本發(fā)明涉及生物防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及一種枯草芽孢桿菌YN145及其在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，全球有半數(shù)以上人口以水稻為食。稻瘟病(病菌為Magnaportheoryzae，其無性世代為Pyiculariaoryzae)是水稻最嚴(yán)重要的真菌性病害之一。稻瘟病菌(M.oryzae)是一種半活體寄生，在感染最初階段具有很明顯的活體營養(yǎng)階段。稻瘟病根據(jù)其發(fā)病部位和發(fā)病時期不同可以分為苗瘟、葉瘟、節(jié)瘟、穗瘟、谷粒瘟、枝梗瘟等。目前生產(chǎn)上主要利用抗病品種和使用化學(xué)殺菌劑控制稻瘟病。主要使用的殺菌劑有三環(huán)唑、稻瘟靈、咪鮮胺、稻瘟酰胺、異稻瘟凈、稻瘟凈、敵瘟磷(克瘟散)、丙環(huán)唑、嘧菌酯、戊唑醇、烯丙苯噻唑、氯溴異氰尿酸、三氯異氰尿酸、四氯苯酞、肟菌·戊唑醇(拿敵穩(wěn))、硫磺·三環(huán)唑、甲硫·三環(huán)唑(稻津)、異稻·稻瘟靈、丙環(huán)唑·咪酰胺等；生物產(chǎn)品化學(xué)有效成分或活體微生物如春雷霉素、乙蒜素、氨基寡糖素、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。由于稻瘟病菌的遺傳背景復(fù)雜，易變異，加上抗瘟品種單一化，主栽品種的遺傳同質(zhì)性高，抗病品種難保持持久抗稻瘟病，常常導(dǎo)致一個新的抗瘟品種在大面積種植幾年后喪失抗性，而感病化。在抗病品種不能滿足生產(chǎn)需要的情況下，化學(xué)防治是防治稻瘟病的有效手段，但由于用藥不合理，給生態(tài)安全帶來潛在的不利影響，也值得人們關(guān)注。生物防治即利用有益微生物活體或代謝產(chǎn)物殺滅或者降低病原微生物的數(shù)量以控制植物病害發(fā)生和危害。從植物病害的可持續(xù)控制來考慮，生物防治是一類綠色安全有效的防治措施。然而，生物防治領(lǐng)域中常會遇到拮抗微生物在田間自然條件下定殖力差、對病害防治效果不穩(wěn)定等問題。大量的研究也表明，室內(nèi)篩選出的拮抗微生物在溫室中對病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，而在大田防治中效果不理想，這可能是由于一方面菌株不適應(yīng)大田生態(tài)環(huán)境而不能很好的定殖到植物的根圍，另一方面與大田土壤中復(fù)雜的微生物種類與拮抗菌株之間出現(xiàn)相互作用，導(dǎo)致拮抗微生物防效降低，因此，選擇篩選生物菌株的田間適應(yīng)能力強(qiáng)或高效代謝產(chǎn)物應(yīng)用于大田病害防治是解決上述問題的重要途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一株新分離的生防菌-枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)YN145。本發(fā)明的另一目的是提供所述枯草芽孢桿菌YN145在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)YN145是從湖南省桃江石牛江鎮(zhèn)花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品種湘早秈24號的病叢中選取健康稻株分離獲得的，采用與稻瘟病菌平板對峙法篩選出的對稻瘟病菌菌絲抑制率達(dá)84.31％的拮抗菌株，同時該菌株對多種真菌病原菌都有良好拮抗作用，如對煙草赤星病菌(Alternariaalternata)、葡萄灰霉菌(Botrytiscinerea)、辣椒膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、黃瓜疫病菌(Phytophthoramelonis)的菌絲抑制率分別達(dá)到74.60％、53.50％、70.00％和63.49％；采用抑菌圈法發(fā)現(xiàn)菌株YN145對細(xì)菌病原菌也存在一定的效果，例如水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，縮寫為Xoo)、黃瓜角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)的抑制率分別達(dá)到33.09％和30.15％。且對稻瘟病菌的產(chǎn)黑色素的能力有一定的抑制作用?，F(xiàn)已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCCNO：M2016339，保藏日期2016年6月22日。菌株YN145在NA平板上培養(yǎng)對其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察及對其菌體的掃描電鏡圖觀察，菌落形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙不透明，邊緣隆起，有褶皺，微黃色。YN145菌體呈桿狀，有鞭毛，大小為(0.6～0.8)μm×(2.0～4.0)μm，芽孢橢圓到柱狀，長0.5～1.0μm，形態(tài)如圖1所示。菌株YN145能使淀粉水解、明膠液化，接觸酶試驗、VP試驗、甲基紅試驗、硝酸鹽還原試驗呈陽性，使硫化氫試驗、吲哚試驗和苯丙氨酸脫氨酶試驗呈陰性，能利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、玉米粉、D-甘露醇、D-阿拉伯糖。菌株YN145的16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明還提供由所述枯草芽孢桿菌YN145制備的菌劑。本發(fā)明還提供所述枯草芽孢桿菌YN145或由其制備的菌劑在防治水稻稻瘟病中的應(yīng)用。前述的應(yīng)用包括將所述枯草芽孢桿菌YN145或由其制備的菌劑施用于水稻作物。其中，所述菌劑中枯草芽孢桿菌YN145的活菌濃度≥1×107cfu/mL。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種防治水稻稻瘟病的方法，其包括將所述枯草芽孢桿菌YN145的培養(yǎng)液進(jìn)行離心，得到活體菌沉淀與上清液，將活體菌配制菌懸液施用于水稻作物，或?qū)⑸锨逡?含代謝產(chǎn)物)施用于水稻作物?？蛇x的，所述上清液(代謝產(chǎn)物)的制備方法包括：將菌株YN145在NA固體培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂17g/L，pH7.0，蒸餾水配制)平板上活化后，用打孔器打取直徑5mm的2個菌餅接入裝有150mLNB液體培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸餾水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min條件下，搖床振蕩培養(yǎng)4d，用細(xì)菌過濾器過濾，獲得枯草芽孢桿菌YN145代謝產(chǎn)物。進(jìn)一步地，所述施用方法優(yōu)選為葉面噴施。即將菌株YN145代謝產(chǎn)物或活體菌(濃度≥1×107cfu/mL)在稻瘟病菌侵染前或侵染后1～3d，采用葉面噴霧法施用于水稻作物上，能夠起到較好的防效效果，也證明了該菌株具有良好的治療稻瘟病效果。預(yù)防時，可在水稻抽穗初期施用，施用方法同上。作為優(yōu)選，施用量為菌體4.5×1012cfu/hm2～4.5×1013cfu/hm2；菌體與代謝產(chǎn)物混合使用4.5×1011cfu/hm2～4.5×1012cfu/hm2。此外，采用平板對峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株YN145對多種真菌病原指示菌有一定的效果，例如煙草赤星病菌(A.alternata)、葡萄灰霉菌(B.cinerea)、辣椒膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黃瓜疫病菌(P.melonis)生長的抑菌率分別為74.60％、53.50％、70.00％和63.49％；采用抑菌圈法發(fā)現(xiàn)菌株YN145對細(xì)菌病原菌也存在一定的效果，例如水稻白葉枯病菌(X.oryzaepv.oryzae，縮寫為Xoo)、黃瓜角斑病菌(P.syringaepv.lachrymans)的抑制率分別達(dá)到33.09％和30.15％。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明經(jīng)篩選得到一種枯草芽孢桿菌YN145并對其進(jìn)行了保藏，利用本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌YN145對水稻稻瘟病進(jìn)行防治，避免了化學(xué)防治對環(huán)境和稻米安全的潛在不良影響及抗病品種利用的感病化風(fēng)險。菌株YN145活體菌及其代謝產(chǎn)物對稻瘟病均有較好的防效，保護(hù)和治療作用兼具，可將其作為活體菌劑和代謝產(chǎn)物的劑型加工開發(fā)。附圖說明圖1為本發(fā)明枯草芽孢桿菌YN145的菌株掃描電鏡下菌體形態(tài)。圖2為本發(fā)明實施例1中枯草芽孢桿菌YN145在NA平板上培養(yǎng)結(jié)果；其中，A為菌落形態(tài)，B為劃線培養(yǎng)結(jié)果。圖3為本發(fā)明實施例1中枯草芽孢桿菌YN145對不同病原指示菌的生長抑制效果；其中，A1為煙草赤星病菌(A.alternata)；A2為YN145對煙草赤星病菌菌絲生長抑制效果；B1為葡萄灰霉菌(B.cinerea)；B2為YN145對灰霉菌絲生長抑制效果。圖4為本發(fā)明實施例2中枯草芽孢桿菌YN145及其代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌(M.oryzae)的菌絲生長抑制效果；其中，A為菌株YN145對稻瘟病菌生長抑制效果，CK為稻瘟病菌；B為菌株YN145的代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌菌絲生長抑制效果，CK為稻瘟病菌。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1枯草芽孢桿菌YN145的分離獲得從湖南省湖南省桃江石牛江鎮(zhèn)花田村(N28°42′55.56″，E112°15′74.24″)感稻瘟病水稻品種湘早秈24號的病叢中選取健康稻株，共分離出517株菌株，采用與稻瘟病菌平板對峙法篩選出1株對稻瘟病菌(M.oryzae)菌絲抑制率達(dá)84.31％的拮抗菌YN145。通過在NA固體培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂17g/L，pH7.0，蒸餾水配制)平板上培養(yǎng)菌株YN145(圖2A和圖2B)，對其菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，對其菌體的掃描電鏡圖觀察，并結(jié)合該菌的生理生化、微生物學(xué)檢測結(jié)果，以及16SrDNA測序結(jié)果(見SEQIDNO.1)，最終確定菌株YN145為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。此外，采用平板對峙培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)菌株YN145對多種真菌病原指示菌具有抑制效果(圖3)，例如煙草赤星病菌(A.alternata)、葡萄灰霉菌(B.cinerea)、辣椒膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、黃瓜疫病(P.melonis)生長的抑菌率分別為74.60％、53.50％、70.00％和63.49％；采用抑菌圈法發(fā)現(xiàn)菌株YN145對細(xì)菌病原菌也存在一定的效果，例如水稻白葉枯病菌(Xoo)、黃瓜角斑病菌(P.syringaepv.lachrymans)的抑制率分別達(dá)到33.09％和30.15％。實施例2枯草芽孢桿菌YN145在水稻稻瘟病防治中的應(yīng)用菌株YN145在NA固體培養(yǎng)基平板上活化后，用打孔器打取直徑5mm的2個菌餅接入裝有150mLNB液體培養(yǎng)基(蛋白胨5g/L，牛肉浸膏3g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，蒸餾水配制)的250mL三角瓶中，28℃、180r/min條件在搖床中振蕩培養(yǎng)4d，用細(xì)菌過濾器過濾，獲得枯草芽孢桿菌YN145代謝產(chǎn)物。將菌株YN145代謝產(chǎn)物和PDA培養(yǎng)基以體積(mL)1:8的量混勻，接直徑為7mm的稻瘟病菌菌餅于配好的培養(yǎng)基上，以無菌水代替拮抗菌培養(yǎng)液為對照，28℃培養(yǎng)，10d后測量稻瘟病菌的菌餅的大小，3次重復(fù)，結(jié)果顯示對稻瘟病菌菌絲的抑制率為84.31％。溫室盆栽試驗包括YN145菌株不同濃度活體菌和代謝產(chǎn)物對水稻高感稻瘟病品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果試驗兩部分，試驗在組培控溫光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行。YN145活體菌對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果：采用噴霧法接種稻瘟病菌(分生孢子濃度為1×105個/mL)誘發(fā)稻瘟病。將YN145活菌濃度梯度設(shè)計為：1×1010cfu/mL、1×109cfu/mL、1×108cfu/mL、1×107cfu/mL共4個濃度梯度。試驗包括3種處理方式，分別為：A組先噴稻瘟病菌孢子液，第3d噴4個濃度梯度的YN145菌株活菌液；B組接種稻瘟病菌孢子懸浮液前1d分別噴4個濃度梯度的YN145菌株活菌液；C組接種稻瘟病菌孢子液前3d先分別噴4個濃度梯度的YN145菌株活菌液；設(shè)置清水、20％三環(huán)唑WP為對照和40％稻瘟靈EC(×500倍液)為對照，每種處理方式3缽，每缽30株。接種后10d對稻瘟病抗性進(jìn)行分級調(diào)查和防治稻瘟病效果評價。YN145菌株代謝產(chǎn)物對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果評價：采用水稻活體接種法接種稻瘟病菌分生孢子懸浮液(濃度為1×105個/mL)誘發(fā)稻瘟病。具體試驗包括3種處理方式，分別為：A組先噴稻瘟病菌孢子液，第3d噴代謝產(chǎn)物；B組先噴代謝產(chǎn)物，1d后噴稻瘟病菌孢子液；C組先噴代謝產(chǎn)物，3d后噴稻瘟病菌孢子液。設(shè)置清水、殺菌劑40％稻瘟靈EC(×500倍液)和20％三環(huán)唑WP(×400倍液)為對照，每種處理方式3缽，每缽30株。接種后7-10d對稻瘟病抗性進(jìn)行分級調(diào)查和防治效果評價。溫室盆栽試驗結(jié)果：YN145活體菌對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果見表1，YN145菌株代謝產(chǎn)物對水稻高感品種湘晚秈12號的稻瘟病防治效果見表2。表1YN145活體菌對湘晚秈12號的稻瘟病治療效果注：以上數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)結(jié)果。表2YN145菌株代謝產(chǎn)物對湘晚秈12號的稻瘟病防治效果處理病株率(％)病情指數(shù)相對防效(％)YN145(A組)65.5617.5372.5940％稻瘟靈(A組)85.5529.8753.2820％三環(huán)唑(A組)85.5536.4243.05清水(A組)97.7863.95/YN145(B組)96.6756.0524.7140％稻瘟靈(B組)100.0061.8515.0820％三環(huán)唑(B組)94.4441.6042.88清水(B組)100.0074.44/YN145(C組)95.5643.2040.6840％稻瘟靈(C組)100.0062.2214.5720％三環(huán)唑(C組)95.5656.5422.37清水(C組)100.0074.44/注：以上數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)結(jié)果。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3