞表面受體(如，b細胞受體)的下調(diào)；和b細胞活化。

術(shù)語“抗原結(jié)合位點”或“結(jié)合部位”指免疫球蛋白分子中參與抗原結(jié)合的部分。該抗原結(jié)合位點是通過重(“h”)鏈和輕(“l(fā)”)鏈的n端可變(“v”)區(qū)的氨基酸殘基形成的。重鏈和輕鏈的v區(qū)域內(nèi)的三種高分歧伸張指代為“高變區(qū)”，且插置于多個作為“骨架區(qū)”或“fr”而為人所知的保守側(cè)翼伸張之間。因此，術(shù)語“fr”指代氨基酸序列，其可于免疫球蛋白的高變區(qū)之間或鄰近該高變區(qū)處自然地發(fā)現(xiàn)。一個抗體分子中，輕鏈的三個高變區(qū)和重鏈的三個高變區(qū)在三維空間內(nèi)相對于彼此而配制，以形成抗原結(jié)合表面。該抗原結(jié)合表面與所結(jié)合抗原的三維表面互補，且該重鏈和輕鏈各自的三個高變區(qū)指代為“互補性決定區(qū)”或“cdr”。

本文中，術(shù)語“表位”包括任何能特異性結(jié)合至免疫球蛋白、scfv、或t細胞受體的蛋白質(zhì)決定因素。表位決定因素由分子的化學活性表面基團如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性的電荷特征。例如，可托起抗體對抗多肽的n端或c端肽、蛋白質(zhì)的線性或非線性肽序列、以及包含第一抗原和第二抗原的氨基酸的表位。本文中，術(shù)語“免疫學結(jié)合”劑“免疫學結(jié)合性質(zhì)”指，出現(xiàn)于免疫球蛋白分子與該免疫球蛋白特異性的抗原之間的非共價相互反應的類型。可使用該相互反應的解離常數(shù)(kd)來表達免疫學結(jié)合相互反應的強度或親和性，其中，較小的kd表示較大的親和性?？墒褂迷擃I(lǐng)域已知的方法將所選擇的多肽的免疫學結(jié)合性質(zhì)定量。一個此方法令測量抗原結(jié)合位點/抗原絡合物形成和解離的速率稱為必需，其中，那些速率取決于該絡合物成員的濃度、該相互反應的親和性、及在兩個方向中同樣影響速率的幾何參數(shù)。因此，可通過計算濃度和實際聯(lián)合和解離速率來測定“運行速率常數(shù)”(kon)和“終止速率常數(shù)”(koff)兩者(nature361:186-87(1993))。koff/kon的比令刪除與親和性不相關(guān)的全部參數(shù)成為可能，且能等于解離常數(shù)kd(daviesetal.(1990)annualrevbiochem59:439-473)。當平衡結(jié)合常數(shù)(kd)為≤1μm，優(yōu)選≤100nm，更優(yōu)選≤10nm，更優(yōu)選≤1nm，且最優(yōu)選≤100pm至約1pm時，本發(fā)明的抗體稱為特異性結(jié)合至本文所揭示的抗原或表位(如，ctla、pd1、pdl1、或其它免疫抑制性蛋白及/或腫瘤抗原)，解離常數(shù)通過試驗如放射性配體結(jié)合試驗或該領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似試驗測得。

本發(fā)明也包含多肽和核酸片段，只要它們分別展現(xiàn)所希望的全長度多肽和核酸的生物學活性(即，拮抗mrgprx2或mrgprb2)即可。采用幾乎任何長度的核酸片段。例如，總長度為約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50對堿基對(包括全部中間長度)的例示性多核苷酸碎片包括于本發(fā)明的多種實作中。同樣，采用幾乎任何長度的多肽片段。例如，總長度為約10,000、約5,000、約3,000、約2,000、約1,000、約5,000、約1,000、約500、約200、約100、或約50個氨基酸(包括全部中間長度)的例示性多肽碎片包括于本發(fā)明的多種實作中。

多核苷酸、多肽、或其它劑經(jīng)純化及/或分離。具體而言，本文中，“經(jīng)分離的”或“經(jīng)純化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、或蛋白質(zhì)，實質(zhì)上不含其它細胞內(nèi)材料、或當通過重組技術(shù)生產(chǎn)時的培養(yǎng)基、或當化學合成時的化學前體或其它化學品。經(jīng)純化的化合物的至少60重量(wt)％(干重)為感興趣的化合物。優(yōu)選地，該制劑的至少75wt％，更優(yōu)選至少90wt％，且最優(yōu)選至少99wt％為感興趣的化合物。例如，以重量計，經(jīng)純化的化合物的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)為所希望的化合物。通過任何適宜的標準方法測量純度，如柱色譜、薄層色譜、或高效液相色譜(hplc)分析。經(jīng)純化或經(jīng)分離的多核苷酸(核糖核酸(rna)或脫氧核糖核酸(dna))不含其天然出現(xiàn)狀態(tài)中位于其側(cè)翼的基因或序列。經(jīng)純化的或經(jīng)分離的多肽不含其天然出現(xiàn)狀態(tài)中位于其側(cè)翼的氨基酸或序列。經(jīng)純化的也定義其對于給藥至人類對象為安全的無菌程度，如缺少感染劑或毒性劑。

同樣，“實質(zhì)上純”意指已經(jīng)從其天然伴隨組分分隔的核苷酸或多肽。典型地，以重量計，當核苷酸和多肽的至少60％、70％、80％、90％、95％、甚或99％不含它們天然關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和天然有機分子時，它們是實質(zhì)上純的。

“分離的核酸”意指核酸，其不含在該核酸來源的有機體的天然基因組中處于其側(cè)翼的基因。該術(shù)語覆蓋，例如：(a)dna，是天然基因組dna分子的一部分，但兩側(cè)未附帶核酸序列，而在該dna天然出現(xiàn)的有機體基因組內(nèi)該核酸序列與該分子的一部分側(cè)面相接；(b)以一定方式并入載體或并入原核生物或真核細胞基因組dna的核酸，因此所得分子并不與任何天然載體或基因組dna相同；(c)獨立的分子如cdna、基因組片段、通過聚合酶鏈反應(pcr)生產(chǎn)的片段、或限制性片段；以及(d)重組核苷酸序列，其實雜交基因的一部分，即編碼融合蛋白的基因。根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子進一步包括合成生產(chǎn)的分子、以及任何已經(jīng)化學改性及/或具有經(jīng)改性的骨架核酸。例如，分離的核酸是純化的cdna或rna多核苷酸。分離的核酸分子也包括信使核糖核酸(mrna)分子。

“備選化合物”意指化學品，為天然存在或人造。備選化合物可包括，例如，肽、多肽、合成性有機分子、天然有機分子、核酸分子、肽核酸分子、及其成分和衍生物。

術(shù)語“藥物組合物”意指任何組合物，其含有至少一種治療劑或生物活性劑，且適用于給藥至患者。任何這些配方可通過該領(lǐng)域已知且被接受的方法制備。見，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,20thedition,(ed.a.r.gennaro),mackpublishingco.,easton,pa.,2000。

“促分泌素”意指造成另一物質(zhì)被分泌的物質(zhì)。

“g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)”意指蛋白質(zhì)受體，其在細胞外感測分子并在細胞內(nèi)活化信號轉(zhuǎn)導通道以及最后的細胞響應。gpcr稱為七跨膜受體，蓋因它們七次穿行通過細胞膜。

“拮抗劑”意指結(jié)合至受體并活化該受體以產(chǎn)生生物學響應的化學品。鑒于拮抗劑造成作用，“拮抗劑”阻斷該拮抗劑的作用，反之，激動劑造成與拮抗劑相反的作用。本文中，術(shù)語“拮抗劑”和“抑制劑”可互換使用，指代任何抵消或抑制、降低、或壓制其靶標分子的生物學活性的分子。適當?shù)膍rgprx2或mrgprb2拮抗劑包括可溶性受體、肽抑制劑、小分子抑制劑、配體融合體、和抗體。

“野生型”或“wt”意指物種作為其在自然界出現(xiàn)的典型形式的表型?；蛘撸撘吧透拍罨癁槲挥谝粋€基因座的標準、“正?！钡任换虻漠a(chǎn)物，與非標準、“突變”等位基因所生產(chǎn)的形成對照。

術(shù)語“假性過敏”指代以其類似真實過敏存在但肇因不同而命名的情況。它可能是由于組胺新陳代謝的改變?！凹傩赃^敏”意指抗體ige依賴性類過敏反應。換句話說，假性過敏并不需要ige來誘發(fā)類過敏反應。

本文中，術(shù)語“給藥”指代轉(zhuǎn)移、輸送、引入、或運輸mrgprb2或mrgprx2拮抗劑至例如需要減輕假性過敏型反應嚴重的對象的任何模式。此類模式包括，但不限于，經(jīng)口給藥、外用給藥、靜脈給藥、腹膜內(nèi)蓋因、肌肉給藥、皮內(nèi)給藥、鼻腔給藥、和皮下給藥。

“mrgprb2或mrgprx2拮抗劑”意指能阻斷、防止、減少、和改變mrgprb2或mrgprx2活化信號轉(zhuǎn)導通道的能力的任何小分子、化學化合物、抗體、核酸分子、或多肽、或其片段。

“改變”意指多肽如mrgprb2或mrgprx2活性中的變化(增加或降低)，通過該領(lǐng)域已知的標準方法如本文中揭示的那些檢測。本文中，改變包括在基因或多肽的表達水平或活性變化10％或更大，優(yōu)選多肽活性變化25％，更優(yōu)選變化40％，且最優(yōu)選變化50％或更大。

本文中，“改變”也包括基因或多肽的表達水平或活性變化2倍或更大，例如，5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更大。

“緩解”意指降低、壓制、削弱、消除、阻止、或穩(wěn)定疾病如，舉例而言，假性過敏型反應的發(fā)展或進展。

“擴大”意指增加分子副本的數(shù)目。一個實施例中，使用聚合酶鏈反應(pcr)來擴大核酸。

“結(jié)合”意指具有對于分子的理化親和性。通過本發(fā)明的任何方法測量結(jié)合，如，藥物/化合物與表達于細胞上的受體的結(jié)合。

本公開中，“包含(comprises或comprising)”、“含有”、“具有”等可具有它們在美國專利法中揭示的意義，且可意指“包括(includes或including)”等；術(shù)語“主要由…組成(consistingessentiallyof或consistsessentially)”同樣具有美國專利法中揭示的意義，且這些術(shù)語是開放的，允許超過其所列舉者的存在，只要其所列舉者的基本或新穎特征并未被超過其所列舉者的存在所改變即可，但不包括先前技術(shù)的具體實施例。

“檢測”指代或直接或間接地鑒別待檢測的信號轉(zhuǎn)導通道的mrgprb2或mrgprx2活化的存在、不存在、或量。

“有效量”意指相對于未治療患者緩解疾病癥狀所需的量。用以實踐本發(fā)明的用于治療性處理的活性化合物的有效量，依據(jù)給藥方式、對象的年齡、體重和總體健康狀況而變。最后，主治醫(yī)生或獸醫(yī)將決定適宜的量和計量方案。該量指代為“有效”量。

本文中使用的術(shù)語“治療(treating)”或“治療(treatment)”指代將劑或配方給藥至臨床上有癥狀的受苦于有害狀態(tài)、病癥、或疾病的個體，以有效減輕癥狀的嚴重性及/或頻率、消除該癥狀及/或其深層原因、及/或促進損害的改善或矯正。

本文提供的范圍理解為該范圍內(nèi)全部數(shù)值的簡寫。例如，1至50的范圍理解為包括來自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50所組成組的任何數(shù)字、數(shù)字組合、或子范圍，以及前述整數(shù)之間的中間小數(shù)如，舉例而言，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。關(guān)于子范圍，具體預期從該范圍斷電延伸的“嵌套子范圍”。例如，1至50的范圍的嵌套子范圍可包含一個方向上的1至10、1至20、1至30、和1至40，或另一方向上的50至40、50至30、50至20、和50至10。

“重組”意指通過基因重組的實驗室方法(如，分子克隆)將來自多個來源的基因材料帶至一起，創(chuàng)建生物有機體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)的序列，由是形成的核酸分子。

“異種啟動子”是一種啟動子，它與實際上可操作性鏈接基因或核酸的啟動子不同。術(shù)語“可操作性鏈接”指代核酸表達控制序列(如啟動子、信號序列、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的陣列)與第二核酸序列之間的功能性鏈接，其中，該表達控制序列影響該核酸相對于該第二序列的轉(zhuǎn)錄及/或轉(zhuǎn)譯。本文中，“異種多核苷酸”或“異種基因”發(fā)源于與特定宿主細胞無關(guān)來源，或者，若來自相同來源，則從其起源形式改性。

“減輕”意指至少10％、25％、50％、75％、或100％的負改變。

“參考”意指標準或?qū)φ諚l件。

除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，術(shù)語“一”、“該”理解為單數(shù)或復數(shù)。除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，術(shù)語“或”理解為包括。

除非具體指明或從語境中明顯可見，本文中，術(shù)語“約”理解為該領(lǐng)域正常公差的范圍內(nèi)，例如，平均數(shù)的2標準偏差內(nèi)。約可理解為所指明數(shù)值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％內(nèi)。除非從語境中明顯排除，本文中提供的全部數(shù)字范圍均由術(shù)語“約”修飾。

從下述優(yōu)選具體實施例的說明書和權(quán)利要求書可明確獲知本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。除非定義排除，本文中使用的全部科技術(shù)語具有與其所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般理解的相同的意義。盡管可使用與本文中揭示的那些類似或等價的方法來實踐或測試本發(fā)明，適當?shù)姆椒ê筒牧辖沂居谙挛闹?。本文中引用的全部外國專利公開案和專利申請案通過引用而并入本文。本文中引用的由保藏號表明的基因銀行(genbank)和ncbi提交書通過引用而并入本文。本文中引用的其它全部已出版的參考文獻、文檔、手稿和科技文獻通過引用而并入本文。存在沖突時，以本說明書包括定義為準。此外，該材料、方法和實施例僅做例示性說明而非限制用。

附圖說明

圖1a是鼠和人mrgpr基因組軌跡的圖解，例示性說明鼠體內(nèi)的擴充基因家族，以及，基于類似的表達模式和激動劑特異性而鑒別的該基因家族的人類直系同源。該鼠mrgpr基因(顯示為名稱位于其上方的垂直棒)叢生于染色體7上。鼠mrgpra3(a3)和mrgprc11(c11)是人mrgprx1(x1)的直系同源，特異性表達于背根神經(jīng)節(jié)(drg)神經(jīng)元中，且起瘙癢受體介導氯喹(cq)和bam8-22(bam)誘發(fā)的瘙癢的功能。人mrgprx2(x2)的直系同源，鼠mrgprb2(b2)的表達和激動劑特異性揭示如下。圖1b顯示嚴格的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(rt-pcr)篩選的結(jié)果，該篩選鑒別mrgprb2轉(zhuǎn)錄本(箭頭)在鼠腹膜肥大細胞中的表達。該mrgpr基因名字標注在凝膠圖片的上方。當將逆轉(zhuǎn)錄酶從cdna合成反應中省略(陰性對照)時，未見譜帶。圖1c顯示細胞內(nèi)鈣濃度[ca²⁺]i的例示性蹤跡，通過放射性fura-2成像從僅以驅(qū)動mrgprb2或mrgprx2表達的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染片刻并曝露于20μmpamp(9-20)的浴應用的hek293細胞測得(由上方黑線標注持續(xù)性)。每一蹤跡為來自獨特細胞的響應。圖1d是顯示來自bac轉(zhuǎn)基因鼠組織的代表性共聚焦圖像的一系列照片。表達mrgprb2開放解讀碼組中egfp-cre的bac鼠與rosa26-loxp-stop-loxp-tdtomato受體鼠交配。因此，通過cre的表達模式測定tdtomato的表達，而cre的表達處于mrgprb2啟動子的控制下。將tdtomato(紅)表達與作為肥大細胞標記物的親和素染色(綠)比較。兩種標記物之間幾乎100％重疊表明，mrgprb2特異性地包含于肥大細胞中。檢查三只鼠除心臟外的所有組織，而檢查兩只鼠的心臟。親和素陽性同時tdtomato也呈陽性的肥大細胞的百分比：無毛的皮膚，97.5％；多毛的皮膚，90.1％；氣管，97.2％；心臟，87.1％。tdtomato陽性同時親和素也呈陽性的細胞的百分比：無毛的皮膚，99.2％；多毛的皮膚，100％；氣管，98.3％；心臟，99％。每一組織中計數(shù)的細胞總數(shù)超過300，但心臟中計數(shù)的細胞總數(shù)超過100。因為腔室附近的肥大細胞密度比該組織其它地方高得多，因此檢查腔室附近的心臟肥大細胞；觀察到親和素陽性同時tdtomato呈陰性的細胞以非常低的數(shù)目包埋在肌肉組織中，但其身份不明。比例尺為20μm。

圖2a(左)是顯示鼠腹膜肥大細胞的代表性熱圖的一系列照片，顯示[ca²⁺]i的改變，通過fluo-4成像測得，由抗ige(5μg/ml)或化合物48/80(10μg/ml)的浴應用誘發(fā)。圖2a(中)顯示代表性成像蹤跡。每一顏色的先表示獨立的細胞?！翱筰ge”圖中的黑線是各基因型的平均蹤跡。注意：wt組與mut組的[ca²⁺]i蹤跡相似。圖2a(右)顯示響應細胞的百分比的定量。如果該[ca²⁺]i上升至少50％并持續(xù)至少10秒，則將細胞鑒定為響應，該現(xiàn)象明顯區(qū)分了來自隨機閃爍事件的配體誘發(fā)的響應。這些和全部其它實驗的分組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用單尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性，且當p<0.05時認為差異顯著。**，p<0.01(對于各基因型，n＝3；每一條件下計數(shù)的細胞超過150個)?？筰ge響應的差異并不顯著。比例尺為10μm。圖2b是顯示組胺釋放入上清液中的柱狀圖，該上清液來自在37℃曝露于48/80(30μg/ml)內(nèi)30分鐘的wt和mrgprb2^mut鼠的氣管和腹部皮膚。將釋放入上清液中的組胺的量定量并表達為ng/mg組織(濕重)。**，p<0.01(對于氣管，n＝5；對于皮膚，n＝8)。圖2c是一系列圖。圖2c(上)顯示代表性蹤跡，其顯示從wt和mrgprb2^mut鼠(先前令其對卵白蛋白(ova)敏感)分離出的氣管響應48/80(30μg/ml)或ova(10μg/ml；即，抗ige依賴性)的收縮。圖2c(下)顯示測定為響應在實驗結(jié)束時加入的10μm卡米可林(carbamycholine)的最大總收縮的平均數(shù)據(jù)。對于48/80wt，n＝5；對于，48/80mrgprb2mut，n＝3。圖2d是一系列照片和一張柱狀圖，左圖顯示足底注射48/80(上，箭頭，10μg/ml，5μl于鹽水中)或鹽水(下)后進行伊文思藍外滲15分鐘的代表性圖像。圖2d(上)顯示15分鐘后滲析入足中的伊文思藍的定量以及足厚度的增加。*，p<0.02(n＝5/wt，n＝6/mrgprb2^mut)。注射鹽水后的差異并不顯著。圖2e是顯示wt和mrgprb2^mut肥大細胞對mrgprx2配體和基礎(chǔ)促分泌素的響應能力的定量，使用fluo-4成像測得。物質(zhì)的濃度(以μm計)：pamp(9-20)，20；皮質(zhì)抑素(cortistatin)-14(cort.)，20；物質(zhì)p(subp)，200；胰激肽，200；黃蜂毒素(mastoparan(masto.)，黃蜂毒(waspvenom)的一種組分)，20；胡蜂毒素(vespidmastoparan)，20。n＝3/基因型；>150計數(shù)細胞/促分泌素。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差(sem)。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性，且當p<0.05時認為差異顯著。*，p<0.05。除非注明，否則**，p<0.01。

圖3a是顯示mrgprb2介導肽能治療性藥物的肥大細胞響應能力和副作用的柱狀圖。圖3a顯示來自用藥后的wt和mrgprb2^mut腹膜肥大細胞的響應細胞的百分比，使用fluo-4成像測得。藥物濃度(以μg/ml計)：艾替班特，50；西曲瑞克，20；亮丙瑞林，100；奧曲肽，10；舍莫瑞林，60；胰島素，80。n＝3/基因型；>150計數(shù)細胞/物質(zhì)，但對于胰島素，計數(shù)細胞>100。胰島素響應能力間的差異并不顯著。圖3b(左)顯示足底注射48/80(上，箭頭，10μg/ml，5μl于鹽水中)或鹽水(下)后進行伊文思藍外滲15分鐘的代表性圖像。圖3b(右)顯示15分鐘后滲析入足中的伊文思藍的定量以及足厚度的增加。**，p<0.01(對于每一基因型，n＝6)。注射鹽水后的差異并不顯著。圖3c是一系列散點圖，顯示從使用所指定物質(zhì)孵化的wt(紅色菱形)和mrgprb2^mut(黑色方塊)鼠釋放的組胺總量。對于任何劑量的抗ige抗體，均未發(fā)現(xiàn)wt與mrgprb2^mut細胞之間的顯著差異。重復實驗>3次。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±sem。雙尾未配對學生t測試：*，p<0.05。**，p<0.01。

圖4a是一系列化合物48/80和環(huán)化變體的結(jié)構(gòu)，而有報導稱環(huán)化變體更強。四氫異喹啉(thiq)結(jié)構(gòu)組元以藍色高亮。圖4b是全nmbd類別的代表性成員的一系列結(jié)構(gòu)。thiq結(jié)構(gòu)組元以藍色高亮。注意，僅琥珀酰膽堿缺乏大體積的疏水基。圖4c是顯示小分子治療性藥物的mrgprb2介導肥大細胞響應能力和副作用的柱狀圖。圖4c顯示來自施加多種nmbd后的wt和mrgprb2^mut腹膜肥大細胞的響應細胞的百分比，使用fluo-4成像測得。藥物的濃度(以μg/ml計)：阿曲庫銨，50；美維庫銨，20；筒箭毒堿，30；羅庫溴銨，500。n＝3鼠/基因型；>150計數(shù)細胞/物質(zhì)。圖4d描述環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)的結(jié)構(gòu)，且全部氟喹諾酮類共有的結(jié)構(gòu)組元以藍色高亮。注意，氮鄰近該喹諾酮結(jié)構(gòu)組元。圖4e是顯示來自施加氟喹諾酮后的wt和mrgprb2^mut腹膜肥大細胞的響應細胞的百分比的柱狀圖，使用fluo-4成像測得。藥物的濃度(以μg/ml計)：環(huán)丙沙星，200；左氧氟沙星，500；莫西沙星，160；氧氟沙星，400。n＝3鼠/基因型；>150計數(shù)細胞/物質(zhì)。圖4f是顯示在時間0靜脈注射環(huán)丙沙星(1.5mg于125μl鹽水中)后的體溫變化的折線圖。n＝4鼠/基因型。數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±sem。雙尾未配對學生t測試：*，p<0.05。**，p<0.01。

圖5a是印跡的照片，顯示在天然條件下，mrgprx1直系同源并未以相關(guān)水平表達在肥大細胞內(nèi)。圖5a顯示用于表達mrgprx1直系同源的mrgpra3和mrgprc11的腹膜肥大細胞的低嚴格度rt-pcr篩選結(jié)果。箭頭指出了預期的譜帶尺寸。圖5b是柱狀圖，顯示響應mrgprx1和mrgprc11激動劑，源自牛腎上腺髓質(zhì)的肽片段8至22(bam8-22，500nm)的腹膜肥大細胞的百分比。通過測量細胞內(nèi)鈣的上升來試驗活性，使用fluo-4染料成像。差異并不顯著(p＝0.39)。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性。圖5c是經(jīng)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的hek293細胞對于mrgprx2配體和mrgprx1配體氯喹(cq)的響應的總結(jié)表，其中，該質(zhì)粒驅(qū)動與mrgprb2最相關(guān)的mrgprx2、mrgprb2和其它鼠mrgpr(即，mrgprb1、b10、及b11)的表達。陽性響應和陰性響應分別標注為“√”和“×”。如果至少半數(shù)的被轉(zhuǎn)染細胞顯示[ca²⁺]i增加50％，則認為響應是陽性。以mrgprb1、b10、及b11轉(zhuǎn)染的細胞不響應任何所列藥物。

圖6a是一系列折線圖，顯示誘發(fā)假性過敏反應的基礎(chǔ)促分泌素和藥物活化在hek293細胞內(nèi)表達的鼠mrgprb2和人mrgprx2。圖6a顯示例示性蹤跡，其顯示來自表達mrgprb2和gα15的hek293細胞內(nèi)的[ca²⁺]i變化，通過fluo-4成像測得。圖6b顯示例示性蹤跡，其顯示來自表達mrgprx2和gα15的hek293細胞內(nèi)的[ca²⁺]i變化，通過fluo-4成像測得。除環(huán)丙沙星外的物質(zhì)在30至90秒時間段內(nèi)灌注，環(huán)丙沙星在30至60秒之間的時間段內(nèi)灌注以最小化與溶解環(huán)丙沙星的低ph溶液的接觸。使用胰島素作為陰性對照。圖6c是基礎(chǔ)促分泌素和與假性過敏反應相關(guān)的藥物活化表達mrgprb2和mrgprx2的hek293細胞的ec50的表。從重復三次的劑量響應研究測得ec50。數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±sem。

圖7是顯示多系bac轉(zhuǎn)基因鼠證實肥大細胞特異性mrgprb2表達的一系列顯微照片。圖7顯示來自兩個其它bac轉(zhuǎn)基因鼠系的代表性共聚焦圖像。表達mrgprb2開放解讀碼組內(nèi)的egfp-cre的bac鼠與tdtomato受體鼠交配，并將tdtomato(紅)表達與肥大細胞標記物親和素染色(綠)比較。比例尺為20μm。

圖8a至圖8b顯示，粘膜肥大細胞或外周白血球內(nèi)不表達mrgprb2。圖8a顯示來自使用抗mcpt1(β-糜蛋白酶)抗體染色以標記粘膜肥大細胞的mrgprb2-tdtomato鼠的胃部切片的代表性圖像。白色箭頭表明陽性細胞。沒有細胞被雙重標記(計數(shù)296個mcpt1標記的細胞和275個tdtomato陽性細胞，n＝3鼠)。比例尺為40μm。圖8b顯示來自使用雙重標記的mrgprb2-tdtomato鼠的外周白血球的細胞離心涂片制劑的代表性圖像，該雙重標記為用于表達mrgprb2的細胞的tdtomato染色(紅；左圖)和hoechst33342細胞核染色(藍；右圖)。沒有外周白血球表達mrgprb2(n＝3鼠；所檢查的細胞>4000個)。比例尺為40μm。

圖9a、圖9b、圖9c、和圖9d顯示mrgprb2^mut鼠經(jīng)功能性基因剔除。圖9a是mrgprb2基因座內(nèi)和附近的基因組區(qū)域的例示性說明。注意，包括長點綴元素(line)、短點綴元素(sine)、和長串聯(lián)重復(ltr)的代表性序列在mrgprb2基因的3’側(cè)立即開始，且額外存在于5’側(cè)的2.5kb范圍內(nèi)。2014年3月份，使用鄰近mrgprb2的3’端的500個堿基作為查詢關(guān)鍵詞進行blastn檢索，在鼠基因組中找到了超過269,000條結(jié)果。圖9b是wt和mut基因組序列的比較，其顯示突變體中四對堿基對消除的位置。數(shù)字對應mrgprb2開放解讀碼組。圖9c是從突變系構(gòu)建18個月后出生的小鼠采樣的wt和mutcdna的定序結(jié)果。突變體中堿基誤配以紅色高亮。圖9d是mrgprb2^mut開放解讀碼組的氨基酸轉(zhuǎn)譯，其揭示該消除創(chuàng)建了在第一跨膜區(qū)域后很快的移碼突變和密碼子(*)的提前結(jié)束。mut：移碼消除的位點。tm1：跨膜區(qū)域1。

圖10a至圖10b是一系列顯微照片和柱狀圖，顯示氣管和皮膚組織的肥大細胞數(shù)目和組胺含量在野生型和mrgprb2^mut動物之間并無差異。圖10a(上)顯示wt和mrgprb2^mut鼠內(nèi)的親和素染色的代表性圖片。比例尺為40μm。圖10a(下)顯示各種組織中肥大細胞數(shù)的定量。使用雙尾未配對學生t測試(對于各基因型，n＝3；對于各基因型的多毛皮膚和無毛皮膚，分別計數(shù)超過3000μm²和1000μm²內(nèi)的細胞；計數(shù)超過10,000的腹膜細胞)，差異并不顯著。圖10b顯示，氣管組胺平均含量分別為5.9±0.9和5.5±1.6ng/mg(對于各基因型，n＝5)；皮膚組胺平均含量分別為30.8±3.2和30.2±4.0ng/mg(對于各基因型，n＝8)。差異不顯著。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性。

圖11a、圖11b、和圖11c分別是一系列顯微照片、折線圖和柱狀圖，其顯示內(nèi)皮素透過etagpcr1在mrgprb2^mut和野生型肥大細胞中誘發(fā)的可比較的活化。圖11a顯示鼠腹膜肥大細胞的代表性熱圖像，顯示有內(nèi)皮素(1μm)的浴應用誘發(fā)的[ca²⁺]i的變化，通過fluo-4成像測得。比例尺為10μm。圖11b顯示wt(紅線)和mrgprb2^mut(黑線)的平均[ca²⁺]i成像軌跡。wt組與mut組之間的[ca²⁺]i軌跡類似。軌跡是圖2a所示者的平均。圖11c顯示響應細胞的百分比的定量。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較(對于各基因組，n＝3；各基因組均計數(shù)超過180個細胞)的顯著性。內(nèi)皮素誘發(fā)的響應沒有顯著差異。

圖12a和圖12b顯示，ige介導的發(fā)炎在野生型和mrgprb2^mut鼠之間并無差異。圖12a顯示，足底注射抗ige抗體(右，箭頭，100μg/ml，7μl于鹽水中)或鹽水(左)后15分鐘，伊文思藍外溢的代表性圖像。圖12b顯示在15分鐘后滲析入足的伊文思藍的定量(對于wt，n＝6；對于mrgprb2^mut，n＝7)。在注射抗ige抗體(p＝0.49)和鹽水(p＝0.23)后的差異不顯著。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性。

圖13a、圖13b、圖13c、圖13d、和圖13e顯示，mrgprb2^mut肥大細胞對基礎(chǔ)促分泌素和多種治療性藥物無響應。圖13a顯示實施例蹤跡，顯示來自wt和mrgprb2^mut腹膜肥大細胞的由圖2e的基礎(chǔ)促分泌素誘發(fā)的[ca²⁺]i變，通過fluo-4成像測得。每一蹤跡是來自一個獨特的細胞的響應。圖13b顯示，應用艾替班特(50μg/ml)的過程中，來自wt(上)和mrgprb2^mut(下)培養(yǎng)的腹膜肥大細胞的代表性fluo-4圖像(左)和熒光示蹤(右)。圖9c顯示實例蹤跡，顯示來自wt和mrgprb2^mut腹膜肥大細胞的由所選擇的fda許可的陽離子肽能藥物誘發(fā)的[ca²⁺]i變化，通過fluo-4成像測得。每一蹤跡為一個獨特的細胞的響應。圖13d是一系列顯微照片和折線圖，顯示應用阿曲庫銨(50μg/ml)的過程中，來自wt(上)和mrgprb2^mut(下)培養(yǎng)的腹膜肥大細胞的代表性fluo-4圖像(左)和熒光示蹤(右)。圖13e是一系列顯微照片和折線圖，顯示應用環(huán)丙沙星(200μg/ml)的過程中，來自wt(上)和mrgprb2^mut(下)培養(yǎng)的腹膜肥大細胞的代表性fluo-4圖像(左)和熒光示蹤(右)。

圖14a和圖14b是一系列柱狀圖，顯示人肥大細胞被基礎(chǔ)促分泌素和與假性過敏反應相關(guān)的藥物以mrgprx2依賴性方式活化。圖14a中，人lad2肥大細胞經(jīng)不同濃度的化合物48/80、黃蜂毒素、艾替班特、阿曲庫銨和環(huán)丙沙星治療。響應這些物質(zhì)的肥大細胞的活化以β-氨基己糖苷酶、tnf、pgd2和組胺的釋放為特征。此外，與經(jīng)治療的細胞(4.1±0.3％釋放)相比，使用0.1μg/ml鏈霉親和素刺激以生物素共軛的人ige敏化的lad2細胞，造成fβ-氨基己糖苷酶(71.3±1.8％釋放)的強烈釋放。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。圖14b顯示，人mrgprx2的削減顯著降低了由基礎(chǔ)促分泌素和與假性過敏反應的藥物誘發(fā)而非ige誘發(fā)的肥大細胞活化。首先使用mrgprx2sirna或?qū)φ誷irna轉(zhuǎn)染人lad2肥大細胞。轉(zhuǎn)染兩天后，使用化合物48/80(0.1μg/ml)、黃蜂毒素(5μg/ml)、艾替班特(10μg/ml)、阿曲庫銨(25μg/ml)、和環(huán)丙沙星(75μg/ml)處理該細胞。響應這些物質(zhì)的肥大細胞的活化以下述為特征：經(jīng)mrgprx2sirna處理的細胞中的β-氨基己糖苷酶的釋放比對照組中的釋放顯著減少。ige介導的肥大細胞脫粒不受mrgprx2sirna削減的影響。各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性，且當*p<0.05；**p<0.01；***p<0.005(實驗重復三次)時認為差異顯著。

圖15是fda許可的50個氨基酸以下的全部治療性藥物的表。電荷通過chemaxon計算。西曲瑞克、加尼瑞克、和奧曲肽的isr數(shù)據(jù)來自下列參考文獻：verschraegen,c.f.etal.gynecologiconcology90,552-559(2003)；fluker,m.etal.fertilityandsterility75,38-45(2001)；以及tuvia,s.etal.thejournalofclinicalendocrinologyandmetabolism97,2362-2369,(2012)，這些參考文獻通過引用并入本文。全部其它信息由fda提供。

圖16是列舉fda許可的全部類別的神經(jīng)肌肉阻斷藥物(nmbd)及代表性成員的圖表。

具體實施方式

本發(fā)明提出測定化合物是否誘發(fā)假性過敏型反應的細胞和方法，以及減輕對象體內(nèi)假性過敏型反應嚴重性的方法。本發(fā)明基于，至少部分地基于下述發(fā)現(xiàn)：g蛋白偶聯(lián)受體，即鼠體內(nèi)的mrgprb2和人體內(nèi)的mrgprx2，排他性表達于一種名為肥大細胞的免疫細胞中，這一現(xiàn)象與對于外來物質(zhì)的假性過敏反應緊密相聯(lián)。本發(fā)明確定，這一單一受體被fda許可的至少13種不同的與過敏型反應相關(guān)的藥物活化，而這一活化是這些藥物副作用的一部分。

在本文中揭示的本發(fā)明之前，mrgprx2/mrgprb2在假性過敏藥物反應中的角色完全未知。本文中揭示了使用基于表達mrgprx2/mrgprb2的細胞的試驗來篩選誘發(fā)假性過敏藥物反應的藥物，以及用來篩選阻斷這些反應的mrgprx2拮抗劑。為了進行試驗工作，本發(fā)明人將表達mrgprx2/mrgprb2的細胞內(nèi)的gtp結(jié)合蛋白α15(gα15)加入基于受體的信號，以增加細胞內(nèi)鈣，令該細胞株與高通量篩選裝置相容。在本發(fā)明之前，mrgprx2/mrgprb2在假過敏藥物反應中的角色未知。據(jù)此，mrgprx2/gα15細胞未被報導著實不令人驚訝。而gα15在其它分離細胞中的表達已被報導，其僅用于當受體不誘發(fā)細胞內(nèi)鈣的上升時。mrgprx2誘發(fā)該上升，這表明分離細胞中包括gαl5并非是必需的。但是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，mrgprx2正常地響應一些激動劑而非其它，從而誘發(fā)了此上升，做出了該試驗工作必需的共表達。

本發(fā)明的分離細胞表達人g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)mrgprx2或鼠gpcrmrgprb2，同時表達gtp結(jié)合蛋白gα15，這令受體活化在基于鈣的試驗中容易可視化。這些細胞株能用來進行對fda許可的藥物和研發(fā)用于mrgprx2激動劑和拮抗劑活性的藥物的篩選。這是所希望的，因為mrgprx2的脫靶活化誘發(fā)了體內(nèi)的過敏型副作用，可導致顯著的不良事件。

在基于細胞的藥物篩選試驗中使用這些細胞，陽性結(jié)果(即，通過例如鈣釋放而測量的細胞株的活化)將指明，該藥物將會正常地活化肥大細胞并潛在地造成患者體內(nèi)的過敏型反應。研發(fā)中的藥物的篩選將會預測其副作用概況；目前使用中的藥物的篩選將會鑒別這些藥物的副作用的肇因；拮抗劑的篩選將對導致新的治療性藥物，該藥物可與誘發(fā)過敏型反應的藥物同時提供，因此阻斷肥大細胞的活化而不感染它們的預期用途。

如下文所詳述的，在缺乏mrgprb2的鼠體內(nèi)沒有野生型鼠響應這些藥物的局部和全身性過敏性響應，mrgprb2是人mrgprx2的鼠直系同源。這一完全意料之外的發(fā)現(xiàn)表明，mrgprx2是一種引人注意的藥物靶標，因為拮抗劑可與非常寬范圍的藥物合用而阻斷它們的過敏型副作用。

本文中揭示用來篩選fda許可藥物和活化或拮抗這一受體的臨床試用化合物的細胞株。這些將可用來確定藥物是否會誘發(fā)過敏型響應，以及用于篩選中以研發(fā)阻斷這些響應的拮抗劑。

本文中揭示了表明基礎(chǔ)促分泌素通過單一受體mrgprb2在體內(nèi)外活化鼠肥大細胞的結(jié)果，該單一受體mrgprb2是人g蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)mrgprx2的鼠直系同源。在不具mrgprb2的突變鼠體內(nèi)未見促分泌素誘發(fā)的組胺釋放、炎癥、以及氣道收縮。再者，如下文中詳述，fda許可的大多數(shù)類別的與過敏型注射位點反應相關(guān)的肽能藥物也活化mrgprb2和mrgprx2，而突變鼠體內(nèi)不存在該注射位點炎癥。本文中揭示的結(jié)果表明，mrgprb2和mrgprx2是眾多與全身性假性過敏反應或過敏性反應相關(guān)的小分子藥物的靶標；藥物誘發(fā)的這些過敏性反應的癥狀在基因剔除鼠體內(nèi)得以顯著減輕。本文中也揭示，對若干個這些幫助預測其它化合物副作用的分子中共有的化學結(jié)構(gòu)組元的鑒別。下文詳述對用來研究基礎(chǔ)促分泌素對肥大細胞活化的鼠模型的介紹，以及對mrgprx2作為治療性靶標以減輕藥物誘發(fā)的副作用子集的鑒別。

肥大細胞

肥大細胞是過敏反應中的主要效應子，且可通過分泌組胺及多種炎性和免疫調(diào)節(jié)性物質(zhì)而在疾病中扮演重要角色(metcalfe,etal.,1997physiologicalreviews77,1033-1079；gallietal.,2005natureimmunology6,135-142)。盡管傳統(tǒng)上認為它們被ige抗體活化，肥大細胞的獨有性質(zhì)為它們對于統(tǒng)稱為基礎(chǔ)促分泌素的陽離子性物質(zhì)范圍的抗體依賴性響應能力，該基礎(chǔ)促分泌素包括炎性肽和與過敏型反應相關(guān)的藥物(metcalfe,etal.,1997physiologicalreviews77,1033-1079；lagunoffetal.,1983annualreviewofpharmacologyandtoxicology23,331-351)。這些物質(zhì)在病理學中扮演的角色已經(jīng)引起了長達數(shù)十年的對于它們的受體的研究。

肥大細胞(mastcell，也寫作mastocyte或labrocyte)源自髓細胞樣干細胞。它是免疫系統(tǒng)的一部分，且含有多種富含組胺和肝素的顆粒。盡管肥大細胞在過敏和過敏性反應中的角色最有名，肥大細胞也扮演重要的保護性角色，它們密切牽涉入傷口愈合包括血管生成中并防御病原體。肥大細胞在外觀上和功能上與嗜堿粒細胞非常相似，嗜堿粒細胞是另一種類型的白血球。這些細胞的區(qū)別下壓，肥大細胞是組織如肌肉組織中的組成部分，而嗜堿粒細胞在血液中被發(fā)現(xiàn)。兩種細胞全是含有組胺和肝素的粒細胞，其中，肝素是一種抗凝劑。兩種細胞在結(jié)合至免疫球蛋白e時均釋放組胺。

肥大細胞存在于典型環(huán)繞血管和神經(jīng)的大多數(shù)組織中，且尤其顯著接近外界與內(nèi)環(huán)境之間的邊界如皮膚、肺粘膜、和消化道，以及口、結(jié)膜、和鼻。

肥大細胞在炎性進程中扮演關(guān)鍵角色。當被活化時，肥大細胞迅速將其特征性顆粒和多種激素介質(zhì)釋放入小間隙中?？赏ㄟ^直接傷害(如，物理或化學傷害(如阿片類、醇類、和某些抗體如多粘菌素))、免疫球蛋白e(ige)受體的交聯(lián)、或補體蛋白來刺激肥大細胞，以進行脫粒。

肥大細胞表達ige的fc區(qū)域的高親和性受體(fcεri)，該受體是該抗體的豐度最小的成員。這一受體的親和性如此之高，以至于ige分子的親和性大體上不可逆。結(jié)果，肥大細胞為漿細胞(免疫系統(tǒng)的生產(chǎn)抗體的細胞)所產(chǎn)生的ige所包覆。

過敏反應中，肥大細胞維持不活化，直至過敏原結(jié)合至已經(jīng)包覆在該細胞上的ige為止。其它膜活化事件可令肥大細胞做好后續(xù)脫粒的準備或與fcεri信號轉(zhuǎn)導協(xié)同作用。通常，抗原是蛋白質(zhì)或多糖。該過敏原結(jié)合至抗原結(jié)合位點，該位點位于結(jié)合至該肥大細胞表明的ige分子的可變區(qū)。結(jié)合細胞的該fc受體的細胞內(nèi)域的集簇與經(jīng)交聯(lián)的ige分子有關(guān)，且該集簇造成該肥大細胞內(nèi)導致該細胞活化的反應的復序列。釋放入細胞外環(huán)境內(nèi)的分子包括：預先形成的介質(zhì)(來自粒)(如，絲氨酸蛋白酶如類以蛋白酶、組胺(2至5pg/細胞)、血清素、蛋白聚糖、肝素(作為抗凝劑作用))、新形成的脂質(zhì)介質(zhì)(類花生酸)(即，凝血惡烷、前列腺素d2、白三烯c4、血小板活化因子)、及細胞因子(如，嗜酸細胞趨化因子)。

組胺擴大毛細管后微靜脈，活化內(nèi)皮，且增加血管滲透性。這導致局部水腫(腫脹)、發(fā)熱、發(fā)紅、以及將其它炎性細胞吸引至該釋放位點。組胺也令神經(jīng)末端去極化(導致瘙癢或疼痛)。組胺釋放的侵犯皮膚表征包括“潮紅和膨疹(flareandwheal)”。蚊子叮咬后立即出現(xiàn)的腫塊和發(fā)紅是這一反應的好例子，這一反應在肥大細胞挑戰(zhàn)過敏原后幾秒鐘內(nèi)出現(xiàn)。

mrgprx2

本文中，mas相關(guān)的g蛋白偶聯(lián)受體成員x2(mrgprx2)是肥大細胞特異性的基礎(chǔ)促分泌素抗體，該基礎(chǔ)促分泌素即陽離子性兩親藥物，以及內(nèi)源肽或外源肽，由堿性頭部和疏水性芯組成。見，mcneilb.d.,2015nature,519:237-241，該文獻通過引用并入本文。如下文詳述的，mrgprx2識別并接合含有經(jīng)環(huán)化的四氫異喹啉(thiq)的小分子，如非甾體神經(jīng)肌肉阻斷藥物(nmbd)，包括筒箭毒堿和阿曲庫銨。如下文詳述的，mrgprx2響應這些化合物而介導假性過敏反應，該假性過敏反應以組胺釋放、炎癥和氣道收縮為特征。本文中，mrgprx2也擔當大量其它配體的受體，該其它配體包括肽和生物堿，如皮質(zhì)抑素-14、腎上腺髓質(zhì)素原n端肽pamp-12、和程度較低的pamp-20、抗細菌蛋白ll-37、pmx-53肽、β-防御素、和扁平石松堿(complanadine)a。

例示性人mrgprx2氨基酸序列提供如下(np_001290544.1(gi:746816153)，通過引用而并入本文(seqidno:1))：

例示性人mrgprx2核酸序列提供如下(nm_001303615.1(gi:746816152)，通過引用并入本文(seqidno:2))：

例示性鼠mrgprb2氨基酸序列提供如下(np_780740.2(gi:229094244)，通過引用并入本文(seqidno:3))：

例示性鼠mrgprb2核酸序列提供如下(nm_175531.4(gi:229094243)，通過引用并入本文(seqidno:4))：

gα15

gtp結(jié)合蛋白α15(gα15)是多種跨膜信令系統(tǒng)的調(diào)節(jié)子或轉(zhuǎn)換子。

例示性人gα15氨基酸序列提供如下(np_002059.3(gi:597709771)，通過引用并入本文(seqidno:5))：

例示性人gα15核酸序列提供如下(nm_002068.3(gi:597709770)，通過引用并入本文(seqidno:6))：

例示性鼠gα15氨基酸序列提供如下(np_034434.1(gi:6754010)，通過引用并入本文(seqidno:7))：

例示性鼠gα15氨基酸序列提供如下(nm_010304.3(gi:34328487)，通過引用并入本文(seqidno:8))：

hek293細胞

人類胚胎腎293細胞，一般也指代為hek293、hek-293、293細胞、或較不精確地稱為hek細胞，是最初源自在組織培養(yǎng)液中生長的人類胚胎腎細胞(來自流產(chǎn)的人類胚胎)及源自死產(chǎn)動物的特異性細胞株。hek293細胞非常容易生長且非常容易轉(zhuǎn)染，并已經(jīng)再細胞生物學中廣泛使用多年。它們也通過生物技術(shù)工業(yè)而被用來生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)和用于基因治療的病毒。

本文中揭示穩(wěn)定表達gα15、以及或mrgprb2或mrgprx2的hek293細胞。

發(fā)表下述實施例，以對該領(lǐng)域技術(shù)人員提供如何做出并使用本發(fā)明的試驗、篩選、和治療性方法的完全公開和說明，且該實施例并非欲以限制本發(fā)明人認為的發(fā)明范疇。

[實施例]

實施例1：材料和方法

使用下述材料和方法。

動物模型

牽涉平等對待wt和突變樣本和動物的全部實驗由實驗人員無視實驗條件而實施。

分析

各組數(shù)據(jù)表達為平均數(shù)±平均數(shù)標準誤差。使用雙尾未配對學生t測試來測定統(tǒng)計學比較的顯著性，且當p<0.05時認為差異顯著。使用統(tǒng)計功效分析來證明樣本尺寸。每一組中，由于大多數(shù)成果數(shù)值關(guān)于該平均數(shù)值對稱分布，因此假設(shè)數(shù)據(jù)正態(tài)分布。通過f測試測得的各組間的方差類似。通過纖連蛋白粘連的可見缺乏或通過不正常的高靜止鈣水平而視為被損害的肥大細胞，被排除在該分析之外。反之，成功進行該過程及/或治療的樣本或動物無一被排除在該分析之外。由于不可用于該研究，因此在動物研究中不使用隨機化。

肽和藥物

化合物48/80、黃蜂毒、羅庫溴銨、筒箭毒堿、環(huán)丙沙星、莫西沙星和氧氟沙星來自西格瑪公司(sigma)。皮質(zhì)抑素來自tocrisbiosciences。pamp(9-20)由genscript定制合成并純化至≥98％。亮丙瑞林來自genscript。物質(zhì)p、胰激肽、黃蜂毒素、西曲瑞克、奧曲肽、舍莫瑞林(生長激素釋放因子1-29)、艾替班特(hoe-140)來自anaspec。阿曲庫銨和美維庫銨來自santacruzbiotechnology。重組人胰島素來自羅氏制藥(roche)。羊抗鼠ige(ab9162)來自艾碧康(abcam)。

藥物制備和存儲

阿曲庫銨、美維庫銨、筒箭毒堿、和全部氟喹諾酮溶液在實驗當天制備，因為發(fā)現(xiàn)前三種的效能對氧化及/或凍融效應敏感，而氟喹諾酮的溶解度當新鮮制備時最佳。普萘洛爾(propranolol)也在實驗當天制備以最小化潛能損失的可能。將除左氧氟沙星之外的全部氟喹諾酮溶解于ph被調(diào)節(jié)為3.5的cib中。全部其它藥物制備為100x至1000x等量小樣，在-80℃儲存，使用時在4℃融化并稀釋入鈣成像緩沖液或鹽水中。

mrgprrt-pcr篩選

根據(jù)制造商的建議，使用qiagenrneasymicro柱將核糖核酸(rna)從4x10⁴鼠腹膜肥大細胞純化出來。使用dnasei(newenglandbiolabs)將rna處理20分鐘，在另一rneasymicro柱上再次純化。根據(jù)制造商的使用說明書，使用寡dt引物并將所推薦的10μl放大至60μl，使用superscriptiii試劑盒(invitrogen)以8ng的rna來生成第一cdna鏈。陰性對照反應相同，但以水替代superscriptiii逆轉(zhuǎn)錄酶。使用12.5μlredtaqreadymix(sigma)、0.5μldmso、各0.25μl的50μm基因特異性正反向引物、10μl水、和2μl的來自cdna或陰性對照合成反應的混合物，運行25μl的pcr反應。全部反應均使用4分鐘的95℃起始步驟、30秒的具體溫度(下文揭示)退火、40秒的72℃擴增、和25秒的95℃(且后三個步驟重復39次)、以及4分鐘的72℃最終步驟。低嚴格度pcr設(shè)定為60℃退火；否則，退火溫度為：62℃，用于mrgpra1、mrgpra10、mrgprb2、和mrgprb6；64℃，用于mrgpra2、mrgpra3、mrgpra4、mrgpra6、mrgpra16、mrgpra18、和mrgprb11；65℃，用于mrgpra9、mrgpra19、mrgprb1、mrgprb3、mrgprb5、和mrgprb8；66℃，用于mrgpra12和mrgprb10；63℃，用于mrgprb4；61℃，用于mrgpra14；以及，65.5℃，用于mrgprc11。

引物如下。mrgpra1(正向：atccagcaagaggaatgggg(seqidno:9)，反向：tgtgacctaggaggaagaagaag(seqidno:10))；mrgpra2(正向：cctcctacacaagccagcaa(seqidno:11)，反向：aagcacaagtgaaagatgatgct(seqidno:12))；mrgpra3(正向：gctacatccagcaagaggaatg(seqidno:13)，反向：gcaaaaattcctttgggtagggt(seqidno:14))；mrgpra4(正向：cctgtgtgctgtgatctggt(seqidno:15)，反向：tcacggttaatccagggcac(seqidno:16))；mrgpra6(正向：cattttcctcccccaacagt(seqidno:17)，反向：atgcctgaatgagcccacaa(seqidno:18))；mrgpra9(正向：cagtgatctacatccagcaaaagg(seqidno:19)，反向：gcgtggaagctatgatgcga(seqidno:20))；mrgpra10(正向：cagtggtccaccatctccaa(seqidno:21)，反向：acaggcaagagagtcatggtt(seqidno:22))；mrgpra12(正向：tcagggatcgggtgaagcac(seqidno:23)，反向：gagcatttgaaggtgttgttgga(seqidno:24))；mrgpra14(正向：ggttgcccctgtgtttcttc(seqidno:25)，反向：tattgccagtcagtaagctgag(seqidno:26))；mrgpra16(正向：gccctctggttcccattact(seqidno:27)，反向：gtttttggaccactgaggcatt(seqidno:28))；mrgpra18(正向：tgctctggttttctcctttgc(seqidno:29)，反向：tgaggcatgtcaagtcagtca(seqidno:30))；mrgpra19(正向：caggacccagatcacgacac(seqidno:31),tcctgggcttccgatttcac(seqidno:32))；mrgprb1(正向：attagccttcatcaggcacca(seqidno:33),ccagcccaactaaggcaatg(seqidno:34))；mrgprb2(正向：gtcacagaccagtttaacacttcc(seqidno:35),cagccatagccaggttgagaa(seqidno:36))；mrgprb3(正向：acctggctgtggctgatttt(seqidno:37)，反向：gctgaacccacagagaacca(seqidno:37))；mrgprb4(正向：tctggctggtgctgatttctt(seqidno:38)，反向：accacgaggctcaacaataga(seqidno:39))；mrgprb5(正向：ctgtggttccttctgtgtcca(seqidno:40)，反向：tttccagttccccagaccttt(seqidno:41))；mrgprb6(正向：tctgtctacatcctcaacctgg(seqidno:42))，反向：attatctcatgaggaaggctcaa(seqidno:43))；mrgprb8(正向：agagaatgcaaagcatgcga(seqidno:44)，反向：gaggaagtttgccccagaca(seqidno:45))；mrgprb10(正向：cactggtcacattgccaacc(seqidno:46，反向：ggggatggaatcaatgtccaaga(seqidno:47)；mrgprb11(正向：accttcttgctatttttccctcca(seqidno:48)，反向：aggatgagactggacccaca(seqidno:49))；mrgprc11(正向：cagcacaagtcagctcctcaa(seqidno:50)，反向：atgcccatgagaaaggacagaacc(seqidno:51))。

表達構(gòu)建

使用標準技術(shù)克隆mrgpr基因并插入pcdna3.1哺乳動物表達質(zhì)粒。全部的鼠基因在其n端具有kozak序列，也編碼通過氨基酸鏈接基diil從該基因分隔開的c端flag標簽。

cdna構(gòu)建

如rt-pcr篩選中所揭示的制備第一cdna鏈，并使用q5熱啟動高保真預混液(hotstarthighfidelitymastermix)(newenglandbiolabs)實施擴增。將至少五種各自從野生型和突變鼠制備的不同克隆物定序，以證實突變種中消除的存在和任何從其它野生型或突變種的突變的不存在。

hek293細胞中鈣成像

在初始篩選中，使用包括c端flag標簽的基因構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)染hek293細胞(未進行支原體測試但迅速分開)，并在轉(zhuǎn)染后6小時，置100μg/ml聚d-賴氨酸涂覆的玻璃蓋板上。24小時后，于37℃，令細胞裝載鈣指示物fura-2或fluo-4(分子探針公司(molecularprobes))的am酯和0.02％pluronicf-127(molecularprobes)，裝載時間為45分鐘。裝載fura-2的細胞在340nm和380nm激發(fā)過程中成像，而裝載fluo-4的細胞在488nm激發(fā)過程中成像。后來的實驗使用穩(wěn)定表達受體的細胞株以及混雜g蛋白gα15的瞬時或穩(wěn)定表達。細胞在鈣成像緩沖液(cib；nacl125mm，kcl3mm，cacl22.5mm，mgcl20.6mm，hepes10mm，葡萄糖20mm，nahco31.2mm，蔗糖20mm，使用naoh帶至ph7.4)中成像。除非具體排除，將藥物灌注入腔室中，灌注時間為45至60秒，并以5秒的間隔在進行另外60至90秒的響應監(jiān)控。

ec50測定

穩(wěn)定表達gα15、以及mrgprb2或mrgprx2的hek293細胞以4x10⁴細胞每孔置于96孔板中，并孵化過夜。第二天，移除培養(yǎng)基并使用來自fliprcalcium5試驗試劑盒(分子器件公司(moleculardevices))的成像溶液替換，根據(jù)制造商的建議在漢克平衡鹽溶液(hank’sbalancedsaltsolution,hbss)中使用20mmhepes(ph7.4)稀釋。細胞在37℃孵化60分鐘，在室溫下恢復15分鐘后，在flexstation3(moleculardevices)中成像。根據(jù)制造商的說明對孔成像120秒，且在成像開始后，以增加的3x濃度加入50μl測試物質(zhì)，加入時間為30秒。通過從最大信號減去最小信號而測定響應。以兩孔的平行實驗來測試物質(zhì)，將信號平均，對于每一次試驗，通過歸一至該試驗中該物質(zhì)的峰值響應而測定ec50。將全部藥物溶解于hbss+hepes溶液中，且由于溶解度問題的免責條款如下：將醋酸西曲瑞克溶解于含有2.5mmcacl2和0.6mmmgcl2的鹽水中；且將除氧氟沙星外的氟喹諾酮溶解于相同的溶液中，但使用hcl將ph調(diào)節(jié)至3.5；氧氟沙星需要100μg/ml的乳酸才能完全溶解。肽有時在凍融循環(huán)后損失效能，因此大多數(shù)肽直接從凍干原料制備。

腹膜肥大細胞純化和成像

通過吸入co2犧牲2至5個月大的成年雄性和雌性鼠。使用總計12ml的冰冷的肥大細胞解離介質(zhì)(mcdm；具有3％胎牛血清和10mmhepes的hbss，ph7.2)進行兩次連續(xù)的腹膜灌洗，合并灌洗液，細胞以200g旋轉(zhuǎn)沉降。來自每一鼠的小樣再次懸浮于2ml的mcdm中，在4ml的等張70％珀可懸浮液(percollsuspension)(2.8mlpercoll、320μl10xhbss、40μl1mhepes、830μlmcdm)上分層，在4℃以500g旋轉(zhuǎn)沉降20分鐘?；厥赵撔又械姆蚀蠹毎?。純度為>95％，通過親和素染色并通過形態(tài)學測定。肥大細胞以5x10⁵至1x10⁶細胞/ml再次懸浮于具有10％胎牛血清和25ng/ml重組鼠干細胞因子(sigma)的dmem中，并置于涂覆有30μg/ml纖連蛋白(sigma)的玻璃蓋板上。對于計數(shù)，替代該放置，將所懸浮的肥大細胞以1/10稀釋，并通過在cytospin(thermoscientific)上于4℃以1000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘而固定在載玻片上。

對于成像，在37℃、5％co2中孵化2小時后，以fluo-4和0.02％pluronicf-127一起于室溫浸泡肥大細胞30分鐘，在cib中洗滌3次，立即用于成像。細胞下浸泡2小時內(nèi)使用。若[ca²⁺]i升高至少50％且持續(xù)至少10秒，則鑒別細胞響應，其清楚地區(qū)分配體誘導的響應與隨機閃爍事件。通過取小鼠中每個細胞的平均響應來計算平均蹤跡，并取該等平均蹤跡的平均值。

bac轉(zhuǎn)基因鼠生成

bac克隆rp23-65i23從兒童醫(yī)院奧克蘭研究中心(children'shospitaloaklandresearchinstitute)購買。這一克隆含有mrgprb2基因座，約60kb的5’基因組序列和超過100kb的3’基因組序列。使用細菌的重組工程來誘發(fā)egfp-cre和緊鄰mrgprb2啟動密碼子之后的polya信號(metcalfe,d.d.,baram,d.&mekori,y.a.mastcells.physiologicalreviews77,1033-1079(1997))。該bac使用noti(newenglandbiolabs)進行線性化，并注射入來自單細胞受精原核c57bl/6卵的原核中。將卵移植入假孕雌性體內(nèi)。構(gòu)建三個bac鼠系。盡管鼠已經(jīng)處于c57bl/6背景中，在實驗之前，它們是c57bl/6背景中wt和荷tdtomato鼠的至少第四代后代。bac鼠與從杰克遜實驗室(jacksonlabs)購買的用于成像的rosa26tdtomato鼠交配。因為tdtomato信號一般是異種的且在雜合鼠體內(nèi)弱，圖1的實驗使用rosa26tdtomato的鼠純合子。在61℃退火下運行bac鼠的基因型分型反應，且引物為：正向，tatatcatggccgacaagca；反向，cagaccgcgcgcctgaaga。兩種引物均處于egfp-cre閱讀框架內(nèi)，但通過先前定序核實整個基因和mrgprb2基因座中的正確布置。

mrgprb2突變鼠生成

以mrgprb2為靶向的編碼鋅指核酸酶mrna是從sigma購買的。結(jié)合位點為gttcctgggcatccg(seqidno:52)和tgcacacgaatgccttcactg(seqidno:53)，分別與mrgprb2開放閱讀框架的堿基180至194和196至216相對應。將mrna于具有0.25mmedta的1mmtris–hcl緩沖液(ph7.4)中稀釋為2ng/ml，并注射入c57bl/6種中單細胞受精卵的原核內(nèi)。未觀察到毒性的明顯征兆。胚胎植入假孕雌性體內(nèi)。位于結(jié)合位點側(cè)翼的dna從始祖鼠放大，并使用cel-1試驗試劑盒(transgenomics)根據(jù)制造商建議進行突變篩選。通過dna定于鑒別并證實，首次28只鼠中的3只攜帶小突變，未進行詳細篩選。除了本研究中使用的4bp突變之外，鑒別出一只攜帶1bp基因缺失，另一只攜帶2bp基因缺失。

野生型和mrgprb2^mut鼠基因型分型

用于野生型鼠的引物為ggttcctgggcatccgtat(seqidno:54)和ggttcctgggcatccgtat(seqidno:55)，該反應在62.8℃的退火溫度下運行。

用于mrgprb2^mut鼠的引物為gttcctgggcatccgcac(seqidno:56)和cttccgcctgaaccttcggt(seqidno:57)，該反應在64.0℃退火溫度下運行。

組織的親和素標記

使用戊巴比妥麻醉最高8月齡的成年雄性和雌性鼠，并灌注20ml0.1mpbs(ph7.4，4℃)，之后灌注25ml固定劑(4％甲醛(vol/vol)，4℃)。從經(jīng)灌注的鼠解剖獲取心臟、氣管和皮膚切片。組織在固定劑中在4℃進一步固定過夜。當僅需要皮膚切片作為組織樣本時，通過吸入co²令鼠窒息后，直接切割皮膚并將其置于固定劑中，省略灌注步驟。組織于20％蔗糖(wt/vol)中冷保護超過24h，并使用低溫恒溫器切片(20μm寬)。將載玻片上的切片在37℃干燥30min，并使用4％多聚甲醛在21至23℃固定10分鐘。將載玻片在封閉溶液(10％正常山羊血清(vol/vol)、0.2％tritonx-100(vol/vol)與pbs中，ph7.4)中于21至23℃預孵化1或2h，隨后使用1/500fitc-親和素(sigma)或若丹明-親和素(vectorlabs)孵化45分鐘。切片使用水或pbs洗滌三次，加入一滴fluoromountg(southernbiotech)，之后將蓋玻片置于頂部。檢查腔室附近的心臟肥大細胞，因為該處的肥大細胞密度比該組織中其它處高得多；觀察到非常少量的包埋在肌肉內(nèi)的親和素陽性、tdtomato陰性的細胞，但其身份不明確。

對于腹膜肥大細胞的親和素標記，如所揭示的將細胞置于肥大細胞純化切片中，以4％多聚甲醛在21至23℃固定10min，以1/1000親和素在pbs中于21至23℃孵化30分鐘，以pbs洗滌后立即成像。

胃切片免疫細胞化學

使用戊巴比妥麻醉最高8月齡的成年雄性和雌性鼠，并灌注20ml0.1mpbs(ph7.4，4℃)，之后灌注25ml固定劑(4％甲醛(vol/vol)，4℃)。移除胃部，徹底洗滌，在4％甲醛中進一步固化2小時，通過在30％蔗糖溶液中孵化48小時而將其準備切片。將組織樣本安裝在冷包埋接著中并冷凍，使用低溫恒為其作成14μm切片，并隨后固定于載玻片上。載玻片使用0.2％tritonx-100pbs溶液洗滌，在10％正常山羊血清溶液中孵化1小時，隨后使用大鼠單克隆抗小鼠mcpt1(單克隆抗體rf6.1，ebiosciences)在0.2％triton/1％正常山羊血清溶液中的1:20稀釋液在4℃孵化過夜。載玻片使用0.2％triton溶液洗滌，并于室溫在triton溶液中使用羊抗鼠iggalexafluor488共軛的抗體(lifetechnologies)的1:500稀釋液孵化2小時。載玻片在pbs中洗滌，之后加上蓋玻片和抗褪色溶液并進行成像。

外周白血球制備

通過使用含有pbs和30單位/ml肝素及5mmedta的針筒經(jīng)由心臟穿刺從mrgprb2-tdtomato鼠收集血液，以相同溶液進行1:1稀釋，冷卻至室溫，之后在15ml錐形管中于6ml的histopaque-1119溶液上分層。試管以700g離心30分鐘，在pbs與histopaque溶液之間的界面處收集白血球。細胞以pbs洗滌，并以500g旋轉(zhuǎn)沉降10分鐘，重復總計三次。將細胞以600rpm在cytospin4(thermoscientific)中的涂覆有聚賴氨酸的載玻片上旋涂3至5分鐘，在37℃加熱塊上干燥過夜，使用在pbs中稀釋為0.5μg/ml的hoechst33342孵化2分鐘，之后，使用抗褪色溶液安裝蓋玻片。平行實驗中，也使用hoechst33342將細胞在懸浮液中染色，旋轉(zhuǎn)沉降細胞，將再次懸浮的細胞直接在pbs/抗褪色溶液中混合，之后直接置于載玻片上，并將蓋玻片裝在該懸浮液上。在使用任何方法的制劑中，均未見tdtomato陽性的細胞。

組織組胺釋放研究

切割從剃毛的最高6月齡雄性和雌性鼠的腹部分離的全氣管或皮膚碎片(4至8mg濕重)，并清除結(jié)締組織。在充氧的krebs碳酸氫鹽緩沖溶液(37℃)中孵化60分鐘后，使用載劑或化合物48/80處理該組織30min。保存上清溶液用于組胺分析。隨后，該組織于37℃水浴中以8％高氯酸處理15分鐘，以獲得總組胺含量。通過先前揭示的自動化熒光測定技術(shù)²測定組胺。

氣管收縮

如先前揭示的進行器官收縮(lagunoff,d.,martin,t.w.&read,g.agentsthatreleasehistaminefrommastcells.annualreviewofpharmacologyandtoxicology23,331-351)。對于過敏原(卵白蛋白，ova)響應，通過以2天的間隔注射三次，每次注射0.2ml的ova溶液(3.75μg/ml)與al(oh)3的混合物，將鼠激活敏化。在首次注射2周后，在8至12周齡的雄性和雌性動物身上進行實驗。將清除結(jié)締組織和氣管環(huán)的氣管(整體或側(cè)向分為兩半)懸浮在兩個鎢制鐙形物之間的10ml器官腔室中，填充加熱至37℃并使用95％o2-5％co2鼓泡以維持ph7.4的krebs。一個鐙形物連接應變儀(型號ft03；grassinstruments,quincy,ma)，在grassmodel7多種波動描記器(grassinstruments,quincy,ma)上記錄張力。令制劑承受0.2g的靜止張力，并使用新鮮的krebs緩沖液以15分鐘間隔在60分鐘平衡期間洗滌。平衡后，令氣管挑戰(zhàn)ova(10μg/ml)或化合物48/80。在每一實驗結(jié)束時，使用碳酰膽堿(carbachol)(1μm)令全部氣管最大收縮。全部結(jié)果都表達為最大收縮的百分比。

后足腫脹和外溢

通過腹膜注射50mg/kg戊巴比妥(sigma)麻醉最高8月齡的成年雄性鼠。麻醉誘導15分鐘后，向鼠靜脈注射50μl的12.5mg/ml溶解在鹽水中伊文思藍(sigma)。5分鐘后，通過足底注射將5μl的測試物質(zhì)(或7μl的抗ige)給藥至一足，并將鹽水給藥至另一足。注射后立即通過卡尺測量足厚度。15分鐘后(抗ige為30分鐘后)，再次測量足厚度，并通過斬首犧牲鼠。收集足組織，在50℃干燥24小時，稱重。通過在甲酰胺中于50℃孵化24小時而萃取伊文思藍，使用分光光度計在620nm讀取o.d.。對于使用酮替芬的研究，在注射戊巴比妥的同時，向小鼠腹膜注射25μl的10mg/ml酮替芬溶液。

全身性過敏性反應試驗

為了最小化壓力，在注射前一天，將動物運輸至實施該過程的區(qū)域。將最高8月齡的成年雄性和雌性鼠(25至35克)從籠子中移除后，立即進行80μg溶解于鹽水中的普萘洛爾(2mg/ml)的腹膜給藥，隨后放回它們的籠子中放置30分鐘，再進行靜脈注射。一次對一只鼠實施靜脈注射。對于每次注射，將一只鼠置于運輸箱中，并帶入沒有其它鼠的房間，以最小化注射過程中來自叫聲的壓力。隨后將該鼠放入限制器中，在限制其行動4分鐘內(nèi)實施注射，這是因為，觀察到更長的限制時間影響身體核心溫度，而這一影響與注射無關(guān)。通過使用100％乙醇浸漬的紙巾重復擦拭而令尾靜脈擴張，之后使用配有30.5計量針的0.25mlhamilton注射器(bdbiosciences)注射環(huán)丙沙星。僅當滿足下列全部條件時才認為注射成功：插針后注射器內(nèi)出現(xiàn)血液、注射后全部尾靜脈可見、撤針后該鼠的注射位點輕微出血。用藥簽擦拭注射位點直至停止流血，將鼠放入與其飼養(yǎng)籠分離的籠子中，一籠一鼠，并返回其被帶出的房間。對于每一實驗對話期，使用至少一只野生型鼠和一只突變鼠。使用直腸溫度計測量身體核心溫度。

鼠腹膜肥大細胞組胺釋放試驗

如鈣成像試驗中一樣純化肥大細胞，令其在具有5％co2的37℃孵化器中在具有10％fbs和25ng/ml鼠干細胞因子的dmem中恢復2小時。隨后，細胞旋轉(zhuǎn)沉降，再次懸浮于cib中，計數(shù)，以300細胞/孔置于涂覆有20μg/ml纖連蛋白(sigma)的96孔板中，每孔具有75μlcib。令它們在37℃通風條件(即，co2水平未調(diào)節(jié))下粘附基板45分鐘，再進行試驗。對于該試驗，將細胞移至室溫，加入75μl的2x濃度的測試物質(zhì)(除環(huán)丙沙星外全部溶解于cib中，環(huán)丙沙星溶解在ph3.5的含有2.5mmcacl2和0.6mmmgcl2的鹽水中)。5分鐘后，吸取40μl上清液，以40μlcib稀釋，在-80℃冷凍，直至測定組胺水平?？筰ge處理類似，但在加入抗ige之后且吸取上清液之前，將細胞在37℃孵化30分鐘。使用htrf組胺試驗試劑盒(cisbioassays)根據(jù)制造商的使用說明書測定組胺含量。

人類肥大細胞培養(yǎng)

在以2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素、和100ng/ml重組人干細胞因子(peprotech)補充的stempro-34sfm培養(yǎng)基(lifetechnologies)中，培養(yǎng)lad2(laboratoryofallergicdiseases2)人肥大細胞。將該細胞懸浮液以0.1×10⁶細胞/ml的密度接種，并在37℃和5％co2下維持，通過流式細胞儀周期性測試cd117和fcεri的表達。每周以新鮮培養(yǎng)基半替換該細胞培養(yǎng)基。

lad2脫粒試驗

使用0.5μg/ml生物素共軛的人ige(abbiotec)敏化lad2細胞20小時。洗滌細胞，再次以每孔0.025×10⁶懸浮于hepes緩沖液(10mmhepes、137mmnacl、2.7mmkcl、0.38mmna2hpo4.7h2o、5.6mm葡萄糖、1.8mmcacl2.h2o、1.3mmmgso4.7h2o、0.4％bsa，ph7.4)中，隨后以0.1μg/ml鏈霉親和素(lifetechnologies)或其它激動劑以所標注的濃度在37℃/5％co2下刺激30分鐘。通過對硝基苯基n-乙?；?β-d-葡糖酰胺(sigma-aldrich)在37℃的0.1m檸檬酸鈉緩沖液(ph4.5)中水解90分鐘，將釋放復該上清液和細胞裂解液中的β-氨基己糖苷酶定量。將所釋放的β-氨基己糖苷酶的百分比計算為總含量的百分比。所測試的激動劑為化合物48/80、黃蜂毒素、艾替班特、阿曲庫銨苯磺酸鹽、和鹽酸環(huán)丙沙星。

eia和elisa

使用培養(yǎng)基洗滌lad2細胞，以每孔0.25×10⁶細胞懸浮，并以化合物48/80、黃蜂毒素、艾替班特、阿曲庫銨或環(huán)丙沙星以所標注濃度在37℃/5％co2下孵化3至24小時。收獲無細胞的上清液，并通過eia(caymanchemical)分析所釋放的pgd2，同時使用elisa試劑盒(ebioscience)根據(jù)制造商的使用說明書定量tnf含量。pgd2的最小檢出限為55pg/ml，而tnf的最小檢出限為5.5pg/ml。

從lad2細胞釋放的組胺的測量

洗滌lad2細胞，以每孔0.1×10⁶懸浮于不含bsa的hepes緩沖液中，并以化合物48/80、黃蜂毒素、艾替班特、阿曲庫銨或環(huán)丙沙星以所標注濃度在37℃/5％co2下孵化30分鐘。制備100μg/ml的組胺(sigma-aldrich)原液，并在-20℃儲存。使用兩倍系列稀釋新鮮制備4000ng/ml至7.8ng/ml的標準工作溶液。將鄰苯二醛(opt；sigma-aldrich)溶解于無丙酮的甲醇(10mg/ml)中并于4℃黑暗中保存。將組胺標樣和無細胞的上清液(60μl)轉(zhuǎn)移至平底黑色96孔微孔板上，并與12μl的1mnaoh和3μl的opt混合。室溫中放置4分鐘后，加入6μl的3mhcl以停止組胺-opt反應。使用355nm激發(fā)濾光片和460發(fā)射濾光片測量熒光強度。

lad2細胞的sirna轉(zhuǎn)染

使用on-target加上對抗mrgprx2的smartpoolsirna和來自dharmacon的對照sirna下調(diào)mrgprx2的表達。使用培養(yǎng)基洗滌lad2細胞，以每孔0.5×10⁶細胞懸浮，并使用lipofectamine3000(lifetechnologies)根據(jù)制造商的使用說明書在37℃/5％co2下在無抗生素的stempro培養(yǎng)基中以100nmmrgprx2sirna和對照sirna轉(zhuǎn)染該細胞。在第48小時，通過逆轉(zhuǎn)錄酶pcr證實基因移除，并將該細胞用于脫粒試驗。

實施例2：mrgprb2是人mrgprx2的直系同源

哺乳動物保留了對基礎(chǔ)促分泌素的響應能力(halpern,b.n.&wood,d.r.theactionofpromethazine(phenergan)inprotectingmiceagainstdeathduetohistamine.britishjournalofpharmacologyandchemotherapy5,510-516(1950))，鳥類體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了該響應能力(taneike,t.,miyazaki,h.,oikawa,s.&ohga,a.compound48/80elicitscholinergiccontractionthroughhistaminereleaseinthechickoesophagus.generalpharmacology19,689-695(1988))，表明其機制中扮演的古老且根本的角色。多數(shù)基礎(chǔ)促分泌素是內(nèi)源性肽，一般與炎癥有關(guān)；但是，它們僅在高濃度時活化結(jié)締組織肥大細胞且不依賴于它們的典型受體，因此，必然存在另一刺激機制(ferry,x.,brehin,s.,kamel,r.&landry,y.gprotein-dependentactivationofmastcellbypeptidesandbasicsecretagogues.peptides23,1507-1515(2002))。若干結(jié)合聚陽離子性化合物的備選已經(jīng)被提議作為基礎(chǔ)促分泌素受體(ferry,x.,brehin,s.,kamel,r.&landry,y.gprotein-dependentactivationofmastcellbypeptidesandbasicsecretagogues.peptides23,1507-1515(2002)；purcell,w.m.,doyle,k.m.,westgate,c.&atterwill,c.k.characterisationofafunctionalpolyaminesiteonratmastcells:associationwithanmdareceptormacrocomplex.journalofneuroimmunology65,49-53(1996)；tatemoto,k.etal.immunoglobuline-independentactivationofmastcellismediatedbymrgreceptors.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications349,1322-1328,(2006)；sick,e.,niederhoffer,n.,takeda,k.,landry,y.&gies,j.p.activationofcd47receptorscauseshistaminesecretionfrommastcells.cellularandmolecularlifesciences:cmls66,1271-1282,(2009)。這些之中，mrgprx2已經(jīng)使用大多數(shù)化合物篩選(tatemoto,k.etal.immunoglobuline-independentactivationofmastcellismediatedbymrgreceptors.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications349,1322-1328,(2006)；robas,n.,mead,e.&fidock,m.mrgx2isahighpotencycortistatinreceptorexpressedindorsalrootganglion.thejournalofbiologicalchemistry278,44400-44404,(2003)；subramanian,h.,gupta,k.,guo,q.,price,r.&ali,h.mas-relatedgenex2(mrgx2)isanovelgprotein-coupledreceptorfortheantimicrobialpeptidell-37inhumanmastcells:resistancetoreceptorphosphorylation,desensitization,andinternalization.thejournalofbiologicalchemistry286,44739-44749,(2011)；kashem,s.w.etal.gproteincoupledreceptorspecificityforc3aandcompound48/80-induceddegranulationinhumanmastcells:rolesofmas-relatedgenesmrgx1andmrgx2.europeanjournalofpharmacology668,299-304,(2011)；subramanian,h.etal.beta-defensinsactivatehumanmastcellsviamas-relatedgenex2.journalofimmunology191,345-352,(2013)；kamohara,m.etal.identificationofmrgx2asahumang-protein-coupledreceptorforproadrenomedullinn-terminalpeptides.biochemicalandbiophysicalresearchcommunications330,1146-1152,(2005))，且sirna基因移除研究支持mrgprx2在通過四種非經(jīng)典基礎(chǔ)促分泌素活化中的至少部分角色(subramanian,h.,gupta,k.,guo,q.,price,r.&ali,h.mas-relatedgenex2(mrgx2)isanovelgprotein-coupledreceptorfortheantimicrobialpeptidell-37inhumanmastcells:resistancetoreceptorphosphorylation,desensitization,andinternalization.thejournalofbiologicalchemistry286,44739-44749,(2011)；subramanian,h.etal.beta-defensinsactivatehumanmastcellsviamas-relatedgenex2.journalofimmunology191,345-352,(2013))。但是，沒有對任何備選化合物采用直接體內(nèi)研究或基因敲除模型。在鼠體內(nèi)的mrgprx2調(diào)查研究是復雜的，蓋因含有四個人mrgprx成員的基因簇在鼠體內(nèi)劇烈擴展，由22個潛在編碼基因組成，且多數(shù)具有與mrgprx2相當?shù)男蛄幸恢滦?圖1a)。因此，鼠mrgprx2直系同源必須通過表達模式和藥理學測定。鼠初代肥大細胞中的嚴格的rt-pcr篩選揭露了用于單一家族成員mrgprb2(圖1b)的譜帶，而mrgprx1直系同源未以相關(guān)水平表達(圖5a和圖5b)。

功能上，異源地表達mrgprb2的hek293細胞(mrgprb2-hek)響應mrgprx2激動劑pamp(9-20)14(圖1c)和化合物48/80(48/80)，經(jīng)典肥大細胞活化劑和經(jīng)典基礎(chǔ)促分泌素(圖6a、圖6b、及圖6c)。mrgprb2-hek細胞也響應其它mrgprx2配體，包括該經(jīng)典促分泌素物質(zhì)p，但不響應mrgprx1配體氯喹(cq)(liu,q.etal.sensoryneuron-specificgpcrmrgprsareitchreceptorsmediatingchloroquine-inducedpruritus.cell139,1353-1365,(2009))；鼠體內(nèi)緊密相關(guān)的家族成員無一響應任何化合物(圖5c、圖6a、及圖6c)。為了測定mrgprb2的表達，生成mrgprb2bac轉(zhuǎn)基因鼠，該轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)egfp-cre重組酶的表達處于mrgprb2啟動子的控制之下。明顯地，cre表達模式表明，mrgprb2表達對于結(jié)締組織肥大細胞是高度特異性的(圖1d、圖7、圖8a、及圖8b)。同時，藥理學和表達數(shù)據(jù)表明，mrgprb2是mrgprx2的鼠直系同源。

實施例3：mrgprb2是鼠肥大細胞基礎(chǔ)促分泌素受體

然后，測定mrgprb2是否為鼠肥大細胞內(nèi)的基礎(chǔ)促分泌素受體。mrgprb2基因組基因座含有太多重復序列以透過同源重組而允許基因靶向(圖9a)。因此，使用基于鋅指核酸酶的策略來生成在mrgprb2編碼區(qū)缺失4對堿基對的鼠系(mrgprb2^mut鼠)，隨即在第一跨膜域后獲得框架位移突變和早期結(jié)束(圖9b、圖9c、及圖9d)。該突變穩(wěn)定且可遺傳(圖9c)，因此mrgprb2^mut被認為是功能上無效。肥大細胞數(shù)目與野生型(wt)和mrgprb2^mut鼠組織內(nèi)的相當，表明mrgprb2對于肥大細胞存活或以組織為靶向不是必需的(圖10a)。腹膜肥大細胞對于抗ige抗體(圖2a)和內(nèi)皮素(圖11a、圖11b、及圖11c)的響應能力也是相當?shù)模f明mrgprb2突變并不在全局上損害ige或gpcr介導的肥大細胞信號傳導。但是，48/80誘發(fā)的肥大細胞活化(圖2a)和組織組胺釋放本質(zhì)上在突變肥大細胞中被摧毀(圖2b和圖10b)。再者，48/80引發(fā)的器官收縮(圖2c)和后足發(fā)炎(外溢和腫脹；圖2d)在mrgprb2^mut背景下幾乎完全不存在，而抗原(圖2c)和抗ige引發(fā)的響應(圖12a和圖12b)與wt鼠相當。最后，四種額外的基礎(chǔ)促分泌素，以及mrgprx2激動劑pamp(9-20)和皮質(zhì)抑素(robas,n.,mead,e.&fidock,m.mrgx2isahighpotencycortistatinreceptorexpressedindorsalrootganglion.thejournalofbiologicalchemistry278,44400-44404,doi:10.1074/jbc.m302456200(2003))，強烈活化wt但不活化mrgprb2^mut肥大細胞(圖2e；圖13a)。表達mrgprb2或mrgprx2的hek293細胞(mrgprx2-hek)也響應這些促分泌素(圖6a和圖6b)。合起來推斷，mrgprb2是鼠肥大細胞基礎(chǔ)促分泌素受體。活化mrgprb2的小的、基礎(chǔ)的肽的列舉很可能大于本研究中的數(shù)目；實際上，數(shù)十種此類肽已經(jīng)顯示活化肥大細胞(lagunoff,d.,martin,t.w.&read,g.agentsthatreleasehistaminefrommastcells.annualreviewofpharmacologyandtoxicology23,331-351,doi:10.1146/annurev.pa.23.040183.001555(1983)；ferry,x.,brehin,s.,kamel,r.&landry,y.gprotein-dependentactivationofmastcellbypeptidesandbasicsecretagogues.peptides23,1507-1515(2002)；mousli,m.,hugli,t.e.,landry,y.&bronner,c.peptidergicpathwayinhumanskinandratperitonealmastcellactivation.immunopharmacology27,1-11(1994)；pundir,p.&kulka,m.theroleofgprotein-coupledreceptorsinmastcellactivationbyantimicrobialpeptides:isthereaconnection？immunologyandcellbiology88,632-640,doi:10.1038/icb.2010.27(2010))。值得注意的是，人mrgprx2對物質(zhì)p的敏感度比鼠mrgprb2強得多(圖6c)，暗示在肥大細胞信號傳導中對于物質(zhì)p的潛在特異-特異性角色。

考慮到mrgprb2活化需要微摩爾濃度的這些肽，這一信號傳導時間可能出現(xiàn)在何處仍不明晰。但是，肥大細胞存在于類似胰腺和腎上腺等粉末大量小的陽離子性肽的器官中，可以想象鄰近釋放位點處的濃度達到這些水平。本文中揭示對mrgprb2具有高親和性的內(nèi)源性配體。內(nèi)源性mrgprb2和mrgprx2配體的鑒別顯著有助于理解肥大細胞如何與處于疾病狀態(tài)中的其它類型的細胞反應。

實施例4：mrgprb2介導肥大細胞響應能力和肽能治療藥物的副作用

肥大細胞在過敏和假性過敏(即，非ige依賴性)反應中的關(guān)鍵角色表明，需要進行證明mrgprx2是否為這些事件中的因子的實驗。因為多數(shù)治療性藥物時陽離子性的，因此處理藥物誘發(fā)的反應。藥物誘發(fā)的不良反應中高達15％在實際上表現(xiàn)為過敏；但是，多數(shù)并未與ige抗體滴度良好地一一關(guān)聯(lián)，表明非抗體依賴性或假性過敏機制的參與(hausmann,o.,schnyder,b.&pichler,w.j.etiologyandpathogenesisofadversedrugreactions.chemicalimmunologyandallergy97,32-46,doi:10.1159/000335614(2012))。

首先，分析肽能藥物，因為大多數(shù)是經(jīng)皮下或經(jīng)肌肉以微摩爾濃度引入(圖15)，而該濃度足以令陽離子性肽活化肥大細胞。這些藥物在fda分類標記中揭示的最常發(fā)生的過敏型響應是注射位點反應(isr)，一種可伴隨疼痛或瘙癢的可見尺寸的局部腫脹及/或潮紅。在對fda許可的肽能藥物的調(diào)查中，與isr相關(guān)的肽能藥物絕大多數(shù)都是陽離子性的(圖15)。全部常見的可商購類別的這些陽離子性藥物的代表性成員以mrgprb2依賴的方式活化肥大細胞，而無害蛋白質(zhì)胰島素沒有效果(圖3a、圖13b、及圖13c)。除了胰島素之外，這些肽始終活化mrgprb2-hek細胞和mrgprx2-hek細胞(圖6a、圖6b、及圖6c)。選擇藥物艾替班特進行進一步研究，因為該藥物幾乎在每一患者體內(nèi)均誘發(fā)isr(lumry,w.r.etal.randomizedplacebo-controlledtrialofthebradykininb(2)receptorantagonisticatibantforthetreatmentofacuteattacksofhereditaryangioedema:thefast-3trial.annalsofallergy,asthma&immunology:officialpublicationoftheamericancollegeofallergy,asthma,&immunology107,529-537,(2011))。臨床濃度的艾替班特在wt鼠體內(nèi)誘發(fā)類似于人isr的廣泛的外溢和腫脹，但在mrgprb2^mut鼠體內(nèi)無此效果(圖3b)。預先以肥大細胞穩(wěn)定劑酮替芬治療的鼠也未顯示發(fā)炎(未經(jīng)酮替芬治療：足厚度增加40.7±2.1％；經(jīng)酮替芬治療：增加3.1±0.6％；各自n＝4；p＝2.2e-6)，強烈表明，肥大細胞介導該炎癥。此外，艾替班特(以及陽性對照48/80和黃蜂毒素)誘發(fā)了來自wt腹膜肥大細胞的組胺釋放，而mrgprb2^mut肥大細胞的釋放大幅度低于前者(圖3c)。但是，ige介導的組胺釋放未受到mrgprb2缺失的影響(圖3c)。這些數(shù)據(jù)指出，藥物誘發(fā)的isr可通過以mrgprx2為靶向而減輕或使用具有較低潛在mrgprx2激動劑性質(zhì)的肽而減輕。

實施例5：mrgprb2介導肥大細胞的響應能力和小分子治療性藥物的副作用

之后，探究mrgprb2介導由小分子誘發(fā)的假性過敏反應的可能性。關(guān)注點在于靜脈施加藥物，因為該藥物一般以高劑量快速給藥，因此比通過其它途徑給藥的藥物更可能實現(xiàn)高血藥濃度和快速的組織分布。靜脈給藥后假性過敏反應的癥狀包括皮膚發(fā)紅或皮疹、血壓或心率變化、以及支氣管痙攣，且該癥狀的最嚴重者稱為中毒反應(anaphylactoid)(nel,l.&eren,e.peri-operativeanaphylaxis.britishjournalofclinicalpharmacology71,647-658,doi:10.1111/j.1365-2125.2011.03913.x(2011))。初始研究是基于48/80的結(jié)構(gòu)。而48/80作為mrgprx2激動劑的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系未知，含有四氫異喹啉(thiq)結(jié)構(gòu)組元的環(huán)化變體(圖4a)作為肥大細胞脫粒的潛能比48/80高七倍(read,g.w.compound48-80.structure-activityrelationsandpoly-thiq,anew,morepotentanalog.journalofmedicinalchemistry16,1292-1295(1973))。對于fda許可的含thiq藥物的研究起獲了煙堿受體拮抗劑非甾體神經(jīng)肌肉阻斷藥物(nmbd)的成員，包括筒箭毒堿和阿曲庫銨(圖4b)。nmbd通常用于外科手術(shù)中，以減少不希望的肌肉移動并允許進行氣管內(nèi)插管用于機械通氣。有趣的是，單獨使用nmbd可對手術(shù)過程中近乎60％的過敏反應產(chǎn)生響應(mertes,p.m.,alla,f.,trechot,p.,auroy,y.&jougla,e.anaphylaxisduringanesthesiainfrance:an8-yearnationalsurvey.jallergyclinimmunol128,366-373(2011))，且除琥珀酰膽堿外全部在人體內(nèi)誘發(fā)組胺的釋放(koppert,w.etal.differentpatternsofmastcellactivationbymusclerelaxantsinhumanskin.anesthesiology95,659-667(2001))。如圖16所示，除琥珀酰膽堿外的nmbd家族的全部成員均以mrgprb2依賴模式在低至臨床注射濃度的0.5％的濃度下活化肥大細胞(圖4c和圖13d)。有趣的是，羅庫溴銨并不含thiq，但具有大體積的疏水基且該疏水基的幾埃距離內(nèi)具有帶電的氮(圖4b)，令人想到48/80。因此，使用thiq結(jié)構(gòu)組元和該48/80結(jié)構(gòu)的改性實施研究，該改性包括環(huán)化的改變和該陽性或極性氮的位置的改變，將該試驗限制為高注射濃度的靜脈給藥的藥物。氟喹諾酮家族的抗生素被鑒別為具有相似的結(jié)構(gòu)組元(圖4d)。與nmbd相似，這些與過敏型反應相關(guān)聯(lián)(kelesidis,t.,fleisher,j.&tsiodras,s.anaphylactoidreactionconsideredciprofloxacinrelated:acasereportandliteraturereview.clinther32,515-526(2010)；blanca-lopez,n.etal.hypersensitivityreactionstofluoroquinolones:analysisofthefactorsinvolved.clinexpallergy43,560-567(2013))且可活化肥大細胞(mori,k.,maru,c.&takasuna,k.characterizationofhistaminereleaseinducedbyfluoroquinoloneantibacterialagentsin-vivoandin-vitro.thejournalofpharmacyandpharmacology52,577-584(2000)；mori,k.,maru,c.,takasuna,k.&furuhama,k.mechanismofhistaminereleaseinducedbylevofloxacin,afluoroquinoloneantibacterialagent.europeanjournalofpharmacology394,51-55(2000))。該四個成員被批準用于靜脈用途，以mrgprb2依賴方式活化mrgprb2-hek細胞和mrgprx2-hek細胞(圖6a、圖6b、及圖6c)以及肥大細胞(圖4e；圖13c)。相應地，阿曲庫銨和環(huán)丙沙星誘發(fā)wt腹膜肥大細胞中的組胺釋放，且實質(zhì)上減少mrgprb2^mut肥大細胞中的該釋放(圖3c)。選擇環(huán)丙沙星用于過敏性反應的體內(nèi)測試，該過敏性反應在鼠體內(nèi)最常通過體溫下降來測試，該體溫下降很可能是由血壓改變和周邊血管擴張造成的(doyle,e.,trosien,j.&metz,m.protocolsfortheinductionandevaluationofsystemicanaphylaxisinmice.methodsinmolecularbiology1032,133-138,doi:10.1007/978-1-62703-496-8_10(2013))。與其它實驗有機體相反，嚙齒動物幾乎在全身性水平上對組胺毒性免疫(halpern,b.n.&wood,d.r.theactionofpromethazine(phenergan)inprotectingmiceagainstdeathduetohistamine.britishjournalofpharmacologyandchemotherapy5,510-516(1950))，但可能對肥大細胞活化劑和使用β-腎上腺素能阻斷劑預治療的分泌產(chǎn)物敏感(bergman,r.k.&munoz,j.efficacyofbeta-adrenergicblockingagentsininducinghistaminesensitivityinmice.nature217,1173-1174(1968)；matsumura,y.,tan,e.m.&vaughan,j.h.hypersensitivitytohistamineandsystemicanaphylaxisinmicewithpharmacologicbetaadrenergicblockade:protectionbynucleotides.jallergyclinimmunol58,387-394(1976))。這些條件下，高劑量的環(huán)丙沙星誘發(fā)了體溫的快速下降且恢復非常慢，而mrgprb2^mut鼠顯示小得多的下降幅度且迅速恢復(圖4f)。這些結(jié)果確認，通過mrgprb2實現(xiàn)的肥大細胞活化是氟喹諾酮和其它藥物的脫靶效應，且人體內(nèi)的相應mrgprx2活化可能是使用這些藥物可見的大多數(shù)假性過敏響應的基礎(chǔ)。

實施例6：與假性過敏相關(guān)的藥物通過mrgprx2活化人肥大細胞

最后，測定藥物是否與通過mrgprx2活化人肥大細胞造成的假性過敏有關(guān)。每一類所檢查藥物的代表性成員均引發(fā)了組胺、tnf、pgd2、和β-氨基己糖苷酶從lad2細胞的釋放(圖14a)。使用48/80和黃蜂毒素作為陽性對照。重要的是，與經(jīng)對照sirna處理的細胞相比，經(jīng)mrgprx2sirna處理的lad2細胞展現(xiàn)了顯著低于通過這些物質(zhì)引發(fā)的β-氨基己糖苷酶釋放，而ige介導的釋放則相當(圖14b)。在經(jīng)mrgprx2sirna處理的細胞中觀察到的釋放很可能是由于mrna及/或蛋白質(zhì)的不完全基因移除。

如上所述，鼠體內(nèi)的mrgprb2和人體內(nèi)的mrgprx2，是肥大細胞內(nèi)的基礎(chǔ)促分泌素受體。本文中也揭示首次獲知的這些受體的體內(nèi)角色的證據(jù)，該證據(jù)表明，這些受體是非ige依賴性藥物誘發(fā)的假性過敏的關(guān)鍵中介物。因此，由于兩個原因，對于mrgprx2在藥物誘發(fā)的假性過敏中所扮演角色的認知擴展。首先，配體結(jié)合需求研究是的對于交叉活化mrgprx2的藥物的更特異性篩選稱為可能。其次，由于經(jīng)口給藥的藥物的副作用一般包括胃腸道問題和頭痛，而這兩種癥狀均與肥大細胞有關(guān)，因此，篩選經(jīng)口給藥的藥物發(fā)現(xiàn)了更多的mrgprx2配體。

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其它具體實施例

盡管本發(fā)明已經(jīng)連同其詳細說明書一起予以揭示，前述說明書傾向于例示性說明而非限制本發(fā)明范疇，本發(fā)明的范疇由權(quán)利要求書的范疇所界定。其它方面、優(yōu)點和修飾處于權(quán)利要求書的范疇內(nèi)。

本文中指代的專利和科技文獻構(gòu)建該領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的知識。本文中引述的全部美國專利和已公開或未公開的美國專利申請案通過引用而并入本文。本文中引述的全部已公開的外國專利和專利申請案通過引用而并入本文。由本文中引述的保藏號表示的genbank和ncbi保藏物通過引用而并入本文。本文中引述的全部其它已出版的參考文獻、文檔、手稿和科學文獻通過引用而并入本文。

盡管已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選具體實施例對本發(fā)明進行特定顯示和揭示，但該領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，可對本發(fā)明內(nèi)容的形式和細節(jié)作出各種改變而不悖離由權(quán)利要求書所涵蓋的本發(fā)明范疇。