本發(fā)明涉及具有抗真菌活性的化合物，具體的說(shuō)，涉及一種從放線菌streptomycesalbolongus發(fā)酵液中提取得到的抗真菌活性的新化合物及其在治療真菌感染疾病中的用途，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)隨著免疫功能低下而被真菌感染的人群數(shù)量不斷增加，尤其是深部真菌感染發(fā)病率的大幅上升，抗真菌藥物研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前抗真菌藥物主要為咪唑類（如酮康唑）和多烯類（如兩性霉素b），它們對(duì)人體均有嚴(yán)重的毒副作用。同時(shí)，臨床上耐藥病原菌的不斷出現(xiàn)，使發(fā)現(xiàn)新型高效低毒抗真菌藥物成為當(dāng)務(wù)之急。

念珠菌(candida)又稱假絲酵母菌，為條件致病性真菌。在機(jī)體免疫功能低下時(shí)，可引起皮膚黏膜念珠菌病、陰道念珠菌病等。另外，在深部真菌感染病人中，念珠菌已成為第四位最常見醫(yī)院內(nèi)血液感染的致病菌，死亡率高達(dá)40％。對(duì)人類致病的念珠菌中白色念珠菌(candidaalbicans)和近平滑念珠菌(candidaparapsilosis)臨床分離率較高。

新型隱球菌(cryptococcusneoformans)屬于隱球菌屬，是一種臨床重要條件致病真菌，可以引起致死性新型隱球菌性腦膜炎。近年來(lái)新型隱球菌感染發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，突出表現(xiàn)在艾滋病人群中，己成為艾滋病患者死亡的首要原因。

放線菌是藥物發(fā)現(xiàn)的重要資源，臨床治療和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的抗生素大約其中75%來(lái)源于放線菌。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究從來(lái)自大象(elephasmaximus)糞便中分離得到的放線菌streptomycesalbolongus發(fā)酵液中分離得到一種抗真菌活性新化合物。同時(shí)，抗真菌實(shí)驗(yàn)顯示，該化合物對(duì)條件致病真菌白色念珠菌、近平滑念珠菌和新型隱球菌顯示了較好的抗真菌活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人從放線菌streptomycesalbolongus發(fā)酵液中分離得到一種新化合物i，命名為(1β,4β,4aβ,8aα)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,4a(2h)-diol，并對(duì)此進(jìn)行了深入地研究，證明該化合物可以用于預(yù)防和治療真菌感染性疾病，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種如結(jié)構(gòu)i所示抗真菌活性新化合物i。

本發(fā)明的另一目的在于提供菌株streptomycesalbolongus制備化合物i的方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的化合物i在制備治療或預(yù)防真菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述的化合物i在制備治療或預(yù)防念珠菌屬和隱球菌屬真菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述的化合物i在制備治療或預(yù)防條件致病真菌白色念珠菌(c.albicans)、近平滑念珠菌(c.parapsilosis)和新型隱球菌(cryptococcusneoformans)感染藥物中的應(yīng)用。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明提供了一種化合物i的制備方法，所述方法包括：

(1)streptomycesalbolongus的種子培養(yǎng)：

種子培養(yǎng)基：酵母膏2~10g,葡萄糖2~10g,麥芽膏2~10g,1~5ml復(fù)合維生素，1~5ml微量元素，蒸餾水1l。培養(yǎng)條件：ph6.5~8.0,培養(yǎng)溫度25~32攝氏度，培養(yǎng)時(shí)間24~72小時(shí)。

(2)streptomycesalbolongus的發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉10g/l,蛋白胨2g/l,葡萄糖20g/l,可溶性淀粉5g/l,酵母膏2g/l,氯化鈉4g/l,磷酸氫二鉀0.5g/l,硫酸鎂0.5g/l,碳酸鈣2g/l。發(fā)酵培養(yǎng)條件：ph6.5~8.0,培養(yǎng)溫度25~32攝氏度，培養(yǎng)時(shí)間96~192小時(shí)。

(3)獲得粗提物：將步驟(2)獲得的發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)過(guò)大孔樹脂柱層析，先用水洗脫除去培養(yǎng)基成分，再用體積為大孔樹脂填料體積10-30倍的體積濃度為75-95%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液并進(jìn)行濃縮，得到粗提物。

(4)單體化合物分離、純化：上述步驟(3)獲得的膏狀物，采用正相硅膠柱色譜二氯甲烷-甲醇（50：1~1：1）梯度洗脫，通過(guò)薄層檢測(cè)合并含有化合物i的組分，該組分經(jīng)過(guò)進(jìn)一步sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱色譜甲醇洗脫進(jìn)行純化，薄層檢測(cè)合并含有化合物i的組分得到化合物i粗品，最后化合物i粗品經(jīng)ods反相柱層析，甲醇-水(70:30)洗脫，得到新化合物i。

根據(jù)本發(fā)明所述的方法所述的大孔樹脂可以為本領(lǐng)域常規(guī)的大孔樹脂，譬如d101，xad16等樹脂。

(5)結(jié)構(gòu)鑒定：本發(fā)明綜合應(yīng)用高分辨質(zhì)譜(hrms)、核磁共振氫譜(¹hnmr)、核磁共振碳譜(¹³cnmr)和二維核磁共振波譜(包括cosy、noesy、hsqc和hmbc譜)確定了單體化合物結(jié)構(gòu)。

另一方面，本發(fā)明還提供了所述方法制備的新化合物i。

再一方面，本發(fā)明還提供了所述的新化合物i在制備治療或預(yù)防真菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

又一方面，本發(fā)明還提供所述的化合物i在制備治療或預(yù)防條件致病真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、近平滑念珠菌(candidaparapsilosis)和新型隱球菌(cryptococcusneoformans)感染藥物中的應(yīng)用。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種抗真菌新化合物及其制備方法和應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1化合物i結(jié)構(gòu)。

圖2化合物i的高分辨質(zhì)譜。

圖3化合物i核磁共振氫譜圖¹hnmr(600mhz，dmso-d6)。

圖4化合物i核磁共振碳譜圖¹³cnmr(150mhz，dmso-d6)。

圖5化合物i的cosy譜圖。

圖6化合物i的noesy譜圖。

圖7化合物i的hsqc譜圖。

圖8化合物i的hmbc譜圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程和產(chǎn)生的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和特點(diǎn)，不作為對(duì)本案可實(shí)施范圍的限定。

實(shí)施例1

新化合物i的制備

1.1streptomycesalbolongus的種子培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)基：酵母膏0.4g,葡萄糖0.4g,麥芽膏0.5g,0.1ml復(fù)合維生素，1.0ml微量元素，蒸餾水100ml。培養(yǎng)條件：ph7.2,培養(yǎng)溫度28攝氏度，培養(yǎng)時(shí)間48小時(shí)。

1.2streptomycesalbolongus的發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉10g/l,蛋白胨2g/l,葡萄糖20g/l,可溶性淀粉5g/l,酵母膏2g/l,氯化鈉4g/l,磷酸氫二鉀0.5g/l,硫酸鎂0.5g/l,碳酸鈣2g/l，蒸餾水70l。培養(yǎng)條件：ph7.8,培養(yǎng)溫度28攝氏度，培養(yǎng)時(shí)間168小時(shí)。

1.3提取。

將步驟(2)獲得的發(fā)酵液離心，上清液經(jīng)過(guò)xad-16大孔吸附樹脂（大孔吸附樹脂體積為35l）柱層析，先用12倍填料體積的20%乙醇洗脫除去培養(yǎng)基成分，再用體積為大孔樹脂填料體積12倍的體積濃度為95%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇溶液并進(jìn)行減壓濃縮，得到粗提物。

1.4分離純化

上述步驟(3)獲得的膏狀物，甲醇溶解后與100~200目硅膠拌樣，采用200~300目硅膠干法裝柱，干法上樣。分別采用二氯甲烷甲醇（50：1，20：1，10：1，4：1）梯度洗脫，通過(guò)薄層檢測(cè)合并相同組分，得到13個(gè)組分（fr.1~13）。組分fr.3含有化合物i，該組分經(jīng)過(guò)進(jìn)一步sephadexlh-20葡聚糖凝膠柱色譜甲醇洗脫進(jìn)行純化，薄層檢測(cè)合并成6個(gè)組分(fr.3.1~fr.3.6)。組分fr.3.1主要含有化合物i，減壓蒸干后得到化合物i粗品，最后化合物i粗品經(jīng)ods反相柱層析，甲醇-水(70:30)洗脫，得到新化合物i。

1.5結(jié)構(gòu)鑒定

化合物i，為白色固體，esimsm/z221[m+na]⁺,419[2m+na]⁺;hresimsm/z221.1513[m+na]⁺(calcdforc12h22o2na,221.1518)，提示該化合物分子量為198，分子式為c12h22o2?；衔飅碳譜顯示12個(gè)碳信號(hào)，包括2個(gè)季碳信號(hào)，2個(gè)次甲基信號(hào)，6個(gè)亞甲基信號(hào)和2個(gè)甲基信號(hào)。氫譜中在化學(xué)位移δ0.70(3h,d,6.0hz)和0.89(3h,s)處給出2個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)，在化學(xué)位移δ3.27（1h,m）處給出含氧次甲基質(zhì)子信號(hào)，在化學(xué)位移δ5.38(1h,d,4.5hz)和4.75(1h,s)處給出2個(gè)活潑氫質(zhì)子信號(hào)，在氫譜中其余的質(zhì)子信號(hào)屬于6個(gè)亞甲基質(zhì)子信號(hào)。結(jié)合上述信息推測(cè)化合物i的不飽和度為2，分子中含有2個(gè)羥基基團(tuán)。通過(guò)hsqc譜歸屬了化合物碳和相應(yīng)氫的信號(hào)（見表1），結(jié)合化合物的cosy、hmbc和noesy譜確定了化合物的結(jié)構(gòu)如下：

化學(xué)名為：(1β,4β,4aβ,8aα)-4,8a-dimethyloctahydronaphthalene-1,4a(2h)-diol.

表1化合物i的¹hnmr(600mhz)和¹³cnmr(150mhz)數(shù)據(jù)（dmso-d6）

實(shí)施例2：抗真菌活性實(shí)驗(yàn)

化合物i溶于dmso中，倍比稀釋配置成9個(gè)不同濃度（22.0,11.0,5.5,2.75,1.38,0.69,0.36,0.18,0.09mg/ml）。病原菌條件致病真菌白色念珠菌(candidaalbicansatccmya-2876)、近平滑念珠菌(candidaparapsilosisatcc22019)和新型隱球菌(cryptococcusneoformansatcc208821)分別接種在rpmi-1640培養(yǎng)基(10.4gl^-1rpmi-1640,2gl^-1nahco3,34.53gl^-1mops,ph7.0)制成菌懸液，白色念珠菌（c.albicans）和近平滑念珠菌（c.parapsilosis）菌懸液濃度為2×10³cfu/ml，新生隱球菌（c.neoformans）菌懸液濃度為5×10⁴cfu/ml。樣品采用rpmi-1640培養(yǎng)基稀釋10倍，10μl的樣品和100μl的菌懸液加到96孔板中，等體積的dmso溶液作陰性對(duì)照，兩性霉素b作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果表明化合物i對(duì)白色念珠菌和近平滑念珠菌顯示較強(qiáng)的抑制活性，mic值分別為12.5和3.3μg/ml,對(duì)新型隱球菌顯示較弱的抑菌活性，mic值為200μg/ml。陽(yáng)性對(duì)照藥兩性霉素b對(duì)三株菌的mic值分別為1.0，2.0和2.0μg/ml。