本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種定量檢測(cè)土壤及植株中荷花腐敗病菌的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增(Real-timeLAMP)引物組、反應(yīng)體系及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：荷花腐敗病是由鐮孢菌(Fusariumcommune)引起的，病菌往往造成藕鞭、藕節(jié)、藕根腐爛，同時(shí)地上部分的葉、花也會(huì)萎蔫黃枯，發(fā)病嚴(yán)重的整株枯死。荷花種植面廣，荷花腐敗病發(fā)生普遍，危害巨大，已成為制約廣東省乃至全國(guó)荷花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大障礙，也是我國(guó)都市農(nóng)業(yè)發(fā)展及濕地環(huán)境綠化中面臨的重要瓶頸問(wèn)題。近年來(lái)，有報(bào)道證實(shí)基于PCR的方法已經(jīng)成功用于荷花腐敗病菌檢測(cè)，但是公開的檢測(cè)方法均是定性檢測(cè)，還沒有關(guān)于荷花腐敗病菌快速定量檢測(cè)方法的報(bào)道。由于荷花腐敗病屬土傳病害，定量檢測(cè)土壤中病原菌的數(shù)量可以為荷花種植土壤的科學(xué)管理提供依據(jù)。另外，植物和土壤中病原菌的分子定量檢測(cè)可替代傳統(tǒng)的稀釋平板計(jì)數(shù)法，并且這種方法快速、特異、靈敏、重復(fù)性好，將有利于研究病原菌在植物和土壤中的數(shù)量和分布。因此，開發(fā)荷花腐敗病菌的快速定量檢測(cè)方法對(duì)于定量跟蹤荷花腐敗病的發(fā)生動(dòng)態(tài)，及指導(dǎo)病害防控意義重大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一在于提供了一種定量檢測(cè)荷花腐敗病菌的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增(Real-timeLAMP)引物組。本發(fā)明的目的之二是提供一種定量檢測(cè)荷花腐敗病菌的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增(Real-timeLAMP)反應(yīng)體系，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包括有實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組。本發(fā)明的目的之三是提供了利用實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組或?qū)崟r(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系定量檢測(cè)荷花腐敗病菌的方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：一種用于定量檢測(cè)荷花腐敗病菌的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組包含一對(duì)外引物F3、B3和一對(duì)內(nèi)引物FIP、BIP，所述外引物F3、B3和所述內(nèi)引物FIP、BIP的序列分別為：F3：CCAGACGGTCAATATAGCTTAT；B3：TAGTTTGCTAGGCTAACCCTA；FIP：CATAGAGGGCTGCCTTCGCGGCAGTACTTGAGGAGGA；BIP：GGACGAAGGCACAGAGAACAAGTTATCTGACCTATGGCATTCA。較佳地，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包括如上所述的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組。較佳地，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系還包括待檢DNA提取液、反應(yīng)液、BstDNA聚合酶及熒光染料。較佳地，所述熒光染料為10×SYBRGreenI。較佳地，所述反應(yīng)液包括dNTP、MgSO4及甜菜堿，所述dNTP、所述MgSO4及所述甜菜堿的體積比為：dNTP：MgSO4：甜菜堿＝8：5：2。較佳地，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系含有0.2μM所述外引物F3、0.2μM所述外引物B3、0.8μM所述內(nèi)引物FIP、0.8μM所述內(nèi)引物BIP、2μL所述待檢DNA提取液、12.5μL所述反應(yīng)液、0.32U/μL所述BstDNA聚合酶及0.5μL所述熒光染料，去離子水補(bǔ)齊到25μL。本發(fā)明還提供一種利用上述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組或?qū)崟r(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系定量檢測(cè)荷花腐敗病菌的方法，包括以下步驟：S1.在反應(yīng)管中配置實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：向若干25μL的反應(yīng)管中均加入0.2μM外引物F3、0.2μM外引物B3、0.8μM內(nèi)引物FIP、0.8μM內(nèi)引物BIP、12.5μL反應(yīng)液、0.32U/μLBstDNA聚合酶及0.5μL熒光染料，然后向所述反應(yīng)管中的其中之一加入陽(yáng)性基因組DNA，剩余所述反應(yīng)管中分別加入2μL待檢DNA提取液，去離子水補(bǔ)齊到25μL；S2.實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)：將步驟S1中配置好的若干所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系混勻后離心，然后放置于實(shí)時(shí)熒光分析儀上，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析，同時(shí)所述熒光分析儀實(shí)時(shí)讀取等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號(hào)；S3.所述實(shí)時(shí)熒光分析儀根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號(hào)繪制等溫?cái)U(kuò)增曲線及熔解曲線，若等溫?cái)U(kuò)增曲線的值高于本底噪音信號(hào)值且熔解曲線的Tm吸收峰值與陽(yáng)性基因組DNA的熔解曲線的Tm吸收峰值一致，則說(shuō)明所述待檢DNA提取液含有荷花腐敗病菌的DNA。較佳地，在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上設(shè)定實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?3℃，60min；等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析，在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上設(shè)定熔解曲線分析的程序?yàn)椋?5℃，15s，然后60℃，1min，從60℃開始每秒升高0.3℃至95℃，95℃保持15s。較佳地，所述實(shí)時(shí)熒光分析儀為ESE-QuantTubeScanner或熒光定量PCR儀。較佳地，所述陽(yáng)性基因組DNA包括若干已知濃度的荷花腐敗病菌樣品的DNA，并于步驟S3中可得到若干已知濃度的荷花腐敗病菌樣品的DNA對(duì)應(yīng)的Ct值，從而得出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系，得出所述待檢DNA提取液中荷花腐敗病菌的DNA含量。較佳地，在步驟S1之前還包括提取待檢DNA提取液的步驟：如果檢測(cè)樣本為荷花腐敗病菌菌絲體，則利用改進(jìn)的SDS法抽提荷花腐敗病菌菌絲體的DNA；如果檢測(cè)樣本為荷花植株組織，則利用CTAB法抽提荷花植株組織中的DNA；如果檢測(cè)樣本為土壤，則利用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取疑感染土壤的微生物的DNA。較佳地，所述荷花植株組織為地下莖、蓮鞭、藕節(jié)或須根部位的組織。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)特異性強(qiáng)：針對(duì)靶基因的不同區(qū)域設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組，不會(huì)受到實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中存在的其他非靶標(biāo)DNA的影響，同時(shí)可根據(jù)熔解曲線鑒別非特異性擴(kuò)增。因此，可從植物組織及土壤中復(fù)雜的病原菌環(huán)境準(zhǔn)確地檢測(cè)到荷花腐敗病菌；(2)靈敏性高：等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)+實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)所檢測(cè)的是熒光信號(hào)，能檢測(cè)到普通PCR的1/10-1/100的拷貝數(shù)；(3)等溫：該實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系只需在恒定溫度下就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性；(4)快速：實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)在63.5min即可完成，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)可設(shè)定于30min-60min內(nèi)完成；(5)定量檢測(cè)：可根據(jù)已檢樣品的Ct值計(jì)算出DNA提取液或樣品中荷花腐敗病菌的DNA含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)荷花植株及土壤中的荷花腐敗病菌的定量檢測(cè)，能實(shí)時(shí)跟蹤荷花腐敗病菌侵染植株的情況；也可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣本檢測(cè)；(6)閉管檢測(cè)：反應(yīng)管可蓋密封，整個(gè)過(guò)程在密封的反應(yīng)管中檢測(cè)，避免因開蓋造成氣溶膠污染；(7)操作簡(jiǎn)便快捷，基于對(duì)核苷酸的檢測(cè)，不受培養(yǎng)條件限制，實(shí)用性強(qiáng)，可滿足植物病害診斷及監(jiān)測(cè)的需要。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)的等溫?cái)U(kuò)增曲線；其中，1～6：10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL；7：10fg/μL；8：陰性對(duì)照。圖2是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)的熔解曲線；其中，1～6：10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL；7：10fg/μL；8：陰性對(duì)照。圖3是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的特異性實(shí)驗(yàn)的等溫?cái)U(kuò)增曲線；1～5：荷花腐敗病(Fusariumcommune)菌株；6～11：非荷花腐敗病菌株；12：空白對(duì)照。圖5是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的特異性實(shí)驗(yàn)的熔解曲線；1～5：荷花腐敗病(Fusariumcommune)菌株；6～11：非荷花腐敗病菌株；12：空白對(duì)照。圖6是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)接種土壤中荷花腐敗病菌所產(chǎn)生的等溫?cái)U(kuò)增曲線；其中，1：107個(gè)分生孢子/克土壤；2：106個(gè)分生孢子/克土壤；3：105個(gè)分生孢子/克土壤；4：104個(gè)分生孢子/克土壤；5：103個(gè)分生孢子/克土壤；6：102個(gè)分生孢子/克土壤；7：10個(gè)分生孢子/克土壤；8：1個(gè)分生孢子/克土壤；9：未接菌土壤對(duì)照。圖7是實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)土壤中荷花腐敗病菌的DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，展示了土壤中分生孢子數(shù)目的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的土壤中荷花腐敗病菌的DNA在Real-timeLAMP中的Ct值間的線性關(guān)系。具體的實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以助于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明。一、實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組設(shè)計(jì)荷花腐敗病菌的引物設(shè)計(jì)選取荷花腐敗病菌的線粒體小亞基(mtSSUrRNAgenes)基因片段，該基因片段重復(fù)性、特異性好，且序列長(zhǎng)度約700bp。運(yùn)用日本榮研株式會(huì)社在線軟件PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)設(shè)計(jì)荷花腐敗病菌實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增(Real-timeLAMP)檢測(cè)方法的特異性引物組：包括一對(duì)內(nèi)引物(FIP，BIP)和一對(duì)外引物(F3，B3)，引物序列如下：F3：CCAGACGGTCAATATAGCTTATB3：TAGTTTGCTAGGCTAACCCTAFIP：CATAGAGGGCTGCCTTCGCGGCAGTACTTGAGGAGGABIP：GGACGAAGGCACAGAGAACAAGTTATCTGACCTATGGCATTCA荷花腐敗病菌的線粒體小亞基(mtSSUrRNAgenes)基因片段的全序列如下：GCCTAACGGCTGAACTGGCAACTTGGAGAAGTGGCAAGTCTTCCAGTATGGGGAGCAAAACAGCTATGGGTCAAGTCCGATATCTTTAGGAGAAGTCTTATTGTGAGGGCGAGTTATATAACACCATAGGACTGGCCGTCCCATATGAAAAGATTATATTAGAATTGAATGAAGCTTTGTTTATATATTGATAATGACAGTATATATATCGTGTCTTGACTAATTGCGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACGTAAGAGACTAGTGTTATTCATCTTAATTAGGTTTAAAGGGTACCCAGACGGTCAATATAGCTTATAAAATGTTAGTACTTGACTAGAGTTTTATGTAAGAGGGCAGTACTTGAGGAGGAGAGATGAAATTTCGTGATACCAAAGGGACTCTGTAAAGGCGAAGGCAGCCCTCTATGTAAAAACTGACGTTGAAGGACGAAGGCACAGAGAACAAACAGGATTAGATACCCAAGTAGTCTTTGCAGTAAATGATGAATGCCATAGGTCAGATAACCAGTTAATGTTTATAGTCTAATAGGGTTAGCCTAGCAAACTAATGACATAGACTATCCATTAAAAATATTTGGTCTATAAATGAAAGTGTAAGCATTTCACCTCAAGAGTAATGTGGCAACGCAGGAACTGAAATCACTAGACCGTTTCTGACACCAGTAGTGAAGTAT。二、荷花腐敗病菌的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法利用上述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組(FIP、BIP、F3和B3)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下：(1)從檢測(cè)樣本中提取DNA：如果檢測(cè)樣本為荷花腐敗病菌菌絲體，則利用改進(jìn)的SDS法抽提荷花腐敗病菌菌絲體的DNA；如果檢測(cè)樣本為荷花植株組織，則利用CTAB法抽提荷花植株組織中的DNA，所述荷花植株組織為地下莖、蓮鞭、藕節(jié)或須根部位的組織；如果檢測(cè)樣本為土壤，則利用土壤基因組DNA快速提取試劑盒提取疑感染土壤的微生物總DNA；(2)在反應(yīng)管中配置實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系：向若干25μL的反應(yīng)管中均加入0.2μM外引物F3、0.2μM外引物B3、0.8μM內(nèi)引物FIP、0.8μM內(nèi)引物BIP、12.5μL反應(yīng)液、8UBstDNA聚合酶及0.5μL10×SYBRGreenI，然后向所述反應(yīng)管中的其中之一加入2μL陽(yáng)性基因組DNA，向剩余的所述反應(yīng)管中分別加入2μL檢測(cè)樣本DNA提取液，去離子水補(bǔ)齊到25μL；(3)實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)：將步驟(2)中配置好的若干所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系混勻后離心，然后放置于實(shí)時(shí)熒光分析儀上，所述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析，同時(shí)所述熒光分析儀實(shí)時(shí)讀取等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號(hào)；較佳地，在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上設(shè)定等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)椋?3℃，60min；等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行熔解曲線分析，在所述實(shí)時(shí)熒光分析儀上設(shè)定熔解曲線分析的程序?yàn)椋?5℃，15s，然后60℃，1min，從60℃開始每秒升高0.3℃至95℃，95℃保持15s；(4)所述實(shí)時(shí)熒光分析儀根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)及熔解曲線分析產(chǎn)生的熒光信號(hào)繪制等溫?cái)U(kuò)增曲線及熔解曲線，若等溫?cái)U(kuò)增曲線的值高于本底噪音信號(hào)值且熔解曲線的Tm吸收峰值與陽(yáng)性基因組DNA的熔解曲線的Tm吸收峰值一致，則判定為陽(yáng)性結(jié)果，等溫?cái)U(kuò)增曲線的值低于本底噪音信號(hào)值則判定為陰性結(jié)果；較佳地，所述實(shí)時(shí)熒光分析儀為ESE-QuantTubeScanner或熒光定量PCR儀。三、實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)所述陽(yáng)性基因組DNA包括若干已知濃度的荷花腐敗病菌基因組DNA，具體地，用10倍稀釋的荷花腐敗病菌基因組DNA作為模版進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，將100ng/μL荷花腐敗病菌基因組DNA以10倍梯度稀釋為10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL七個(gè)濃度梯度作為檢測(cè)模版，用實(shí)施例2的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在圖1的擴(kuò)增曲線中，有6個(gè)濃度梯度的模版DNA得到了擴(kuò)增，所以最低可檢出的荷花腐敗病菌基因組DNA濃度為100fg/μL。在圖2中，融解曲線Tm＝79±0.5，則以后用于檢測(cè)樣品時(shí)，根據(jù)此Tm值即可排除假陽(yáng)性的可能。此外，根據(jù)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果繪制荷花腐敗病菌基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，結(jié)果表明稀釋荷花腐敗病菌基因組DNA濃度的對(duì)數(shù)(X)和對(duì)應(yīng)的Real-timeLAMP中的Ct值(Y)之間的線性關(guān)系為：Y＝-2.011X+21.03(R2＝0.995,E＝186.08％)，R2＝0.995，很接近1，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)線性率及可信度較高。此實(shí)例得出的結(jié)論是，本發(fā)明方法的最低檢測(cè)DNA濃度為100fg/μL。根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系，可得出所述檢測(cè)樣本DNA提取液中荷花腐敗病菌的DNA含量。四、實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)荷花腐敗病菌的靈敏度實(shí)驗(yàn)使用上述的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增法分別對(duì)樣品1-5：分離自不同地區(qū)的5個(gè)荷花腐敗病菌(Fusariumcommune)菌株，6：培養(yǎng)的香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)，7：冬瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.benincasae)，8：棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)，9：蓮小菌核葉腐病菌(Sclerotiumhydrophilum)，10：甘蔗稍腐病菌(Fusariumsacchari)，11：蓮炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)，12：無(wú)菌水為空白對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示5個(gè)分離自不同地區(qū)的荷花腐敗病菌(樣品1-5)菌株擴(kuò)增正常，且熔解曲線為單一尖銳峰，Tm值為79.5±0.5；而香蕉枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、蓮小菌核葉腐病菌、甘蔗稍腐病菌、蓮炭疽病菌及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增，如圖4-5所示。表明本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增引物組及實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)荷花腐敗病菌具有較好的特異性。五、接種土壤中荷花腐敗病菌(F.commune)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈敏度檢測(cè)將荷花腐敗病菌株置于100mLPDB培養(yǎng)基中，在25℃，180r/min的搖床上搖菌培養(yǎng)5天。用4層紗布過(guò)濾孢子，以轉(zhuǎn)速10000g離心l0min，用滅菌的蒸饋水沖洗2次。將采自廣東東莞市荷田的土壤樣品，121℃，60min滅菌2次，去掉土壤雜物，置于烘箱中烘至恒重。分生孢子懸液經(jīng)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)后，稀釋成不同濃度5×107個(gè)孢子/mL，5×106個(gè)孢子/mL，5×105個(gè)孢子/mL，5×104個(gè)孢子/mL，5×103個(gè)孢子/mL，5×102個(gè)孢子/mL，5×10個(gè)孢子/mL及5個(gè)孢子/mL，分別加入100μL到15mL體積且裝有500mg滅菌土壤的離心管中，以未接菌的土壤作為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)三次。用土壤基因組DNA快速提取試劑盒如土壤DNA提取試劑盒EZNASoilDNA提取待測(cè)土壤樣品總DNA，用上述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)接種不同濃度分生孢子的土壤總DNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)Ct值的有無(wú)來(lái)確定實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法檢測(cè)土壤中分生孢子數(shù)目的靈敏度。結(jié)果表明：土壤中分生孢子數(shù)目的對(duì)數(shù)(X)和對(duì)應(yīng)的土壤DNA的Ct值(Y)之間的線性關(guān)系為:Y＝-3.2319X+31.825(R2＝0.979,E＝113.30％)(如圖7所示)。以后根據(jù)此函數(shù)可以計(jì)算出待測(cè)土壤樣品中荷花腐敗病菌分生孢子數(shù)的數(shù)目。低于103個(gè)分生孢子/克土壤時(shí)，該實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系三次重復(fù)試驗(yàn)不是都能檢測(cè)到(如圖6所示)，因此，該等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光法檢測(cè)土壤中分生孢子的下限是103個(gè)分生孢子/克土壤。六、實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的田間應(yīng)用2015年在廣東省東莞市橋頭鎮(zhèn)蓮湖公園采集不同發(fā)病級(jí)別的荷花地下莖(藕)樣品16個(gè)，用5％的NaClO消毒3min,用無(wú)菌水沖洗2次，用無(wú)菌濾紙吸干。然后用無(wú)菌的解剖刀切下約5g的組織，放到不同的離心管中，快速冷凍提取DNA。參照上述實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法對(duì)提取的植物組織DNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，得到不同檢測(cè)樣品的CT值，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出荷花腐敗病不同發(fā)病級(jí)別的每克植物組織中病原菌(F.commune)的DNA含量，試驗(yàn)重復(fù)三次。通過(guò)檢測(cè)得到不同發(fā)病級(jí)別荷花樣品的Ct值及對(duì)應(yīng)的病原菌DNA含量如表1所示，16個(gè)不同發(fā)病級(jí)別的荷花地下莖樣品DNA含量差異較顯著，發(fā)病越嚴(yán)重(病害級(jí)別越高)，其地下莖組織中DNA的含量越高，但是有一個(gè)肉眼觀察沒有發(fā)病的荷花地下莖也檢測(cè)出微量的病原菌DNA，說(shuō)明了還沒顯示出病害癥狀的荷花植株也可能已經(jīng)被病菌侵染，此實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法為提前預(yù)測(cè)病害的嚴(yán)重程度，制定科學(xué)防控措施提供了良好的依據(jù)。表1不同發(fā)病級(jí)別荷花植株中病原菌的DNA含量病害級(jí)別CT值DNA含量(ng)0無(wú)無(wú)0無(wú)無(wú)038.47282.11985×10-10133.32327.70941×10-10133.32327.70941×10-10226.526791.84773×10-6225.34687.135×10-6225.87753.886×10-6318.11490.028318.18550.028318.27460.029418.87470.012417.997320.032512.290922.164513.26897.233512.516617.116當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3