本發(fā)明涉及循環(huán)核酸作為乳腺癌生物標(biāo)志物的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及循環(huán)microrna(mirna)在乳腺癌預(yù)后中的應(yīng)用；更具體而言，本發(fā)明涉及2-10個不同mirna的組合在乳腺癌預(yù)后中的應(yīng)用，包括基于所述2-10個不同mirna的組合來制備用于乳腺癌預(yù)后的試劑盒、微陣列、以及利用所述試劑盒和微陣列對乳腺癌預(yù)后進(jìn)行預(yù)測的方法。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥，占所有癌癥的23％，同時乳腺癌也是女性癌癥死亡的主要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)(globocan2012)，相比于2008年，在過去四年間，乳腺癌的全球發(fā)病率增加了20％，死亡率增加了14％。在歐美國家，女性乳腺癌年發(fā)病率為100～110/10萬。雖然中國女性乳腺癌總體年發(fā)病率為30/10萬，約為歐美國家的1/3左右，但是年死亡率與歐美國家接近。而且近10年來，中國女性乳腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，正以每年3％的速度遞增，城市乳腺癌發(fā)病率更是以每年7.5％的速度增長。同時，中國女性乳腺癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)出年輕化趨勢，發(fā)病高峰年齡為40～50歲，比西方國家提前10年，已嚴(yán)重威脅我國婦女的健康。此外，乳腺癌還是高度異質(zhì)性的疾病，主要體現(xiàn)在其具有不同的基因型、臨床特征、病理過程和對藥物不同的反應(yīng)以及生存情況。不同類型的乳腺癌病人生存有差異，不同分子型的病人的藥物反應(yīng)有差別。除不同乳腺癌病人間的異質(zhì)性體現(xiàn)外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤內(nèi)部也存在異質(zhì)性，即，來源于同一乳腺癌病人組織的不同細(xì)胞，其基因水平的變化也有很大差別。這在一定程度上能夠解釋同樣分子型病理型的乳腺癌患者接受同樣的治療但效果卻不同的現(xiàn)象；另一方面，由于乳腺癌個體的高度異質(zhì)性，臨床上同一分期和病理類型的患者，其預(yù)后及對輔助治療的反應(yīng)性可以顯著不同，表明在乳腺癌預(yù)后方面仍是任重而道遠(yuǎn)。特別地，腋淋巴結(jié)為陰性的早期乳腺癌，70％的患者無需任何輔助治療就可長期生存，但根據(jù)美國nccn(nationalcomprehensivecancernetwork)指南，超過80％-90％的早期乳腺癌患者接受了輔助治療，治療嚴(yán)重過度。因此，尋找乳腺癌高危患者來進(jìn)行針對性的輔助治療，既能延長患者的生存期，又能避免低危人群的過度治療。迄今為止，乳腺癌預(yù)后的經(jīng)典風(fēng)險因素主要依賴于組織學(xué)層面，包括腫瘤大小、分級及淋巴結(jié)狀態(tài)，這些因素的獨(dú)立預(yù)后表現(xiàn)已整合成tnm(tumor，node，metastasis)分期和npi(nottinghamprognosticindex)系統(tǒng)。然而，這些傳統(tǒng)的病理指標(biāo)具有其各自的局限性，不適宜作為病人臨床結(jié)果的預(yù)后指標(biāo)。分子水平的標(biāo)志物對于乳腺癌病人亞型的區(qū)分更有效，可能作為乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物。例如，免疫組化因子ihc4(包括er、pr、her2和ki67)對乳腺癌的治療具有指導(dǎo)意義，但這些風(fēng)險因子在區(qū)分高危和低危乳腺癌病人方面具有局限性，并且，受乳腺癌病人腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的影響，上述分子很難反映病人的特異性特征。因此，為乳腺癌尋找新型預(yù)后標(biāo)志物來對其異質(zhì)性進(jìn)行精確分類在本領(lǐng)域中存在迫切需求。就此而言，在體液中進(jìn)行的分子或細(xì)胞水平的檢測以其獨(dú)特優(yōu)勢引起人們越來越多的關(guān)注。首先，其取樣不需要腫瘤原發(fā)或轉(zhuǎn)移的組織，避免了創(chuàng)傷性取材以及在取材過程中可能導(dǎo)致的擴(kuò)散；其次，可以跟隨治療過程，進(jìn)行長期的不同時間的取樣，便于檢測藥效和腫瘤的復(fù)發(fā)等；再次，基于體液中的基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平的檢測，可能消除腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性的問題。其中，mirna為長約22nt的內(nèi)源非編碼rna。除了在正常生理過程中發(fā)揮作用外，mirna還通過調(diào)控促癌基因或抑癌基因的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的發(fā)育和增殖過程中發(fā)揮重要作用。并且，已有研究顯示mirna的差異表達(dá)能夠區(qū)分乳腺癌組織和癌旁組織，提示其可能成為新的乳腺癌診斷、預(yù)后及預(yù)測標(biāo)志物，不過，創(chuàng)傷性檢測一定程度上限制了組織mirna作為標(biāo)志物的應(yīng)用。因而，體液中的循環(huán)mirna的發(fā)現(xiàn)為乳腺癌新型無創(chuàng)標(biāo)志物的研究開創(chuàng)了新的空間。相比傳統(tǒng)的標(biāo)志物分子，體液中的循環(huán)mirna具有如下優(yōu)勢：1)更穩(wěn)定：循環(huán)mirna在血漿、血清中的穩(wěn)定性好，經(jīng)過煮沸、反復(fù)凍融、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、dna酶、rna酶等多種極端條件的處理，其含量仍保持相對穩(wěn)定；2)更敏感：研究發(fā)現(xiàn)某些mirna在疾病早期已有變化，可預(yù)示疾病的發(fā)生，而且核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展使得低豐度分子的檢測成為可能；3)更特異：mirna具有組織表達(dá)和病理過程的特異性，不同疾病有各自特異的循環(huán)mirna表達(dá)譜，而且基于堿基配對的序列特異性擴(kuò)增避免了技術(shù)上的假陽性；4)更方便：相比蛋白類標(biāo)志物檢測需要篩選和制備特異性抗體，mirna可以直接測定。不過，雖然乳腺癌相關(guān)循環(huán)mirna的研究已有一定基礎(chǔ)，但現(xiàn)有結(jié)果多集中在區(qū)分乳腺癌病人和健康人群的作用上，即循環(huán)mirna作為乳腺癌早期診斷標(biāo)志物的探討，對于循環(huán)mirna作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的研究，盡管存在少量涉及與乳腺癌病人的轉(zhuǎn)移、分子亞型等的相關(guān)性的探討，但已有的研究中樣本量較少，并且不同課題組間結(jié)果的重復(fù)性比較差。對于循環(huán)mirna與乳腺癌病人臨床結(jié)果、生存情況的研究還很少，特別是基于較大樣本進(jìn)行長時間隨訪的病人研究更是十分匱乏。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明對循環(huán)mirna作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物，特別是與復(fù)發(fā)生存的關(guān)系進(jìn)行了研究，通過與北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺癌預(yù)防治療中心的合作，對乳腺癌樣本庫中300例乳腺癌病人血清(有7年隨訪資料)及來自體檢人群的200例健康對照血清進(jìn)行研究。通過全面的文獻(xiàn)調(diào)研，確定了96個與乳腺癌疾病發(fā)生相關(guān)或在組織中有差異表達(dá)的候選mirna分子。通過采用杜克大學(xué)開發(fā)的機(jī)器訓(xùn)練的二元回歸模型(binreganalysis)對182例乳腺癌病人血清中96個候選mirna的表達(dá)譜進(jìn)行分析。其中40例為測試集，142例為驗證集。通過主成分分析(principalcomponentanalysis，pca)、probit回歸曲線擬合和交叉驗證分析，篩選得到具有很好區(qū)分效果的2-10個mirna的組合。之后，在142例驗證樣本中，對2-10個mirna的組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險乳腺癌病人進(jìn)行無病生存(disease-freesurvival，dfs)和無遠(yuǎn)處疾病生存(distantdisease-freesurvival，ddfs)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4-5個mirna的組合具有最好的生存預(yù)測效果。多因素cox回歸分析顯示，2-7個mirna的組合為乳腺癌預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險因子，其中4-5個mirna的組合風(fēng)險比例最高。隨后在淋巴結(jié)陰性和陽性病人生存分析中發(fā)現(xiàn)，4-5個mirna的組合對淋巴結(jié)陰性的乳腺癌病人生存預(yù)測效果更好，由此完成了本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含循環(huán)核酸檢測試劑，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，本發(fā)明提供了循環(huán)核酸檢測試劑在制備用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的試劑盒中的用途，其特征在于，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的微陣列，其特征在于，所述微陣列包含循環(huán)核酸檢測探針，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。根據(jù)本發(fā)明的第四個方面，本發(fā)明提供了循環(huán)核酸檢測探針在制備用于乳腺癌預(yù)后的微陣列中的用途，其特征在于，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，本發(fā)明提供了循環(huán)核酸在預(yù)測乳腺癌預(yù)后中的用途，其特征在于，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測乳腺癌預(yù)后的方法，其特征在于，所述方法包括檢測體液中循環(huán)核酸的步驟，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。有益效果本發(fā)明通過利用大樣本隨訪人群，首次研究了循環(huán)mirna與有長期隨訪的乳腺癌人群的預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特定的2-10個mirna的組合對不同預(yù)后的乳腺癌病人有很好的區(qū)分。其中，2-8個mirna的組合預(yù)測的高低風(fēng)險乳腺癌病人無病生存(dfs)和無遠(yuǎn)處疾病生存(ddfs)都具有顯著性差異。特別地，4-5個mirna的組合是生存預(yù)測的最佳預(yù)測因子，可作為高風(fēng)險和低風(fēng)險乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。這些特定mirna組合，相對于傳統(tǒng)的組織學(xué)層面的預(yù)后風(fēng)險因素(如淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤大小等)，可以更為方便、顯著地預(yù)測乳腺癌病人的生存效果，為乳腺癌的預(yù)后評估和治療方案的選擇提供了理論指導(dǎo)，具有實際且寶貴的應(yīng)用價值。附圖說明圖1示出了利用內(nèi)參(mir-103a/mir-132)標(biāo)準(zhǔn)化后的循環(huán)mirna在乳腺癌病人血清中的相對表達(dá)量。bc-1～bc-4表示不同乳腺癌病人。圖2示出了訓(xùn)練集中預(yù)后良好及不良的乳腺癌病人的主成分分析。乳腺癌病人基于2-10個mirna組合特征散在分布。因子1為區(qū)分要素，因子2作為展示。每一個病人臨床預(yù)后效果用數(shù)字表示，其中數(shù)字1-20為臨床上預(yù)后良好的病人，數(shù)字21-40為臨床上預(yù)后不良的病人。圖3示出了基于因子回歸分析結(jié)果(factorregressionanalysis)在訓(xùn)練集中進(jìn)行留一交叉驗證分析。x軸為總的評分，y軸為與之相對應(yīng)的分類概率，虛線為90％的置信區(qū)間對應(yīng)的概率。其中metagenescore大于0為預(yù)測的預(yù)后不良病人，小于0為預(yù)測的預(yù)后良好病人。每一個病人臨床預(yù)后效果用數(shù)字表示，其中數(shù)字1-20為臨床上預(yù)后良好的病人，數(shù)字21-40為臨床上預(yù)后不良的病人。圖4示出了對驗證樣本中2-10個mirna組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險兩組病人進(jìn)行kaplan-meier無病生存(dfs)分析的結(jié)果。通過log-rank對生存差異進(jìn)行顯著性分析。圖5示出了對驗證樣本中2-10個mirna組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險兩組病人進(jìn)行kaplan-meier無遠(yuǎn)處疾病生存(ddfs)分析的結(jié)果。通過log-rank對生存差異進(jìn)行顯著性分析。圖6示出了基于5個mirna組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險病人，對驗證集中的淋巴結(jié)陽性(a、b)和陰性(c、d)乳腺癌病人進(jìn)行kaplan-meierdfs和ddfs分析的結(jié)果，通過log-rank對生存差異進(jìn)行顯著性分析。具體實施方式1.循環(huán)mirna的提取相比于組織或細(xì)胞中的mirna，體液中的循環(huán)mirna的含量要低很多，同時mirna只有22-25nt，小片段在提取過程中不容易富集，加之循環(huán)mirna以與蛋白或者囊泡結(jié)合的形式存在，為循環(huán)mirna的提取和純化帶來了很大的難度。循環(huán)mirna的提取主要是采用針對液體提取的試劑以及基于吸附柱的試劑盒。試劑常用的是和lsreagent(invitrogen)，在血清或血漿與試劑結(jié)合后，通過酚/氯仿抽提去除包裹mirna的蛋白等可能影響后續(xù)反應(yīng)的因素，隨后進(jìn)行乙醇沉淀，但是不同的方法在這個過程中有所差異，而會導(dǎo)致mirna不同程度地丟失。另一種提取方法主要是基于柱結(jié)合的試劑盒，常用的有mirnaisolationkit(ambion)、mirvanapariskit(ambion)和mirnakit(qiagen)。這些試劑盒主要是通過rna與不同濃度的酒精混合后，利用rna與硅或玻璃纖維柱的親和性不同，而對rna的大小進(jìn)行區(qū)分，通常是對200nt以下的rna進(jìn)行富集。相比于試劑的方式，該試劑盒具有一定的優(yōu)勢，主要是起始的需求樣本量相對較少。2.循環(huán)mirna的檢測循環(huán)mirna作為疾病標(biāo)志物的研究策略通常分為兩步：(1)基于高通量或多基因篩選的發(fā)現(xiàn)過程；(2)通過qrt-pcr方法驗證上述結(jié)果。高通量篩選的方法主要有mirnamicroarray、deepsequencing和qrt-pcrarray。這三種方式各有其優(yōu)勢和劣勢。mirnamicroarray是固定在固體基片上的大量dna序列的微陣列，通過探針與靶序列雜交的熒光信號進(jìn)行分析。但因為mirna的序列短，且同一家族的mirna序列相似性高，因此通過mirnamicroarray進(jìn)行表達(dá)譜分析假陽性會比較高。deepsequencing能夠解決上述mirna序列短、同源性高的問題，且能對mirna的多態(tài)性和未知的mirna進(jìn)行研究和發(fā)現(xiàn)，但deepsequencing需要的rna量大，需要大量體液來進(jìn)行rna提取，同時deepsequencing花費(fèi)大，會限制多樣本在發(fā)現(xiàn)期的納入。很多研究中通過混合體液樣本進(jìn)行測序，但這種方式可能會使一些有差異的mirna不容易被檢出，同時此方法需要進(jìn)行比較復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，耗時較長。mirnaqrt-pcrarray是三種方法中耗時最短的方式，它通過兩個384孔板對已知的754個mirna進(jìn)行qrt-pcr來分析。但因為循環(huán)mirna的豐度低，一般進(jìn)行qrt-pcrarray前都要進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，這可能會使一些mirna在檢測中過飽和而引入偏差。同時qrt-pcrarray的方法需要合適的內(nèi)參進(jìn)行校正，但目前循環(huán)mirna的研究中，還沒有尋找到合適的統(tǒng)一的內(nèi)參。循環(huán)mirna研究的驗證階段一般都是通過熒光定量-反轉(zhuǎn)錄pcr(qrt-pcr)進(jìn)行。因為mirna序列短，這是檢測的一個難點(diǎn)，對此目前主要有兩種策略，一種策略為在反轉(zhuǎn)錄中采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物(stem-loopprimer)，得到序列延長的cdna；另一種策略是先對mirna進(jìn)行poly(a)尾的延長，再利用oligodt對延長后的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。得到cdna后對mirna的檢測又有不同的方式。主要有基于序列特異的taqman探針法、lna探針以及非特異的green染料法。taqman探針和lna探針法的靈敏度高，但花費(fèi)大；green染料法的靈敏度相對低一些，但是成本低，便于做較大規(guī)模的驗證和分析。3.循環(huán)mirna的內(nèi)參選擇循環(huán)mirna的研究中，驗證階段幾乎都是采用qrt-pcr進(jìn)行相對定量，合適的內(nèi)參選擇對于數(shù)據(jù)的分析至關(guān)重要，但目前血清或血漿中還沒有持家基因可以作為穩(wěn)定的內(nèi)參，其發(fā)現(xiàn)和選擇可以參考組織和細(xì)胞水平的研究方法，主要有以下幾種方式：(1)選用文獻(xiàn)已報道的基因作為內(nèi)參，主要為mir-16和核小rnarnu6(u6)、rnu44和rnu48。雖然上面幾個基因作為內(nèi)參被廣泛使用，但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)，它們在不同的生理或病理條件下水平有所變化。另一種是在提取過程中加入外源mirna作為內(nèi)參，如線蟲mirnacel-mir-39、cel-mir-54和cel-mir-328，這能夠?qū)μ崛〉男蔬M(jìn)行檢測。(2)在已有的基因內(nèi)篩選表達(dá)穩(wěn)定的作為內(nèi)參。主要的分析方法有g(shù)enorm和normfinder。genorm是將一個基因假定為內(nèi)參，得出與其它基因的比值，所有比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值定義為m值，m值最小的兩個基因組合為最終的內(nèi)參，參見文獻(xiàn)vandesompele,j.,etal.,accuratenormalizationofreal-timequantitativert-pcrdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes,genomebiol,3(7),research0034(2002)。normfinder則是對基因的穩(wěn)定性(standarddeviation，sd)進(jìn)行評估，參見文獻(xiàn)andersen,c.l.,j.l.jensen,andt.f.orntoft,normalizationofreal-timequantitativereversetranscription-pcrdata:amodel-basedvarianceestimationapproachtoidentifygenessuitedfornormalization,appliedtobladderandcoloncancerdatasets,cancerres,64(15),5245-5250(2004)。(3)利用所有基因表達(dá)的平均值作為內(nèi)參。這種方式的前提是，不同樣品的rna加入量是相同的。4.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)方法(1)內(nèi)參篩選通過微量血清免抽提多重qrt-pcr方法(參見下文詳細(xì)描述)對25例乳腺癌患者和20例健康對照的96個mirna的表達(dá)譜進(jìn)行mirna穩(wěn)定性分析。使用genex軟件內(nèi)的genorm和normfinder進(jìn)行評估，篩選得到內(nèi)參mirna，其它mirna的表達(dá)以此進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即δct＝cttargetmirna-ctreferencemirna，相對表達(dá)量為2-δct。(2)機(jī)器學(xué)習(xí)二元回歸模型分析循環(huán)mirna作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的研究中，mirna組合的選擇是通過基于bayesianbinaryregression算法的binreg2.0軟件包進(jìn)行分析的。此分析方法由杜克大學(xué)在2001年開發(fā)，通過matalab實現(xiàn)。binreg的分析主要是將樣本分為訓(xùn)練集和驗證集，通過訓(xùn)練集的已知信息建立分類模型，再在驗證集中對上述分類組合進(jìn)行驗證。由于實驗樣本數(shù)量限制，直接使用極大似然估計(mle)訓(xùn)練模型可能會出現(xiàn)擬合過度，導(dǎo)致模型的泛化能力降低。因此本研究采用貝葉斯框架(bayesianregularization)進(jìn)行分析，選擇γi(i＝1，2，…，r)的先驗分布為相互獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布n(0，1)，按照后驗分布＝似然函數(shù)×先驗分布得到γi的后驗分布。此后利用標(biāo)準(zhǔn)的mcmc(markovchainmontecarlo)方法對后驗分布進(jìn)行采樣，利用采樣數(shù)據(jù)得到后驗分布的估計。最后，按照最大化后驗分布(map)的原則得到模型參數(shù)。模型選擇過程如下：待選擇的參數(shù)為降維后的空間維數(shù)r，即奇異值的數(shù)量，采用標(biāo)準(zhǔn)的留一交叉驗證(loocv)方法對模型進(jìn)行驗證。具體如下，對于每一個模型，選取一例樣本xi作為驗證集，剩余樣本作為訓(xùn)練集，通過訓(xùn)練的模型預(yù)測待驗證的樣本xi，其結(jié)果記為i(zi＝zpredict)預(yù)測結(jié)果正確為1，錯誤為0。將這個驗證集遍歷所有訓(xùn)練集樣本，得到模型預(yù)測的正確率為：利用λ作為不同模型的評價標(biāo)準(zhǔn)，從而完成模型選擇的過程。(3)統(tǒng)計學(xué)分析通過循環(huán)mirna組合對乳腺癌病人預(yù)后進(jìn)行預(yù)測，將病人分為高、低風(fēng)險組，兩組人的分類效果除了使用靈敏度(sensitivity)和特異度(specificity)進(jìn)行評估外，另一個重要的指標(biāo)是兩組人的生存情況。對于預(yù)測的高低風(fēng)險組分別通過kaplan-meier方法對他們的無病生存(dfs)和無遠(yuǎn)處疾病生存(ddfs)進(jìn)行分析，通過log-rank檢驗對兩組人群的生存差異進(jìn)行顯著性分析。在此，dfs是指到隨訪結(jié)束沒有發(fā)生原位復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡事件；而ddfs是指到隨訪結(jié)束沒有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡事件。到隨訪結(jié)束仍然存活的病人作為刪失數(shù)據(jù)(censoreddata)，因其他原因死亡的乳腺癌病人也作為刪失數(shù)據(jù)。循環(huán)mirna組合及其他病理特征的生存分析通過spss18.0的多元cox風(fēng)險回歸實現(xiàn)，用以評估風(fēng)險因素是否為生存預(yù)測的獨(dú)立風(fēng)險因子。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙尾(two-sidetailed)檢驗，p<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.微量血清免抽提多重qrt-pcr方法建立為了完成微量血清mirna的檢測，除了本部分第1項和第2項中所述的方法，本研究進(jìn)一步嘗試免去提取步驟，在直接對血清進(jìn)行加熱后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行熒光定量pcr，并驚訝地發(fā)現(xiàn)此方法可以更加高效地檢測到循環(huán)mirna的表達(dá)。進(jìn)而，此方法可以避免血清或血漿提取過程中rna的損失，同時，微量檢測的方法還可以方便使用生物樣本庫進(jìn)行研究，實驗結(jié)果更可靠，信息更全面。在研究標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)階段，高通量的mirna檢測方法非常重要。在組織樣本mirna的研究中，多重cdna合成(multiplexcdnasynthesis)同時檢測48個不同的mirna已被證明是可行的?；诖耍狙芯繉ξ⒘垦迕獬樘岫嘀豵rt-pcr檢測循環(huán)mirna的方法進(jìn)行探索。通過血清免抽提方法對10個mirna多重cdna合成進(jìn)行評估。在健康對照的血清中，9個mirna及u6都能夠通過上述方法檢出，ct值在25-35之間，mir-150豐度最高，mir-191豐度在待測mirna中最低，同時對qrt-pcr的產(chǎn)物進(jìn)行了測序驗證。隨后的研究發(fā)現(xiàn)20個mirna多重cdna合成也是可行的，并且通過cdna的梯度稀釋對該方法的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測。在對cdna進(jìn)行2、4、8倍梯度稀釋后，4個mirna檢測的ct值都呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)介于0.896到0.999之間。在此基礎(chǔ)上將20個mirna多重cdna合成遍歷到96個mirna多重cdna合成。具體而言，通過將96個不同mirna的特異性莖環(huán)rt引物(每個10μl，各50μm)混合，制成微量血清免抽提多重qrt-pcr引物。將混合的引物濃縮并用無核酸酶ddh2o調(diào)整至終濃度為5μm。將10μl血清樣品與2.5μl無核酸酶ddh2o混合并加熱至60℃-80℃(例如70℃)，隨后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(transgene,beijing,china)、利用2μl前述微量血清免抽提多重qrt-pcr引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(終體積20μl)。得到cdna后，用無核酸酶ddh2o將cdna產(chǎn)物稀釋10倍，并以13200rpm離心5min來收集上清液。隨后利用上清液進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。在25μlqpcr反應(yīng)中使用2μlcdna，該反應(yīng)中還含有sybrgreeni染料和mirna特異性檢測引物。將pcr產(chǎn)物克隆到pgm-t載體(tiangen,beijing,china)中并通過測序進(jìn)行驗證。各患者的血清樣本均進(jìn)行三個平行試驗。其中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)已知的mirna序列，適當(dāng)?shù)卦O(shè)計并合成反轉(zhuǎn)錄過程中所使用的mirna特異性莖環(huán)引物(例如但不限于表16中所示的mirna特異性莖環(huán)引物)；同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可根據(jù)已知的mirna序列，適當(dāng)?shù)卦O(shè)計并合成pcr過程中所使用的mirna特異性檢測引物(例如但不限于表17中所示的mirna特異性檢測引物)。6.本發(fā)明的試劑盒和微陣列本發(fā)明的試劑盒和微陣列用于對循環(huán)核酸進(jìn)行檢測，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205；優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種(例如1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種以及全部8種)：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b；更優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a和循環(huán)mir-16；最優(yōu)選地，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16和循環(huán)mir-34a。不受限制地，可將循環(huán)核酸檢測引物或循環(huán)核酸檢測探針用于制備本發(fā)明的試劑盒或微陣列，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于表16和表17中所示的序列來制備本發(fā)明的試劑盒或微陣列，但本發(fā)明并不限于此。此外，本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含dna純化試劑(如nucleontm試劑盒、裂解緩沖液、蛋白酶溶液等)；pcr試劑(如反應(yīng)緩沖液、熱穩(wěn)定聚合酶、dntp等)，但本發(fā)明并不限于此。用于對循環(huán)核酸進(jìn)行檢測的探針可用不同的可檢測工具來標(biāo)記。這種可檢測工具是指可綴合、連接或附加至探針以提供可定量的指標(biāo)(如密度、濃度、數(shù)量等)的化合物、生物分子或仿生材料?？蓹z測工具的實例包括熒光標(biāo)記物、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性同位素，但本發(fā)明并不限于此?？蓹z測工具的詳細(xì)信息和選擇對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明的各個方面可由如下編號段落中的任一項定義：1.一種用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含循環(huán)核酸檢測試劑，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。2.如段落1所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。3.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205和循環(huán)mir-450a。4.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a和循環(huán)mir-16。5.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16和循環(huán)mir-34a。6.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a和循環(huán)mir-20a。7.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a和循環(huán)mir-373。8.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373和循環(huán)mir-519c。9.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c和循環(huán)mir-452。10.如段落2所述的試劑盒，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。11.如段落1-10中任一項所述的試劑盒，其中，所述試劑盒的檢測對象為體液。12.如段落11所述的試劑盒，其中，所述體液為血清或血漿。13.如段落12所述的試劑盒，其中，在利用所述試劑盒對所述血清進(jìn)行循環(huán)核酸檢測時，不對所述血清進(jìn)行提取，而是直接對所述血清進(jìn)行加熱，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到cdna以用于檢測。14.如段落1-13中任一項所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中進(jìn)一步包含用于檢測mir-107、mir-103a和mir-132中至少一種的試劑。15.如段落14所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中包含用于檢測mir-103a和mir-132的試劑。16.如段落1-15中任一項所述的試劑盒，其中，所述試劑盒中包含循環(huán)核酸檢測引物，所述循環(huán)核酸檢測引物選自于如seqidno.14～seqidno.40所示的引物中的至少一者。17.循環(huán)核酸檢測試劑在制備用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的試劑盒中的用途，其特征在于，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。18.如段落17所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。19.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205和循環(huán)mir-450a。20.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a和循環(huán)mir-16。21.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16和循環(huán)mir-34a。22.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a和循環(huán)mir-20a。23.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a和循環(huán)mir-373。24.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373和循環(huán)mir-519c。25.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c和循環(huán)mir-452。26.如段落18所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。27.如段落17-26中任一項所述的用途，其中，所述試劑盒的檢測對象為體液。28.如段落27所述的用途，其中，所述體液為血清或血漿。29.如段落28所述的用途，其中，在利用所述試劑盒對所述血清進(jìn)行循環(huán)核酸檢測時，不對所述血清進(jìn)行提取，而是直接對所述血清進(jìn)行加熱，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到cdna以用于檢測。30.如段落17-29中任一項所述的用途，其中，所述試劑盒中進(jìn)一步包含用于檢測mir-107、mir-103a和mir-132中至少一種的試劑。31.如段落30所述的用途，其中，所述試劑盒中包含用于檢測mir-103a和mir132的試劑。32.如段落17-31中任一項所述的用途，其中，所述試劑盒中包含循環(huán)核酸檢測引物，所述循環(huán)核酸檢測引物選自于如seqidno.14～seqidno.40所示的引物中的至少一者。33.一種用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的微陣列，其特征在于，所述微陣列包含循環(huán)核酸檢測探針，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。34.如段落33所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。35.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205和循環(huán)mir-450a。36.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a和循環(huán)mir-16。37.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16和循環(huán)mir-34a。38.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a和循環(huán)mir-20a。39.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a和循環(huán)mir-373。40.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373和循環(huán)mir-519c。41.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c和循環(huán)mir-452。42.如段落34所述的微陣列，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。43.如段落33-42中任一項所述的微陣列，其中，所述微陣列的檢測對象為體液。44.如段落43所述的微陣列，其中，所述體液為血清或血漿。45.如段落44所述的微陣列，其中，在利用所述微陣列對所述血清進(jìn)行循環(huán)核酸檢測時，不對所述血清進(jìn)行提取，而是直接對所述血清進(jìn)行加熱，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到cdna以用于檢測。46.如段落33-45中任一項所述的微陣列，其中，所述微陣列中進(jìn)一步包含用于檢測mir-107、mir-103a和mir-132中至少一種的探針。47.如段落46所述的微陣列，其中，所述微陣列中包含用于檢測mir-103a和mir-132的探針。48.循環(huán)核酸檢測探針在制備用于預(yù)測乳腺癌預(yù)后的微陣列中的用途，其特征在于，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203和循環(huán)mir-205。49.如段落48所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸進(jìn)一步包括如下循環(huán)mirna中的一種或多種：循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。50.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205和循環(huán)mir-450a。51.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a和循環(huán)mir-16。52.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16和循環(huán)mir-34a。53.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a和循環(huán)mir-20a。54.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a和循環(huán)mir-373。55.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373和循環(huán)mir-519c。56.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c和循環(huán)mir-452。57.如段落49所述的用途，其中，所述循環(huán)核酸包括循環(huán)mir-203、循環(huán)mir-205、循環(huán)mir-450a、循環(huán)mir-16、循環(huán)mir-34a、循環(huán)mir-20a、循環(huán)mir-373、循環(huán)mir-519c、循環(huán)mir-452和循環(huán)mir-193b。58.如段落48-57中任一項所述的用途，其中，所述微陣列的檢測對象為體液。59.如段落58所述的用途，其中，所述體液為血清或血漿。60.如段落59所述的用途，其中，在利用所述微陣列對所述血清進(jìn)行循環(huán)核酸檢測時，不對所述血清進(jìn)行提取，而是直接對所述血清進(jìn)行加熱，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，從而得到cdna以用于檢測。61.如段落48-60中任一項所述的用途，其中，所述微陣列中進(jìn)一步包含用于檢測mir-107、mir-103a和mir-132中至少一種的探針。62.如段落61所述的用途，其中，所述微陣列中包含用于檢測mir-103a和mir-132的探針。實施例接下來，通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)地說明，但本發(fā)明不僅限于這些實施例。1.臨床樣本信息在循環(huán)mirna與乳腺癌病人預(yù)后關(guān)系的研究中，189例乳腺癌病人為2005年-2009年到北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院就診的乳腺癌病人，血清為病人接受治療前取樣。在189例乳腺癌患者血清中進(jìn)行96個mirna的表達(dá)譜檢測，對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析，其中182例乳腺癌患者的實驗結(jié)果符合數(shù)據(jù)要求，納入后續(xù)分析。病人年齡范圍為28-85歲，中位年齡為52歲。腫瘤分期根據(jù)uicc(unioninternationalconterlecancer)的tnm分期方式進(jìn)行。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)為對淋巴結(jié)進(jìn)行清除后進(jìn)行組織學(xué)檢測確定。在182例乳腺癌患者中，174例病人有隨訪資料，隨訪時間為5-83個月，中位隨訪時間為58.5個月。這項研究經(jīng)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理研究協(xié)會支持并得到參與者書面知情同意。2.血清rna提取ls提取：500μl血清中加入3倍體積的ls(invitrogen)進(jìn)行室溫變性，隨后經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，在晾干的rna中加入20μldepch2o。用nd-1000測濃度后進(jìn)行后續(xù)qrt-pcr。mirna提取試劑盒：取500μl血清，按照試劑盒說明進(jìn)行提取。主要過程為：血清與等體積變性溶液混合后，通過酚/氯仿進(jìn)行抽提。與80％酒精混合后通過玻璃纖維柱進(jìn)行富集，經(jīng)過洗滌后溶于20μldepch2o中。用nd-1000測濃度后進(jìn)行后續(xù)qrt-pcr實驗。paris提取試劑盒：過程同mirna提取試劑盒。humanmicrornaarray檢測血清mirna表達(dá)譜1ml患者血漿通過mirna提取試劑盒進(jìn)行rna提取，過程如上所示?？俽na(200ng)與2個megaplex反轉(zhuǎn)錄引物(humanpoola&b，appliedbiosystems)一起，通過microrna反轉(zhuǎn)錄試劑盒(appliedbiosystems)進(jìn)行合成，每個megaplex反轉(zhuǎn)錄引物覆蓋377個mirna和6個內(nèi)參。7.5μl反應(yīng)體系包含rna、10×反轉(zhuǎn)錄引物、10×反轉(zhuǎn)錄溶液、mgcl2(25mm)以及rna酶抑制劑(20u/μl)。反應(yīng)過程如下：16℃2分鐘、42℃1分鐘、50℃1秒，此三步進(jìn)行40個循環(huán)；隨后85℃加熱5分鐘。得到的cdna不經(jīng)預(yù)擴(kuò)增，直接通過humanmicrornaarrayseta&b(appliedbiosystems)進(jìn)行384孔的熒光定量pcr反應(yīng)。cdna稀釋成50μl溶液后與50μl的universalpcrmastermix(noung，appliedbiosystems)混合。熱循環(huán)過程如下：94.5℃加熱10分鐘；隨后進(jìn)行包含97℃30秒、59.7℃1分鐘的40個循環(huán)。以上反應(yīng)在7900htfastreal-timepcr儀器(appliedbiosystems)上進(jìn)行。得到的mirna的循環(huán)數(shù)ct通過內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。4.微量血清免抽提多重qrt-pcr檢測mirna混合96個mirna的反轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物，取每個mirna的反轉(zhuǎn)錄引物溶液(50μm)10μl混合，在冷凍干燥機(jī)中干燥1小時，加入100μldepch2o，形成終濃度5μm的mirna多重反轉(zhuǎn)錄引物溶液。10μl血清經(jīng)加熱(70℃)變性后，加入反轉(zhuǎn)錄體系(全式金，transgene)，進(jìn)行20μl的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中含2μl前述微量血清免抽提多重反轉(zhuǎn)錄引物(5μm)。得到cdna后進(jìn)行10倍稀釋，取其中的2μl進(jìn)行后續(xù)熒光定量pcr反應(yīng)。熒光定量pcr反應(yīng)在steponeplus儀器上進(jìn)行，實驗過程如下：25μl的熒光定量pcr體系中包含10×hotmastertaq酶緩沖液(天根)、20μm正反向引物、2.5u/μlhotmastertaq酶(天根)、greeni(invitrogen)以及depch2o。熱循環(huán)過程如下：95℃預(yù)熱10分鐘；隨后在95℃變性15秒、60℃退火延伸60秒(40個循環(huán))后進(jìn)行熔解曲線收集。未加模板的qrt-pcr作為實驗的陰性對照。實施例196個候選mirna的確定為了找到可有效作為乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物的循環(huán)mirna，本研究在已經(jīng)報道的數(shù)據(jù)庫或研究中篩選了多個與乳腺癌相關(guān)的mirna，而它們的循環(huán)形式尚未有研究。以此作為候選基因，在多樣本的訓(xùn)練集中進(jìn)行表達(dá)譜分析。候選基因的來源和選擇標(biāo)準(zhǔn)：1)在乳腺癌與癌旁組織中，芯片或功能實驗提示其表達(dá)有差異(>2倍)的mirna；2)與乳腺癌的分型、淋巴結(jié)狀態(tài)等預(yù)后指標(biāo)有關(guān)聯(lián)的mirna；3)在細(xì)胞或動物模型中證明參加乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程的mirna；4)在小樣本乳腺癌人群血清中已檢測到可能有效的mirna；5)在血清血漿中廣泛存在的mirna。通過上述分析，篩選出96個mirna作為候選分子用于后續(xù)的檢測。實施例2內(nèi)參的篩選及mirna表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化隨機(jī)選擇25例乳腺癌病人及20例與之年齡相匹配的健康對照，進(jìn)行96個mirna微量血清免抽提多重qrt-pcr表達(dá)譜的檢測，對得到的mirnact值通過normfinder和genorm軟件進(jìn)行穩(wěn)定性評估。normfinder分析顯示mir-132是在病人及健康對照中表達(dá)最穩(wěn)定的mirna，而genorm分析認(rèn)為mir-103a/mir-107適合作為內(nèi)參。對上述三個mirna(mir-132、mir-103a、mir-107)的兩兩組合的穩(wěn)定性進(jìn)行的評估顯示mir-103a/mir-132穩(wěn)定性最強(qiáng)，適宜作為內(nèi)參。在選擇內(nèi)參之后，對乳腺癌病人及健康對照的其余mirna進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如圖1所示，不同mirna在血清中有不同豐度的表達(dá)。實施例3乳腺癌病人循環(huán)mirna表達(dá)譜的獲得為了獲得預(yù)測乳腺癌轉(zhuǎn)歸的有效mirna組合，本研究對189例乳腺癌患者的96個mirna的原始數(shù)據(jù)按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了篩選：1)循環(huán)mirna的ct值在15-35之間；相同病人血清重復(fù)實驗中mirna的ct值std<2；2)mirna的ct值在189名乳腺癌患者的平均ct±3之間。最后得到符合要求的182名乳腺癌病人的82個血清mirna的表達(dá)譜。182名乳腺癌病人的臨床信息如表1所示，中位年齡為52歲，其中有55例乳腺癌病人有不良臨床結(jié)果，包括原位復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡。以mir-103a/mir-132作為內(nèi)參，對其他80個mirna的ct值進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化用于后續(xù)分析。表1182例乳腺癌病人的臨床特征實施例4通過訓(xùn)練集獲得不同mirna組合為了更精確地找出對乳腺癌病人臨床結(jié)果預(yù)測效果好的mirna，本研究通過機(jī)器訓(xùn)練的二元回歸模型對實施例3中選擇的182例乳腺癌病人的標(biāo)準(zhǔn)化后的80個mirna表達(dá)譜進(jìn)行分析。其中，在55例預(yù)后不良的乳腺癌病人中，隨機(jī)挑選20例病人；并在127例預(yù)后良好的乳腺癌病人中，選擇與之臨床特征相匹配的20例病人作為對照共同組成訓(xùn)練集，具體臨床特征如表2所示，剩余的142例乳腺癌病人作為驗證集。表2訓(xùn)練集中40例乳腺癌病人的臨床信息在訓(xùn)練集的二元回歸模型中，通過對40個不同預(yù)后病人的80個mirna的相對表達(dá)量進(jìn)行基于奇異值分解(singularvaluedcomposition,svd)的主成分分析(pca)，得到2-10個mirna的組合，如圖2所示，因子1(factor1)為區(qū)分要素，因子2(factor2)作為展示。每一個病人臨床預(yù)后效果用數(shù)字表示，其中數(shù)字1-20為臨床上預(yù)后良好的病人，數(shù)字21-40為臨床上預(yù)后不良的病人?？梢钥闯?，2-10個mirna組合對不同預(yù)后的乳腺癌病人有很好的區(qū)分。為了進(jìn)一步篩選穩(wěn)定可靠的組合，本研究對pca分析得出的2-10個mirna組合在訓(xùn)練集中進(jìn)行留一交叉驗證(leave-one-outcrossvalidation)，不同mirna組合對兩類乳腺癌病人預(yù)測的概率如圖3所示，metagenescore大于0為預(yù)測的預(yù)后不良病人，小于0為預(yù)測的預(yù)后良好病人。每一個病人臨床預(yù)后效果用數(shù)字表示，其中數(shù)字1-20為臨床上預(yù)后良好的病人，數(shù)字21-40為臨床上預(yù)后不良的病人。對2-10個mirna在訓(xùn)練集中對乳腺癌病人的區(qū)分準(zhǔn)確度進(jìn)行統(tǒng)計分析，如表3所示，發(fā)現(xiàn)6個mirna的組合具有最高的靈敏度和特異度。表32-10個mirna組合對訓(xùn)練集中預(yù)后良好及不良的乳腺癌病人的區(qū)分度不同mirna組合的組成如表4所示。表42-10個mirna組合的組成及各mirna對分類的貢獻(xiàn)ce(coefficience)指mirna在二元回歸方程中的系數(shù)，即其對病人分類的貢獻(xiàn)值。在此二元回歸的機(jī)器訓(xùn)練模型分析中，表4中呈現(xiàn)出的2-10mirna的組合為同類組合中對乳腺癌病人預(yù)后效果區(qū)分度最好的組合。以2個mirna組合為例，機(jī)器訓(xùn)練的模型將80個mirna中的兩兩mirna進(jìn)行組合(共3160個)，分別評估這些組合對病人預(yù)后效果的分類能力，得出區(qū)分效果最好的組合為mir-203/mir-205，其他組合未呈現(xiàn)于此。實施例5不同mirna組合對驗證集中乳腺癌病人的區(qū)分及對生存的預(yù)測隨后，本研究對2-10個mirna的不同組合在142例驗證集中的區(qū)分情況進(jìn)行評估。在142例驗證樣本中，35例為預(yù)后不良的乳腺癌病人，107例為預(yù)后良好的乳腺癌病人。2-10個mirna組合對兩類病人的區(qū)分情況如表5所示，4個mirna和5個mirna預(yù)測的區(qū)分度最高，靈敏度和特異度分別為89％和62％。表52-10個mirna組合對驗證集中預(yù)后良好及不良的乳腺癌病人的區(qū)分度為了更為直接客觀地評估2-10個mirna組合作為預(yù)測因素與臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)，本研究對差異mirna組合與病人生存率進(jìn)行相關(guān)分析。根據(jù)預(yù)測得出的metagenescore將驗證集分為高風(fēng)險(預(yù)測的預(yù)后不良，metagenescore大于0)和低風(fēng)險(預(yù)測的預(yù)后良好，metagenescore小于0)兩類病人，并用kaplan-meier生存分析方法，對這些病人的無病生存(dfs)和無遠(yuǎn)處疾病生存(ddfs)進(jìn)行分析，通過log-rank檢驗對兩類病人的生存差異進(jìn)行顯著性分析，p<0.05表示生存差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-10個mirna組合預(yù)測的高低風(fēng)險乳腺癌病人的dfs均具有顯著性差異，風(fēng)險比例(hazardratio，hr)在2.550到5.796之間(圖4)，其中，2-8個mirna組合預(yù)測的高低風(fēng)險乳腺癌病人的ddfs同樣具有顯著性差異，風(fēng)險比例在2.329-4.756之間(圖5)?？梢?，2-10個mirna組合對乳腺癌病人的預(yù)后均有區(qū)分效果，其中4個mirna和5個mirna的組合對預(yù)后良好和不良的乳腺癌病人預(yù)測效果最好，結(jié)合訓(xùn)練集中的表現(xiàn)，5個mirna組合對兩類乳腺癌病人的區(qū)分度優(yōu)于4個mirna組合，因此5個mirna組合(mirna-16、mir-205、mir-450a、mir-203和mir-34a)為最佳預(yù)測因子(表4)。實施例62-7個mirna組合為乳腺癌預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險因子為了檢驗5個mirna的組合是否可作為高風(fēng)險和低風(fēng)險乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)測因素，本研究通過cox風(fēng)險比例回歸對其進(jìn)行檢驗。在對驗證樣本的年齡、腫瘤大小、er、pr、her2和淋巴結(jié)狀態(tài)平衡之后，發(fā)現(xiàn)5個mirna組合為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險因子，如表6所示，對dfs的預(yù)測的風(fēng)險比例為6.891，置信區(qū)間為2.291-20.724，p值＝0.001；對ddfs的預(yù)測的風(fēng)險比例為5.960，置信區(qū)間為1.899-18.369，p值＝0.002。表6多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(5-mirna)除了5個mirna的組合外，上述多因素cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)狀態(tài)也是此驗證樣本中乳腺癌病人dfs和ddfs的獨(dú)立風(fēng)險因子。為此，本研究對驗證樣本中的淋巴結(jié)陽性和陰性的病人，基于5個mirna組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險的病人分組，通過kaplan-meier方法分別對其dfs和ddfs進(jìn)行單因素風(fēng)險分析(圖6)。相比于淋巴結(jié)陽性病人(圖6a和圖6b)，5個mirna組合對淋巴結(jié)陰性病人dfs和ddfs的風(fēng)險預(yù)測更為顯著(圖6c和圖6d)。另外本研究還對其他mirna組合同樣進(jìn)行了多因素cox回歸分析(表7-表14)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2-7個mirna組合同樣為乳腺癌病人dfs和ddfs的獨(dú)立風(fēng)險因子，但5個mirna和4個mirna的組合風(fēng)險比例最高。對驗證樣本中的淋巴結(jié)陽性和陰性的病人，基于4個mirna組合預(yù)測的高風(fēng)險和低風(fēng)險的病人分組，通過kaplan-meier方法分別對其dfs和ddfs進(jìn)行單因素風(fēng)險分析，結(jié)果與圖6類似，4個mirna組合對淋巴結(jié)陰性病人dfs和ddfs的風(fēng)險預(yù)測更為顯著。表7多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(2-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表8多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(3-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表9多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(4-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表10多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(6-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表11多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(7-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表12多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(8-mirna)表13多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(9-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。表14多因素cox回歸分析驗證集中乳腺癌人的dfs和ddfs(10-mirna)*除去12例臨床資料部分缺失的乳腺癌病人，此cox回歸分析中納入130例乳腺癌病人。如表6、表9所示，淋巴結(jié)狀態(tài)對ddfs的預(yù)測的風(fēng)險比例為2.898，p值＝0.023；4個mirna或5個mirna組合對ddfs的預(yù)測的風(fēng)險比例為5.960，p值＝0.002。由此可見，相比于傳統(tǒng)的組織學(xué)層面的經(jīng)典預(yù)后風(fēng)險因素--淋巴結(jié)狀態(tài)，非侵入型腫瘤標(biāo)志物--血液中的循環(huán)核酸(4個mirna或5個mirna的組合)預(yù)測乳腺癌病人預(yù)后效果更為顯著。從而，本發(fā)明中2-7個mirna組合可以作為高低風(fēng)險乳腺癌患者的預(yù)后獨(dú)立風(fēng)險因子，基于此，可以開發(fā)用于乳腺癌預(yù)后的試劑盒或微陣列。表15本發(fā)明中使用的mirna的序列mirna序列(5’->3’)seqidno.hsa-mir-203gugaaauguuuaggaccacuag1hsa-mir-205-5puccuucauuccaccggagucug2hsa-mir-450a-5puuuugcgauguguuccuaauau3hsa-mir-16-5puagcagcacguaaauauuggcg4hsa-mir-34a-5puggcagugucuuagcugguugu5hsa-mir-20a-5puaaagugcuuauagugcagguag6hsa-mir-373-3pgaagugcuucgauuuuggggugu7hsa-mir-519c-3paaagugcaucuuuuuagaggau8hsa-mir-452-5paacuguuugcagaggaaacuga9hsa-mir-193b-3paacuggcccucaaagucccgcu10hsa-mir-107agcagcauuguacagggcuauca11hsa-mir-103a-3pagcagcauuguacagggcuauga12hsa-mir-132-3puaacagucuacagccauggucg13表16本發(fā)明中使用的mirna特異性莖環(huán)引物的序列表17本發(fā)明中使用的mirna特異性檢測引物的序列當(dāng)前第1頁12