本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是關(guān)于一種針對(duì)MALAT-1基因的RNA干擾技術(shù)。
背景技術(shù)：
：反義技術(shù)(Antisensetechnology)是指反義DNA或者RNA以序列特異性的方式抑制基因表達(dá)的技術(shù)，其已在基因功能解析、靶標(biāo)確定和疾病治療等方面得到了廣泛運(yùn)用。至今，人們運(yùn)用的反義技術(shù)主要有三種：反義寡聚核苷酸(Antisenseoligonucleotides，AS-ONs)、核酶(Ribozyme)與脫氧核酶(Deoxyribozyme)以及RNA干擾(RNAinference，RNAi)。AS-ONs和其互補(bǔ)配對(duì)的RNA結(jié)合，人們已經(jīng)成功地用新穎的化學(xué)修飾方法來增強(qiáng)AS-ONs的穩(wěn)定性和靶標(biāo)親和性；而核酶和脫氧核酶是本身具有催化活性的寡聚核苷酸，它們不僅可以和互補(bǔ)配對(duì)的靶序列結(jié)合，還能剪切這些靶序列。作為第三種高效的反義技術(shù)，RNAi技術(shù)利用21-23個(gè)核苷酸的小干擾RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)分子就能夠有效地抑制細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。Dicer酶是RNA干擾(RNAinterference，RNAi)機(jī)制中的核心組成之一，其屬于RNaseIII超級(jí)家族中特異識(shí)別雙鏈RNA中的一員。Dicer酶以二聚體的形式切割長雙鏈RNA(DoublestrandRNA，dsRNA)前體，產(chǎn)生22nt左右的小干擾RNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)；其還可以作用于Drosha(RNaseIII超級(jí)家族另一成員)下游，產(chǎn)生成熟的microRNA(miRNA)，隨后siRNA或miRNA進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplexes，RISC)中，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式和靶mRNA結(jié)合，進(jìn)而降解靶mRNA或者阻止其翻譯。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種新的針對(duì)MALAT-1基因的asRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明提一種針對(duì)MALAT-1基因的asRNA，其序列如SEQIDNO:2所示。所述的asRNA在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。癌癥如宮頸癌和乳腺癌。所述的asRNA在制備抑制癌細(xì)胞中MALAT-1基因表達(dá)的試劑中的應(yīng)用。癌細(xì)胞如人宮頸癌細(xì)胞系Hela和人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231。所述的asRNA在制備促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。所述的asRNA在調(diào)控癌細(xì)胞中MALAT-1基因表達(dá)的應(yīng)用。一種治療癌癥的藥物，所述藥物包括針對(duì)MALAT-1基因的asRNA，所述asRNA的序列如SEQIDNO:2所示。所述asRNA干擾的靶序列是指MALAT-1基因轉(zhuǎn)錄本RNA的一段序列，該段RNA序列如下：5’-AUAAAUCCCUUUACACCUC-3’(SEQIDNO:3)，對(duì)應(yīng)的是完整序列的第3099個(gè)堿基到第3117個(gè)堿基。利用與Dicer酶高效親和的適配體OligomerRNA定向誘導(dǎo)Dicer切割反義RNA-靶RNA雜交分子，高效實(shí)現(xiàn)降解靶RNA，有效地提高基因調(diào)控作用。本發(fā)明的有益效果是：MALAT-1在癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染asRNA，可以有效敲低MALAT-1的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。附圖說明圖1是GPU6-GFP-Neo質(zhì)粒的物理圖譜；圖2是Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT-1表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果圖，其中左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞中MALAT-1的表達(dá)水平顯著下降；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT-1的表達(dá)水平顯著下降；圖3是CCK-8法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化的曲線圖，其中，A部分，實(shí)線表示針對(duì)Hela細(xì)胞的對(duì)照組，虛線表示針對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；B部分，實(shí)線表示針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的對(duì)照組，虛線表示針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；圖4是EdU法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化的曲線圖，其中，A部分，上方一排是針對(duì)Hela細(xì)胞的對(duì)照組，下方一排是針對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；B部分，上方一排是針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的對(duì)照組，下方一排是針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；C部分，左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞的增殖能力明顯下降；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力明顯下降；圖5是劃痕法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化的結(jié)果圖；其中，A部分，上方是針對(duì)Hela細(xì)胞的對(duì)照組分別在0h、16h的劃痕圖，下方是針對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組分別在0h、16h的劃痕圖；B部分，上方是針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的對(duì)照組分別在0h、16h的劃痕圖，下方是針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組分別在0h、16h的劃痕圖；C部分，左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制；圖6是Transwell法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化的結(jié)果圖，其中，A部分，左邊是針對(duì)Hela細(xì)胞的對(duì)照組，右邊是針對(duì)Hela細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；B部分，左邊是針對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的對(duì)照組，右邊是針對(duì)MDA-MB-231的實(shí)驗(yàn)組；C部分，左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力被顯著抑制；圖7是ELISA法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的變化的結(jié)果圖，其中，左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞的凋亡能力顯著提高；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡能力顯著提高；圖8是Hoechst法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的變化的結(jié)果圖。其中，A部分，左邊分別是針對(duì)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的對(duì)照組，右邊分別是針對(duì)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組；B部分，左邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞的凋亡能力顯著提高；右邊一組方柱顯示轉(zhuǎn)染asRNA后，MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡能力顯著提高。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。技術(shù)與方法1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系人宮頸癌細(xì)胞系Hela和人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231均購自上海生化所細(xì)胞庫。2質(zhì)粒構(gòu)建用GPU6-GFP-Neo質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)和Dicer酶高度結(jié)合的寡聚核苷酸OligomerRNA載體，并經(jīng)過陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證，即獲得OligomerRNA表達(dá)質(zhì)粒，這也是本研究中對(duì)照組(Negativecontrol)實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒。Oligomer序列如下：5’-GGGAGAAUCAUAAGUAGCGGUGUGUGAGUCGUGGUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCC-3’(SEQIDNO:1)用GPU6-GFP-Neo質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)asRNA的載體(本實(shí)驗(yàn)所用靶標(biāo)為MALAT-1基因)，并經(jīng)過陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證，即獲得asRNA表達(dá)質(zhì)粒，這也是本研究中實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒。asRNA序列如下：5’-GGGAGAAUCAUAAGUAGCGGUGUGUGAGUCGUGGUGCCCCAUGUUAACAGUUAGCCAUAAAUCCCUUUACACCUC-3’(SEQIDNO:2)本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒載體全由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，所用GPU6-GFP-Neo質(zhì)粒的物理圖譜如圖1所示：3藥品及試劑表1藥品及試劑4實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備5.氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)菌制備全程均需實(shí)行無菌操作，并于4℃冰上條件下進(jìn)行，4℃條件下離心，制備步驟如下所示：(1)挑取宿主菌DH5α，在不含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上輕輕劃線，在37℃條件下的細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h，至長出較大單菌落即可；(2)挑取單個(gè)大菌落，接種到5ml不含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱溫度為37℃，振蕩速度為200rpm的條件下培養(yǎng)過夜，當(dāng)測(cè)定培養(yǎng)基OD550＝0.4時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；(3)將500μl培養(yǎng)物按1:100的比例接種到50ml不含氨芐抗生素、且預(yù)熱過的LB液體培養(yǎng)基中，在振蕩速度為200rpm，溫度為37℃的條件下培養(yǎng)2-2.5h，即菌液OD550為0.45-0.5；(4)置菌液于冰上預(yù)冷15min后，4℃，4,000rpm/分鐘，離心5min，收集菌體；(5)棄上清，用15mlTFB1溶液重懸菌體沉淀，渦旋振蕩，懸浮徹底后于冰上放置15min，同時(shí)準(zhǔn)備30個(gè)1.5ml離心管，冰上預(yù)冷；(6)在4℃，4,000rpm/分鐘，離心5min條件下使菌體沉淀，棄上清后，加入3mlTFB2溶液，渦旋振蕩，使菌體重懸，冰上放置15min；(7)重新混勻菌液后，按100μl/管的量將其分裝到已預(yù)冷的1.5mlEP管中，冰上放置4-6h直接用于轉(zhuǎn)化或置于-80℃儲(chǔ)存。6.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將外源DNA分子導(dǎo)入靶細(xì)胞或受體細(xì)胞，使靶細(xì)胞或受體細(xì)胞新增加一些能夠穩(wěn)定遺傳的性狀的技術(shù)。靶細(xì)胞或受體細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性通過物理方法，如電擊法或者化學(xué)方法，如CaCl2、RbCl等處理后會(huì)暫時(shí)發(fā)生改變，即細(xì)胞處于感受態(tài)，從而使外源性DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞。經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞在經(jīng)過抗性篩選后獲得帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。具體步驟如下：(1)配制LB培養(yǎng)基，以1000ml配置為例，配方如表3所示：表3LB培養(yǎng)基配置(2)室溫條件下解凍感受態(tài)細(xì)胞DH5α，解凍后立刻將其置于冰上，按質(zhì)粒：感受態(tài)細(xì)胞＝1:5比例加入相應(yīng)質(zhì)粒(質(zhì)粒10μl、感受態(tài)細(xì)胞50μl)，兩者充分混勻后，靜置冰浴30min；(3)在42℃水浴條件下熱休克，計(jì)時(shí)45s，后迅速冰浴1min；(4)加入700μlLB液體培養(yǎng)基，充分混勻后在溫度37℃、轉(zhuǎn)速200rpm的條件下培養(yǎng)1h；(5)在12,000rpm的轉(zhuǎn)速條件下離心1min后，倒掉上清，剩下菌液；(6)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將剩余菌液吹勻后涂于含Amp的LB-瓊脂平板培養(yǎng)基上，并用玻璃棒均勻涂板，正面向上放置培養(yǎng)板1h；(7)待培養(yǎng)基完全吸收菌液后倒置培養(yǎng)板，37℃條件下培養(yǎng)16-24h。7.質(zhì)粒擴(kuò)增(1)取出長滿菌落的培養(yǎng)皿，觀察菌落的形態(tài)后，挑選單克隆菌落；(2)將5ml的LB液體培養(yǎng)基和5μl卡納抗生素母液(母液和工作液的濃度比為1000:1)分別加入15ml離心管中；(3)用滅菌的白色小槍頭挑取選好的單克隆菌落后，連同白色小槍頭一起將菌落置于已加有培養(yǎng)的15ml離心管中，并將其放置在溫度37℃的搖床中過夜。8.質(zhì)粒提取依據(jù)Endo-FreePlasmidMiniKitII說明使用進(jìn)行如下操作：(1)將10-15mlLB培養(yǎng)基和卡納抗生素母液(母液和工作液的濃度比為1000:1)分別加入到50ml已滅菌的離心管中，擴(kuò)增攜帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌；(2)室溫條件下，轉(zhuǎn)速5,000g，離心菌液10min；(3)倒掉上清，用500μlSolutionI/RNaseA重懸細(xì)菌沉淀，并混勻；(4)菌液混勻后轉(zhuǎn)移其至新的無菌的2ml離心管中，然后加500μlSolutionII，緩慢上下顛倒、轉(zhuǎn)動(dòng)離心管數(shù)次，觀察到菌液澄清后，停止混勻，室溫條件下靜置離心管2min；(5)向離心管中加入250μlice-cold的BufferN3溶液，緩慢上下顛倒、旋轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，看到白色絮狀沉淀形成后離心，離心條件為室溫，但最好在4℃，轉(zhuǎn)速大于12,000g每分鐘，離心10min；(6)將上清液小心地轉(zhuǎn)移至新的滅菌的1.5ml離心管中，并用等體積的ETRBindingBuffer溶液混勻；(7)將潔凈的HiBindDNAMini柱放置在配套的2ml收集管中，并吸取700μl的上述混合液于Mini柱中，轉(zhuǎn)速10,000g，室溫條件下離心1min。去掉收集管內(nèi)離心下來的液體，并重復(fù)使用；(8)重復(fù)步驟7，直到混合液全部經(jīng)過Mini柱；(9)加500μlETRWashBufferI于Mini柱內(nèi)。轉(zhuǎn)速10,000g，室溫條件下離心1min。倒掉收集管內(nèi)離心下來的液體，重復(fù)利用收集管；(10)向Mini柱內(nèi)加500μlBufferEHB，轉(zhuǎn)速10,000g，室溫條件下離心1min。倒掉收集管內(nèi)離心下來的液體，重復(fù)利用收集管；(11)向Mini柱內(nèi)加700μl已用酒精稀釋的DNAWashBuffer，轉(zhuǎn)速10,000g，室溫條件下離心1min，去掉收集管中離心下來的液體；(12)重復(fù)步驟11；(13)去掉收集管內(nèi)離心下來的液體后，空管離心，轉(zhuǎn)速調(diào)至大于等于13,000g，室溫條件下離心3min；(14)將Mini柱放入新的1.5ml的離心管中，并向Mini柱內(nèi)加60-100μlEndotoxin-FreeBuffer溶液溶解積累在Mini柱膜上質(zhì)粒，室溫條件下靜置2min后，用轉(zhuǎn)速大于等于13,000g的離心機(jī)離心1min。扔掉Mini柱，保留1.5ml離心管。9.細(xì)胞復(fù)蘇(1)從液氮中取出需要復(fù)蘇的人宮頸癌細(xì)胞Hela和人乳腺癌細(xì)胞MAD-MB-231凍存管，用鑷子將凍存管立刻夾放在37℃水浴鍋中，快速搖晃凍存管，使凍存細(xì)胞融化；(2)將融化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中，加入2ml培養(yǎng)基后，在轉(zhuǎn)速1000rpm每分鐘的條件下，離心5min，小心吸取上清，用1ml完全培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS+P/S)吹打懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。10.細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞均使用含100U/ml青霉素(Penicillin)、100U/ml鏈霉素(Streptomycin)和10％FBS胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在CO2濃度為5％、溫度為37℃、濕度狀態(tài)飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，用含EDTA濃度為0.25％的胰蛋白酶(Trypsin)消化細(xì)胞，在轉(zhuǎn)速為1000rpm每分鐘條件下離心3min，將離心得到的細(xì)胞沉淀重懸后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代，每2-3天傳代或者更換培養(yǎng)基。11.細(xì)胞鋪板(1)胰蛋白酶消化處于生長期的細(xì)胞，并用含10％FBS培養(yǎng)基中和胰蛋白酶的消化作用，轉(zhuǎn)速1,000rpm條件下離心3min，2ml培養(yǎng)基重懸離心沉淀下來的細(xì)胞；(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)：先將細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍稀釋，即吸取10μl細(xì)胞懸液于90μl培養(yǎng)基中并混勻，接著，將干凈的蓋玻片蓋在酒精擦拭過的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上后，吸取混勻的稀釋過的10μl細(xì)胞懸液沿著蓋玻片邊緣打到計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)數(shù)(一般中皿長滿計(jì)500萬細(xì)胞，大皿長滿計(jì)1500萬細(xì)胞，依細(xì)胞種類和大小而定)；(3)根據(jù)孔板調(diào)節(jié)細(xì)胞鋪板密度及培養(yǎng)基量：表4細(xì)胞鋪板密度孔板類型細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)基體積6孔板20-50萬/每孔2ml12孔板20-30萬/每孔1ml24孔板10-20萬/孔500μl96孔板5000-8000/孔100μl12.細(xì)胞轉(zhuǎn)染本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，所用試劑為Invitrogen公司的Lipofectamine3000，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：(1)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇相應(yīng)的培養(yǎng)板及接種的細(xì)胞數(shù)量接種細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度在70％-90％，一般需要24h，細(xì)胞數(shù)目滿足條件后開始轉(zhuǎn)染；(2)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的配制：在2個(gè)1.5ml的離心管中，使用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipofectamine3000試劑和DNA質(zhì)粒，然后將兩管培養(yǎng)基混合，并充分混勻后室溫條件下靜置孵育5min。DNA質(zhì)粒指的是表達(dá)OligomerRNA的對(duì)照組質(zhì)粒以及表達(dá)asRNA的實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒。具體稀釋比例如下：表5轉(zhuǎn)染復(fù)合物(3)取靜置孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物吹打混勻后，緩慢逐滴加入到對(duì)應(yīng)孔板中，把孔板放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)前輕輕搖勻，轉(zhuǎn)染4-6h后棄掉含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，更換成新的培養(yǎng)基。繼續(xù)將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4天，然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。13.細(xì)胞RNA提取(1)吸去孔板中的培養(yǎng)基，然后將500μlTrizol試劑于每孔，室溫反應(yīng)5min，待貼壁細(xì)胞全部脫落后轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5ml離心管中，室溫條件下細(xì)胞裂解15min；(2)在預(yù)冷的低溫高速離心機(jī)以溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為12,000rpm的條件離心15min，離心后可見溶液分為三層，最上面的上清液為需要回收的RNA層，中間的蛋白質(zhì)層和下層的有機(jī)層則直接棄掉；(3)將含RNA的上清液吸取到另一滅菌的1.5ml離心管中(注意避免吸到蛋白層)，加入體積和上清液相等的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，室溫條件下靜置15min，用已經(jīng)預(yù)冷的低溫高速離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為12,000rpm每分鐘的條件下，離心10min，白色的RNA會(huì)沉淀于管底，小心吸去上清；(4)按75％乙醇與Trizol體積比大于等于1的原則，加入用滅菌雙蒸水處理過的75％乙醇懸浮沉淀，上下緩慢顛倒離心管進(jìn)行RNA洗滌，用4℃已經(jīng)預(yù)冷的低溫高速離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為7,500rpm每分鐘的條件下，離心5min。清洗步驟重復(fù)1-2次；(5)吸去上清，室溫條件下靜置約10min，自然干燥RNA沉淀，加入適量(10-50μl)的滅菌的DEPC水于55-60℃溫度下溶解；(6)用ThermoNanoDrop2000紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品濃度進(jìn)行測(cè)定，其中作為空白對(duì)照的是滅菌的去離子水，讀取OD260和OD280后并計(jì)算OD260/OD280比值，用來分析RNA純度(OD260/OD280的比值在1.8-2.0之間說明提取的RNA純度較好，OD260/OD280＜1.8表示有蛋白質(zhì)污染，OD260/OD280＞2.2表示RNA已降解)。0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量；(7)記錄每管RNA的濃度、純度及提取時(shí)間，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?4.反轉(zhuǎn)錄(ReverseTranscription，RT)反應(yīng)根據(jù)日本ReverTraAce-α-TMFirstStrandcDNASynthesisKit試劑盒說明書(所有操作均在冰上進(jìn)行)：(1)融化模板RNA和反轉(zhuǎn)錄試劑，緩慢顛倒數(shù)次混勻并離心數(shù)十秒；(2)按照下表成份配制反應(yīng)液用來去除RNA基因組中DNA雜質(zhì)；表6去DNA混合液(3)滅活DNA酶：去除DNA的反應(yīng)結(jié)束后，將離心管迅速置于冰上，加入1μl10mM的EDTA試劑后，充分振蕩混勻，65℃條件下處理10min；(4)合成cDNA：參照說明書配制如下反轉(zhuǎn)錄體系：表7反轉(zhuǎn)錄體系反應(yīng)組分體積(μl)DNaseI處理過的RNA(1μg)115×RT-Buffer4DntpMixture2Oligo(dT)201RNaseInhibitor1ReverTraAce1Total20(5)振蕩混勻，稍離心后，繼續(xù)以下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后于-20℃條件下保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。表8反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件反應(yīng)溫度孵育條件42℃30min99℃5min4℃5min15.引物合成本實(shí)驗(yàn)所用引物代由上海生工生物工程股份有限公司合成。表9引物序列16.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(1)參照SYBRPremixExTaqTMII使用說明書配制下表反應(yīng)混合液：表10實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系(2)上述反應(yīng)體系混勻后向96孔反應(yīng)板中加樣，封膜，室溫下1000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘去除氣泡；(3)按如下表反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：表11實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件(4)數(shù)據(jù)分析：本實(shí)驗(yàn)采用數(shù)據(jù)分析方法為2-ΔΔCt法，采用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件分析結(jié)果和GraphPadPrism6.0軟件作圖。17.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液后標(biāo)記為0H，向其中加入培養(yǎng)基體積1/10的CCK-8；(2)將孔培養(yǎng)板繼續(xù)放置于5％CO2和37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)約1-4h，取出孔板用MultiscanGO在450nm波長處檢測(cè)OD值，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)24H、48H和72H時(shí)CCK-8處理方法同上，注意CCK-8孵育時(shí)間一致。18.EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染換液48H后進(jìn)行EdU標(biāo)記，標(biāo)記方法如下：(1)用細(xì)胞培養(yǎng)基按1000:1的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50μMEdU培養(yǎng)基；注：①EdU濃度與孵育時(shí)間相關(guān)，短時(shí)間孵育(<2h)宜采用高濃度(10～50μM)，長時(shí)間孵育(>24h)宜采用低濃度(1～10μM)；②如果需配置10μMEdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000：1稀釋比例；③配置好的培養(yǎng)基的保存時(shí)間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)。(2)每孔加入500μl50μMEdU培養(yǎng)基孵育2小時(shí)，棄培養(yǎng)基；注：①最佳孵育時(shí)間與細(xì)胞周期相關(guān)(表12)，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞系均可采用2小時(shí)孵育時(shí)間；②EdU培養(yǎng)基用量以沒過細(xì)胞為宜，但需要保證EdU孵育時(shí)間內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供給(表13)。表12EdU孵育時(shí)間設(shè)定參考表13EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考(3)PBS清洗細(xì)胞1-2次，每次5min；注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細(xì)胞類型而定，貼壁不牢的細(xì)胞請(qǐng)降低清洗強(qiáng)度。(4)細(xì)胞固定化每孔加入500μl細(xì)胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室溫孵30min，棄固定液；每孔加入500μl2mg/mL甘氨酸，脫色搖床孵育5min后，棄甘氨酸溶液；(5)每孔加入500μLlPBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS；(6)(加強(qiáng))每孔加入500μl滲透劑(0.5％TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10min；PBS清洗1次，5min。(7)Apollo染色每孔加入500μl的1X染色反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；加入500μl滲透劑(0.5％TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2-3次，每次10min，棄滲透劑；(加強(qiáng))每孔每次加入500μl甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清洗1次，每次5min。(8)DNA染色用去離子水按100:1的比例稀釋試劑F，制備適量1XHoechst33342反應(yīng)液，避光保存；每孔加入500μl1XHoechst33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30min后，棄染色反應(yīng)液；每孔每次加入500μlPBS清洗1-3次；建議染色完成后立即進(jìn)行觀測(cè)拍照；如果條件限制，請(qǐng)避光4℃濕潤保存待測(cè)，但不應(yīng)超過3天。19.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移(1)細(xì)胞鋪板本實(shí)驗(yàn)所用孔板為6孔板，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化離心后適量接種于6孔板，每孔2ml細(xì)胞懸液。(2)劃痕處理培養(yǎng)板接種細(xì)胞之前先用標(biāo)記筆在6孔板背面畫橫線標(biāo)記(方便拍照時(shí)定位同一個(gè)視野)；細(xì)胞鋪6孔板培養(yǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，數(shù)量以細(xì)胞轉(zhuǎn)染貼壁后鋪滿板底為宜；細(xì)胞轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后用白槍頭(2.5μl)比著垂直于板背后橫線的直尺，盡量槍頭垂直于孔板劃一道痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致；輕輕搖晃以除去劃落細(xì)胞，吸去舊培養(yǎng)基，并用滅菌1×PBS輕輕洗孔板3次，換上無血清培養(yǎng)基；拍照記錄劃痕寬度；16小時(shí)后再次拍照記錄劃痕寬度。20.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移(1)細(xì)胞鋪板本實(shí)驗(yàn)所用孔板為12孔板，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化離心后適量接種于12孔板，每孔1ml細(xì)胞懸液。(2)Transwell處理細(xì)胞接種前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24h，進(jìn)一步去除血清的影響(但這一步并不是必須的)；消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，(用PBS洗1-2遍)，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，并調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml；取細(xì)胞懸液100μl加入Transwell小室；24孔板下室一般加入600μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基；常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞12-48h(主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定)。24h較常見，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視；取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，甲醇固定30min，將小室適當(dāng)風(fēng)干；0.1％結(jié)晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍；對(duì)染色的細(xì)胞拍照后用33％的冰醋酸溶解細(xì)胞，并測(cè)定細(xì)胞在波長570nm處的吸收值，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。21.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(1)試劑配置①洗滌工作液濃洗滌液按1:25倍用去離子水進(jìn)行稀釋。例如用量筒量取240ml去離子水，倒入燒杯或者其他潔凈容器中，再量取10ml濃洗滌液，均勻加入，攪拌均勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。②辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液辣根過氧化物酶標(biāo)記物按1:100倍用辣根過氧化物酶標(biāo)記物稀釋液進(jìn)行稀釋。如10ul辣根過氧化物酶標(biāo)記物加990ul辣根過氧化物酶標(biāo)記物稀釋液，輕輕混勻，在臨用錢10分鐘內(nèi)配妥。(2)樣本采集及保存①細(xì)胞在24孔板中轉(zhuǎn)染48H后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，收集到對(duì)應(yīng)的1.5mlEP管中：胰酶100μl/孔+全陪200μl/孔終止；②1000轉(zhuǎn)離心5min，去上清；③400μl冷PBS/孔重懸細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心，3min，去上清；④200μl冷PBS/孔再次重懸細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心，3min，去上清；⑤100μl冷PBS/孔重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至-80°保存待明天或繼續(xù)⑥；⑥反復(fù)凍融：-80°凍存30min，立即轉(zhuǎn)至37°水浴鍋30min；重復(fù)3次。(3)將各種試劑移至室溫(18-25℃)平衡至少30分鐘；(4)加樣：每孔待測(cè)樣本100μl。輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37°溫育30分鐘；(5)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2分鐘，200μl/每孔，甩干；(6)每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記物工作液100μl，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37°溫育30分鐘；(7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2分鐘，200μl/每孔，甩干；(8)依序每孔加底物溶液90μl，37°避光顯色20分鐘；(9)依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)；(10)在反應(yīng)終止后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。22.Hoechst法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(1)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將培養(yǎng)基吸出，然后用滅菌的1×PBS洗滌2-3次；(2)4％多聚甲醛固定20min；(3)吸除固定液，用滅菌1×PBS洗滌2次，每次3分鐘；(4)加入Hoechst33342染色液，室溫染色5-15分鐘，滅菌1×PBS洗2次，每次3分鐘；(4)取出爬片，反蓋在滴有封片液的載玻片上，稍晾干；熒光顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT-1表達(dá)水平的檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)組質(zhì)粒48h后，收集細(xì)胞，并在提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT-1表達(dá)水平結(jié)果如圖2所示。和對(duì)照組相比，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)asRNA質(zhì)粒后，兩種細(xì)胞中MALAT-1的表達(dá)水平都顯著降低(P<0.05)。2.Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)采用CCK-8和EdU兩種方法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化。如圖3和圖4所示，和對(duì)照組相比，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)asRNA質(zhì)粒后，兩種細(xì)胞的增殖能力都顯著降低(CCK-8，P<0.001；EdU，P<0.05)。圖3是利用CCK-8法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化。圖3的A部分中，和對(duì)照組相比，asRNA實(shí)驗(yàn)組中，Hela細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.001)；圖3的B部分中，和對(duì)照組相比，asRNA實(shí)驗(yàn)組中，MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.001)。圖4是利用EdU法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的變化。圖4的A、B部分中，Hoechst染料標(biāo)記的是所有細(xì)胞，EdU染料標(biāo)記的是24h內(nèi)增殖的細(xì)胞，Merge表示兩種染料標(biāo)記的細(xì)胞重疊。圖4的C部分中，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算增殖細(xì)胞占所有細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染asRNA后，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力明顯下降(P<0.05)。3.Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)向Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒和asRNA質(zhì)粒后，用用劃痕和Transwell兩種方法檢測(cè)兩種細(xì)胞遷移能力的變化。如圖5和圖6所示，轉(zhuǎn)染asRNA質(zhì)粒后的Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制(劃痕：Hela，P<0.01；MDA-MB-231，P<0.05；Transwell：Hela，P<0.01；MDA-MB-231，P<0.01)。圖5是利用劃痕法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化。對(duì)于圖5的A、B部分，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組和asRNA質(zhì)粒后，0H時(shí)劃痕處理后拍照，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞16h后，再拍照。對(duì)于圖5的C部分，計(jì)算16H后細(xì)胞遷移的比率，結(jié)果表明，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的asRNA能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移能力(HelaP<0.01，MDA-MB-231P<0.05)。圖6是利用Transwell法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化。對(duì)于圖6的A、B部分，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對(duì)照組和asRNA質(zhì)粒24H后，消化并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至Transwell小室中，繼續(xù)培養(yǎng)20H，細(xì)胞固定染色后拍照，用33％冰醋酸溶解細(xì)胞后測(cè)OD值。對(duì)于圖6的C部分，依據(jù)OD值的結(jié)果表明，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)asRNA的質(zhì)粒后細(xì)胞的遷移顯著下降(P<0.01)。4.Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的檢測(cè)將asRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞后，用ELISA和Hoechst染色兩種方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力的變化。如圖7和圖8所示，轉(zhuǎn)染asRNA質(zhì)粒的Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒的細(xì)胞。圖7是利用ELISA法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的變化。和對(duì)照組相比，asRNA實(shí)驗(yàn)組中，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡能力顯著提高(P<0.05)。圖8是Hoechst法檢測(cè)Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞凋亡能力的變化。對(duì)于圖8的A部分，用Hoechst染料標(biāo)記細(xì)胞，其中標(biāo)記較亮的為凋亡細(xì)胞。對(duì)于圖8的B部分，統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)目后并計(jì)算其比率，結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，asRNA實(shí)驗(yàn)組中，Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯多于對(duì)照組(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)利用Dicer酶能將長雙鏈RNA切割成短雙鏈RNA的特性，通過一段與Dicer酶高度親和的寡聚核苷酸(OligomerRNA)定向引導(dǎo)Dicer酶切割反義RNA-靶RNA雙鏈，最終達(dá)到降解靶RNA的目的。本實(shí)驗(yàn)選取與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MALAT-1基因的RNA作為靶RNA，將其反義RNA和OligomerRNA相連后，形成人工小RNA(ArtificialsmallRNA，asRNA)，選取Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。成功構(gòu)建轉(zhuǎn)錄asRNA質(zhì)粒后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其導(dǎo)入到Hela細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞中，其中對(duì)照組實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒為只轉(zhuǎn)錄OligomerRNA的質(zhì)粒。在親和力和堿基互補(bǔ)原則作用下，細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的反義RNA和Dicer、靶RNA形成一個(gè)復(fù)合體，接著，復(fù)合體中靶RNA和反義RNA中的互補(bǔ)序列形成的雙鏈RNA被Dicer酶剪切。該技術(shù)發(fā)揮結(jié)合內(nèi)源Dicer蛋白功能的核酸適配體OligomerRNA與發(fā)揮識(shí)別靶點(diǎn)RNA功能的反義RNA實(shí)現(xiàn)連接，形成人工反義RNA，這種新型器件可在細(xì)胞內(nèi)高親和性結(jié)合Dicer蛋白分子，并進(jìn)一步借助反義RNA特異性抑制RNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)利用適配體OligomerRNA定向誘導(dǎo)Dicer切割反義RNA-靶RNA雜交分子，高效實(shí)現(xiàn)降解靶RNA，有效地提高基因調(diào)控作用，拓寬了基因工程的方法路線，進(jìn)一步推動(dòng)了反義技術(shù)在基因調(diào)控中的研究，加強(qiáng)了其在功能基因組學(xué)、靶標(biāo)鑒定和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換。當(dāng)前第1頁1 2 3