本申請(qǐng)涉及藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地說(shuō)，涉及一種透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途、和包含透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：在種類繁多的多糖中，有一類雜多糖被稱為糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，也曾稱粘多糖(mucopolysaccharide)，其為不分支的長(zhǎng)鏈聚合物，由含己糖醛酸(角質(zhì)素除外)和己糖胺成分的重復(fù)復(fù)合單位構(gòu)成。糖胺聚糖主要有透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素和肝素等，它們與生物體內(nèi)很多生理過(guò)程密切聯(lián)系，因此對(duì)糖胺聚糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、以及功能化進(jìn)行研究具有重大的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。其中，透明質(zhì)酸(hyaluronicacid、hyaluronan、HA)作為非常重要的一員，具有多樣的生理功能和優(yōu)良的物化性質(zhì)，而且作為人體中無(wú)處不在的免疫性多糖，對(duì)許多細(xì)胞和組織功能至關(guān)重要。透明質(zhì)酸是一種直鏈聚陰離子多糖，由(1→4)-β-D-葡萄糖醛酸和(1→3)-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復(fù)單元組成，其結(jié)構(gòu)如下所示：透明質(zhì)酸廣泛存在于動(dòng)物的各種組織中，具有特殊的生理功能。透明質(zhì)酸除保水作用外還具有調(diào)節(jié)滲透壓、維持組織形態(tài)、屏障擴(kuò)散、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)和緩沖應(yīng)力等生理功能。更為重要的是，透明質(zhì)酸能夠被特定的細(xì)胞受體，如CD44，識(shí)別從而調(diào)控細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、分化和激活特異性細(xì)胞類型，調(diào)控免疫反應(yīng)、血管化和愈合過(guò)程。近年來(lái)，以合成或天然聚合物為載體，通過(guò)共價(jià)結(jié)合治療藥物制備共價(jià)軛合物來(lái)延長(zhǎng)藥物半衰期或降低其毒副作用的研究已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。其中透明質(zhì)酸以其優(yōu)良特性成為了制備軛合物的首選載體：①透明質(zhì)酸具有良好的生物降解性、生物相容性、無(wú)毒、無(wú)抗原性，在體內(nèi)可酶解消除；②透明質(zhì)酸分子中含有大量羧基、羥基和N-乙酰氨基，這些基團(tuán)均可被化學(xué)修飾，尤其是羧基易與小分子藥物結(jié)合，并保持較高的載藥率；③透明質(zhì)酸與藥物共價(jià)結(jié)合能夠延長(zhǎng)藥物的半衰期、提高穩(wěn)定性、降低免疫原性和提高藥物溶解性；④透明質(zhì)酸與其特異性受體CD44的專一性結(jié)合使HA藥物軛合物具備藥物增稠、靶向治療作用，同時(shí)也能達(dá)到緩釋、控釋的目的。目前，透明質(zhì)酸及其衍生物已被廣泛用作多種抗癌藥物、多肽和蛋白類藥物的載體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)制備成HA藥物軛合物之后能夠延長(zhǎng)藥物在用藥部位的存留時(shí)間，提高生物利用度，減少給藥次數(shù)，降低不良反應(yīng)。然而透明質(zhì)酸作為藥物載體也存在一些問(wèn)題：①透明質(zhì)酸為高聚物，其分子量存在不均一性，因此其與藥物的綴合物的連接位點(diǎn)、載藥量并不是精確確定的；②不同分子量的透明質(zhì)酸對(duì)CD44的作用并不相同，且機(jī)理尚未確定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本申請(qǐng)的發(fā)明人采用結(jié)構(gòu)確定的透明質(zhì)酸寡糖組裝成糖簇，利用其糖簇效應(yīng)，既保證了其活性，又克服了其諸多不足。本申請(qǐng)的第一個(gè)目的是提供一種透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本申請(qǐng)的第二個(gè)目的是提供上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的用途。本申請(qǐng)的第三個(gè)目的是提供包含上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物。具體地說(shuō)，本申請(qǐng)以透明質(zhì)酸寡糖(四糖、六糖等)為起始原料，采用多功能基的分子(如多元醇、多元胺、樹(shù)枝狀大分子)作為分子骨架，合成了一系列具有式I的基于透明質(zhì)酸寡糖的糖簇。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽這里，式I中，m為2-4中的整數(shù)，優(yōu)選地，m＝2或3；n為2-15中的整數(shù)，優(yōu)選地，n為2、3、4、5、6、8、或9；L1為與糖直接相連的連接臂-1，選自直鏈或支鏈C1-C8烷烴亞基、氧代的直鏈或支鏈C1-C8烷烴亞基、C3-C8環(huán)烷烴亞基、或聚乙二醇亞基，優(yōu)選地，為聚乙二醇亞基，更優(yōu)選地，為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基、硫橋鍵、-HN-C(O)-或-(O)C-NH-的酰胺鍵結(jié)構(gòu)，更優(yōu)選地，為三氮唑基；L2為連接L1和T的連接臂-2，選自直鏈或支鏈C1-C8烷烴亞基、氧代的直鏈或支鏈C1-C8烷烴亞基、C3-C8環(huán)烷烴、或聚乙二醇亞基；優(yōu)選地，亞基為-CH2-、-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-或-CH2CH2CH2C(O)-；Y為糖簇的多官能團(tuán)支架，即帶有多羥基或多氨基的樹(shù)枝狀大分子化合物基團(tuán)；優(yōu)選地，選自2-叔丁氧羰酰氨基-1,3-丙二醇、甘油、季戊四醇、沒(méi)食子酰丙胺或聚酰胺PAMAM。在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝2；n＝2；L1為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2-；Y為2-叔丁氧羰酰氨基-1,3-丙二醇，即：在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝2；n＝3；L1為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2-；Y為甘油，即：在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝2；n＝4；L1為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2-；Y為季戊四醇，即：在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝2；n＝8；L1為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2CH2CH2C(O)-；Y為G1-PAMAM，即：在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝2；n＝9；L1為-CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；Y為沒(méi)食子酸衍生物，即：在本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物，其中，m＝3；n＝3；L1為-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-；T為三氮唑基；L2為-CH2-；Y為甘油。本申請(qǐng)還提供了一種透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，所述化合物選自化合物10、化合物13、化合物17、化合物20、化合物23和化合物32。本申請(qǐng)所提供的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，選自酸加成鹽或堿金屬鹽；所述酸加成鹽選自無(wú)機(jī)酸鹽或有機(jī)酸鹽；所述無(wú)機(jī)酸鹽選自氫鹵酸鹽(如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、或氫碘酸鹽等)、硫酸鹽、硫酸氫鹽、或磷酸鹽等，優(yōu)選地為鹽酸鹽；所述有機(jī)酸鹽選自甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、馬來(lái)酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、枸櫞酸鹽、或蘋果酸鹽等；所述堿金屬鹽選自鉀鹽、鈉鹽或鋰鹽。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕谕该髻|(zhì)酸寡糖的糖簇，其中，原料透明質(zhì)酸寡糖既可以是商品化的試劑，也可以是通過(guò)寡糖合成方法合成的產(chǎn)物，更可以是通過(guò)酶降解高分子量透明質(zhì)酸后分離得到的產(chǎn)物。本申請(qǐng)也提供了上述如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為抗腫瘤藥物或者作為藥用靶向輔料(例如基因藥物載體)的用途。透明質(zhì)酸為高分子量聚糖，其粘性較高，成藥性較差，而本申請(qǐng)的透明質(zhì)酸寡糖糖簇在分子量相差數(shù)十倍的情況可以有效地克服這一缺點(diǎn)；不僅與CD44蛋白具有較好的結(jié)合力，而且對(duì)CD44高表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有一定的結(jié)合能力，且具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用。本申請(qǐng)又提供了包含上述如式I所示的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物，其中，所述透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物作為藥物組合物的活性成分、或者藥用靶向輔料(例如基因藥物載體)。附圖說(shuō)明圖1表示的是本申請(qǐng)透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物23和化合物13的石英晶體微天平結(jié)果。圖2表示的是本申請(qǐng)透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物20和化合物17的石英晶體微天平結(jié)果。圖3表示的是對(duì)照組劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4表示的是本申請(qǐng)透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物17劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖5表示的是高分子量透明質(zhì)酸劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步地說(shuō)明本申請(qǐng)的可實(shí)施性，并非對(duì)本申請(qǐng)保護(hù)范圍的限制。檢測(cè)儀器：核磁：BrukerAV-400型核磁共振儀，溶劑為CDCl3,TMS為內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜：BrukerAPEXIV型質(zhì)譜儀實(shí)施例1步驟(1)：(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-1,4,6-三-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺2的合成將10.0g(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺1溶于1.2L濃度為0.08M的冷氯化氫甲醇溶液中。而后將反應(yīng)液于4℃攪拌96h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用三乙胺中和至中性，而后減壓蒸餾，并濃縮至干。加入吡啶50mL，冷卻至0℃，緩慢滴加乙酸酐25mL后將反應(yīng)液緩慢升至室溫，并于室溫下攪拌24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在冰水浴中冷卻，緩慢滴加甲醇30mL，并于該溫度下攪拌1h，將反應(yīng)液減壓蒸餾后溶于300mL乙酸乙酯中，有機(jī)相依次用50mL濃度為1M的鹽酸洗滌3次，水相用100mL乙酸乙酯萃取三次。合并有機(jī)相，并依次用60mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，60mL飽和食鹽水洗滌1次，將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾，所得產(chǎn)品用二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝1:1:0.14(洗脫劑含0.1％三乙胺)快速硅膠柱層析純化，得14.8g白色固體?？偸章?3.8％。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1225.3777,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1225.3750。步驟(2)：(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺3的合成取10.0g(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-1,4,6-三-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺溶于100mL分析純四氫呋喃中，在攪拌下緩慢滴加6mL3-N,N-二甲基-氨基丙胺，并于室溫下攪拌3h。將反應(yīng)液用200mL氯仿稀釋，有機(jī)相用60mL濃度為1M的鹽酸溶液洗滌3次，水相用100mL氯仿萃取3次，合并有機(jī)相，用100mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌1次，60mL飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮得8.5g淡黃色粉末，收率88％。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1182.3599,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1182.3658。步驟(3)：O-(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺基)三氯乙酰亞胺酯4的合成取干燥的(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺粗品7.0g(6.0mmol)溶于60mL干燥二氯甲烷中，加入三氯乙腈6.7mL(60mmol)，將此混合物在氬氣氣氛下于冰水浴中冷卻。之后緩慢滴加1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯149μL(0.9mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌2.5h。待反應(yīng)完成后將反應(yīng)液減壓濃縮，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.10，含0.1％三乙胺)得5.5g白色無(wú)定形固體，收率79％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H,C＝NH),6.23(d,J＝3.7Hz,1H),5.84(d,J＝7.5Hz,1H),5.77(d,J＝9.6Hz,1H),5.21(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.15-5.07(m,3H),4.90(dd,J＝J＝9.4Hz,1H),4.83-4.73(m,4H),4.63(d,J＝7.8Hz,1H),4.59(ddd,J＝10.1Hz,3.8Hz,3.8Hz,1H),4.43(dd,J＝J＝9.7Hz,1H),4.29(dd,J＝4.2Hz,12.4Hz,1H),4.18(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.85(m,11H),3.72(s,3H),3.66-3.64(m,1H),3.14(ddd,J＝17.4Hz,8.0Hz,8.0Hz,1H),2.08-2.01(m,33H,COCH3)。13C(100MHz,CDCl3),171.0,170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,160.2,100.9,100.0,98.7,95.3,90.8,77.3,76.8,75.8,74.9,72.3,72.1,71.8,71.8,71.7,71.6,70.2,69.4,68.0,67.7,61.8,61.7,57.7,53.0,52.8,51.8,23.6,23.2,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1326.2768,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1326.2738。步驟(4)：O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉5的合成。取干燥的(((2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺基)三氯乙酰亞胺酯9.0g(6.8mmol)溶于80mL干燥二氯甲烷中，并于氬氣氣氛下在冰水浴中冷卻。緩慢滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯182μL(1.02mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌0.5h。待反應(yīng)完成后滴加150μL三乙胺淬滅反應(yīng)。將反應(yīng)液減壓濃縮至干，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.15，含0.1％三乙胺)得7.1g白色無(wú)定形固體，收率90％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.92(d,J＝6.6Hz,1H),5.82(d,J＝7.3Hz,1H),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.12(dd,J＝J＝9.0Hz,1H),5.06(dd,J＝J＝9.2Hz,1H),4.92-4.78(m,6H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(m,1H),4.41-4.30(m,2H),4.20(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.92(m,6H),3.82(s,3H),3.71-3.63(m,11H),3.41(m,2H),3.30(m,1H),3.01(m,1H),2.06-1.96(m,33H).13C(100MHz,CDCl3),171.2(2C),170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,100.7,100.0,99.4,98.3,77.9,76.7,75.6,74.5,72.3,72.2,72.2,71.9,71.8,71.7,71.6,70.4,69.9,69.4,68.9,68.5,68.1,62.4,62.0,58.1,57.5,52.9,52.7,50.7,23.6,23.4,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5；HRMS:計(jì)算值[M+H]+:1165.3566,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1165.3561。步驟(5)：1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷7的合成。取干燥的O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙?；?1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉5.0g溶于35mL干燥的三氯甲烷中,加入7.5g1-疊氮-2,4-二氧-6己醇6和無(wú)水氯化銅631mg。反應(yīng)液于下回流10h后加入10mL蒸餾水并繼續(xù)回流1h。將反應(yīng)液于室溫下冷卻，加入飽和碳酸氫鈉水溶液并劇烈攪拌。水相用10mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得無(wú)色糖漿。將該糖漿分散于30mL無(wú)水乙醚中劇烈攪拌12h，可見(jiàn)大量白色固體析出，過(guò)濾收集固體，將固體用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝1:1:0.10,含0.1％三乙胺)得4.84g白色無(wú)定形固體，收率84％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.08(m,2H,NHAc),5.20(dd,J＝J＝9.3Hz,1H),5.12(dd,J＝J＝9.0Hz,1H),5.06(dd,J＝J＝9.2Hz,1H),4.92-4.78(m,6H),4.65(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(d,J＝7.8Hz,1H),4.52(m,1H),4.41-4.30(m,2H),4.20(dd,J＝4.2Hz,12.5Hz,1H),4.12-3.92(m,6H),3.82(s,3H),3.71-3.63(m,11H),3.41(m,2H),3.30(m,1H),3.01(m,1H),2.06-1.96(m,33H)。13C(100MHz,CDCl3),171.2(2C),170.8,170.2,170.1,169.8,169.8,169.7,169.4,169.2,169.1,167.9,167.0,100.7,100.0,99.4,98.3,77.9,76.7,75.6,74.5,72.3,72.2,72.2,71.9,71.8,71.7,71.6,70.4,69.9,69.4,68.9,68.5,68.1,62.4,62.0,58.1,57.5,52.9,52.7,50.7,23.6,23.4,20.8,20.7,20.6,20.6,20.5,20.5。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:1339.4450,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1339.4482。步驟(6)：全保護(hù)糖簇9的合成取10.3mg1,2,3-三(炔丙基氧)丙烷8，加入1.6mL甲醇，0.2mL去離子水，加入221.1mg1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷7，2.7mg無(wú)水硫酸銅，32.7mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入10mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得145.3mg白色固體，收率91.0％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:4225.4326,實(shí)測(cè)值[M+H]+：4225.5108步驟(7)：糖簇化合物10的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇9溶于5mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入2.0mL1MLiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得70.1mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:3007.0535,實(shí)測(cè)值[M+H]+：3007.0312實(shí)施例2步驟(1)至步驟(5)同實(shí)例1。步驟(6)：全保護(hù)糖簇12的合成取109.1mg八己炔酰G-2PAMAM即化合物11加入4mL甲醇，0.5mL去離子水，加入643.3mg1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷7，7.7mg無(wú)水硫酸銅，95.1mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入20mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得563.3mg白色固體，收率89.3％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:12901.9322,實(shí)測(cè)值[M+H]+：12902.1628步驟(7)：糖簇化合物13的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇12溶于5mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入2.0mL1MLiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得76.4mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:9651.9177,實(shí)測(cè)值[M+H]+：9651.8161。這里，八己炔酰G-1PAMAM即化合物11的合成取143.2mgG1-PAMAM溶于2mL二氯甲烷中，滴入一滴N,N-二甲基甲酰胺，加入177.8mg5-己炔酸，184.0mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，130.0mg1-羥基苯并三唑，室溫?cái)嚢?4h。將溶劑蒸干，加入3mL甲醇溶解，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得205.7mg淺綠色油狀液體，收率94.2％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:2184.3744,實(shí)測(cè)值[M+H]+：2184.3046實(shí)施例3步驟(1)至步驟(4)同實(shí)例1。步驟(5)：3-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]-1-丙炔14的合成取干燥的O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉5.0g溶于35mL干燥的三氯甲烷中,加入2.5g炔丙醇和無(wú)水氯化銅631mg。反應(yīng)液于下回流10h后加入10mL蒸餾水并繼續(xù)回流1h。將反應(yīng)液于室溫下冷卻，加入飽和碳酸氫鈉水溶液并劇烈攪拌。水相用10mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得無(wú)色糖漿。將該糖漿分散于30mL無(wú)水乙醚中劇烈攪拌12h，可見(jiàn)大量白色固體析出，過(guò)濾收集固體，將固體用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝1:1:0.10,含0.1％三乙胺)得4.07g白色固體，收率78.2％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:1220.3755,實(shí)測(cè)值1220.3582步驟(6)：全保護(hù)糖簇16的合成取126.9mg化合物15，加入4mL甲醇，0.5mL去離子水，加入604.4mg3-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]-1-丙炔即化合物14，7.2mg無(wú)水硫酸銅，98.1mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入20mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得598.3mg白色固體，收率96.9％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:13522.7516,實(shí)測(cè)值13523.0645步驟(7)：糖簇化合物17的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇16溶于5mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入2.0mL1MLiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得72.8mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:9866.6108,實(shí)測(cè)值9866.8904實(shí)施例4步驟(1)至步驟(5)同實(shí)例1。步驟(6)：全保護(hù)糖簇19的合成取26.7mg2-叔丁氧羰基氨基-1,3-二(炔丙基氧)丙烷即化合物18，加入1.6mL甲醇，0.2mL去離子水，加入321.6mg1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷即化合物7，3.8mg無(wú)水硫酸銅，47.5mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入10mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得280.1mg白色固體，收率95.0％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:2947.0404,實(shí)測(cè)值[M+H]+：2947.0564步驟(7)：糖簇化合物20的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇19溶于5mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入2.0mL濃度為1M的LiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得72.4mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:2133.7843,實(shí)測(cè)值2133.7658實(shí)施例5步驟(1)至步驟(5)同實(shí)例1。步驟(6)：全保護(hù)糖簇22的合成取28.8mg1,3-二(炔丙基氧)-2,2-二(炔丙基氧基甲基)丙烷即化合物21，加入1.6mL甲醇，0.2mL去離子水，加入643.3mg1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷即化合物7，7.6mg無(wú)水硫酸銅，95.0mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入10mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得553.1mg白色固體，收率97.9％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:5647.9288,實(shí)測(cè)值[M+H]+：5647.9256步驟(7)：糖簇化合物23的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇22溶于10mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入4.0mL1MLiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得71.2mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:4022.4140,實(shí)測(cè)值4022.4195實(shí)施例6步驟(1)：(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-1,4,6-三-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺26的合成將10.0g(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-(2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(1→3)-2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺25溶于1.5L，0.08M的冷氯化氫甲醇溶液中。而后將反應(yīng)液于4℃攪拌96h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液用三乙胺中和至中性，而后減壓蒸餾，并濃縮至干。加入吡啶75mL，冷卻至0℃，緩慢滴加乙酸酐35mL后將反應(yīng)液緩慢升至室溫，并于室溫下攪拌24h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在冰水浴中冷卻，緩慢滴加甲醇45mL，并于該溫度下攪拌1h，將反應(yīng)液減壓蒸餾后溶于450mL乙酸乙酯中，有機(jī)相依次用75mL的1M鹽酸洗滌3次，水相用150mL乙酸乙酯萃取三次。合并有機(jī)相，并依次用90mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌2次，90mL飽和食鹽水洗滌1次，將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸餾，所得產(chǎn)品用二氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇＝1:1:0.14(洗脫劑含0.1％三乙胺)快速硅膠柱層析純化，得15.1g白色固體?？偸章?8.0％。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1785.5398,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1785.5406。步驟(2)：(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺27的合成取10.0g(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1-4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1-3)-1,4,6-三-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺26溶于100mL分析純四氫呋喃中，在攪拌下緩慢滴加6mL3-N,N-二甲基-氨基丙胺，并于室溫下攪拌3h。將反應(yīng)液用200mL氯仿稀釋，有機(jī)相用60mL的1M鹽酸溶液洗滌3次，水相用100mL氯仿萃取3次，合并有機(jī)相，用100mL飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌1次，60mL飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮得8.8g淡黃色粉末，收率90.2％。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1743.5292,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1743.5246。步驟(3)：O-(((2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺基)三氯乙酰亞胺酯28的合成取干燥的(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-吡喃葡萄糖胺277.0g(6.0mmol)溶于60mL干燥二氯甲烷中，加入三氯乙腈6.7mL(60mmol)，將此混合物在氬氣氣氛下于冰水浴中冷卻。之后緩慢滴加1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯149μL(0.9mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌2.5h。待反應(yīng)完成后將反應(yīng)液減壓濃縮，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.10，含0.1％三乙胺)得5.8g白色無(wú)定形固體，收率76.5％。HRMS(ESI):[M+H]+計(jì)算值1886.4389,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1886.4405。步驟(4)：O-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙?；?1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉29的合成。取9.0g(6.8mmol)干燥的O-(((2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖胺)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-)-O-4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺基)三氯乙酰亞胺酯28溶于80mL干燥二氯甲烷中，并于氬氣氣氛下在冰水浴中冷卻。緩慢滴加三氟甲磺酸三甲基硅酯182μL(1.02mmol)。反應(yīng)液于0℃下攪拌0.5h。待反應(yīng)完成后滴加150μL三乙胺淬滅反應(yīng)。將反應(yīng)液減壓濃縮至干，并用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝3：1：0.15，含0.1％三乙胺)得7.2g白色無(wú)定形固體，收率87.8％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:1725.5187,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1725.5165。步驟(5)：1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷30的合成。取5.0g干燥的O-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙酰基-2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-2-甲基-(4,6-二-O-乙酰基-1,2-二脫氧-α-D-吡喃葡萄糖)[2,1-d]2-噁唑啉29溶于35mL干燥的三氯甲烷中,加入7.5g1-疊氮-2,4-二氧-6己醇6和無(wú)水氯化銅631mg。反應(yīng)液于下回流10h后加入10mL蒸餾水并繼續(xù)回流1h。將反應(yīng)液于室溫下冷卻，加入飽和碳酸氫鈉水溶液并劇烈攪拌。水相用10mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，用飽和NaCl水溶液洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，濃縮得無(wú)色糖漿。將該糖漿分散于30mL無(wú)水乙醚中劇烈攪拌12h，可見(jiàn)大量白色固體析出，過(guò)濾收集固體，將固體用硅膠快速柱色譜純化(二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇＝1:1:0.10,含0.1％三乙胺)得4.7g白色無(wú)定形固體，收率85.5％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:1725.5187,實(shí)測(cè)值[M+H]+：1725.5165。步驟(6)：全保護(hù)糖簇31的合成取10.3mg1,2,3-三(炔丙基氧)丙烷8，加入1.6mL甲醇，0.2mL去離子水，加入342.3mg1-疊氮-2,4-二氧-6-O-[(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-(2,3,4-三-O-乙?；?β-D-葡萄糖醛酸甲酯基)-(1→3)-(4,6-二-O-乙?；?2-脫氧-2-N-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基)]己烷30，2.7mg無(wú)水硫酸銅，32.7mg抗壞血酸鈉，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。將溶劑蒸干，加入10mL甲醇，濾去不溶物，以甲醇為洗脫劑過(guò)LH-20凝膠柱，旋干得285.0mg白色固體，收率96.3％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:5909.9441,實(shí)測(cè)值[M+H]+：5909.9356步驟(7)：糖簇化合物32的合成取100.0mg全保護(hù)糖簇31溶于5mL四氫呋喃、于冰鹽浴中冷卻，然后緩慢加入5.0mL1MLiOH水溶液、30％H2O2水溶液，滴加完畢后于室溫下反應(yīng)12h，待反應(yīng)完成后用“Amberlite”IR-120氧離子交換樹(shù)脂中和反應(yīng)液至中性。過(guò)濾去除樹(shù)脂，將濾液冷凍干燥，并在盛有無(wú)水氯化鈣的干燥器中干燥，得70.1mg白色固體，收率100％。HRMS:計(jì)算值[M+H]+:4144.3879,實(shí)測(cè)值[M+H]+：4144.5616效果例1表面等離子共振(SPR)測(cè)定本申請(qǐng)透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物與透明質(zhì)酸受體CD44蛋白的結(jié)合能力將CD44(R&D,RecombinanthumanCD44-Fc)固定于BiacoreT200的CM7芯片上。芯片先由EDC:NHS＝4：1活化液活化7min，CD44溶于10mMpH＝4醋酸鹽緩沖液配置成17μg/mL并流經(jīng)芯片5min。后由pH＝8.51M乙醇胺溶液封閉多余活性基團(tuán)。將本申請(qǐng)的糖簇化合物13、17、20、23配制成一定濃度的工作溶液，在BiacoreT200儀器上測(cè)定其與CD44結(jié)合能力?；衔锞幪?hào)KD(μM)133.072172.493205.195239.431SPR數(shù)據(jù)表明本申請(qǐng)的透明質(zhì)酸寡糖糖簇化合物與CD44蛋白均具有很好的結(jié)合能力。效果例2石英晶體微天平(QCM)測(cè)定透明質(zhì)酸寡糖糖簇對(duì)CD44高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的靶向性石英晶體微天平(QCM)是一種以質(zhì)量變化為依據(jù)的傳感器，具有高度的靈敏性。芯片(標(biāo)準(zhǔn)芯片，鍍金)預(yù)處理：紫外/臭氧處理10min，浸入10mL蒸餾水，2mL雙氧水，2mL氨水組成的混合溶液，75℃加熱5min，后用蒸餾水沖洗，超聲。用Ar氣流吹干。然后浸入5mM3-巰基丙酸中反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)完成后用乙醇洗，再用水洗，放入多聚賴氨酸中反應(yīng)1h。用水洗干凈晶片，用Ar氣吹干。本實(shí)驗(yàn)采用CD44高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231(北京大學(xué)藥學(xué)院)進(jìn)行測(cè)定。培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基，含10％血清，1％100U/ml青霉素和鏈霉素(雙抗)。細(xì)胞懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)基中。糖簇樣品用無(wú)血清培養(yǎng)基配制，濃度為1mg/mL。所用石英晶體微天平型號(hào)為Q-SenseE4。將處理好的芯片裝于流動(dòng)池中，先將細(xì)胞懸液固定于芯片表明，待基線穩(wěn)定后進(jìn)入待測(cè)樣品，流速為70μL/min。石英晶體微天平的結(jié)果(參見(jiàn)圖1和圖2)可以分析出：所合成的透明質(zhì)酸寡糖糖簇，即使是最小的二價(jià)糖簇，與CD44高表達(dá)的細(xì)胞也有一定的結(jié)合能力。效果例3劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定透明質(zhì)酸寡糖糖簇對(duì)遷移性腫瘤細(xì)胞遷移活動(dòng)的影響透明質(zhì)酸與其受體結(jié)合會(huì)影響細(xì)胞的一系列活動(dòng)，其中非常重要的一項(xiàng)是影響腫瘤細(xì)胞的遷移?，F(xiàn)有技術(shù)表明：較小分子量的透明質(zhì)酸會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，而高分子量的透明質(zhì)酸會(huì)抑制透明質(zhì)酸的遷移。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于12孔板，每孔1ml，置于孵箱(5％CO2，37℃)中培養(yǎng)24h。用含1％血清的培養(yǎng)基配制本申請(qǐng)化合物17和高分子量透明質(zhì)酸(MW>500kDa)濃度為100μg/ml的溶液。取出培養(yǎng)24h的細(xì)胞，用直尺和10μl槍頭槍頭在孔內(nèi)劃痕，棄去培養(yǎng)基，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗兩遍，加入配制好的藥液，每個(gè)濃度兩個(gè)孔，設(shè)置空白對(duì)照組。在孵箱中培養(yǎng)24h。賦育結(jié)束后，在倒置顯微鏡下，選取隨機(jī)視野，觀察細(xì)胞傷口愈合情況(參見(jiàn)圖3-5)。由圖可以看出，未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞劃痕接近愈合。以本申請(qǐng)化合物17(分子量為10kDa左右)處理過(guò)的細(xì)胞其劃痕依舊較寬，顯示了化合物17具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用；與分子量為500kDa以上的陽(yáng)性對(duì)照高分子量透明質(zhì)酸相同，也抑制該腫瘤細(xì)胞遷移的作用。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3