本發(fā)明屬用于微生物發(fā)酵技術(shù)和環(huán)境保護(hù)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，涉及一種用于污泥和蓄禽糞便等有機(jī)污染物高溫堆肥的菌株與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化水平不斷提高，污水處理設(shè)施建設(shè)得到了高速發(fā)展，2014年底我國(guó)城鎮(zhèn)污水處理廠已經(jīng)建有4436多座，城市污水處理能力已達(dá)到每天1.71億噸，為實(shí)現(xiàn)國(guó)家的減排目標(biāo)和水環(huán)境改善，做出了巨大貢獻(xiàn)。但是污水廠的建設(shè)及運(yùn)行伴隨產(chǎn)生了大量剩余污泥，以產(chǎn)泥量0.8‰計(jì)，全國(guó)年污泥總產(chǎn)量將很快突破13.6萬(wàn)噸，污泥處理形勢(shì)十分嚴(yán)峻。在城市污水處理過(guò)程中必然會(huì)產(chǎn)生大量的污水污泥，它容量大、不穩(wěn)定、易腐敗、有惡臭，如不加妥善處理和處置，將造成堆放和排放區(qū)周圍環(huán)境嚴(yán)重的二次污染，更有甚者，將污泥任意施于農(nóng)業(yè)，導(dǎo)致農(nóng)作物污染，土壤受到不可逆轉(zhuǎn)的中毒受害。傳統(tǒng)污泥處理方法有三種：焚燒、填埋和資源化利用。國(guó)外多采用焚燒工藝，但投資巨大，易造成大氣污染；國(guó)內(nèi)多采用填埋，但需要占用大量的土地，同時(shí)會(huì)造成環(huán)境的二次污染；國(guó)內(nèi)大中城市土地再生資源很少，難以長(zhǎng)期采用此方式。國(guó)內(nèi)外常用的污泥穩(wěn)定化技術(shù)有：厭氧消化、好氧消化、堆肥、堿法穩(wěn)定和干化穩(wěn)定。堿法穩(wěn)定因無(wú)法長(zhǎng)期使污泥穩(wěn)定，僅做應(yīng)急之用；干化穩(wěn)定因投資運(yùn)行費(fèi)用高，應(yīng)用很少；好氧消化需要較高的動(dòng)力能耗，寒冷季節(jié)處理效率降低，副產(chǎn)品沒(méi)有實(shí)用價(jià)值，僅適用于小型污水廠；厭氧消化應(yīng)用最為廣泛，但有安全隱患、運(yùn)行管理要求高；堆肥是一種生物處理方法，因其充分利用污泥中有用成分，可變廢為寶，有利于建立循環(huán)型經(jīng)濟(jì)而受到廣泛關(guān)注。同時(shí)，工業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)的興起，奶牛場(chǎng)，養(yǎng)豬場(chǎng)，養(yǎng)雞場(chǎng)等地的畜禽類糞便也成為環(huán)境一大污染源，采用傳統(tǒng)堆肥技術(shù)，發(fā)酵慢，產(chǎn)生臭氣多，發(fā)酵效果差?，F(xiàn)有微生物菌劑在畜禽糞便和污泥的發(fā)酵中，也常有采用，但菌種活性差，菌群生態(tài)環(huán)境構(gòu)建不夠茁壯，發(fā)酵效果不穩(wěn)定。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對(duì)污泥和畜禽糞便發(fā)酵中普遍存在厭氧的情況，采用兼氧和好氧的菌種結(jié)合的方案，提供一種堆肥污泥發(fā)酵效率高，高溫維持時(shí)間長(zhǎng)，發(fā)酵后物料體積、密度及有機(jī)質(zhì)顯著下降的菌株及由該菌株制得的堆肥接種劑，使發(fā)酵效果更穩(wěn)定。本發(fā)明首先提供一種分離自土壤的熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillusthermosphaericus)，命名為D1。本發(fā)明利用細(xì)菌16SrDNA通用引物，用PCR的方法擴(kuò)增D1菌株16SrDNA部分片段，PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得該片段序列，測(cè)序所得D1菌株的16SrDNA(長(zhǎng)度1.4kbp)如SEQIDNO.1所示。該菌株D1已于2016年4月1日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為熱球狀尿素芽孢桿菌Ureibacillusthermosphaericus，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329。本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillusthermosphaericus)在污泥堆肥發(fā)酵和有機(jī)污染物發(fā)酵中的應(yīng)用。含有保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillusthermosphaericus)的生物制劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌(Ureibacillusthermosphaericus)的菌劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329熱球狀尿素芽孢桿菌D1或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的生物制劑或菌劑在堆肥或有機(jī)物發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329熱球狀尿素芽孢桿菌D1或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有其的生物制劑或菌劑在制備堆肥接種劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種堆肥接種劑，其制備方法包括以下步驟：1)活化培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌D1的菌種在60-80℃下活化培養(yǎng)12-48h；2)種子液制備：將活化菌種接種于培養(yǎng)液中，密封瓶口，在65-80℃下振蕩培養(yǎng)1-3天，振蕩頻率為160-200rpm；3)發(fā)酵菌液制備：將步驟2)制得的種子液按3％-10％的體積比加入滅菌培養(yǎng)液中，發(fā)酵時(shí)間48-72小時(shí)。在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，通氣量的氣：液的通氣比在0-24小時(shí)是1:0.5，24-72小時(shí)是1:1，發(fā)酵罐的罐壓為0.08-0.1MPa，攪拌速率為180-200rpm；4)堆肥接種劑制備：將發(fā)酵菌液與糖類混合均勻，加吸附料，與堆肥物料混合均勻，進(jìn)行堆置發(fā)酵，發(fā)酵至含水量10％-15％即得。上述方法中，步驟2)和步驟3)所述的培養(yǎng)液為：按照與水的質(zhì)量百分比，工業(yè)酵母粉0.5-1％，工業(yè)蔗糖1.0-3％，工業(yè)蛋白胨1-2％，氯化鈉1-2％。其中步驟4)中，吸附料為玉米面、麩皮、豆粕中的一種或多種；堆肥物料為污泥和輔料或動(dòng)物糞便和輔料，污泥與輔料的質(zhì)量比1:0.05-0.5，動(dòng)物糞便與輔料的質(zhì)量比為：1:0.1-0.5；本發(fā)明提供的堆肥接種劑，其含有熱球狀尿素芽孢桿菌D1活菌數(shù)為103-108CFU/g。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了上述堆肥接種劑在高溫發(fā)酵有機(jī)物料中的應(yīng)用，包括以下步驟：首次發(fā)酵：將有機(jī)物料、輔料按照質(zhì)量比1:0.05-0.5混合，按與前者混合物質(zhì)量比0.08％-0.15％加入堆肥接種劑，充分?jǐn)嚢?，堆積在高度0.5-2米，寬度2-5米，長(zhǎng)度10-50米，底部曝氣發(fā)酵，首次發(fā)酵混合后物料的含水率應(yīng)為35％-65％，環(huán)境溫度應(yīng)大于5度，發(fā)酵時(shí)間1～3周；后期發(fā)酵：將有機(jī)物料、首次發(fā)酵的腐熟料、輔料、堆肥接種劑按照質(zhì)量比1:0.3-1:0.05-0.5:0.0008-0.0015充分?jǐn)嚢璋l(fā)酵，堆積在高度0.5-2米，寬度2-5米，長(zhǎng)度10-50米，底部曝氣發(fā)酵，首次發(fā)酵混合后物料的含水率應(yīng)為35％-65％，環(huán)境溫度應(yīng)大于5度，發(fā)酵時(shí)間1～3周。所述輔料為玉米芯、秸稈、麩皮、鋸沫、花生殼、枯枝落葉、磷礦粉、中藥渣、沸石粉、麥飯石、餅粕和蔗糖中的一種或多種。所述有機(jī)物料為污泥或畜禽糞便。本發(fā)明的保藏編號(hào)為CGMCCNO.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌對(duì)堆肥發(fā)酵效果有著明顯的優(yōu)化作用，具體表現(xiàn)在堆體升溫快，高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)物降解徹底，降解過(guò)程中堆體散發(fā)的氨氣等臭氣明顯減少。含有保藏編號(hào)為CGMCCNO.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌的本發(fā)明的菌劑可以有效抵制雜菌的干擾，使得發(fā)酵快速、高效，堆肥污泥發(fā)酵起溫快，0.5-3天就能達(dá)到最高溫度，高溫期維持時(shí)間長(zhǎng)，達(dá)3-15天，經(jīng)發(fā)酵后，檢測(cè)物料體積、密度及有機(jī)質(zhì)，與堆肥初期相比，堆體體積減小到原來(lái)的45％-60％，有機(jī)質(zhì)降解了35-67.2％，纖維素降解了35％-55％，半纖維素降解了55％-61％，木質(zhì)素降解了23％-38％，濕度下降到20-30％，糞大腸桿菌數(shù)＜102，蛔蟲卵死亡率100％，減少發(fā)酵過(guò)程中臭氣氨氣，減少量約80％以上，其它臭氣約70％的排放，發(fā)酵后的有機(jī)物松散，不結(jié)塊，沒(méi)有臭味，極大地優(yōu)化發(fā)酵效果，達(dá)到堆肥排放標(biāo)準(zhǔn)。附圖說(shuō)明圖1為熱球狀尿素芽孢桿菌鏡下形態(tài)圖。圖2為實(shí)施例3中污泥接種堆肥和未接種堆肥溫度曲線比較圖。圖3為實(shí)施例3中15天發(fā)酵期接種堆肥的效果圖。圖4為實(shí)施例3中15天發(fā)酵期未接種堆肥的效果圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中涉及的試驗(yàn)材料和試劑均為市售。實(shí)施例1熱球狀尿素芽孢桿菌D1的分離與鑒定1)取樣：在高溫達(dá)到50-70℃以上2天的堆體取樣50g，放入無(wú)菌三角瓶中加入250ml滅菌水，震蕩30分鐘。2)分離：在無(wú)菌操作臺(tái)中，將上述樣品用絕跡稀釋法涂布平板，放入培養(yǎng)袋，再將其一起放入培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)：放置在50-65℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48h；固體培養(yǎng)平板配方：按照與水的質(zhì)量百分比，進(jìn)口酵母粉0.5-1％，蔗糖2％，工業(yè)蛋白胨2％，氯化鈉1％，瓊脂2.0-2.5％，蒸餾水，121攝氏度滅菌30min。3)純化：將培養(yǎng)出的菌株用上述固體培養(yǎng)平板進(jìn)行劃線分離，分離出純培養(yǎng)物為止。該菌株顯微鏡下圖見(jiàn)圖1。4)鑒定：分離出純培養(yǎng)物經(jīng)DNA提取，PCR測(cè)序，鑒定。將分離得到的菌株D1進(jìn)行生物學(xué)特性驗(yàn)證，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性長(zhǎng)桿狀菌株，適宜生長(zhǎng)溫度為50-75℃的兼性嗜熱菌，經(jīng)過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，最高80℃不生長(zhǎng)。將該菌種在培養(yǎng)液平板上55-65℃活化培養(yǎng)24小時(shí)，然后接種于培養(yǎng)基上，分別放入40、50、60、70、80℃的恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察菌株生長(zhǎng)情況，觀察結(jié)果如下表1。該菌株能以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖為唯一碳源生長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)酸。生長(zhǎng)pH范圍5.0-9.5，最適pH值為7.5。最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為0-1.5％。表1菌株溫度生長(zhǎng)表培養(yǎng)溫度(℃)4050607080生長(zhǎng)情況不生長(zhǎng)輕微生長(zhǎng)中度生長(zhǎng)生長(zhǎng)良好不生長(zhǎng)利用細(xì)菌16SrDNA通用引物，用PCR的方法擴(kuò)增D1菌株16SrDNA部分片段，PCR產(chǎn)物測(cè)序獲得該片段序列，測(cè)序所得D1菌株的16SrDNA(長(zhǎng)度1.4kbp)如SEQIDNO.1所示。該菌株D1已于2016年4月1日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為熱球狀尿素芽孢桿菌Ureibacillusthermosphaericus，保藏號(hào)為CGMCCNo.12329。實(shí)施例2堆肥接種劑的制備1)活化培養(yǎng)：將保藏編號(hào)為CGMCCNo.12329的熱球狀尿素芽孢桿菌D1的菌種在60-80℃下活化培養(yǎng)12-48h；2)種子液制備：將活化菌種接種于培養(yǎng)液中，密封瓶口，在65-80℃下振蕩培養(yǎng)1-3天，振蕩頻率為160-200rpm；3)發(fā)酵菌液制備：將步驟2)制得的種子液按3％-10％的體積比加入滅菌培養(yǎng)液中，發(fā)酵時(shí)間48-72小時(shí)。在進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，通氣量的氣：液的通氣比在0-24小時(shí)是1:0.5，24-72小時(shí)是1:1，發(fā)酵罐的罐壓為0.08-0.1Mpa，攪拌速率為180-200rpm；4)堆肥接種劑制備：將發(fā)酵菌液與糖類混合均勻，加吸附料，與堆肥物料混合均勻，進(jìn)行堆置發(fā)酵，發(fā)酵至含水量10％-15％即得。上述方法中，步驟2)和步驟3)所述的培養(yǎng)液為：按照與水的質(zhì)量百分比，工業(yè)酵母粉0.5-1％，工業(yè)蔗糖1.0-3％，工業(yè)蛋白胨1-2％，氯化鈉1-2％。其中步驟4)中，吸附料為玉米面、麩皮、豆粕中的一種或多種；堆肥物料為污泥和輔料或動(dòng)物糞便和輔料，污泥與輔料的質(zhì)量比1:0.05-0.5，動(dòng)物糞便與輔料的質(zhì)量比為：1:0.1-0.5；本發(fā)明提供的堆肥接種劑，其含有熱球狀尿素芽孢桿菌D1活菌數(shù)為103-108CFU/g。實(shí)施例3本發(fā)明堆肥接種劑的應(yīng)用與效果1、污泥堆肥效果以下以市政污泥的堆肥化處理說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例2制得的堆肥接種劑的應(yīng)用效果。按重量比1:0.5取市政污泥、秸稈粉初步混合均勻后，按總物料0.5％添加實(shí)施例2中制備的堆肥接種劑，進(jìn)行堆置發(fā)酵，此為接菌處理。另設(shè)對(duì)照，不接種堆肥接種劑，進(jìn)行試驗(yàn)。其中，常規(guī)處理，每5天或溫度超過(guò)75℃進(jìn)行翻堆；接種處理，每4-6天進(jìn)行翻堆。通過(guò)堆肥溫度變化、耗氧速率判定堆肥的腐熟度，并監(jiān)測(cè)堆肥過(guò)程中臭氣排放量。接菌處理達(dá)到50℃所需天數(shù)和降至40℃天數(shù)均比常規(guī)處理早；而高溫期達(dá)到的最高溫度、大于50℃維持天數(shù)、高溫期積溫、高溫期平均溫度，接菌處理均明顯大于常規(guī)處理。說(shuō)明接菌有利于堆體快速起溫、提高堆溫的持續(xù)性和強(qiáng)度，保證衛(wèi)生無(wú)害化效果。堆肥污泥發(fā)酵起溫快0.5-3天就能達(dá)到最高溫度，高溫期維持時(shí)間長(zhǎng)3-12天。接種后的溫度曲線圖見(jiàn)圖2。使用實(shí)施例2的堆肥接種劑和未接種的堆肥過(guò)程中臭氣排放比較見(jiàn)表2，堆肥過(guò)程中的溫度變化記錄見(jiàn)表3。表2堆肥接種和未接種臭氣排放比較表表3堆肥溫度分析試驗(yàn)結(jié)束后接菌處理和常規(guī)處理有機(jī)物降解率分別(67.2)％和(45.4)％，說(shuō)明接菌有利于促進(jìn)有機(jī)物的降解。試驗(yàn)結(jié)束后接菌處理和常規(guī)處理的發(fā)芽指數(shù)分別95％和60％，說(shuō)明接菌處理較常規(guī)處理對(duì)堆肥物料腐熟有促進(jìn)作用；從試驗(yàn)過(guò)程發(fā)芽指數(shù)的變化規(guī)律來(lái)看，接菌處理在堆肥的第15天發(fā)芽指數(shù)已趨于穩(wěn)定，接近于試驗(yàn)結(jié)束值，達(dá)到腐熟；而常規(guī)處理的發(fā)芽指數(shù)仍呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明常規(guī)處理在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)還未達(dá)到腐熟。15天發(fā)酵期堆肥效果見(jiàn)圖3和圖4。經(jīng)發(fā)酵后，檢測(cè)物料體積、密度及有機(jī)質(zhì)變化。與堆肥初期相比，堆體體積減小到原來(lái)的45-60％(最初體積100m3，減少為45m3-60m3)，有機(jī)質(zhì)降解了67.2％(有機(jī)質(zhì)最初100公斤，降解了67.2公斤剩余22.8公斤)，纖維素降解了35-55％，半纖維素降解了55-61％，木質(zhì)素降解了23-38％，糞大腸桿菌數(shù)＜102，蛔蟲卵死亡率100％，達(dá)到堆肥排放標(biāo)準(zhǔn)。從上表可見(jiàn)，接種本發(fā)明堆肥接種劑后，縮短了堆肥從中溫進(jìn)入高溫期(＞50℃)的時(shí)間，使堆肥高溫期(＞50℃)提前1天，高溫期(＞50℃)維持的天數(shù)延長(zhǎng)5天，堆肥最高溫度提高，微生物活性明顯提高，保證有機(jī)物料的快速降解及提高堆料的無(wú)害化程度，從而縮短了堆肥周期。整個(gè)堆肥過(guò)程中，接種處理?yè)]發(fā)分的含量均比相同時(shí)期的空白對(duì)照的低，堆肥結(jié)束時(shí)，接種處理與空白對(duì)照的揮發(fā)分降解率分別是55％與33％，接種處理明顯要高于空白對(duì)照，說(shuō)明接種本發(fā)明菌劑加快了有機(jī)物的分解速率。接菌堆肥與空白對(duì)照相比，碳氮比下降的速度快，在第15天后趨于穩(wěn)定，而空白對(duì)照則一直呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明接種本菌劑能加快堆肥有機(jī)物料的降解，達(dá)到穩(wěn)定化的程度，最終的碳氮比及T值(終點(diǎn)C/N：初始C/N)分別為：1.5:1及3:1。堆肥過(guò)程中，發(fā)芽指數(shù)基本呈上升趨勢(shì)；在第5天后，接種堆肥的發(fā)芽指數(shù)比空白對(duì)照上升的速率更快些，到堆肥結(jié)束時(shí)增加為80％，說(shuō)明接種本發(fā)明提供的堆肥接種劑有利于減少堆肥的生物毒性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3