本發(fā)明涉及工業(yè)微生物酒精發(fā)酵技術領域，特別涉及一種酵母絮凝的可逆調控方法和應用。

背景技術：

酒精作為重要工業(yè)基礎原料，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化工等領域。近年來，隨著石油、煤炭等化石能源日漸枯竭及其燃燒廢氣對大氣環(huán)境污染日益嚴重，酒精作為一種可再生清潔能源愈發(fā)受到世界各國的重視。目前我國酒精年產量已居世界第三位，其中96.5％由微生物發(fā)酵制取，木薯、甘蔗糖蜜、甜高粱等非糧發(fā)酵原料倍受青睞，但酒精發(fā)酵行業(yè)也存在諸多亟待解決的難題，比如高能耗、高污染等?，F(xiàn)如今大部分酒精企業(yè)，由于分離設備投資大且運行能耗高，遂將發(fā)酵醪中的大量細胞隨蒸餾廢液排放，這不僅浪費細胞蛋白資源而且造成水體富化加重污染。近年來有學者提出利用自絮凝酵母進行酒精發(fā)酵，可以降低酵母分離能耗，但還存在一些應用過程中產生的問題。

酵母絮凝類型分為組成型(自發(fā)絮凝)和誘導型(外界因素誘導絮凝)，其中大部分自絮凝酵母為基因工程菌，絮凝特性現(xiàn)已普遍應用于啤酒發(fā)酵，淀粉質和糖質原料酒精發(fā)酵也有個別涉及，但未形成規(guī)?；I(yè)應用。專利CN200610025259.7《馴化選育的自絮凝酵母變異株及其應用》、CN101045937《燃料乙醇清潔生產技術》，發(fā)明人將絮凝酵母自沉降在四級串聯(lián)發(fā)酵罐的底部從而實現(xiàn)無載體酵母固定化連續(xù)酒精發(fā)酵，但是后級發(fā)酵罐酒精濃度可達到8～15％(v/v)，高酒精濃度可抑制酵母繁殖，導致后級發(fā)酵罐底部酵母老化且得不到補充和更新，終將導致發(fā)酵活力低、殘?zhí)歉叩葐栴}；專利CN102260139《一種酒精發(fā)酵醪液的分離方法》有提及用聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺分離酵母的方法，所用絮凝劑對酵母細胞有一定副作用，且該絮凝劑會將發(fā)酵醪中的大部分顆粒雜質包括纖維、灰分等一起絮凝，從而增加酵母回收利用的處理難度，另外該專利亦未提及絮凝酵母的解絮凝方法。誠然在細胞回收能耗方面，絮凝酵母要優(yōu)于游離酵母，絮凝酵母可形成毫米級的顆粒從而自我沉降，節(jié)省離心設備投資及運行能耗；然而在細胞數(shù)相同的情況下，游離細胞的總表面積遠大于絮凝酵母，即游離酵母與發(fā)酵液的傳質接觸面積更大，所以不論增殖亦或發(fā)酵速率，游離酵母都更具優(yōu)勢。絮凝特性是一把雙刃劍，一方面它有利于酵母自沉降回收，省卻離心設備、節(jié)約分離能耗；另一方面，絮凝酵母比表面積低、發(fā)酵活力低，不能均勻分布于整個發(fā)酵罐體，導致發(fā)酵周期長、出酒低、殘?zhí)歉?，因此絮凝酵母自沉降回收后必須采取特定的方法相應地解絮才能最大程度的恢復其發(fā)酵活力。目前自絮凝釀酒酵母應用于酒精發(fā)酵行業(yè)表現(xiàn)出三個缺陷：一，絮凝時間點不可控，全程或過早絮凝造成出酒率較低；二，絮凝性能遺傳不穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增多，絮凝性能逐漸下降甚至丟失；三，絮凝細胞回收后不經解絮凝便直接投入發(fā)酵使用，造成其活力低、出酒率低，發(fā)酵周期長。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種酵母絮凝的可逆調控方法，實現(xiàn)非自絮凝釀酒酵母游離細胞在發(fā)酵末期節(jié)能促絮凝分離以及絮凝后的釀酒酵母解絮凝成為游離細胞再發(fā)酵利用，解決絮凝釀酒酵母應用于酒精發(fā)酵過程時所表現(xiàn)出的低發(fā)酵率、遺傳不穩(wěn)定性、回收活力低等問題，此方法可充分結合并利用游離酵母和絮凝酵母各自的優(yōu)點以及避免兩者的缺點。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述酵母絮凝的可逆調控方法的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種酵母絮凝的可逆調控方法，包括以下步驟：

(1)以種子培養(yǎng)基為原料培養(yǎng)酵母，得到酵母種子液；其中，所述的酵母為非自絮凝酵母，即非組成型絮凝酵母；

(2)培養(yǎng)結束后，將步驟(1)中得到的酵母種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，得到發(fā)酵醪；

(3)往步驟(2)中得到的發(fā)酵醪中添加促絮凝劑，靜止沉降待其分層，將上層和下層分離，下層為酵母乳液；

(4)往步驟(3)中得到的酵母乳液中添加解絮凝劑，搖勻后接種至新的發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，得到發(fā)酵醪；

(5)到此終止；或是步驟(3)～(4)往復循環(huán)，酵母細胞得以重復利用。

步驟(1)中所述的酵母優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，可利用可發(fā)酵性碳水化合物發(fā)酵生產酒精和二氧化碳。

所述的釀酒酵母菌株優(yōu)選為釀酒酵母AS2.1190。

步驟(1)中所述的酵母種子液的細胞密度為0.8～1.5億/mL，優(yōu)選為0.85～1.35億/mL。

步驟(1)中所述的種子培養(yǎng)基的碳源包括淀粉質原料和糖質原料，可發(fā)酵性糖的濃度為2～5％(w/v)，pH值為4.5～6.8，pH值優(yōu)選為5。

所述的淀粉質原料和糖質原料優(yōu)選為可用于生產乙醇的原料。

所述的淀粉質原料包括糧食類淀粉質原料和非糧食類淀粉質原料。

所述的糧食類淀粉質原料為玉米、小麥和早秈稻中的一種或以上。

所述的非糧食類淀粉質原料為木薯、甘薯和龍舌蘭中的一種或以上。

所述的糖質原料包括甘蔗、甜菜、甜高粱莖稈和菊芋中的一種或以上。

步驟(1)中所述的種子培養(yǎng)基優(yōu)選為通過步驟(A)或步驟(B)得到的培養(yǎng)基：

(A)在固形物含量為10°Brix的糖蜜中添加尿素，尿素的終濃度為質量體積比0.2％，接著將pH值調至4.5～6.8，滅菌，得到種子培養(yǎng)基；

(B)將淀粉和水混合，糊化，接著添加淀粉酶液化，再加入糖化酶進行糖化；然后加入硫酸銨、酵母浸粉，將pH值調至4.5～6.8，滅菌，得到種子培養(yǎng)基；其中，每1.5g淀粉配比0.2g硫酸銨和0.5g酵母浸粉。

步驟(A)中所述的糖蜜優(yōu)選為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中的一種或兩種。

步驟(A)和步驟(B)中所述的pH值優(yōu)選為5。

步驟(A)和步驟(B)中所述的滅菌的條件優(yōu)選為于115℃滅菌20min。

步驟(B)中所述的淀粉優(yōu)選為木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、龍舌蘭淀粉中的一種或至少兩種；更優(yōu)選為木薯淀粉。

步驟(B)中所述的水是作為溶劑使用；其用量優(yōu)選為1.5g淀粉配比50mL水。

所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

步驟(B)中所述的糊化的條件優(yōu)選為于60℃保溫20～30min；優(yōu)選為20min。

步驟(B)中所述的淀粉酶優(yōu)選為α-淀粉酶。

所述的液化的條件優(yōu)選為95℃加熱60min；α-淀粉酶的用量為每1g淀粉配比20U的α-淀粉酶。

所述的糖化的條件優(yōu)選為65℃加熱20～30min，優(yōu)選為20min；糖化酶的用量為每1g淀粉配比100U的糖化酶。

步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源包括淀粉質原料和糖質原料，可發(fā)酵性糖的濃度為16～23％(w/v)，pH4.0～5.5，pH值優(yōu)選為4.5。

步驟(2)中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為通過步驟(C)或步驟(D)得到的培養(yǎng)基：

(C)在固形物含量為30°Brix的糖蜜中添加尿素，尿素的終濃度為質量體積比0.2％，接著將pH值調至4.5～6.8，滅菌，得到發(fā)酵培養(yǎng)基；

(D)將淀粉和水混合，糊化，接著添加淀粉酶液化，再加入糖化酶進行糖化；然后加入硫酸銨、酵母浸粉，將pH值調至4.5～6.8，滅菌，得到種子培養(yǎng)基；其中，每32g淀粉配比0.4g硫酸銨和0.5g酵母浸粉。

步驟(C)中所述的糖蜜優(yōu)選為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜中的一種或兩種。

步驟(C)和步驟(D)中所述的pH值優(yōu)選為4.5。

步驟(C)和步驟(D)中所述的滅菌的條件優(yōu)選為于115℃滅菌20min。

步驟(D)中所述的淀粉優(yōu)選為木薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、龍舌蘭淀粉中的一種或至少兩種；更優(yōu)選為木薯淀粉。

步驟(D)中所述的水是作為溶劑使用；其用量優(yōu)選為32g淀粉配比100mL水。

所述的水優(yōu)選為蒸餾水。

步驟(D)中所述的糊化的條件優(yōu)選為于60℃保溫20～30min，優(yōu)選為30min。

步驟(D)中所述的淀粉酶優(yōu)選為α-淀粉酶。

所述的液化的條件優(yōu)選為95℃加熱60min；α-淀粉酶的用量為每1g淀粉配比20U的α-淀粉酶。

所述的糖化的條件優(yōu)選為65℃加熱20～30min，優(yōu)選為30min；糖化酶的用量為每1g淀粉配比100U的糖化酶。

步驟(2)中所述的酵母種子液的接種量優(yōu)選為10～15％(v/v)。

步驟(2)和步驟(4)中所述的發(fā)酵為厭氧發(fā)酵。

步驟(3)還包括如下步驟：對分離出的上層清液進行酒精蒸餾。

步驟(3)中所述的促絮凝劑優(yōu)選為FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃和類黑精混合物中的一種或至少兩種；更優(yōu)選為類黑精混合物。

所述的類黑精混合物優(yōu)選為通過如下步驟制備得到：將75～85°Brix糖蜜加熱至85～95℃保持90～120min，得到類黑精混合物。

所述的糖蜜優(yōu)選為甘蔗糖蜜。

步驟(3)中所述的靜止沉降的時間為3～6min。

所述的促絮凝劑的添加量優(yōu)選為每升發(fā)酵液中添加5～10mg促絮凝劑。

步驟(2)和步驟(4)中所述的發(fā)酵的溫度為28～32℃，優(yōu)選為30～32℃。

步驟(4)中所述的解絮凝劑為EDTA(乙二胺四乙酸)、EDTA二鈉(乙二胺四乙酸二鈉)和細胞自溶物中的一種或至少兩種；更優(yōu)選為細胞自溶物。

所述的細胞自溶物通過如下步驟制備得到：取步驟(1)制備的酵母種子液中的一部分于50～60℃、100～200w超聲波振蕩20～30min。

所述的解絮凝劑的添加量為每升發(fā)酵液中添加100～500μL解絮凝劑。

步驟(5)中所述的循環(huán)次數(shù)優(yōu)選為5～8次。

所述酵母絮凝的可逆調控方法在酒精發(fā)酵中的應用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)自絮凝酵母存在遺傳性能不穩(wěn)定、不可操控的缺點，通過本發(fā)明的促絮凝方法，可成功實現(xiàn)酵母絮凝的可操控性，從時間、空間以及絮凝程度都可以得到很好的控制，控制發(fā)酵后期酵母絮凝可避免發(fā)酵不徹底、出酒率不高的問題。

(2)絮凝酵母有效傳質面積低、密度大，于發(fā)酵液中分布不均勻，導致發(fā)酵效率低，另外絮凝酵母團的內部酵母長期得不到營養(yǎng)供給，容易衰老和自溶，不經解絮凝直接回收利用會造成發(fā)酵活力低、出酒率低、殘?zhí)歉叩葐栴}，通過本發(fā)明的解絮凝方法，可成功實現(xiàn)絮凝酵母回收再發(fā)酵利用，其中解絮凝后的老化酵母在發(fā)酵階段逐漸自溶成為新生酵母的部分營養(yǎng)來源，同時在發(fā)酵前期酒度不高的情況下，不斷有新生酵母替代老化酵母，如此可大大提高回收酵母的發(fā)酵活力和回收使用次數(shù)。

(4)與聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺等絮凝方法相比，本發(fā)明促絮凝和解絮凝是可逆調控的，且本發(fā)明所用促絮凝和解絮凝劑的制備原料經濟、安全無毒并可兼做酵母營養(yǎng)素，另外本發(fā)明所用促絮凝劑只選擇性地誘導酵母絮凝而對其他顆粒雜質無絮凝作用。

(5)酵母繁殖需要耗用碳源、氮源及各種營養(yǎng)素，另外如果隨廢液排放會大量增加廢液CODcr，增加廢液處理難度，通過本發(fā)明的方法對酵母進行回收利用，不但可以節(jié)約回收分離能耗，還可以節(jié)省培養(yǎng)原料、增加出酒率，系統(tǒng)地實現(xiàn)節(jié)能減排。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的釀酒酵母絮凝可逆調控方法和應用的流程圖。

圖2為實施例1(一)、(二)中發(fā)酵液添加促絮凝劑和實施例1(一)中添加解絮凝劑后的酵母細胞顯微鏡鏡檢圖；其中，圖(A)是使用聚合氯化鋁促絮凝劑，圖(B)是使用類黑精混合物促絮凝劑，圖(C)是使用類黑精混合物促絮凝劑和細胞自溶物解絮凝劑。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

乙醇生產菌株

適用于本發(fā)明的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)必須是非自絮凝酵母，可以采用本領域常規(guī)的能夠將可發(fā)酵性糖轉化成乙醇和二氧化碳的任何釀酒酵母。

在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的釀酒酵母包括釀酒酵母AS2.1190(購于廣東省微生物菌種保藏中心)，它可適用于糖質和淀粉質原料發(fā)酵生產酒精。

可用于本發(fā)明的原料沒有特別限制，可以是任何淀粉質原料和糖質原料，尤其是目前用于乙醇生產中的原料。

在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的淀粉質原料選自糧食類淀粉質原料如玉米、小麥和早秈稻；及非糧食類淀粉質原料如木薯、甘薯、龍舌蘭。所述的糖質原料包括甘蔗、甜菜、甜高粱莖稈和菊芋。

注：1、細胞計數(shù)、酒精蒸餾方法采用GB/T 20886-2007；殘?zhí)菧y定采用菲林滴定法；發(fā)酵周期采用稱重測量直至失重速率≤0.05g/(100mL.h)。

2、濁度測試方法為采用濁度儀(WGZ-200濁度儀)進行檢測。

實施例1

一、本發(fā)明提供的酵母絮凝的可逆調控方法如圖1所示，具體步驟如下：

(1)種子酵母培養(yǎng)收集階段：將固形物含量為85°Brix的甘蔗糖蜜(廣東徐聞三和發(fā)展有限公司)用蒸餾水稀釋至10°Brix，按質量體積比0.2％添加尿素(廣州化學試劑廠)，pH值用濃硫酸(濃度為質量百分比98％，廣州化學試劑廠)調至5.0，取50mL于115℃滅菌20min，作為種子培養(yǎng)基。在無菌條件下，接一環(huán)新鮮釀酒酵母菌苔(AS2.1190)至種子培養(yǎng)基，30℃、100rpm培養(yǎng)16h，測得酵母數(shù)為0.85億/mL，得到酵母種子液。

(2)促絮凝劑和解絮凝劑的制備：將85°Brix甘蔗糖蜜于95℃水浴加熱90min作為促絮凝劑；取上述酵母種子液10mL于60℃、100w超聲波振蕩30min作為解絮凝劑。

(3)糖蜜發(fā)酵酒精階段：將85°Brix甘蔗糖蜜用蒸餾水稀釋至30°Brix，按質量體積比0.2％添加尿素，pH值用濃度為質量百分比98％的濃硫酸調至4.5，取100mL于115℃滅菌20min，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。無菌條件下，取10mL步驟(1)中得到的酵母種子液接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，套上發(fā)酵栓于30～32℃靜止發(fā)酵，每隔2～4h測失重，直至失重速率≤0.05g/(100mL.h)時發(fā)酵結束，往發(fā)酵液添加0.55mg步驟(2)中得到的促絮凝劑，搖勻1min，肉眼可見酵母絮凝沉降，靜止6min，吸取上清液約100mL用于蒸餾酒精和測殘?zhí)牵粚?μL步驟(2)中得到的解絮凝劑加入吸取上清液后剩余的10mL酵母乳液中，搖勻10秒后接入新發(fā)酵培養(yǎng)基，如此回收再利用8次。

二、常規(guī)的酵母絮凝方法作為對比例

(1)種子酵母培養(yǎng)收集階段：步驟與實施例1第(一)部分步驟(1)相同。

(2)糖蜜發(fā)酵酒精階段：將固形物含量為85°Brix的甘蔗糖蜜用蒸餾水稀釋至30°Brix，按質量體積比0.2％添加尿素，pH值調至4.5，取100mL于115℃滅菌20min，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。無菌條件下，取10mL步驟(1)中得到的酵母種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，套上發(fā)酵栓于30～32℃靜止發(fā)酵，每隔2～4h測失重，直至失重速率≤0.05g/(100mL.h)時發(fā)酵結束，往發(fā)酵液添加2.2mg聚合氯化鋁(鹽基度45～96％，天津市鼎盛鑫化工有限公司)，搖勻5min，肉眼可見慢慢絮凝沉降，靜止20min，吸取上清液約100mL用于蒸餾酒精和測殘?zhí)?，將剩?0mL酵母乳液接入新發(fā)酵培養(yǎng)基，如此回收再利用8次。

三、結果

(1)將實施例1第(一)部分步驟(3)促絮凝和解絮凝后得到的細胞進行鏡檢，同時將實施例1第(二)部分步驟(2)促絮凝效果進行對比，結果如圖2所示，A圖可見聚合氯化鋁將發(fā)酵醪中的細胞及大部分顆粒雜質(纖維、灰分晶體等)一起絮凝，B圖可見采用本發(fā)明的促絮凝劑則只選擇性地誘導酵母絮凝，同時C圖可以表明本發(fā)明解絮凝效果良好。

(2)將實施例1第(一)部分和第(二)部分中的各組回收再利用批次的發(fā)酵指標進行比對，結果如表1所示，可以看出采用本發(fā)明方法，回收再利用8次后，發(fā)酵周期由30h延長至32h，殘?zhí)怯?.54％升高至1.7％，酒分由10.15％(v/v)降至10％(v/v)，循環(huán)使用效果良好。對比例則隨著回收次數(shù)的增加、發(fā)酵率逐步降低，回收再利用8次后，發(fā)酵周期由42h延長至50h，殘?zhí)怯?.25％升高至3.84％，酒分由9.65％(v/v)降至8.8％(v/v)。產生這種結果：其一是由于聚合氯化鋁本身對酵母細胞有一定的負作用；其二是由于聚合氯化鋁將部分有害雜質絮凝對細胞產生毒害作用；其三是由于絮凝酵母有效傳質面積低、密度大、內部酵母易衰老和自溶，導致發(fā)酵效率低。本發(fā)明所用促絮凝劑和解絮凝劑的制備原料經濟、安全無毒并可兼做酵母營養(yǎng)素，另外本發(fā)明所用促絮凝劑只選擇性地誘導酵母絮凝而對其他顆粒雜質無絮凝作用。

表1實施例1第(一)部分和第(二)部分的發(fā)酵指標對比

實施例2：

一、本發(fā)明提供的酵母絮凝的可逆調控方法如圖1所示，具體步驟如下：

(1)種子酵母培養(yǎng)收集階段：稱取1.5g木薯粉(中山市弘欣生物科技有限公司)，加入50mL蒸餾水，于60℃水浴鍋中糊化20min，升溫至95℃添加30U的α-淀粉酶(酶活2000U/mL，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)液化60min，再降溫至65℃添加150U的糖化酶(酶活10000U/mL，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)糖化20min。上述過程中用玻璃棒不斷攪拌，保證傳質均勻，使木薯粉充分液化、糖化。冷卻后加入0.2g硫酸銨(廣州化學試劑廠)、0.5g酵母浸粉(青島高科園海博生物技術有限公司)，并調pH值至5.0，于115℃滅菌20min，作為種子培養(yǎng)基。無菌條件下，接一環(huán)新鮮釀酒酵母菌苔(AS2.1190)至種子培養(yǎng)基，30℃、100rpm培養(yǎng)20h，測得酵母數(shù)為1.35億/mL，得到酵母種子液。

(2)促絮凝劑和解絮凝劑的制備：將75°Brix甘蔗糖蜜于85℃水浴120min作為促絮凝劑；取上述酵母種子液10mL于50℃、200w超聲波振蕩20min作為解絮凝劑。

(3)木薯酒精發(fā)酵階段：稱取32g木薯粉，加入100mL蒸餾水，于60℃水浴鍋中糊化30min，升溫至95℃添加640U的α-淀粉酶液化60min，再降溫至65℃添加3200U的糖化酶糖化30min。上述過程中用玻璃棒不斷攪拌，保證傳質均勻，使木薯粉充分液化、糖化。冷卻后加入0.4g硫酸銨、0.5g酵母浸粉并調pH值至4.5，取100mL于115℃滅菌20min，作為發(fā)酵培養(yǎng)基。無菌條件下，取10mL步驟(1)中得到的酵母種子液接入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，套上發(fā)酵栓于30～32℃靜止發(fā)酵，每隔2～4h測失重，直至失重速率≤0.05g/(100mL.h)時發(fā)酵結束，往發(fā)酵液添加1mg步驟(2)中得到的促絮凝劑，搖勻1min，肉眼可見酵母絮凝沉降，靜止3min，吸取上清液約100mL測濁度后用于蒸餾酒精和測殘?zhí)?，?μL步驟(2)中得到的解絮凝劑加入吸取上清液后剩余的10mL酵母乳液中，搖勻10秒后接入新發(fā)酵培養(yǎng)基，如此回收再利用5次。

二、常規(guī)的酵母絮凝方法作為對比例

(1)種子酵母培養(yǎng)收集階段：步驟與實施例2第(一)部分步驟(1)相同。

(2)木薯酒精發(fā)酵階段：稱取32g木薯粉，加入100mL蒸餾水，于60℃水浴鍋中糊化30min，升溫至95℃添加640U的α-淀粉酶液化60min，再降溫至65℃添加3200U的糖化酶糖化30min。上述過程中用玻璃棒不斷攪拌，保證傳質均勻，使木薯粉充分液化、糖化。冷卻后加入0.4g硫酸銨、0.5g酵母浸粉，并調pH至4.5，取100mL于115℃滅菌20min。無菌條件下，取10mL步驟(1)得到的酵母種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，套上發(fā)酵栓于30～32℃靜止發(fā)酵，每隔2～4h測失重，直至失重速率≤0.05g/(100mL.h)時發(fā)酵結束，往發(fā)酵液添加50mg分子量為500萬的陰離子聚丙烯酰胺(天津市永大化學試劑有限公司)，搖勻1min，肉眼可見酵母絮凝沉降，靜止10min，吸取上清液約100mL測濁度后用于蒸餾酒精和測殘?zhí)?，剩?0mL酵母乳液接入新發(fā)酵培養(yǎng)基，如此回收再利用5次。

試驗結果如表2，可以看出采用本發(fā)明方法，回收再利用5次后，發(fā)酵周期由36h延長至38h，殘?zhí)怯?.12％微升至0.5％，酒分由13.2％(v/v)略降至12.9％(v/v)，循環(huán)使用效果理想。對比例則隨著回收次數(shù)的增加、發(fā)酵率逐步降低，回收再利用5次后，發(fā)酵周期由50h延長至56h，殘?zhí)怯?.89％升高至4.97％，酒分由12.70％(v/v)降至9.55％(v/v)。實施例2第(一)部分的上清液濁度為900NTU左右，實施例2第(二)部分的上清液濁為470NTU左右，間接反映了聚丙烯酰胺將酵母和發(fā)酵液中的部分雜質一起絮凝沉淀帶入新的發(fā)酵培養(yǎng)基，從而對酵母產生不利作用；另外聚丙烯酰胺粘附在酵母團周圍可進一步降低酵母傳質面積，最終導致發(fā)酵率越來越低。本發(fā)明所用促絮凝劑和解絮凝劑的制備原料經濟、安全無毒并可兼做酵母營養(yǎng)素，另外本發(fā)明所用促絮凝劑只選擇性地誘導酵母絮凝而對其他顆粒雜質無絮凝作用。

表2實施例2第(一)部分和第(二)部分的發(fā)酵指標對比

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。