本發(fā)明屬于可皆霉素生產(chǎn)技術領域，具體涉及一種狹旋毛殼菌及其在制備可皆霉素中的應用。

背景技術：

狹旋毛殼屬于子囊菌門毛殼屬真菌，具有重要的經(jīng)濟學價值和生態(tài)意義。研究表明：毛殼菌作為生防菌能夠應用于植物病害的防治。可皆霉素(Cochliodinol，分子式為C₃₂H₃₀N₂O₄；分子量：506.22；CAS登錄號：11051-88-0)僅在毛殼屬（Chaetomium globosum,C. cochliodes）中分離得到，其結構式為

。

Brewerr的科研團隊發(fā)現(xiàn)，在1-10μg/ml時，可皆霉素抑制多屬真菌的生長，并能抑制真菌Botrytis allii 和 Fusarirm moniliforme孢子的萌發(fā)，其形成三乙胺鹽后，水溶性顯著增加，且溶解后能顯著抑制多種微生物質的生長；同時發(fā)現(xiàn)可皆霉素在低濃度時，能夠抑制多種鐮刀菌的生長，而鐮刀菌可侵染多種植物(糧食作物、經(jīng)濟作物、藥用植物及觀賞植物)，引起植物多種病害，造成作物大量死亡，是生產(chǎn)上防治最具挑戰(zhàn)性的病害之一。由此可見，其在植物病害防治方面的潛在應用價值非常大。另外，Casellada等研究發(fā)現(xiàn)可皆霉素具有顯著細胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌細胞KB和乳腺癌細胞MDA-MB-435的增殖，IC₅₀分別為0.53 μM、2.20μM。

綜上所述，可皆霉素具有多重重要的生物活性，但由于合成成本高，得率低，無法獲得大量純品，難以進行更深入研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種可大量生產(chǎn)可皆霉素的狹旋毛殼菌及其在制備可皆霉素中的應用。

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種狹旋毛殼菌，其保藏的分類學名稱為狹旋毛殼(Chaetomium angustispirale) CLC001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國 武漢 武漢大學；保藏日期：2016年4 月28 日，保藏號為CCTCC NO：M 2016231。該菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)出大量可皆霉素。該菌的18S rDNA如序列表所示，即

CGTGGGTCTTTCTACCTGATCCGAGGTCACCTTGGGTTAAAAGGTGGTTTAACGGCCGGAACCCGCAGCACGCCCAGAGCGAGATGTATGCTACTACGCTCGGTGTGACAGCGAGCCCGCCACTGCTTTTCAGGGCCTGCGGCAGCCGCAGGTCCCCAACACAAGCCCGGGGGCTTGATGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGACTTATTCAGTACAGAAGACTCAGAGAGGCCATAAATTAACAAGAGTTTGGTGACCTCCGGCGGGCGCCCGCGGTGGGGCCCAGGGGCGCCCGGGGGGTAAACCCCGGGGCCGCCCGCCGAAGCAACGGTTTAGGTAACGTTCACAATGGTTTAGGGAGTTTTGCAACTCTGTAATGATCCCTCCGCAGGTCCCCCTACGGAAG。

所述的狹旋毛殼菌在制備可皆霉素中的應用，包括以下步驟：

（1）菌種活化：將狹旋毛殼菌種接種到平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)72小時，獲得活化菌種；

（2）制備種子液：將步驟（1）中得到的活化菌種接種到裝有無菌培養(yǎng)液A的無菌三角瓶中，轉速為150rpm、溫度為25℃條件下震蕩培養(yǎng)72小時，獲得種子液；培養(yǎng)液A的配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH6.0±0.1；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（2）制備的種子液與培養(yǎng)液B按照體積比為5:100接入到無菌三角瓶中，轉速為150rpm、溫度為25℃條件下震蕩培養(yǎng)7d，獲得發(fā)酵液；培養(yǎng)液B的配方為：葡萄糖40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH6.0±0.1；

（4）甲醇提取物的制備：將步驟（3）制備的發(fā)酵液用醫(yī)用紗布過濾，得到狹旋毛殼菌體，將狹旋毛殼菌體用甲醇作為提取溶劑，超聲提取，得到甲醇提取液，40~45℃下減壓除去甲醇后得到甲醇提取物；

（5）可皆霉素的制備：將步驟（4）制備的甲醇提取物用80～100目硅膠拌樣后裝柱，固定相為200~300目硅膠，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脫，硅膠薄層層析檢測，合并二氯甲烷-甲醇的體積比為100:（2~4）的流份，40~45℃下減壓除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素。

所述步驟（1）中平板培養(yǎng)基配方為：酵母膏10g/L，葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，瓊脂粉20g/L，pH6.0±0.1。

所述步驟（4）中將狹旋毛殼菌體用甲醇提取時，用甲醇提取3次，每次提取時狹旋毛殼菌體與甲醇的固液比為1g︰60ml、每次提取時于20~25℃下超聲20 min。

所述步驟（5）中將甲醇提取物與80～100目硅膠拌樣時，甲醇提取物與80～100目硅膠的重量比為1︰2。

本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是：本發(fā)明中提供的狹旋毛殼(Chaetomium angustispirale) CLC001可在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)出大量可皆霉素；本發(fā)明的提取方法簡單，成本低，并具有可持續(xù)性，提取得到可皆霉素單體，提取過程中用到的溶劑可回收利用，提取量大，可工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。

實施例1

所述的狹旋毛殼菌在制備可皆霉素中的應用，包括以下步驟：

（1）菌種活化：將狹旋毛殼菌種（來自于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC NO：M 2016231）接種到平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)72小時，獲得活化菌種；

（2）制備種子液：將步驟（1）中得到的活化菌種接種到裝有無菌培養(yǎng)液A的無菌三角瓶中，轉速為150rpm、溫度為25℃條件下震蕩培養(yǎng)72小時，獲得種子液；培養(yǎng)液A的配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH6.0±0.1；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（2）制備的種子液與培養(yǎng)液B按照體積比為5:100接入到無菌三角瓶中，轉速為150rpm、溫度為25℃條件下震蕩培養(yǎng)7d，獲得發(fā)酵液20L；培養(yǎng)液B的配方為：葡萄糖40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母粉 10 g/L，pH6.0±0.1；

（4）甲醇提取物的制備：將步驟（3）制備的發(fā)酵液用醫(yī)用紗布過濾，得到狹旋毛殼菌體，將狹旋毛殼菌體用甲醇作為提取溶劑，超聲提取3次（每次23℃下超聲20 min，每次提取時狹旋毛殼菌體與甲醇的固液比為1g︰60ml），得到甲醇提取液，45℃下減壓除去甲醇后得到甲醇提取物；

（5）可皆霉素的制備：將步驟（4）制備的甲醇提取物用80～100目硅膠拌樣后裝柱（甲醇提取物與80～100目硅膠的重量比為1︰2），固定相為200~300目硅膠，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脫(二氯甲烷－甲醇體積比為100:0；100:1；100:2；100:4；100:8)，硅膠薄層層析，紫外254 nm檢測，合并二氯甲烷-甲醇的體積比為100:2和100:4的流份，45℃下減壓除去二氯甲烷和甲醇，得可皆霉素10.1g（純度為98.8%）。

本實施例所提取到的可皆霉素的結構鑒定如下：

【性狀】紫色粉末

【鑒定】分子式：C₃₂H₃₀N₂O₄, 分子量：506.2206

儀器設備：Agilent 1100液相色譜儀, ¹H, ¹³C NMR 圖譜由 Bruker am-400 MHz 核磁共振儀測定(TMS為內標),質譜由Agilent 6490 型質譜儀測定。

利用ESI-MS，¹H NMR和¹³C NMR試驗，標準數(shù)據(jù)如下：ESI-MS m/z: 505.2124 [M-H]⁺; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.41 (1H, s, 2,5-OH), 8.13 (1H, s, 1-NH), 7.60 (1H, s, H-2), 7.44 (1H, s, H-4), 7.34 (1H, d, J = 8.4, H-7),7.08 (1H, d, J = 8.4, H-6), 5.40 (1H, m, H-11), 3.46 (1H, m, H-10), 1.75 (3H, s, 13-CH₃), 1.74 (1H, s, 14-CH₃); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ:134.4 (C-8), 133.9 (C-5), 131.7 (C-12), 127.2 (C-2), 126.3 (C-9), 124.5 (C-11), 123.6 (C-6), 120.9 (C-4), 111.1 (C-7), 110.8 (C-3, C-6), 104.4 (C-3), 34.7 (C-10), 25.8 (C-14), 17.9 (C-13).

【檢查】利用TLC，在UV 254nm呈強熒光；以硫酸顯色劑，110℃下20秒鐘，呈現(xiàn)棕色。

【含量測定】利用HPLC，色譜條件：Sepax GP-C18 5μm（250mm×4.6mm）色譜柱。流動相：乙腈︰水︰甲酸為10︰90︰0.1；流速：1.25 mL/min，檢測波長254nm，保留時間值9.46 min。

對照例1

對照例1與實施例1的不同之處在于：所述步驟（4）中的提取溶劑為丙酮，步驟（5）中所得可皆霉素的量為3.78 g。

對照例2

對照例1與實施例1的不同之處在于：所述步驟（4）中的提取溶劑為乙腈，步驟（5）中所得可皆霉素的量為1.87 g。

對照例3

對照例1與實施例1的不同之處在于：所述步驟（4）中的提取溶劑為二氯甲烷，步驟（5）中所得可皆霉素的量為0.45g。

對照例4

對照例1與實施例1的不同之處在于：所述步驟（4）中用甲醇提取時每次提取時狹旋毛殼菌體與甲醇的固液比為1g︰50ml，步驟（5）中所得可皆霉素的量為6.85g。

對照例5

對照例1與實施例1的不同之處在于：所述步驟（4）中用甲醇提取時每次提取時狹旋毛殼菌體與甲醇的固液比為1g︰100ml，步驟（5）中所得可皆霉素的量為7.67g。

SEQUENCE LISTING

<110> 黃河科技學院

<120> 一種狹旋毛殼菌及其在制備可皆霉素中的應用

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> Chaetomium angustispirale

<400> 1

cgtgggtctt tctacctgat ccgaggtcac cttgggttaa aaggtggttt aacggccgga 60

acccgcagca cgcccagagc gagatgtatg ctactacgct cggtgtgaca gcgagcccgc 120

cactgctttt cagggcctgc ggcagccgca ggtccccaac acaagcccgg gggcttgatg 180

gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca atgtgcgttc 240

aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt tcgctgcgtt 300

cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgacttat tcagtacaga 360

agactcagag aggccataaa ttaacaagag tttggtgacc tccggcgggc gcccgcggtg 420

gggcccaggg gcgcccgggg ggtaaacccc ggggccgccc gccgaagcaa cggtttaggt 480

aacgttcaca atggtttagg gagttttgca actctgtaat gatccctccg caggtccccc 540

tacggaag 548