本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預(yù)測預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測ERC1異常為手段的腫瘤診斷、預(yù)測預(yù)后方法；及激活ERC1基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。
背景技術(shù)：
：下咽癌是嚴(yán)重危害人們生命和健康的常見頭頸部惡性腫瘤，病理類型多為鱗狀細胞癌。近年來，由于環(huán)境等多種不同致癌因素的共同作用，下咽癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。盡管以外科手術(shù)為主的綜合治療措施取得較大進展，但是下咽癌患者綜合治療后的年生存率仍無明顯的提高。盡管如此，臨床大量數(shù)據(jù)表明，治療的早晚對患者預(yù)后產(chǎn)生重要的影響。據(jù)統(tǒng)計，早期下咽癌治療效果相對較好，晚期下咽癌由局部浸潤和處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，治療效果較差，年生存率下降。由此，提高下咽癌療效的關(guān)鍵在于的早期診斷、早期治療。然而下咽癌早期診斷困難，目前尚沒有可靠的用于早期診斷的特異性指標(biāo)，因此，臨床上亟待尋找下咽癌相關(guān)的特異性腫瘤標(biāo)志物以輔助早期診斷。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測ERC1基因或蛋白表達差異來診斷下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測ERC1基因或蛋白表達差異來預(yù)測下咽癌預(yù)后的方法。本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過激活ERC1基因或ERC1蛋白來治療下咽癌的方法。本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療下咽癌的藥物的方法。本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療下咽癌的藥物。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了檢測ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品在制備下咽癌診斷工具中的用途。本發(fā)明還提供了檢測ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測下咽癌預(yù)后工具中的用途。進一步，所述檢測ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品包括檢測ERC1基因或ERC1蛋白的表達水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ERC1基因的表達水平；所述物質(zhì)能夠檢測ERC1蛋白的表達水平。本發(fā)明的檢測ERC1基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。進一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(AmplificationRefractoryMutationSystem，擴增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可擴增片段長度多態(tài)性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。上面所述的核酸包括擴增ERC1基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計，并通過化學(xué)合成來制備。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為QPCR實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如SEQIDNO.1(正向序列)和SEQIDNO.2(反向序列)所示。上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計，并通過化學(xué)合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。本發(fā)明的檢測ERC1蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、Western印跡等。本發(fā)明的檢測ERC1蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合ERC1蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)(雙抗體)、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測ERC1蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的ERC1蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對ERC1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMSO、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH(DojindoLaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)555標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyteFluor(TM)647標(biāo)記試劑盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight547和DyLight647(TechnoChemicalCorp.)、Zenon(TM)、AlexaFluor(TM)抗體標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒(InvitrogenCorporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(FunakoshiCorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標(biāo)記的抗體或其片段。作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。在本發(fā)明中，“預(yù)后”是指腫瘤患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。在本說明書中，預(yù)后可以是通過手術(shù)處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態(tài)。預(yù)后可以通過檢查生物標(biāo)志物即ERC1蛋白或編碼ERC1蛋白的基因來預(yù)測。預(yù)后預(yù)測可以這樣進行：根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。在本發(fā)明中，“預(yù)后良好”是指在通過手術(shù)處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘?，預(yù)后好可以意指在這樣長時間內(nèi)存活、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)、或無再發(fā)。例如，預(yù)后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如本文中所使用的，“預(yù)后良好”還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉(zhuǎn)移，但是惡性低且不嚴(yán)重地影響生存能力。在本發(fā)明中，“預(yù)后不良”是指患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短時期(例如1、2、3、4、5年或更短)內(nèi)發(fā)生致命狀況?；蛘撸A(yù)后差是指在這樣的短時期里死亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、或再發(fā)。例如，預(yù)后差可以意指至少3年或尤其至少5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或死亡。預(yù)測預(yù)后是指預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能以100％的準(zhǔn)確度預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果。預(yù)測預(yù)后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中ERC1基因或ERC1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。進一步，所述檢測ERC1基因或ERC1蛋白的產(chǎn)品可以是檢測ERC1基因或ERC1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌的工具，所述工具能夠檢測ERC1基因或ERC1蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ERC1基因的表達水平；所述物質(zhì)能夠檢測ERC1蛋白的表達水平。進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。進一步，所述診斷下咽癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知ERC1基因的異常與下咽癌相關(guān)也屬于ERC1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測下咽癌預(yù)后的工具，所述預(yù)測下咽癌預(yù)后工具包括能夠結(jié)合ERC1基因的核酸或者能夠結(jié)合ERC1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ERC1基因的mRNA水平；所述物質(zhì)能夠檢測ERC1蛋白的表達水平。進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。進一步，所述預(yù)測下咽癌預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷下咽癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知ERC1基因的異常與下咽癌相關(guān)也屬于ERC1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ERC1抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合ERC1即可。本發(fā)明還提供了一種診斷下咽癌或預(yù)測下咽癌預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：(1)獲取受試者的樣品；(2)檢測受試者樣品中ERC1基因或蛋白的表達水平；(3)將測得的ERC1基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。(4)與對照相比，ERC1基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被診斷為下咽癌，或該受試者被確定為預(yù)后不良。本發(fā)明還提供了一種下咽癌的治療方法，所述方法包括激活ERC1基因或ERC1蛋白。進一步，所述方法包括促進ERC1基因的表達，或促進ERC1蛋白的表達或增強ERC1蛋白的活性。本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量ERC1基因或者ERC1蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說，當(dāng)ERC1基因或者ERC1蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復(fù)正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。本發(fā)明還提供了一種含有ERC1基因或ERC1蛋白的激活劑的藥物。本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療下咽癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的ERC1基因或ERC1蛋白的激活劑不受限制，只要是可以促進或者增強ERC1或涉及ERC1上游或下游途徑的物質(zhì)的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。進一步，所述激活劑包括ERC1基因、ERC1蛋白、促進型miRNA、促進型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進型靶向小分子化合物。所述激活劑還包括包含攜帶ERC1基因的載體或者宿主細胞。本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補充內(nèi)源性的ERC1蛋白的缺失或不足，通過提高ERC1蛋白的表達，從而治療因ERC1蛋白缺乏導(dǎo)致的下咽癌。另一方面可以用于增強ERC1蛋白的活性，從而治療下咽癌。本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用?？梢耘c本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預(yù)防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司??；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素C、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應(yīng)修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來確定。在本發(fā)明的上下文中，“診斷下咽癌”既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有下咽癌、也包括判斷受試者是否存在患有下咽癌的風(fēng)險。本文所用的“治療”涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：(1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。術(shù)語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用)，其中可達到某些預(yù)期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術(shù)語“治療”中。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷下咽癌的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在下咽癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。另外，通過預(yù)測患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。本發(fā)明的包括ERC1基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的下咽癌的治療藥物。附圖說明圖1顯示利用QPCR在mRNA水平上研究ERC1基因的差異表達；圖2顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測ERC1基因的差異表達；圖3顯示利用QPCR在mRNA水平上檢測ERC1基因過表達的情況；圖4顯示利用免疫印跡在蛋白水平上檢測ERC1基因過表達的情況；圖5顯示ERC1基因過表達對下咽癌細胞增殖的影響。具體的實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1基因芯片篩選差異表達基因1、取材：8例行同期頸部淋巴結(jié)清掃的原發(fā)下咽癌患者手術(shù)切除癌組織，另取9例非下咽癌疾病患者的下咽正常粘膜組織作為對照。所有癌組織均術(shù)后病理證實為下咽癌。全部原發(fā)下咽癌患者術(shù)前均未行放、化療，全部病例臨床資料完整。2、組織RNA的獲取使用Trizol一步法提取組織總RNA。3、RNA純度及濃度的測定取RNA溶液1μl，儀器測定OD260、OD280，RNA濃度為OD260值×稀釋倍數(shù)×40/1000，計算OD260/OD280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液純度高，含蛋白質(zhì)等雜質(zhì)少，-20℃保存。4、RNA完整性檢測(1)取2μlRNA樣品行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)；(2)分出區(qū)帶后，genefinder染色，藍光下觀察電泳區(qū)帶；(3)當(dāng)28s/18s約2:1時，說明RNA穩(wěn)定無降解。5、高通量轉(zhuǎn)錄組測序5.1RNA-seq讀段定位首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHatv1.3.1將清潔片段與UCSCH.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配，H.sapiensUCSChg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從TopHat主頁下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的剪切位點庫，根據(jù)這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用的TopHat方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。5.2轉(zhuǎn)錄豐度評估匹配上的讀段文件通過Cufflinksv1.0.3處理，Cufflinksv1.0.3將RNA-seq片段數(shù)目進行標(biāo)準(zhǔn)化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。5.3差異表達基因的檢測將下載的EnsemblGTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度，檢測差異表達。在Cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。6、結(jié)果RNA-Sep結(jié)果顯示，下咽癌組織與正常對照組織之間共篩選出211個差異表達基因，其中表達水平上調(diào)的基因54個，表達水平下調(diào)的基因157個。實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因基于前期高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序的結(jié)果，根據(jù)Pvalue的大小，我們選擇ERC1基因進行驗證。1、樣本收集按照實施例1的方法收集下咽癌組織45例，正常對照組織50例。2、在mRNA水平上進行驗證2.1提取組織RNA步驟同實施例1。2.2逆轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄使用Primescript1ststrandcDNAsynthesiskit試劑盒，操作步驟如下進行：(1)在微量離心管中加入以下反應(yīng)液體，如表1所示：表1反應(yīng)液體試劑劑量RNA2.0μgdNTP1.0μlOligo(dT)2.0μlRnasefreedH2O加至10.0μl(2)70℃孵育5min，迅速冷卻至4℃；在微量離心管內(nèi)加入以下反應(yīng)試劑，制成反應(yīng)體系：表2反應(yīng)體系的配制輕輕震蕩，快速離心后，42℃反應(yīng)1h，70℃10min終止反應(yīng)，4℃冷卻，-20℃保存。采用SYBPPremixExTapTMII試劑盒，在EppendorfReal-timePCR分析儀進行，具體操作如下：(1)在冰上配制以下PCR反應(yīng)液：表3PCR反應(yīng)液的配制試劑劑量SYBR10.0μl正向引物1.0μl反向引物1.0μlcDNA2.0μlddH2O6.0μl總量20.0μl引物序列設(shè)計如下：ERC1基因：5’-CTTCTTCTCTGGCATCCT-3’(SEQIDNO.1)；5’-ACACTCCTCCTTCTTCTG-3’(SEQIDNO.2)β-actin：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQIDNO.3)；5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQIDNO.4)(2)上機，執(zhí)行下述程序：95℃預(yù)變性3min；95℃變性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。結(jié)果釆用相對定量法，運用公式2-△△ct計算。實驗重復(fù)3次?！鱟t＝ct(A)-ct(β-actin)△△ct＝△ct(實驗組)-△ct(對照組)結(jié)果如圖1所示，與正常對照組織相比，下咽癌組織中ERC1基因的mRNA水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3、在蛋白水平上進行驗證按照RIPA蛋白裂解液試劑盒說明書提取各組蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品中蛋白濃度。以常規(guī)Western-blot方法檢測ERC1蛋白變化，各組實驗均重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參，做ERC1蛋白條帶吸光度定量分析，表達量以ERC1蛋白/β-actin吸光度的比值代表。結(jié)果如圖2所示，與正常對照組織相比，下咽癌組織中ERC1蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實施例3ERC1基因過表達1、質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)ERC1基因的編碼序列設(shè)計擴增引物，引物的設(shè)計為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。從成人胎腦的cDNA文庫(clontech公司，貨號：638831)中擴增全長的ERC1基因的編碼序列，上述cDNA序列插入到真核細胞表達載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-ERC1用于后續(xù)實驗。2、下咽癌細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染2.1細胞培養(yǎng)下咽癌FADU細胞采用含有10％胎牛血清(FBS)、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃，5％CO2，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。2.2細胞轉(zhuǎn)染(1)轉(zhuǎn)染前一天將0.5-2*105個腫瘤細胞懸浮于500μl不含抗生素的培養(yǎng)基，接種至24孔培養(yǎng)板。(2)轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞密度應(yīng)達80％-90％，準(zhǔn)備以下復(fù)合物A：將1μg質(zhì)粒DNA稀釋于無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻；復(fù)合物B：取4μlLipofectamine2000稀釋于無血清培養(yǎng)基中，混勻。(3)將復(fù)合物A和B混合，輕輕混勻，室溫孵育。(4)將100μl脂質(zhì)體復(fù)合體加入腫瘤細胞中，上下左右輕輕混勻，將細胞放入37℃含5％CO2培養(yǎng)箱孵育5-7小時。(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞18-24小時。3、利用QPCR實驗檢測pcDNA3.1-ERC1的過表達情況3.1提取細胞總RNA利用常規(guī)方法進行操作。3.2逆轉(zhuǎn)錄步驟同實施例2。3.3QPCR步驟同實施例2。3.4結(jié)果結(jié)果如圖3所示，pcDNA3.1-ERC1能夠成功過表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3、Westernblot實驗檢測pcDNA3.1-ERC1過表達情況步驟同實施例2。結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1的細胞中ERC1蛋白的含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實施例4ERC1基因的表達對下咽癌細胞增殖能力的測定1、步驟：將轉(zhuǎn)染24小時后的下咽癌細胞FADU接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個細胞/孔/200μl，細胞分組如下：實驗組1(對照組)：下咽癌細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1；實驗組2：下咽癌細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1。將細胞在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱再次孵育24小時后，根據(jù)BrdU細胞增殖試劑盒(ChemiconInternational)的說明書，測量細胞增殖速率。2、統(tǒng)計學(xué)方法實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。3、結(jié)果結(jié)果如圖5所示，相比于實驗組1，實驗組2的細胞增殖減緩，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述實驗結(jié)果表明，ERC1表達可以抑制下咽癌細胞增殖。實施例5檢測ERC1基因表達對細胞遷移的影響1、遷移實驗步驟(1)將轉(zhuǎn)染24h后的細胞消化，調(diào)整細胞密度為105/ml；(2)24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入600μL進口胎牛血清(FBS)，將Transwell小室置入24孔細胞培養(yǎng)板小孔，Transwell小室內(nèi)加入各100μLRPMI1640培養(yǎng)基細胞懸液；(3)24孔細胞培養(yǎng)板孵育24h，將Transwell小室從24孔細胞培養(yǎng)板取出，棄掉培養(yǎng)基，PBS沖洗Transwell小室膜部附著細胞；(4)取新24孔細胞培養(yǎng)板，小孔內(nèi)加入甲醇/PBS混合液((1:1)600μL，將Transwell小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液從下室(24孔細胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(5)棄掉Transwell小室上室及24孔細胞培養(yǎng)板小孔內(nèi)甲醇/PBS混合液，下室加入600μL甲醇，將Transwell小室置入小孔，使甲醇從下室(24孔細胞培養(yǎng)板小孔)浸入上室，室溫靜置15min；(6)棄掉甲醇，室溫下干燥15-30min；(7)取0.1％結(jié)晶紫染液600μL滴入24孔細胞培養(yǎng)板小孔，將Transwell小室置入小孔染色15min；(8)棄掉0.1％結(jié)晶紫染液，蒸餾水沖洗Transwell小室15min，晾干，顯微鏡下觀察，取不同視野拍照計數(shù)，實驗重復(fù)3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組每個視野下平均遷移細胞數(shù)目分別為(166.32±15.41)個和(76.57土9.13)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述實驗結(jié)果表明，ERC1基因表達抑制了下咽癌細胞的遷移。實施例6檢測ERC1基因表達對細胞侵襲的影響1、侵襲實驗步驟實驗前從-20℃冰箱取出MatrigelTM基質(zhì)膠，冰盒上融化，取MatrigelTM基質(zhì)膠與RPMI1640培養(yǎng)基按1:6比例混合，制成混合液加入Transwell小室上室，每孔45μL，將Transwell小室置入24孔細胞培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育30min，后續(xù)細胞接種及培養(yǎng)操作同上述細胞遷移實驗。培養(yǎng)24h后，棄掉培基，用棉簽輕輕拭去Transwell小室上室內(nèi)MatrigelTM基質(zhì)膠，勿損傷小室底膜，余操作同細胞轉(zhuǎn)移實驗。本實驗重復(fù)3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組每個視野下平均侵襲細胞數(shù)目分別為(55.24±5.74)個和(26.01土3.45)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述實驗結(jié)果表明，ERC1基因表達抑制了下咽癌細胞的侵襲。實施例7體外克隆形成能力的檢測1、步驟(1)將轉(zhuǎn)染24h后的細胞消化后制成細胞懸液，細胞計數(shù)板計數(shù)；(2)六孔細胞培養(yǎng)板每孔加入2ml10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)基，按500個/孔細胞密度接種細胞懸液，輕輕混勻；(3)六孔細胞培養(yǎng)板移至37℃5％CO2培養(yǎng)箱孵育10天，每3天更換培養(yǎng)基1次，每次2ml/孔；(4)培養(yǎng)結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)基，PBS緩沖液小心清洗3次，每次5min，室溫干燥，甲醇固定15min，棄掉甲醇，室溫空氣干燥20min；(5)取0.1％結(jié)晶紫染液加入細胞培養(yǎng)板，每孔加入1ml，染色15min；(6)回收0.1％結(jié)晶紫染液，細胞培養(yǎng)板蒸餾水清洗15min；(7)拍照觀察計數(shù)，重復(fù)試驗3次。2、結(jié)果轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組平均集落形成數(shù)目分別為(174.41±15.63)個，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ERC1組細胞平均集落形成數(shù)目為(77.15土4.73)個。上述實驗結(jié)果表明，ERC1基因表達抑制了下咽癌細胞的成瘤能力。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3