本發(fā)明屬于植物病害預(yù)防技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芝麻枯萎病菌毒素的提取方法的專(zhuān)利申請(qǐng)。

背景技術(shù)：

芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的優(yōu)質(zhì)油料作物，也是我國(guó)重要的特色油料作物。

芝麻枯萎?。⊿esame Fusarium wilt）由尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型（Fusarium oxysporum f.sp.sesami，F(xiàn)OS）侵染引起，與莖點(diǎn)枯病并稱(chēng)為芝麻兩大主要真菌病害。我國(guó)芝麻枯萎病害主要發(fā)生在東北、華北、西北、黃淮以及江淮部分地區(qū)，常年發(fā)生率在15%左右，嚴(yán)重影響芝麻產(chǎn)量和品質(zhì)。

為探明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，國(guó)內(nèi)外先后開(kāi)展了枯萎病菌分離、鑒定及病原菌致病力鑒定方法等研究。2014年河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院首次建立了芝麻枯萎病菌致病力室內(nèi)鑒定技術(shù)體系，為芝麻FOS致病以及芝麻抗枯萎病機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐（仇存璞等，芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法，2014，植物病理學(xué)報(bào)，44(01)：26-35）。

以往研究結(jié)果顯示，尖孢鐮刀菌在侵入植株組織后多能產(chǎn)生毒素，并對(duì)植株造成毒害作用。2006年臺(tái)蓮梅等利用尖孢鐮刀菌毒素濾液評(píng)價(jià)了不同大豆品種對(duì)根腐病的抗病性，并將該方法用于大豆抗病植株的初篩工作。近期初步研究及內(nèi)部資料表明，芝麻枯萎病菌FOS同其他尖孢鐮刀菌相似，侵染芝麻后，菌絲體逐漸堵塞維管束，切段水分及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，從而導(dǎo)致植株發(fā)病。同時(shí)，F(xiàn)OS病原菌能夠產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等水解酶，對(duì)芝麻植株起到侵染作用（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研檔案記載）。但至今為止，尚未明確芝麻枯萎病菌是否能夠產(chǎn)生毒素，亦未見(jiàn)有關(guān)FOS毒素對(duì)芝麻毒害癥狀的公開(kāi)報(bào)道。因此，當(dāng)前急需一種提取芝麻枯萎病菌毒素的技術(shù)，以探明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，并為推動(dòng)芝麻病害基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種芝麻枯萎病菌毒素的提取方法，從而為相關(guān)芝麻病害研究奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種芝麻枯萎病菌毒素提取方法，包括以下步驟：

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型）菌株接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d左右，檢查菌株活性；

然后，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片，接入裝有PD培養(yǎng)液的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶接2~3片， 28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d；

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

以2層無(wú)菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對(duì)步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過(guò)濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

將接菌母液接入理查德培養(yǎng)基，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d；

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，以2層無(wú)菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液4000rpm離心15min，取上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過(guò)濾器中，真空抽濾，收集濾液，并用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值在3.0~3.5之間；

最后，向?yàn)V液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃取；取上層有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥后，濾除硫酸鈉，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品，即為含有芝麻枯萎病菌毒素的粗產(chǎn)品（簡(jiǎn)稱(chēng)粗毒素）。

初步測(cè)定表明，以中等致病力（20≤DI≤50）（參照仇存璞等，芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法，植物病理學(xué)報(bào)，2012)的芝麻枯萎病菌為例，采用上述方法，200mL菌液最終可提取含芝麻枯萎病菌毒素粗產(chǎn)品90~120毫克左右。

進(jìn)一步地，所提取的粗毒素可用于評(píng)價(jià)芝麻枯萎病菌對(duì)芝麻生長(zhǎng)的影響，初步試驗(yàn)表明，粗毒素濃度為1-10μg/mL時(shí)，芝麻幼苗的生長(zhǎng)即會(huì)受到明顯抑制。

更進(jìn)一步地，所提取的粗毒素用于評(píng)價(jià)芝麻枯萎病菌對(duì)芝麻生長(zhǎng)影響時(shí)的評(píng)價(jià)方法（或者說(shuō)粗毒素對(duì)芝麻的毒性測(cè)定方法）為，包括如下步驟：

（1）種子消毒與接種，具體為：

挑選飽滿(mǎn)健康的芝麻種子，先用清水沖洗種子表面3~5遍；

然后將種子浸泡于75%酒精中30 s，無(wú)菌水沖洗3遍；

再然后用3%次氯酸鈉浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗種子3~4遍；

將消毒后的種子放入裝有無(wú)菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（以無(wú)菌水剛剛浸沒(méi)種子為宜）；

挑選露白的芝麻種子，接種在MS固體培養(yǎng)基上，25℃、L//D=14 h//10 h光照/d條件下培養(yǎng)1周；

（2）配置含有粗毒素的MS培養(yǎng)基，具體為：

配置MS培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，1.5%瓊脂粉），分別加入上述所制備的粗毒素，使粗毒素濃度呈特定梯度濃度分布，如粗毒素濃度分別為1μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL；

（3）在含粗毒素培養(yǎng)基中接種芝麻幼苗，具體為：

無(wú)菌條件下，切取步驟（1）所培育的芝麻幼苗根莖基部以上部分（無(wú)根苗），分別接種于步驟（2）中所制備的含粗毒素的MS培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置空白MS培養(yǎng)基作為隱性對(duì)照；設(shè)置相關(guān)實(shí)驗(yàn)組別及對(duì)照組別時(shí)，需注意，為滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)及準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的需要，建議可以每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種6株無(wú)根苗；

（4）性狀統(tǒng)計(jì)及結(jié)果判定，具體為：

在步驟（3）中接種無(wú)根苗2周后，統(tǒng)計(jì)芝麻幼苗株高、生根數(shù)、根長(zhǎng)等數(shù)據(jù)，并拍照記錄，最終綜合評(píng)價(jià)粗毒素對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的抑制程度，也即，粗毒素對(duì)芝麻的毒性程度。

總體而言，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面：

（1）菌株培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)，確保能夠產(chǎn)生芝麻枯萎病菌毒素，本發(fā)明中通過(guò)采用預(yù)培養(yǎng)方式，結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)，確保相應(yīng)菌株能夠產(chǎn)生足夠的毒素，從而便于后續(xù)過(guò)程的制備和提取；

（2）芝麻枯萎病菌毒素提取過(guò)程簡(jiǎn)便易行，提取效果穩(wěn)定；與現(xiàn)有活性炭法（臺(tái)蓮梅等，2004）等提取技術(shù)相比，本發(fā)明主要包括離心過(guò)濾、乙酸乙酯萃取和真空蒸發(fā)等簡(jiǎn)要的步驟，該方法方法簡(jiǎn)便易行，具有較好可操作性；同時(shí)綜合而言，本發(fā)明的芝麻枯萎病菌毒素提取效率高、重復(fù)性較好、提取效果較為穩(wěn)定，因而具有較好地技術(shù)創(chuàng)造性；

（3）為芝麻抗性研究奠定了良好基礎(chǔ)；通過(guò)提取芝麻枯萎病菌毒素，并依此建立一種評(píng)價(jià)模型，可為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)芝麻枯萎病菌對(duì)芝麻生長(zhǎng)影響奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可為芝麻抗枯萎病機(jī)理研究及抗芝麻枯萎病種質(zhì)資源的篩選奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型菌株HSFO07021在PDA平板培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)結(jié)果；

圖2為用于培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型菌株HSFO07021菌片；

圖3為用乙酸乙酯萃取獲得的芝麻枯萎病菌毒素；

圖4為5μg/mL粗毒素處理?xiàng)l件下，豫芝11號(hào)幼苗生長(zhǎng)受到抑制情況；其中1、2圖分別為清水對(duì)照培養(yǎng)條件下豫芝11號(hào)幼苗和根生長(zhǎng)情況；3、4圖分別為5μg/mL粗毒素處理?xiàng)l件下豫芝11號(hào)幼苗和根生長(zhǎng)情況，從圖中可以看出，幼苗及根生長(zhǎng)受到明顯抑制。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步解釋說(shuō)明，在介紹具體實(shí)施例前，對(duì)下述實(shí)施例中涉及部分生物材料及培養(yǎng)基情況簡(jiǎn)要介紹說(shuō)明如下。

生物材料：

豫芝11號(hào)，由河南省農(nóng)科院芝麻種質(zhì)保藏中心提供，可從公開(kāi)渠道獲得；

下述實(shí)施例中所采用的尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型菌株HSFO07021，由河南省農(nóng)科院芝麻中心提供，可由公開(kāi)渠道獲得；下述實(shí)施例中提取方法僅以此菌株為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不應(yīng)理解為本發(fā)明的技術(shù)方案特定依賴(lài)于或者說(shuō)特定限定于該菌株。

培養(yǎng)基：

下述實(shí)施例中所涉及培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，主要有：

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-18g，蒸餾水1000mL；

PD培養(yǎng)液：與PDA平板培養(yǎng)基相比，不含瓊脂；

理查德培養(yǎng)基：KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，F(xiàn)eCl₃ 0.02g，蔗糖50g，蒸餾水1000mL。

實(shí)施例1

以尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型菌株HSFO07021為例，就本申請(qǐng)所提供的芝麻枯萎病菌毒素提取方法詳述如下。

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

用無(wú)菌牙簽將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻專(zhuān)化型）菌株HSFO07021接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，菌株活力較高，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

無(wú)菌條件，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片（如圖2所示），接入裝有200 mL PD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶接2~3片，28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d。

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

無(wú)菌條件下，以2層無(wú)菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對(duì)步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過(guò)濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

無(wú)菌條件下，取接菌母液2mL，接入裝有200mL理查德培養(yǎng)基的500mL三角瓶?jī)?nèi)，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d。

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，無(wú)菌條件下，以2層無(wú)菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過(guò)濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液分批裝入50mL離心管內(nèi)，4000rpm離心15min，收集并合并上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過(guò)濾器中，真空抽濾，收集并合并濾液，用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=3.0；

最后，向?yàn)V液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃??；于500mL分液漏斗中萃取3次，每次萃取15~20min；合并上層有機(jī)相，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，濾除硫酸鈉后，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品（如圖3所示），即為含有芝麻枯萎病菌HSFO07021菌株毒素的粗產(chǎn)品（簡(jiǎn)稱(chēng)粗毒素）。

最終測(cè)定結(jié)果表明，從上述200mL芝麻枯萎病菌濾液中可提取90~120mg左右的芝麻枯萎病菌毒素。

實(shí)施例2

對(duì)實(shí)施例1所制備的粗毒素產(chǎn)品，發(fā)明人對(duì)這一粗毒素產(chǎn)品對(duì)芝麻的毒性（粗毒素對(duì)芝麻生長(zhǎng)的影響）進(jìn)行了具體評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法如下所述。

（1）種子消毒與接種，具體為：

挑選飽滿(mǎn)健康的豫芝11號(hào)種子500粒，先用清水沖洗種子表面3~5遍；

然后將種子浸泡于75%酒精中30 s，無(wú)菌水沖洗3遍；

再然后用3%次氯酸鈉浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗種子3~4遍；

將消毒后的種子放入裝有10 mL無(wú)菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；

挑選露白的芝麻種子，接種在MS固體培養(yǎng)基上，每份培養(yǎng)基中接種50粒露白種子；25℃、L//D=14 h//10 h光照/d條件下培養(yǎng)1周；

（2）配置含有粗毒素的MS培養(yǎng)基，具體為：

配置MS培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，1.5%瓊脂粉），分別加入上述所制備的粗毒素，使粗毒素濃度分別為1μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL；

（3）在含粗毒素培養(yǎng)基中接種芝麻幼苗，具體為：

無(wú)菌條件下，切取步驟（1）所培育的芝麻幼苗根莖基部以上部分（無(wú)根苗），分別接種于步驟（2）中所制備的含粗毒素的固體MS培養(yǎng)基上，同時(shí)設(shè)置空白MS培養(yǎng)基作為隱性對(duì)照；每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種6株無(wú)根苗；

（4）性狀統(tǒng)計(jì)及結(jié)果判定，具體為：

在步驟（3）中接種無(wú)根苗2周后，統(tǒng)計(jì)芝麻幼苗株高、生根數(shù)、根長(zhǎng)等數(shù)據(jù)，并拍照記錄，最終綜合評(píng)價(jià)粗毒素對(duì)芝麻幼苗生長(zhǎng)的抑制程度（如圖4所示），也即，粗毒素對(duì)芝麻的毒性程度。

采用本技術(shù)方法所提取的芝麻枯萎病菌毒素（粗毒素）對(duì)芝麻幼苗進(jìn)行處理。從圖4中可以看出，2周后，清水對(duì)照組中芝麻幼苗處理1對(duì)真葉期，發(fā)根數(shù)量多在3-7個(gè)，長(zhǎng)約3-4cm，長(zhǎng)勢(shì)正常。5μg/mL枯萎病菌毒素處理的芝麻幼苗生長(zhǎng)緩慢，處于子葉展開(kāi)時(shí)期，未見(jiàn)根生長(zhǎng)，表明幼苗受到較嚴(yán)重的抑制。該結(jié)果表明，采用本技術(shù)方法提取出的芝麻枯萎病菌毒素對(duì)芝麻有毒害作用。